JPH0354560B2 - - Google Patents
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- JPH0354560B2 JPH0354560B2 JP8540687A JP8540687A JPH0354560B2 JP H0354560 B2 JPH0354560 B2 JP H0354560B2 JP 8540687 A JP8540687 A JP 8540687A JP 8540687 A JP8540687 A JP 8540687A JP H0354560 B2 JPH0354560 B2 JP H0354560B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dhfr
- fusion protein
- activity
- pblak1
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、血中ペプタイドであるブラジキニン
（Bradykinin）（Arg−Pro−Pro−Gly−Phe−
Ser−Pro−Phe−Argの９個のアミノ酸配列によ
りなるペプチド、以下、BKと略す。）をカルボ
キシ末端側に有するジヒドロ葉酸還元酵素−ブラ
ジキニン融合タンパク（以下、DHFR−BKと略
す。）に関するものである。
（Bradykinin）（Arg−Pro−Pro−Gly−Phe−
Ser−Pro−Phe−Argの９個のアミノ酸配列によ
りなるペプチド、以下、BKと略す。）をカルボ
キシ末端側に有するジヒドロ葉酸還元酵素−ブラ
ジキニン融合タンパク（以下、DHFR−BKと略
す。）に関するものである。
BKは、血中ペプタイドの一種であり、血圧降
下作用（血管拡張作用）を有する。このような作
用を有することから、BKは、高血圧症等の治療
薬としての利用が期待されている。本発明の
DHFR−BKは、第１図において示されるアミノ
酸配列を有する全く新規なタンパクであり、これ
の利用分野としては、医療、医薬品工業等の分野
に好適である。
下作用（血管拡張作用）を有する。このような作
用を有することから、BKは、高血圧症等の治療
薬としての利用が期待されている。本発明の
DHFR−BKは、第１図において示されるアミノ
酸配列を有する全く新規なタンパクであり、これ
の利用分野としては、医療、医薬品工業等の分野
に好適である。
従来の技術
BKは、血中ペプタイドの一種であり、血圧降
下作用（血管拡張作用）、腸管収縮作用、血管透
過性作用などの作用を有することが知られてい
る。BKは、Arg−Pro−Pro−Gly−Phe−Ser−
Pro−Phe−Argの９個のＬ−アミノ酸により構
成されていることが明らかにされている。BKは
これ自体が活性なペプチドであり、Ｎ末端にLys
がついたカルリジン（Kallidin）、またMet−Lys
−ブラジキニンはBKよりも低いが活性を有する
ことが知られていいる。BKは、短いペプチドで
あり、既にBoissonnasら（Boissonnas et al.，
Helv.Chim.Acta，vol 43，pp.1349（1960）によ
つて化学合成が行われている。
下作用（血管拡張作用）、腸管収縮作用、血管透
過性作用などの作用を有することが知られてい
る。BKは、Arg−Pro−Pro−Gly−Phe−Ser−
Pro−Phe−Argの９個のＬ−アミノ酸により構
成されていることが明らかにされている。BKは
これ自体が活性なペプチドであり、Ｎ末端にLys
がついたカルリジン（Kallidin）、またMet−Lys
−ブラジキニンはBKよりも低いが活性を有する
ことが知られていいる。BKは、短いペプチドで
あり、既にBoissonnasら（Boissonnas et al.，
Helv.Chim.Acta，vol 43，pp.1349（1960）によ
つて化学合成が行われている。
本発は、BKの新合成法の開発の一環として行
なわれたものである。本発明の技術的背景として
は、いわゆる遺伝子操作技術がある。B.subtilis
のDHFRとBKとの融合タンパクを暗号化する遺
伝子を組込んだプラスミドは、既に本発明者らが
構築している特開昭63−245679号公報が、それ以
前は全く知られていなかつた。また、DHFR−
BKを暗号化する遺伝子を組込んだ組換えプラス
ミドpBLAK1は、E.coli C600株に導入されて安
定状態に保たれ、pBLAK1を含有するE.coli
C600株は微工研にFERMP−9300として寄託され
ている。
なわれたものである。本発明の技術的背景として
は、いわゆる遺伝子操作技術がある。B.subtilis
のDHFRとBKとの融合タンパクを暗号化する遺
伝子を組込んだプラスミドは、既に本発明者らが
構築している特開昭63−245679号公報が、それ以
前は全く知られていなかつた。また、DHFR−
BKを暗号化する遺伝子を組込んだ組換えプラス
ミドpBLAK1は、E.coli C600株に導入されて安
定状態に保たれ、pBLAK1を含有するE.coli
C600株は微工研にFERMP−9300として寄託され
ている。
問題点
BKは、９個のアミノ酸よりなるペプチドであ
ることから、これに対応する遺伝子を化学合成
し、これを発現する組換えプラスミドを作成し、
大腸菌等の宿主で発現させることができるものと
考えられる。しかしながら、短いペプチド等は、
大腸菌等に存在するタンパク分解酵素により速や
かに分解されることから、遺伝子の発現効率を向
上させても宿主菌体内に蓄積させることができな
い。従つて、遺伝子操作技術を利用してBKなど
の短いポリペプチドを生産しようとした場合、融
合遺伝子を作成し、融合タンパクとして発現させ
ることが必要である。この際、多くの場合、融合
タンパクが不溶化すること、及び融合タンパクに
容易に測定可能な酵素活性がないこと、などから
生成物の単離・精製の上で障害が考えられてい
た。既に、本発明者らは、この問題を解消すべく
研究を行い、DHFR−BK融合タンパク遺伝子を
有する組換えプラスミドpBLAK1を構築し、こ
れをE.coli宿主に導入し、その安定な発現に成功
している（特開昭63−245679号公報）。しかしな
がら、DHFR−BK融合タンパクに関しての報告
がなく、全く新規な化合物である。
ることから、これに対応する遺伝子を化学合成
し、これを発現する組換えプラスミドを作成し、
大腸菌等の宿主で発現させることができるものと
考えられる。しかしながら、短いペプチド等は、
大腸菌等に存在するタンパク分解酵素により速や
かに分解されることから、遺伝子の発現効率を向
上させても宿主菌体内に蓄積させることができな
い。従つて、遺伝子操作技術を利用してBKなど
の短いポリペプチドを生産しようとした場合、融
合遺伝子を作成し、融合タンパクとして発現させ
ることが必要である。この際、多くの場合、融合
タンパクが不溶化すること、及び融合タンパクに
容易に測定可能な酵素活性がないこと、などから
生成物の単離・精製の上で障害が考えられてい
た。既に、本発明者らは、この問題を解消すべく
研究を行い、DHFR−BK融合タンパク遺伝子を
有する組換えプラスミドpBLAK1を構築し、こ
れをE.coli宿主に導入し、その安定な発現に成功
している（特開昭63−245679号公報）。しかしな
がら、DHFR−BK融合タンパクに関しての報告
がなく、全く新規な化合物である。
発明の目的
本発明者らは、鋭意研究を行い、pBLAK1を
含有するE.coli C600株からDHFR−BK融合タン
パクの分離精製法を確立し、また、得られた融合
タンパクが、DHFR活性及びBKの抗原性（即
ち、免疫学的活性）を保持している多機能タンパ
クであることを明らかにし、本発明を完成させる
に至つた。
含有するE.coli C600株からDHFR−BK融合タン
パクの分離精製法を確立し、また、得られた融合
タンパクが、DHFR活性及びBKの抗原性（即
ち、免疫学的活性）を保持している多機能タンパ
クであることを明らかにし、本発明を完成させる
に至つた。
発明の構成
本発明のDHFR−BK融合タンパクは、第１図
に示されるように172個のアミノ酸より構成され
る。融合タンパクのアミノ末端側から162番目ま
では、B.subtilisのDHFR（168個のアミノ酸より
成る。）の１〜162番目のアミノ酸配列と同一であ
り、164〜172番目の配列がBKの配列である。
163番目のアミノ酸はMetであり、ブロムシアン
で融合タンパクを処理することによりBKを切り
出すことが可能な構造である。融合タンパクの分
子量は19801である。
に示されるように172個のアミノ酸より構成され
る。融合タンパクのアミノ末端側から162番目ま
では、B.subtilisのDHFR（168個のアミノ酸より
成る。）の１〜162番目のアミノ酸配列と同一であ
り、164〜172番目の配列がBKの配列である。
163番目のアミノ酸はMetであり、ブロムシアン
で融合タンパクを処理することによりBKを切り
出すことが可能な構造である。融合タンパクの分
子量は19801である。
第１図には、DHFR−BK融合タンパクを暗号
化するDNA配列を同時に記述している。この
DNA配列よりアミノ酸配列を決定することがで
きた。
化するDNA配列を同時に記述している。この
DNA配列よりアミノ酸配列を決定することがで
きた。
B.subtilisのDHFRは、168個のアミノ酸より構
成されるが、第１図に示される配列の163〜168番
目のまでの配列が、Ser−Lys−Val−Gly−Gly
−Pheであり、DHFR−BK融合タンパクと全く
異なつた配列をしている。通常、タンパクの一次
構造を変化させた場合、その生理活性を失うこと
が多いが、本発明の場合は、B.subtilisのDHFR
のカルボキシ末端の配列が変わつても、DHFR
活性には影響が認められない。
成されるが、第１図に示される配列の163〜168番
目のまでの配列が、Ser−Lys−Val−Gly−Gly
−Pheであり、DHFR−BK融合タンパクと全く
異なつた配列をしている。通常、タンパクの一次
構造を変化させた場合、その生理活性を失うこと
が多いが、本発明の場合は、B.subtilisのDHFR
のカルボキシ末端の配列が変わつても、DHFR
活性には影響が認められない。
本発明のDHFR−BK融合タンパクは、BKに
対する抗体と特異的に反応し、免疫複合体を形成
する。即ち、実施例で示されるように、DHFR
−BK融合タンパクとウサギで作らせたBKに対
する抗体を反応させ生じた免疫複合体を、ヤギで
作らせたウサギのイムノグロブリンに対する抗体
と反応させることにより得られる免疫複合体沈殿
を分離した後、沈殿を可溶化して、DHFR活性
を測定したところ、DHFR活性が存在した。さ
らに、このDHFR活性量は、DHFR−BK融合タ
ンパクとBK抗体との反応液にBKを共存させる
ことにより競争的に減少した。一方、B.subtilis
のDHFRとBK抗体とを反応させた場合、免疫複
合体沈殿中にDHFR活性を検出できない。この
ことから、DHFR−BK融合タンパクは、免疫学
的にBKの性質を有することが明らかとなつた。
以上のことから、DHFR−BK融合タンパクは、
DHFRとBKの両方の特性を有することが示され
た。
対する抗体と特異的に反応し、免疫複合体を形成
する。即ち、実施例で示されるように、DHFR
−BK融合タンパクとウサギで作らせたBKに対
する抗体を反応させ生じた免疫複合体を、ヤギで
作らせたウサギのイムノグロブリンに対する抗体
と反応させることにより得られる免疫複合体沈殿
を分離した後、沈殿を可溶化して、DHFR活性
を測定したところ、DHFR活性が存在した。さ
らに、このDHFR活性量は、DHFR−BK融合タ
ンパクとBK抗体との反応液にBKを共存させる
ことにより競争的に減少した。一方、B.subtilis
のDHFRとBK抗体とを反応させた場合、免疫複
合体沈殿中にDHFR活性を検出できない。この
ことから、DHFR−BK融合タンパクは、免疫学
的にBKの性質を有することが明らかとなつた。
以上のことから、DHFR−BK融合タンパクは、
DHFRとBKの両方の特性を有することが示され
た。
このような特徴を有する、DHFR−BK融タン
パクは、組換えプラスミドpBLAK1を含有する
E.coliの細胞中に化可溶性の状態で生産される。
すなわち、pBLAK1を含有するE.coliを培養し、
菌体を集め、これを音波破砕し、20000回転／分
で遠心分離して得られる上清中に、DHFR−BK
融合タンパクのほとんど全てが存在する。即ち、
融合タンパクは不溶性でなく可溶性の状態でE.
coli細胞中に産生されている。
パクは、組換えプラスミドpBLAK1を含有する
E.coliの細胞中に化可溶性の状態で生産される。
すなわち、pBLAK1を含有するE.coliを培養し、
菌体を集め、これを音波破砕し、20000回転／分
で遠心分離して得られる上清中に、DHFR−BK
融合タンパクのほとんど全てが存在する。即ち、
融合タンパクは不溶性でなく可溶性の状態でE.
coli細胞中に産生されている。
DHFR−BK融合タンパクは、pBLAK1を含有
するE.coliをYT＋Ap培地（培地１中に、５ｇ
のNaC1、８ｇのバクトトリブトン、５ｇのイー
ストエキス、及び50mgのアンピシリンナトリウム
を含む液体培地）を用いて、37℃で対数増殖期の
終わりもしくは定常期まで培養した後、菌体を集
め、これを超音波破砕し遠心分離上清（無細胞抽
出液）を得て、この上清をイオン交換カラムクロ
マトグラフイー及びそれに引き続くゲルろ過カラ
ムクロマトグラフイーにより高度に精製すること
ができる。これらカラムクロマトグラフイーの
際、溶出液を分画し、目的のDHFR−BK融合タ
ンパクがどの分画（フラクシヨン）に存在するか
を調べなければならない。本発明においては、目
的のDHFR−BK融合タンパクがDHFR酵素活性
を有することから、この活性を測定することによ
つて融合タンパクが存在するフラクシヨンを知る
ことができる。
するE.coliをYT＋Ap培地（培地１中に、５ｇ
のNaC1、８ｇのバクトトリブトン、５ｇのイー
ストエキス、及び50mgのアンピシリンナトリウム
を含む液体培地）を用いて、37℃で対数増殖期の
終わりもしくは定常期まで培養した後、菌体を集
め、これを超音波破砕し遠心分離上清（無細胞抽
出液）を得て、この上清をイオン交換カラムクロ
マトグラフイー及びそれに引き続くゲルろ過カラ
ムクロマトグラフイーにより高度に精製すること
ができる。これらカラムクロマトグラフイーの
際、溶出液を分画し、目的のDHFR−BK融合タ
ンパクがどの分画（フラクシヨン）に存在するか
を調べなければならない。本発明においては、目
的のDHFR−BK融合タンパクがDHFR酵素活性
を有することから、この活性を測定することによ
つて融合タンパクが存在するフラクシヨンを知る
ことができる。
DHFR酵素活性は、0.05ｍＭのジヒドロ葉酸、
0.06ｍＭのNADPH（還元型ニコチンアミドジヌ
クレオチドホスフエート）、12ｍＭの２−メルカ
プトエタノール、50ｍＭのリン酸カリウム緩衝液
（PH7.0）を、１mlのキユベツトにとり、これに酵
素液を加え、30℃で酵素反応に伴つて減少するジ
ヒドロ葉酸とNADPHを、340nｍの吸光度の時
間変化を測定することにより行うことができる。
この測定は、分光光度計を用いて容易に行うこと
ができる。
0.06ｍＭのNADPH（還元型ニコチンアミドジヌ
クレオチドホスフエート）、12ｍＭの２−メルカ
プトエタノール、50ｍＭのリン酸カリウム緩衝液
（PH7.0）を、１mlのキユベツトにとり、これに酵
素液を加え、30℃で酵素反応に伴つて減少するジ
ヒドロ葉酸とNADPHを、340nｍの吸光度の時
間変化を測定することにより行うことができる。
この測定は、分光光度計を用いて容易に行うこと
ができる。
実施例においては、イオン交換カラムクロマト
グラフイーの担体としてDEAE−トヨパール
650Mゲルを、またゲルろ過カラムクロマトグラ
フイーの担体としてトヨパールHW55ゲルを用い
ているが、本発明の精製法の特徴は、DHFR酵
素活性を測定することによつて、DHFR−BK融
合タンパクの精製過程における溶出等をモニター
することにあり、用いた担体によつて本発明が制
限されるものではない。
グラフイーの担体としてDEAE−トヨパール
650Mゲルを、またゲルろ過カラムクロマトグラ
フイーの担体としてトヨパールHW55ゲルを用い
ているが、本発明の精製法の特徴は、DHFR酵
素活性を測定することによつて、DHFR−BK融
合タンパクの精製過程における溶出等をモニター
することにあり、用いた担体によつて本発明が制
限されるものではない。
次に本発明の実施例を示す。
実施例 １
組換えプラスミドpBLAK1を含有するE.coli
C600株からのDHFR−BK融合タンパクの精製 プラスミドpBLAK1を含有するE.coli C600株
を３のYT＋Ap培地中で37℃で一晩培養後、
菌体を遠心分離により集めた。湿重量約12ｇの菌
体がえられた。菌体0.1ｍＭのエチレンジアミン
４酢酸２ナトリウム（EDTA）を含む10ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液PH7.0（緩衝液１）に懸濁し、
超音波破砕により細胞を破砕した後、20000回
転／分、１時間の遠心分離とより上清35mlを得
た。得られた上清のDHFRの酵素活性を測定し
たところ、90ユニツト／mlという値であつた（全
活性3150ユニツト、全タンパク902mg、比活性3.5
ユニツト／mg）。DHFR酵素活性は、DHFR反応
液（0.05ｍＭ ジヒドロ葉酸、0.06ｍＭ
NADPH、12ｍＭ ２−メルカプトエタノール、
50ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（PH7.0）を、１
mlのキユベツトにとり、これに酵素液を加え、分
光光度計中で、30℃で反応を行わせ、340nｍの
吸光度の時間変化を測定することにより行つた。
酵素１ユニツトは、上記反応条件において、１分
間に１マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元するの
に要する酵素量として定義した。得られた遠心上
清を、DEAE−トヨパール650Mカラム（250mmx
1500mm、約75cm3）に吸着させ、50ｍＭのCK1を含
む緩衝液１で溶出した。約６mlずつフラクシヨン
を集め、DHFRの酵素活性を測定し、酵素活性
を有する画分を集めた。65mlの酵素液が得られた
（回収活性1897ユニツト（60％）、回収タンパク25
mg、比活性75.9ユニツト／mg）。これをアミコン
限外ろ過装置を用いて約１mlにまで濃縮し、これ
をトヨパールHW55カラムクロマトグラフイーに
より分画した。約2.8mlずつフラクシヨンを集め、
DHFRの酵素活性を測定し、酵素活性のピーク
画分を集めた。11.2mlの酵素液が得られた（回収
活性1151ユニツト（36％）、回収タンパク5.7mg、
比活性202ユニツト／mg）。得られた酵素タンパク
をSDS電気泳動法により分析したところ、均一で
あり、ラクトアルブミン、トリプシンインヒビタ
ー、トリプシノーゲン、カーボニツクアンヒドラ
ーゼ、グリセロアルデヒド−３リン酸デヒドロゲ
ナーゼ、卵アルブミン、及び牛血清アルブミンを
分子量マーカーとして、精製ジヒドロ葉酸還元酵
素の分子量を推定したところ20000であり、塩基
配列から予想される分子量19801とほぼ一致した
値であつた。
C600株からのDHFR−BK融合タンパクの精製 プラスミドpBLAK1を含有するE.coli C600株
を３のYT＋Ap培地中で37℃で一晩培養後、
菌体を遠心分離により集めた。湿重量約12ｇの菌
体がえられた。菌体0.1ｍＭのエチレンジアミン
４酢酸２ナトリウム（EDTA）を含む10ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液PH7.0（緩衝液１）に懸濁し、
超音波破砕により細胞を破砕した後、20000回
転／分、１時間の遠心分離とより上清35mlを得
た。得られた上清のDHFRの酵素活性を測定し
たところ、90ユニツト／mlという値であつた（全
活性3150ユニツト、全タンパク902mg、比活性3.5
ユニツト／mg）。DHFR酵素活性は、DHFR反応
液（0.05ｍＭ ジヒドロ葉酸、0.06ｍＭ
NADPH、12ｍＭ ２−メルカプトエタノール、
50ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（PH7.0）を、１
mlのキユベツトにとり、これに酵素液を加え、分
光光度計中で、30℃で反応を行わせ、340nｍの
吸光度の時間変化を測定することにより行つた。
酵素１ユニツトは、上記反応条件において、１分
間に１マイクロモルのジヒドロ葉酸を還元するの
に要する酵素量として定義した。得られた遠心上
清を、DEAE−トヨパール650Mカラム（250mmx
1500mm、約75cm3）に吸着させ、50ｍＭのCK1を含
む緩衝液１で溶出した。約６mlずつフラクシヨン
を集め、DHFRの酵素活性を測定し、酵素活性
を有する画分を集めた。65mlの酵素液が得られた
（回収活性1897ユニツト（60％）、回収タンパク25
mg、比活性75.9ユニツト／mg）。これをアミコン
限外ろ過装置を用いて約１mlにまで濃縮し、これ
をトヨパールHW55カラムクロマトグラフイーに
より分画した。約2.8mlずつフラクシヨンを集め、
DHFRの酵素活性を測定し、酵素活性のピーク
画分を集めた。11.2mlの酵素液が得られた（回収
活性1151ユニツト（36％）、回収タンパク5.7mg、
比活性202ユニツト／mg）。得られた酵素タンパク
をSDS電気泳動法により分析したところ、均一で
あり、ラクトアルブミン、トリプシンインヒビタ
ー、トリプシノーゲン、カーボニツクアンヒドラ
ーゼ、グリセロアルデヒド−３リン酸デヒドロゲ
ナーゼ、卵アルブミン、及び牛血清アルブミンを
分子量マーカーとして、精製ジヒドロ葉酸還元酵
素の分子量を推定したところ20000であり、塩基
配列から予想される分子量19801とほぼ一致した
値であつた。
実施例 ２
DHFR−BK融合タンパクのイムノアツセイ
市販のウサギ抗BK抗体（Biosys，S.A.社製）
を0.1ml、0.15M NaC1、0.1％ ウシ血清アルブ
ミン、及び0.1％アジ化ナトリウムを含むリン酸
ナトリウム緩衝液、PH7.0（BSAPEと称する。）を
0.1ml、及びBSAPBで1000倍希釈したDHFR−
BKを0.1ml（10.3ミリユニツト、50.1ngのDHFR
−BKを含む）を混合し、30°で１時間反応させ、
次に、BSAPBで300倍希釈したウサギ血清を0.1
ml及びBSAPBで300倍希釈したヤギ抗ウサギガ
ンマグロブリンを0.1mlを加えてさらに30℃で１
時間反応させた。生じた沈殿を12000rpmの遠心
分離により集め、さらに、BASPBで３回沈殿を
洗浄した。得られた沈殿に、0.02mlの0.005規定
の塩酸を加えて可溶化し、さらに、10ｍＭのジチ
オトレイトールを含む0.5M リン酸カリウム緩
衝液、PH7.0を0.2ml加えた。対照として、(1)0.1mg
のBKを加えたもの、(2)DHFR−BKの代わりに
B.subtilisのDHFRを用いたもの、(3)ウサギ抗
BK抗体を加えないもの、及び(4)ヤギ抗ウサギガ
ンマグロブリンを加えないもの、同様にして調製
し、DHFR酵素活性を測定した。その結果、対
照として調製した(2)〜(4)のサンプル中には、有意
なDHFR活性が認められなかつたのに対して、
完全系では加えたDHFR−BKの約0.5〜２％の酵
素活性が認められて、また、対照として用いた(1)
のサンプルではその約10分の１（加えたDHFR−
BKの約0.05〜0.2％）の酵素活性が認められた。
を0.1ml、0.15M NaC1、0.1％ ウシ血清アルブ
ミン、及び0.1％アジ化ナトリウムを含むリン酸
ナトリウム緩衝液、PH7.0（BSAPEと称する。）を
0.1ml、及びBSAPBで1000倍希釈したDHFR−
BKを0.1ml（10.3ミリユニツト、50.1ngのDHFR
−BKを含む）を混合し、30°で１時間反応させ、
次に、BSAPBで300倍希釈したウサギ血清を0.1
ml及びBSAPBで300倍希釈したヤギ抗ウサギガ
ンマグロブリンを0.1mlを加えてさらに30℃で１
時間反応させた。生じた沈殿を12000rpmの遠心
分離により集め、さらに、BASPBで３回沈殿を
洗浄した。得られた沈殿に、0.02mlの0.005規定
の塩酸を加えて可溶化し、さらに、10ｍＭのジチ
オトレイトールを含む0.5M リン酸カリウム緩
衝液、PH7.0を0.2ml加えた。対照として、(1)0.1mg
のBKを加えたもの、(2)DHFR−BKの代わりに
B.subtilisのDHFRを用いたもの、(3)ウサギ抗
BK抗体を加えないもの、及び(4)ヤギ抗ウサギガ
ンマグロブリンを加えないもの、同様にして調製
し、DHFR酵素活性を測定した。その結果、対
照として調製した(2)〜(4)のサンプル中には、有意
なDHFR活性が認められなかつたのに対して、
完全系では加えたDHFR−BKの約0.5〜２％の酵
素活性が認められて、また、対照として用いた(1)
のサンプルではその約10分の１（加えたDHFR−
BKの約0.05〜0.2％）の酵素活性が認められた。
この結果は、DHFR−BK融合タンパクは、
BKに対する抗体と反応し、化学合成したBKに
よつて抗原−抗体反応が競争的に阻害されること
を示している。
BKに対する抗体と反応し、化学合成したBKに
よつて抗原−抗体反応が競争的に阻害されること
を示している。
実施例 ３
DHFR−BK融合タンパクのアミノ酸配列
既に、本発明者らはDHFR−BK融合タンパク
遺伝子を含有する組換えプラスミドpBLAK1の
全塩基配列を明らかにしている（特開昭63−
245679号公報）。得られた塩基配列よりDHFR−
BK融合蛋白を暗号化する部分を取り出し、それ
をトリプレツトコドン表を用いてアミノ酸に翻訳
した。その結果、第１図に示す結果が得られた。
第１図は、DHFR−BK融合タンパクを暗号化す
る部分のDNA配列及びそれに対応するアミノ酸
配列を示している。この結果、(1)DHFR−BK融
合タンパクは、172個のアミノ酸より構成され、
融合タンパクのアミノ末端側から162番目までは、
B.subtilisのDHFRのアミノ酸配列と同一であり、
164〜172番目の配例がBKの配列であること。
遺伝子を含有する組換えプラスミドpBLAK1の
全塩基配列を明らかにしている（特開昭63−
245679号公報）。得られた塩基配列よりDHFR−
BK融合蛋白を暗号化する部分を取り出し、それ
をトリプレツトコドン表を用いてアミノ酸に翻訳
した。その結果、第１図に示す結果が得られた。
第１図は、DHFR−BK融合タンパクを暗号化す
る部分のDNA配列及びそれに対応するアミノ酸
配列を示している。この結果、(1)DHFR−BK融
合タンパクは、172個のアミノ酸より構成され、
融合タンパクのアミノ末端側から162番目までは、
B.subtilisのDHFRのアミノ酸配列と同一であり、
164〜172番目の配例がBKの配列であること。
(2)163番目のアミノ酸はMetであり、ブロムシ
アンで融合タンパクを処理することによりBKを
切り出すことが可能な構造であること、(3)融合タ
ンパクの分子量は19801であること、が明らかと
なつた。
アンで融合タンパクを処理することによりBKを
切り出すことが可能な構造であること、(3)融合タ
ンパクの分子量は19801であること、が明らかと
なつた。
また、精製したDHFR活性を有するタンパク
のカルボキシ末端側のアミノ酸配列をカルボキシ
ペプチダーゼ法を用いて検討したところ、−Phe
−Ser−Pro−Phe−Arg（カルボキシ末端）であ
ることが判明した。この配列は、BKのカルボキ
シ末端側配列と完全に一致している。以上の結果
は、DHFR−BK融合タンパクが、確かにBKを
含んでいることを示している。
のカルボキシ末端側のアミノ酸配列をカルボキシ
ペプチダーゼ法を用いて検討したところ、−Phe
−Ser−Pro−Phe−Arg（カルボキシ末端）であ
ることが判明した。この配列は、BKのカルボキ
シ末端側配列と完全に一致している。以上の結果
は、DHFR−BK融合タンパクが、確かにBKを
含んでいることを示している。
発明の効果
上記のように、DHFR−BK融合タンパクは
DHFR酵素活性を示し、精製を容易に行うこと
ができる。それを利用したBKの生産に有益であ
る。
DHFR酵素活性を示し、精製を容易に行うこと
ができる。それを利用したBKの生産に有益であ
る。
第１図は、pBLAK1中に存在するDHFR−BK
融合タンパクを暗号化する部分の塩基配列及びタ
ンパクのアミノ酸配列を示す図である。図中符号
は、核酸塩基及びアミノ酸を表わし、Ａはアデニ
ン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニンを、Ｔはチミン
を、A1aはアラニンを、Argはアルギニンを、
Asnはアスパラギンを、Aspはアスパラギン酸
を、Cysはシステインを、Glnはグルタミンを、
Glnはグルタミンを、Gluはグルタミン酸を、Gly
はグリシンを、Hisはヒスチジンを、Ileはイソロ
イシンを、Leuはロイシンを、Lysはリジンを、
Metはメチオニンを、Pheはフエニルアラニン
を、Proはプロリンを、Serはセリンを、Thrは
トレオニンを、Trpはトリプトフアンを、Tyrは
チロシンを、Valはバリンを示している。図中番
号は、一番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号
化するATGコドンの“Ａ”を１番として数えた
番号を示している。
融合タンパクを暗号化する部分の塩基配列及びタ
ンパクのアミノ酸配列を示す図である。図中符号
は、核酸塩基及びアミノ酸を表わし、Ａはアデニ
ン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニンを、Ｔはチミン
を、A1aはアラニンを、Argはアルギニンを、
Asnはアスパラギンを、Aspはアスパラギン酸
を、Cysはシステインを、Glnはグルタミンを、
Glnはグルタミンを、Gluはグルタミン酸を、Gly
はグリシンを、Hisはヒスチジンを、Ileはイソロ
イシンを、Leuはロイシンを、Lysはリジンを、
Metはメチオニンを、Pheはフエニルアラニン
を、Proはプロリンを、Serはセリンを、Thrは
トレオニンを、Trpはトリプトフアンを、Tyrは
チロシンを、Valはバリンを示している。図中番
号は、一番目のアミノ酸であるメチオニンを暗号
化するATGコドンの“Ａ”を１番として数えた
番号を示している。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 組換えプラスミドpBLAK1を含有するE.coli
C600株が生産し、下記に示すアミノ酸配列を有
するジヒドロ葉酸還元酵素−ブラジキニン融合タ
ンパク。 【表】 【表】 ２ 組換えプラスミドpBLAK1を含有するE.coli
C600株を培養し、培養菌体の無細胞抽出液から、
ジヒドロ葉酸還元酵素活性を目安にして、イオン
交換カラムクロマトグラフイー及びそれに引き続
くゲルろ過カラムクロマトグラフイーを用いて精
製することを特徴とするジヒドロ葉酸還元酵素−
ブラジキニン融合タンパクの製造分離精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8540687A JPS6438099A (en) | 1987-04-07 | 1987-04-07 | Fused protein or dihydrofolate reductase and bradykinin |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8540687A JPS6438099A (en) | 1987-04-07 | 1987-04-07 | Fused protein or dihydrofolate reductase and bradykinin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6438099A JPS6438099A (en) | 1989-02-08 |
| JPH0354560B2 true JPH0354560B2 (ja) | 1991-08-20 |
Family
ID=13857912
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8540687A Granted JPS6438099A (en) | 1987-04-07 | 1987-04-07 | Fused protein or dihydrofolate reductase and bradykinin |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6438099A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5270181A (en) * | 1991-02-06 | 1993-12-14 | Genetics Institute, Inc. | Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules |
-
1987
- 1987-04-07 JP JP8540687A patent/JPS6438099A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6438099A (en) | 1989-02-08 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |