JPH0370480B2 - - Google Patents
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- JPH0370480B2 JPH0370480B2 JP61249259A JP24925986A JPH0370480B2 JP H0370480 B2 JPH0370480 B2 JP H0370480B2 JP 61249259 A JP61249259 A JP 61249259A JP 24925986 A JP24925986 A JP 24925986A JP H0370480 B2 JPH0370480 B2 JP H0370480B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fusion protein
- lek
- dhfr
- leucine enkephalin
- leucine
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- Expired - Lifetime
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
- C12N9/0028—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with NAD or NADP as acceptor (1.5.1)
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、ペプチドホルモンの一種であるロイ
シンエンケフアリン（Ｌ−チロシル（Tyr）−グ
リシル（Gly）−グリシル（Gly）−Ｌ−フエニル
アラニル（Phe）−Ｌ−ロイシン（Leu）のアミノ
酸配列よりなるペンタペプタイド）の製造方法に
関するものである。本発明のロイシンエンケフア
リンの製造方法の産業上の利用分野としては、医
薬品工業等の分野に好適である。
シンエンケフアリン（Ｌ−チロシル（Tyr）−グ
リシル（Gly）−グリシル（Gly）−Ｌ−フエニル
アラニル（Phe）−Ｌ−ロイシン（Leu）のアミノ
酸配列よりなるペンタペプタイド）の製造方法に
関するものである。本発明のロイシンエンケフア
リンの製造方法の産業上の利用分野としては、医
薬品工業等の分野に好適である。
従来の技術
ロイシンエンケフアリンは、モルヒネ様鎮痛作
用を示す内因性ペプチドとして知られ、習慣性の
ない鎮痛剤または麻酔薬としての利用が期待され
る興味深いポリペプチドである。本発明の技術的
背景としては、いわゆる遺伝子操作技術がある。
遺伝子操作技術を利用したロイシンエンケフアリ
ンの製造方法は、これまで報告がなく、本発明は
全く新規な方法である。ロイシンエンケフアリン
は５個のアミノ酸よりなるペプチドであることか
ら、これに対応する遺伝子を化学合成し、これを
発現ベクターに導入し組換えプラスミドを作成
し、大腸菌等の宿主に発現生産させることが容易
にできるものと考えられる。しかしながら、短い
ペプチド等は、大腸菌等の宿主自身のタンパク分
解酵素により速やかに分解されることから、遺伝
子の発現効率を向上させても宿主内に蓄積させる
ことができない。このことを避けるために、宿主
内で安定に生産されるタンパクとの融合タンパク
として発現させることが行われる。この際、生産
された融合タンパクはもとのタンパクの生理活性
を失つてしまうことから分離精製等の上で問題が
あつた。既に、本発明者らはこの問題を解消すべ
く研究を行い、ジヒドロ葉酸還元酵素−ロイシン
エンケフアリン（以下、DHFR−LEKと略す。）
融合タンパク遺伝子を有する組換えプラスミド
pBSFOLEK1を構築し、これをE.coli宿主に導入
しその発現に成功している（特開昭63−87981号
公報参照）。また、プラスミドpBSFOLEK1中
は、E.coli C600株に導入されて安定状態に保た
れ、pBSFOLEK1を含有するE.coli C600株は微
工研にFERM Ｐ−8969として寄託されている。
用を示す内因性ペプチドとして知られ、習慣性の
ない鎮痛剤または麻酔薬としての利用が期待され
る興味深いポリペプチドである。本発明の技術的
背景としては、いわゆる遺伝子操作技術がある。
遺伝子操作技術を利用したロイシンエンケフアリ
ンの製造方法は、これまで報告がなく、本発明は
全く新規な方法である。ロイシンエンケフアリン
は５個のアミノ酸よりなるペプチドであることか
ら、これに対応する遺伝子を化学合成し、これを
発現ベクターに導入し組換えプラスミドを作成
し、大腸菌等の宿主に発現生産させることが容易
にできるものと考えられる。しかしながら、短い
ペプチド等は、大腸菌等の宿主自身のタンパク分
解酵素により速やかに分解されることから、遺伝
子の発現効率を向上させても宿主内に蓄積させる
ことができない。このことを避けるために、宿主
内で安定に生産されるタンパクとの融合タンパク
として発現させることが行われる。この際、生産
された融合タンパクはもとのタンパクの生理活性
を失つてしまうことから分離精製等の上で問題が
あつた。既に、本発明者らはこの問題を解消すべ
く研究を行い、ジヒドロ葉酸還元酵素−ロイシン
エンケフアリン（以下、DHFR−LEKと略す。）
融合タンパク遺伝子を有する組換えプラスミド
pBSFOLEK1を構築し、これをE.coli宿主に導入
しその発現に成功している（特開昭63−87981号
公報参照）。また、プラスミドpBSFOLEK1中
は、E.coli C600株に導入されて安定状態に保た
れ、pBSFOLEK1を含有するE.coli C600株は微
工研にFERM Ｐ−8969として寄託されている。
問題点及び発明の目的
しかしながら、プラスミドpBSFOLEK1を含
有するE.coliは本発明者らが開発したものであ
り、当該菌体を用いるロイシンエンケフアリンの
製造方法に関しては全く未知であり、このことが
問題であつた。本発明者は、プラスミド
pBSFOLEK1を含有するE.coliを用いることによ
り、ロイシンエンケフアリンを効率的に製造する
ことを目的として、鋭意研究を行い、プラスミド
pBSFOLEK1を含有するE.coliからまずDHFR−
LEK融合タンパクを分離精製し、次いで、精製
して得られたDHFR−LEK融合タンパクをブロ
ムシアンで処理し、高速液体クロマトグラフイー
によりロイシンエンケフアリンを容易に分離精製
できることを明らかにし本発明を完成させた。
有するE.coliは本発明者らが開発したものであ
り、当該菌体を用いるロイシンエンケフアリンの
製造方法に関しては全く未知であり、このことが
問題であつた。本発明者は、プラスミド
pBSFOLEK1を含有するE.coliを用いることによ
り、ロイシンエンケフアリンを効率的に製造する
ことを目的として、鋭意研究を行い、プラスミド
pBSFOLEK1を含有するE.coliからまずDHFR−
LEK融合タンパクを分離精製し、次いで、精製
して得られたDHFR−LEK融合タンパクをブロ
ムシアンで処理し、高速液体クロマトグラフイー
によりロイシンエンケフアリンを容易に分離精製
できることを明らかにし本発明を完成させた。
発明の構成
本発明に係わるDHFR−LEK融合タンパクは、
第１図にに示されるように168個のアミノ酸より
構成される。融合タンパクのアミノ末端側から
162番目までは、B.subtilisのジヒドロ葉酸還元酵
素の１〜162番目までのアミノ酸配列と同一であ
り、164〜168番目の配列がロイシンエンケフアリ
ンの配列である。163番目のアミノ酸はメチオニ
ン（Met）であり、ブロムシアンで融合タンパク
を処理することによりロイシンエンケフアリンを
切り出すことが可能な構造である。融合タンパク
の分子量は19296である。第１図には、DHFR−
LEK融合タンパクを暗号化するDNA配列も記述
している。このDNA配列よりアミノ酸配列を決
定することができた。
第１図にに示されるように168個のアミノ酸より
構成される。融合タンパクのアミノ末端側から
162番目までは、B.subtilisのジヒドロ葉酸還元酵
素の１〜162番目までのアミノ酸配列と同一であ
り、164〜168番目の配列がロイシンエンケフアリ
ンの配列である。163番目のアミノ酸はメチオニ
ン（Met）であり、ブロムシアンで融合タンパク
を処理することによりロイシンエンケフアリンを
切り出すことが可能な構造である。融合タンパク
の分子量は19296である。第１図には、DHFR−
LEK融合タンパクを暗号化するDNA配列も記述
している。このDNA配列よりアミノ酸配列を決
定することができた。
DHFR−LEK融合タンパクは、pBSFOLEK1
を含有するE.coli C600の細胞中に生産される。
DHFR−LEK融合タンパクは、pBSFOLEK1を
含有するE.coli C600をYT＋Ap培地（培地１
中に５ｇのNaCl，８ｇのバクトトリプトン、５
ｇのイーストエキス、及び50mgのアンピシリンナ
トリウムを含む培地）で37℃で培養し、対数増殖
期の終わりもしくは定常期に菌体を集め、これを
破砕し上清（無細胞抽出液）を得て、この上清を
イオン交換カラムクロマトグラフイー及びそれに
引き続くゲルろ過クロマトグラフイーにかけるこ
とにより高度に精製することができる。これらカ
ラムクロマトグラフイーによる分離の際、溶出液
を各フラクシヨンに分け、目的のDHFR−LEK
融合タンパクが何処のフラクシヨンに溶出されて
くるかを調べなければならないが、目的の
DHFR−LEK融合タンパクがジヒドロ葉酸還元
酵素活性を有することから、この酵素活性を測定
することによつて溶出位置を知ることができる。
ジヒドロ葉酸還元酵素活性は、0.05mMのジヒド
ロ葉酸、0.06mMのNADPH（還元型ニコチンア
ミドジヌクレオチドホスフエート）、12mMの２
−メルカプトエタノール、50mMリン酸カリウム
緩衝液、PH7.0を含む反応液に酵素を加えて、37
℃で酵素反応に伴つて減少するジヒドロ葉酸と
NADPHを、340nmの吸光度の減少の時間変化を
測定することによつて行うことができる。上記の
精製過程によりDHFR−LEK融合タンパクを均
一に精製することができる。
を含有するE.coli C600の細胞中に生産される。
DHFR−LEK融合タンパクは、pBSFOLEK1を
含有するE.coli C600をYT＋Ap培地（培地１
中に５ｇのNaCl，８ｇのバクトトリプトン、５
ｇのイーストエキス、及び50mgのアンピシリンナ
トリウムを含む培地）で37℃で培養し、対数増殖
期の終わりもしくは定常期に菌体を集め、これを
破砕し上清（無細胞抽出液）を得て、この上清を
イオン交換カラムクロマトグラフイー及びそれに
引き続くゲルろ過クロマトグラフイーにかけるこ
とにより高度に精製することができる。これらカ
ラムクロマトグラフイーによる分離の際、溶出液
を各フラクシヨンに分け、目的のDHFR−LEK
融合タンパクが何処のフラクシヨンに溶出されて
くるかを調べなければならないが、目的の
DHFR−LEK融合タンパクがジヒドロ葉酸還元
酵素活性を有することから、この酵素活性を測定
することによつて溶出位置を知ることができる。
ジヒドロ葉酸還元酵素活性は、0.05mMのジヒド
ロ葉酸、0.06mMのNADPH（還元型ニコチンア
ミドジヌクレオチドホスフエート）、12mMの２
−メルカプトエタノール、50mMリン酸カリウム
緩衝液、PH7.0を含む反応液に酵素を加えて、37
℃で酵素反応に伴つて減少するジヒドロ葉酸と
NADPHを、340nmの吸光度の減少の時間変化を
測定することによつて行うことができる。上記の
精製過程によりDHFR−LEK融合タンパクを均
一に精製することができる。
精製したDHFR−LEK融合タンパクを凍結乾
燥し、これを１〜10mgタンパク／mlとなるように
70％蟻酸を加え、溶かした後、タンパクの約20倍
量の結晶ブロムシアンを加え密栓し、室温（実施
例では37℃）で24時間反応させる。反応液を凍結
乾燥し過剰の試薬を除く。乾燥試料を１〜10mgタ
ンパク／mlとなるように70％蟻酸に溶かす。溶か
した試料を逆相高速液体クロマトグラフイー装置
（島津LC−6A）、を用いて、ヌクレオシル5C18カ
ラム（４×150mm）にかけ、17.5％アセトニトリ
ルを含む0.2Mリン酸トリエチルアンモニウム緩
衝液（PH3.0）で１ml／minの流速で溶出し、分
離することができる。溶出物は220nmにおける吸
光度測定することにより検出することができ、こ
の条件においてロイシンエンケフアリンは試料注
入10分後に単一なピークで溶出される。ロイシン
エンケフアリンを融合していないもとのジヒドロ
葉酸還元酵素を同様の処理をして、上記逆相高速
液体クロマトグラフイーで分析したところロイシ
ンエンケフアリンの溶出位置には何等の溶出物も
検出されない。本発明の実施例では、31の培地か
ら湿重量約13ｇの菌体が得られ、この菌体（計算
上約28.6mgのDHFR−LEK融合タンパク、約0.83
mgのロイシンエンケフアリンを含む）から約4.8
mgのDHFR−LEK融合タンパク（収率16.8％）
を精製して得ることができ、4.8mgの精製DHFR
−LEK融合タンパクをブロムシアンで分解し、
これを逆相高速液体クロマトグラフイーで精製す
ることにより約0.045mgのロイシンエンケフアリ
ン（収率5.4％）を分離することができた。
燥し、これを１〜10mgタンパク／mlとなるように
70％蟻酸を加え、溶かした後、タンパクの約20倍
量の結晶ブロムシアンを加え密栓し、室温（実施
例では37℃）で24時間反応させる。反応液を凍結
乾燥し過剰の試薬を除く。乾燥試料を１〜10mgタ
ンパク／mlとなるように70％蟻酸に溶かす。溶か
した試料を逆相高速液体クロマトグラフイー装置
（島津LC−6A）、を用いて、ヌクレオシル5C18カ
ラム（４×150mm）にかけ、17.5％アセトニトリ
ルを含む0.2Mリン酸トリエチルアンモニウム緩
衝液（PH3.0）で１ml／minの流速で溶出し、分
離することができる。溶出物は220nmにおける吸
光度測定することにより検出することができ、こ
の条件においてロイシンエンケフアリンは試料注
入10分後に単一なピークで溶出される。ロイシン
エンケフアリンを融合していないもとのジヒドロ
葉酸還元酵素を同様の処理をして、上記逆相高速
液体クロマトグラフイーで分析したところロイシ
ンエンケフアリンの溶出位置には何等の溶出物も
検出されない。本発明の実施例では、31の培地か
ら湿重量約13ｇの菌体が得られ、この菌体（計算
上約28.6mgのDHFR−LEK融合タンパク、約0.83
mgのロイシンエンケフアリンを含む）から約4.8
mgのDHFR−LEK融合タンパク（収率16.8％）
を精製して得ることができ、4.8mgの精製DHFR
−LEK融合タンパクをブロムシアンで分解し、
これを逆相高速液体クロマトグラフイーで精製す
ることにより約0.045mgのロイシンエンケフアリ
ン（収率5.4％）を分離することができた。
本発明方法で用いられるプラスミド
pBSFOLEK1は、第２図に示すDNA配列をもつ
もので、その675〜681塩基の所に制限酵素EcoRl
の認識切断部位が存在する。
pBSFOLEK1は、第２図に示すDNA配列をもつ
もので、その675〜681塩基の所に制限酵素EcoRl
の認識切断部位が存在する。
次に本発明の実施例を示す。
実施例
プラスミドpBSFOLEK1を含有するE.coli
C600株からのDHFR−LEK融合タンパクの精製
及びタンパクの性質。
C600株からのDHFR−LEK融合タンパクの精製
及びタンパクの性質。
プラスミドpBSFOLEK1を含有するE.coli
C600株（FEPM Ｐ−8969として微工研に寄託）
を３の50mg／のアンピシリンナトリウムを含
む栄養培地（１中に、５ｇのNaCl、８ｇのバ
クトペプトン、５ｇのイーストエキスを含む液体
培地、PH7.4）中で37℃で一晩培養後、菌体を遠
心分離により集めた。湿重量約13ｇの菌体が得ら
れた。菌体を20mlの0.1mMのジチオトレイトー
ル（DTT）及び0.1mMのエチレンジアミン４酢
酸２ナトリウム（EDTA）を含む10mMリン酸カ
リウム緩衝液PH7.0に懸濁し、超音波破砕により
細胞を破砕した後、20000回転／分、１時間の遠
心分離により上清25mlを得た。得られた上清のジ
ヒドロ葉酸還元酵素活性を測定したところ、144
ユニツト／ml（全活性3600ユニツト）という値で
あつた。上清を、DEAE−トヨパール650Mカラ
ム（25cm ｘ 150cm、約75cm）に吸着させ、０
から100mMのKCl濃度勾配をかけ溶出した。約
１mlずつフラクシヨンを集め、ジヒドロ葉酸還元
酵素活性を測定し、酵素活性を有する画分を集め
た。25mlの酵素液が得られた（回収活性1837ユニ
ツト、収率51％）。これをアミコン限外ろ過装置
を用いて約１mlにまで濃縮し、トヨパールHW55
カラムクロマトグラフイーにより分画した。約１
mlずつフラクシヨンを集め、ジヒドロ葉酸還元酵
素活性を測定し、酵素活性のピーク画分を集めた
（約3.7ml、回収活性605ユニツト、収率16.8％、
回収タンパク4.8mg）。得られた酵素タンパクを
SDS電気泳動法により分析したところ、均一であ
り、ラクトアルブミン、トリプシンインヒビタ
ー、トリプシノーゲン、カーボニツクアンヒドラ
ーゼ、グリセルアルデヒド−３リン酸デヒドロゲ
ナーゼ、卵アルブミン、及び牛血清アルブミンを
分子量マーカーとして精製DHFR−LEK融合タ
ンパクの分子量を推定したところ19000であり、
塩基配列から予想される分子量19296と一致した
値であつた。
C600株（FEPM Ｐ−8969として微工研に寄託）
を３の50mg／のアンピシリンナトリウムを含
む栄養培地（１中に、５ｇのNaCl、８ｇのバ
クトペプトン、５ｇのイーストエキスを含む液体
培地、PH7.4）中で37℃で一晩培養後、菌体を遠
心分離により集めた。湿重量約13ｇの菌体が得ら
れた。菌体を20mlの0.1mMのジチオトレイトー
ル（DTT）及び0.1mMのエチレンジアミン４酢
酸２ナトリウム（EDTA）を含む10mMリン酸カ
リウム緩衝液PH7.0に懸濁し、超音波破砕により
細胞を破砕した後、20000回転／分、１時間の遠
心分離により上清25mlを得た。得られた上清のジ
ヒドロ葉酸還元酵素活性を測定したところ、144
ユニツト／ml（全活性3600ユニツト）という値で
あつた。上清を、DEAE−トヨパール650Mカラ
ム（25cm ｘ 150cm、約75cm）に吸着させ、０
から100mMのKCl濃度勾配をかけ溶出した。約
１mlずつフラクシヨンを集め、ジヒドロ葉酸還元
酵素活性を測定し、酵素活性を有する画分を集め
た。25mlの酵素液が得られた（回収活性1837ユニ
ツト、収率51％）。これをアミコン限外ろ過装置
を用いて約１mlにまで濃縮し、トヨパールHW55
カラムクロマトグラフイーにより分画した。約１
mlずつフラクシヨンを集め、ジヒドロ葉酸還元酵
素活性を測定し、酵素活性のピーク画分を集めた
（約3.7ml、回収活性605ユニツト、収率16.8％、
回収タンパク4.8mg）。得られた酵素タンパクを
SDS電気泳動法により分析したところ、均一であ
り、ラクトアルブミン、トリプシンインヒビタ
ー、トリプシノーゲン、カーボニツクアンヒドラ
ーゼ、グリセルアルデヒド−３リン酸デヒドロゲ
ナーゼ、卵アルブミン、及び牛血清アルブミンを
分子量マーカーとして精製DHFR−LEK融合タ
ンパクの分子量を推定したところ19000であり、
塩基配列から予想される分子量19296と一致した
値であつた。
精製したDHFR−LEK融合タンパクをエンザ
イムイムノアツセイにより測定したところ、ロイ
シンエンケフアリンに対する抗体と反応し、化学
合成したロイシンエンケフアリンによつて抗原−
抗体反応が競争的に阻害されることが明らかとな
つた。
イムイムノアツセイにより測定したところ、ロイ
シンエンケフアリンに対する抗体と反応し、化学
合成したロイシンエンケフアリンによつて抗原−
抗体反応が競争的に阻害されることが明らかとな
つた。
精製したDHFR−LEK融合タンパク約4.8mgを
凍結乾燥した後、2.0mlの70％蟻酸に溶かした。
これに100mgの結晶ブロムシアンを加え密封して
37℃で、24時間振とうし反応させた。反応液を凍
結乾燥し、これを1.45mlの70％蟻酸に溶解した。
この溶液を0.05mlとり、逆相高速液体クロマトグ
ラフイー装置（島津LC−6A）を用い、ヌクレオ
シル5C18カラム（４ ｘ 150mm）にかけ、17.5
％アセトニトリルを含む0.2Mリン酸トリエチル
アンモニウム緩衝液（PH3.0）で１ml／minの流
速で溶出し、溶出物を220nmにおける吸光度を測
定することにより行つたところ、第２図に示すよ
うな溶出曲線が得られた。化学合成したロイシン
エンケフアリンを同様に分析したところ、約10分
の所に溶出することが示された。さらに、ブロム
シアン処理したDHFR−LEK融合タンパクと化
学合成したロイシンエンケフアリンを混合して、
同様に逆相高速液体クロマトグラフイーで分析し
たところ、第３図と同様の溶出曲線で且つ約10分
の所の溶出ピークが高くなつた溶出曲線が得られ
た。また、ロイシンエンケフアリンを融合してい
ないものとのジヒドロ葉酸還元酵素を同様の処理
をして、上記逆相高速液体クロマトグラフイーで
分析したところロイシンエンケフアリンの溶出位
置（約10分の位置）には溶出物ピークが現われな
かつた。以上の結果、ブロムシアン処理した
DHFR−LEK融合タンパク溶液中に、ロイシン
エンケフアリンが含まれていることが示された。
凍結乾燥した後、2.0mlの70％蟻酸に溶かした。
これに100mgの結晶ブロムシアンを加え密封して
37℃で、24時間振とうし反応させた。反応液を凍
結乾燥し、これを1.45mlの70％蟻酸に溶解した。
この溶液を0.05mlとり、逆相高速液体クロマトグ
ラフイー装置（島津LC−6A）を用い、ヌクレオ
シル5C18カラム（４ ｘ 150mm）にかけ、17.5
％アセトニトリルを含む0.2Mリン酸トリエチル
アンモニウム緩衝液（PH3.0）で１ml／minの流
速で溶出し、溶出物を220nmにおける吸光度を測
定することにより行つたところ、第２図に示すよ
うな溶出曲線が得られた。化学合成したロイシン
エンケフアリンを同様に分析したところ、約10分
の所に溶出することが示された。さらに、ブロム
シアン処理したDHFR−LEK融合タンパクと化
学合成したロイシンエンケフアリンを混合して、
同様に逆相高速液体クロマトグラフイーで分析し
たところ、第３図と同様の溶出曲線で且つ約10分
の所の溶出ピークが高くなつた溶出曲線が得られ
た。また、ロイシンエンケフアリンを融合してい
ないものとのジヒドロ葉酸還元酵素を同様の処理
をして、上記逆相高速液体クロマトグラフイーで
分析したところロイシンエンケフアリンの溶出位
置（約10分の位置）には溶出物ピークが現われな
かつた。以上の結果、ブロムシアン処理した
DHFR−LEK融合タンパク溶液中に、ロイシン
エンケフアリンが含まれていることが示された。
ブロムシアン処理したDHFR−LEK融合タン
パク溶液中のロイシンエンケフアリン含量を測定
するために、既知の量（それぞれ0.167μg、
0.33μg、1.67μg、2.4μg）の化学合成したロイシ
ンエンケフアリンを量を変えて上記逆相高速液体
クロマトグラフイーにかけ、約10分の位置の溶出
物ピークの高さを測定し、検量線を作成した。検
量線を用いて、第３図のロイシンエンケフアリン
の溶出位置（約10分の位置）のピークの高さか
ら、ロイシンエンケフアリン含量を測定したとこ
ろ、0.05mlの試料あたり1.55μgのロイシンエンケ
フアリンが含まれていることが明らかとなつた。
パク溶液中のロイシンエンケフアリン含量を測定
するために、既知の量（それぞれ0.167μg、
0.33μg、1.67μg、2.4μg）の化学合成したロイシ
ンエンケフアリンを量を変えて上記逆相高速液体
クロマトグラフイーにかけ、約10分の位置の溶出
物ピークの高さを測定し、検量線を作成した。検
量線を用いて、第３図のロイシンエンケフアリン
の溶出位置（約10分の位置）のピークの高さか
ら、ロイシンエンケフアリン含量を測定したとこ
ろ、0.05mlの試料あたり1.55μgのロイシンエンケ
フアリンが含まれていることが明らかとなつた。
この結果より、計算すると、最終的に得られた
ブロムシアン処理したDHFR−LEK融合タンパ
ク溶液が1.45mlであることから、この試料中に
0.045mgのロイシンエンケフアリンが含まれてい
ることが推定された。DHFR−LEK融合タンパ
クの精製過程における収率が16.8％であり、収量
が4.8mgであることから、出発E.coli菌体、湿重量
13ｇ中にはDHFR−LEK融合タンパクが約28.6
mg含まれていた計算になる。DHFR−LEK融合
タンパクの分子量が約19000、ロイシンエンケフ
アリンの分子量が約550であることから、E.coli
菌体、湿重量13ｇ中には、ロイシンエンケフアリ
ンに換算して約0.83mgが含まれている計算にな
る。この値を利用すると、最終的に0.045mgがロ
イシンエンケフアリンとして得られたことから、
収率を5.4％と推定することができた。
ブロムシアン処理したDHFR−LEK融合タンパ
ク溶液が1.45mlであることから、この試料中に
0.045mgのロイシンエンケフアリンが含まれてい
ることが推定された。DHFR−LEK融合タンパ
クの精製過程における収率が16.8％であり、収量
が4.8mgであることから、出発E.coli菌体、湿重量
13ｇ中にはDHFR−LEK融合タンパクが約28.6
mg含まれていた計算になる。DHFR−LEK融合
タンパクの分子量が約19000、ロイシンエンケフ
アリンの分子量が約550であることから、E.coli
菌体、湿重量13ｇ中には、ロイシンエンケフアリ
ンに換算して約0.83mgが含まれている計算にな
る。この値を利用すると、最終的に0.045mgがロ
イシンエンケフアリンとして得られたことから、
収率を5.4％と推定することができた。
第１図は、DHFR−LEK融合タンパクを暗号
化する部分の塩基配列及びタンパクのアミノ酸配
列を示す図、第２図は、pBSFOLEK1の全塩基
配列の、２本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列だ
けを5′末端から３未端の方向に示す図である。図
中符号は、核酸塩基及びアミノ酸を表わし、Ａは
アデニンを、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、
Ｔはチミンを、Alaはアラニンを、Argはアルギ
ニンを、Asnはアスパラギンを、Aspはアスパラ
ギン酸を、Cysはシステインを、Glnはグルタミ
ンを、Gluはグルタミン酸を、Glyはグリシンを、
Hisはヒスチジンを、Ileはイソロイシンを、Leu
はロイシンを、Lysはリジンを、Metはメチオニ
ンを、Pheはフエニルアラニンを、Proはプロリ
ンを、Serはセリンを、Thrはトレオニンを、
Trpはトリプトフアンを、Tyrはチロシンを、
Valはバリンを示している。図中番号は、第１図
については１番目のアミノ酸であるメチオニンを
暗号化するATGコドンの“Ａ”を１番として数
えた番号を、また第２図については
pBSFOLEK1に２箇所存在する制限酵素Cla切
断認識部位のうち制限酵素Hind切断部位に近
い方のCla切断認識部位の、ATCGATの最初
の“Ａ”を１番として数えた番号を示している。
第３図は、ブロムシアン処理したDHFR−LEK
融合タンパクの逆相高速液体クロマトグラフイー
での溶出曲線を示す図である。横軸は時間を分単
位で、縦軸は220nm吸光度を相対的値で示してい
る。
化する部分の塩基配列及びタンパクのアミノ酸配
列を示す図、第２図は、pBSFOLEK1の全塩基
配列の、２本鎖DNAのうち片方のDNA鎖配列だ
けを5′末端から３未端の方向に示す図である。図
中符号は、核酸塩基及びアミノ酸を表わし、Ａは
アデニンを、Ｃはシトシンを、Ｇはグアニンを、
Ｔはチミンを、Alaはアラニンを、Argはアルギ
ニンを、Asnはアスパラギンを、Aspはアスパラ
ギン酸を、Cysはシステインを、Glnはグルタミ
ンを、Gluはグルタミン酸を、Glyはグリシンを、
Hisはヒスチジンを、Ileはイソロイシンを、Leu
はロイシンを、Lysはリジンを、Metはメチオニ
ンを、Pheはフエニルアラニンを、Proはプロリ
ンを、Serはセリンを、Thrはトレオニンを、
Trpはトリプトフアンを、Tyrはチロシンを、
Valはバリンを示している。図中番号は、第１図
については１番目のアミノ酸であるメチオニンを
暗号化するATGコドンの“Ａ”を１番として数
えた番号を、また第２図については
pBSFOLEK1に２箇所存在する制限酵素Cla切
断認識部位のうち制限酵素Hind切断部位に近
い方のCla切断認識部位の、ATCGATの最初
の“Ａ”を１番として数えた番号を示している。
第３図は、ブロムシアン処理したDHFR−LEK
融合タンパクの逆相高速液体クロマトグラフイー
での溶出曲線を示す図である。横軸は時間を分単
位で、縦軸は220nm吸光度を相対的値で示してい
る。
Claims (1)
- １ プラスミドpBSFOLEK1を含有するE.coliの
生産するジヒドロ葉酸還元酵素−ロイシンエンケ
フアリン融合タンパクを分離精製し、これをブロ
ムシアン分解法により分解したのちロイシンエン
ケフアリンを分離精製することを特徴とするロイ
シンエンケフアリンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61249259A JPS63102698A (ja) | 1986-10-20 | 1986-10-20 | ロイシンエンケフアリンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61249259A JPS63102698A (ja) | 1986-10-20 | 1986-10-20 | ロイシンエンケフアリンの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63102698A JPS63102698A (ja) | 1988-05-07 |
| JPH0370480B2 true JPH0370480B2 (ja) | 1991-11-07 |
Family
ID=17190300
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61249259A Granted JPS63102698A (ja) | 1986-10-20 | 1986-10-20 | ロイシンエンケフアリンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS63102698A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0653758B2 (ja) * | 1989-03-30 | 1994-07-20 | 工業技術院長 | 新規ジヒドロ葉酸還元酵素一成長ホルモン放出因子誘導体融合タンパク質 |
-
1986
- 1986-10-20 JP JP61249259A patent/JPS63102698A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63102698A (ja) | 1988-05-07 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |