PT94776B

PT94776B - Plasmideos, sua producao e sua utilizacao na obtencao de um activador de plasminogenio

Info

Publication number: PT94776B
Application number: PT94776A
Authority: PT
Inventors: Regina E Brigelius-Flohe; Leopold Flohe; Wolfgang Hillen; Gerd J Steffens; Wolfgang Strassburger; Martin R F Wilhelm
Original assignee: Gruenenthal Gmbh
Priority date: 1989-07-19
Filing date: 1990-07-19
Publication date: 1997-09-30
Also published as: CA2020656C; FI102386B1; NZ234542A; ZA904006B; LV10120A; DD298426A5; AU631662B2; PL166199B1; HUT54211A; HRP920596A2; HU903970D0; IL94529A; JP3236284B2; KR910003105A; CA2020656A1; IL94529A0; ATE131534T1; LTIP776A; HU214243B; NO902720L

Description

MÓRIA DESCRITIVA

Os activadores de plasminogénio desempenham um papel impor tante na terapia de obstruções vasculares provocadas pela fibr ina como, por exemplo, enfarte cardíaco, embolias pulmonares, doença arterial oclusiva das extremidades^etc.. Desde princípios dos anos 50 é sabido que a urina humana contém uma enzima proteolítica que provoca a transformação do plasminogénio na pias mina, isto é, na enzima que provoca a cisão da fibrina tendo?) como resultado polipéptidos solúveis e, consequentementè, a dissolução de obstruções provocadas pela fibrina. Este activador de plasminogénio foi denominado uroquinase, e verificou-se que existem, realmente, várias formas de uroquinase. Todas estas formas são, no entanto, derivadas directamente da mesma molécula precursora, o zimogénio pró-uroquinase, conhecido desde

SG meados dos anos 70. Depois de/ter verificado que esta pró-uroquinase possui uma estrutura de cadeia simples, passou a ser de nominada scu-PA (single ehain urinary plasminogen activator), Este scu-PA consiste em 411 aminoácidos e está glicosado, na sua forma natural no aminoácido 302.

Através de vários trabalhos conhece-se a produção genético-tecnológica da parte de proteína do seu-PA não glicosado, que é denominada rscu-PA” (scu-PA recombinante), sendo, também, chamado livremente Saruplase”. Na aplicação terapêutica do rscu-PA verificou-se que este é superior aos fibrinolíticos tradicionais no que diz respeito á sua eficácia e assimilabili dade (ver Lancet 1989, páginas 863 - 868).

Para a produção do aGtivador de plasminogénio não glinosa do, rscu-PA, utilizam-se procariotas referente ao qual já exi£ tem, também, algumas especificações na- literatura. Os processos de produção do rscu-PA conhecidos até á data, assentam na expressão do gene estrutural do scu-PA, isolado a partir de te eidos humanos. Infelizmente, neste caso, apenas se conseguem taxas de expressão baixas, que não permitem uma produção econó mica do produto desejado em maiores quantidades. Assim, por exemplo, Hibino et al. em Agric. Biol. Chem. 52, 329 - 336 (1988) referem ·., para uma produção de rscu-PA em E.ooli, um

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-3nível de expressão de apenas 2%, em relação ao total de proteí nas das bactérias. Por outro lado, não são referidas de modo detalhado, no pedido de patente europeia 92 182 A2, assim como por Holmes et al. (10), as taxas de expressão conseguidas. Mas tomando por modelo as indicações aí dadas.obteve -se, no entanto, em estirpes diferentes, menos do que 2/ de rscu-PA, em relação à proteína das bactérias.

Chama-se a atenção para o facto de que, como na maior par te dos casos de expressão de proteínas em. bactérias eucarioti^cas 5 também o rscu-PA é obtido na célula como corpo de inclusão desnaturado - que se denominara á partir daqui ^f’proteína precursora’' - o qual deve ser renaturado depois de ser isolado proteico-quimicamente como intermediário, para se obter a estrutura terciária correcta de rscu-PA. 0 produto assim obtido po de, então, para a determinação da quantidade do rscu-PA formada, ser transformado, por exemplo pela adição de plasmina, em uroquinase de cadeia dupla não glicosada (”rtcu-PA”), cuja actividade enzimática/e determinada, serve .= de medida para a quantidade de rscu-PA formada. Evidentemente é, também, possí vel determinar o rendimento em proteína precursora· ou rscu-PA, respectivamente, e assim, consequentemente, também a taxa de expressão, por exemplo por meio de uma avaliação densitomé trica da separação por electroforese em gel da totalidade das proteínas,

Verificou-se então, surpreendentemente, que bactérias transformadas por meio dos plasmideos de acordo com o invento tinham uma taxa de expressão muito mais elevada do que as estirpes hospedeiras idênticas,transformadas com plasmideos de acordo com o nível actual da tecnologia. Os plasmideos de acor do com o invento são, em conformidade com isto, mais apropriados para a obtenção de rscu-PA ou da sua proteína precursora, respectivamente, do que todos os plasmideos conhecidos até à data. Para completar, mencione-se o facto de que é possível obter também o rtcu-PA em escala industrial, de maneira conhecida para fins analíticos, já acima mencionada, através da cisão do rscu-PA, por exemplo por meio de plasmina, depois de o rscu-PA se ter tornado facilmente acessível devido ao presente invento.

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-4Os plasmideos de acordo Gom o invento distinguem-se, além disso, por o seu operao apresentar um promotor regulável, even tualmente sintético, uma sequência Shine-Balgarno que actua co mo um sítio de ligação aos ribossomas, um codão de iniciação, um gene estrutural sintético para o scu-PA, e pelo menos um terminador, a jusante, em relação ao gene estrutural. Be preferência, há dois terminadores sucessivos, que são, particular mente, o terminador trp A e/ou o terminador tet A/orf L de Tn 10, ver Schollmeier et. al. (6).

Ho que diz respeito ao promotor regulável, trata-se, nome adamente, do promotor trp ou do promotor tac.

Ha região de controlo dos plasmideos de acordo com o inven to, a distância entre a sequência Shine-Dalgarno e o codão de iniciação eleva-se a 6 - 12, de preferência 8 - 10, nucleótidos

Ha construção do gene estrutural a introduzir nos plasmíde os de acordo com o invento utilizam-se, de preferência, as sequências de bases que codificam os respectivos aminoácidos, indicadas na seguinte tabela. Mas não é preciso que todas estas características estejam presentes simultaneamente- no gene estru tural.

Aminoácido Tripleto

arginina	GGT
leucina	CTG
valina	GTT
prolina	GGG
glicina	GGT

Por outro lado, convém, na construção do gene estrutural, evitar tanto quanto possível a utilização dos seguintes codões para os respectivos aminoácidos mencionados (não sendo necessá rio, mais uma vez, que estas características estejam presentes simultaneamente para todos os aminoácidos):

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-5codão a evitar

ATA

GTG

CGC

AAG

AGG, AGA; GGG, CGA GGA, GGG aminoácido

Isoleucina valina prolina lisina arginina glicina

Pela escolha, de acordo com o invento, dos codões para os aminoácidos individuais do gene estrutural, assim como pelas caracteristicas da região de controlo, acima mencionadas, impe de-se amplamente a formação de estruturas secundárias estáveis entre o gene estrutural e a região de controlo.

Para a obtenção do gene estrutural’ sintético sintetizam-se, em primeiro lugar, oligonucleótidos, em troços de 40 - 80 bases, de cadeia simples. É conveniente produzi-los, de acor do com o método de fase sólida de Adams et al. (7), por meio de um sintetizador de ADN (modelo Biosear.ch 8600 da empresa New Brunswick Scientific Go. na escala de ljwmol. Neste caso, como sintóes monoméricos utilizam-se, os di-isopropilamino-fosforamidetos protegidos com -cianoetilo, de tipo comercial, dos desoxiribonucleósidos necessários para cada caso individual Após a sua separação do portador, as cadeias ., que_: nos seus ter minais, ainda estão protegidas com tritilo, são dessalinizadas e pré-purifiçadas, e depois, submetidas a uma primeira separação, passando duas vezes por uma coluna de HPLC de fase inversa 0 respectivo produto principal é destritilado e tan como resultado, após mais duas passagens de purificação por HPLG de fase in versa o oligonu^jcleótido desejado, altamente puro, como revela a análise por electroforese em gel (PAGE).

A partir de grupos de 4 a 9 destas cadeias simples são, en tão, obtidos fragmentos de cadeia dupla, com um comprimento de por cerca de 200 nucleótidos,/fosforilação, no terminal 5^f, dos oli gonucleótidos de cadeia simples não terminais, e por têmpera e ligação /.as respectivas cadeias complementares, juntamente com os oligonucleótidos terminais. Depois da ligação, introduzem-se, então, os fragmentos de cadeia dupla formados capazes de

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-6serem cionados em vectores linearizados, apropriados. A manei ra de prooeder depois disto e-expostá 'nos exemplos que se seguem, mais abaixo.

As abreviaturas utilizadas no presente os seguintes significados:

pedido.;;· . têm

Pb

DE 52

EDTA

IPTG

PAGE

PU

SDS

Sequência S.D. Tris-HOl

Tween-80 pares de bases permutador de aniões, da empresa Whatman ácido etilenodiaminotetrafacético isopropil- (i -D-tiogalactopiranósido electroforese em gel de poliacrilamida unidades Ploug dodecilsulfato de sódio sequencia Shine-Dalgarno hidroeloreto de tris-hidroximetilamino metano mono^õHeato'. no de polietilenoxi(20)sorbita

Para construir os plasmideos de acordo com o invento, parte-se, de preferência, do plasmideo de tipo comercial pBR 322 (4363 pb). De preferência, são eliminados, deste plasmideo, a região nic/bom e/ou o gene de resistência à tetraciclina. Nes te caso, não é necessário eliminar, completamente, o gene de resistência á tetraciclina mas é, pelo contrário, suficiente que isto se faça atê ao ponto de o plasmideo já não proporcionar ás estirpes de bactérias com ele transformadas qualquer re sistência á tetraciclina. Através destas medidas (eliminação da região nic/bom e, pelo menos, de uma parte do gene de resis tência á tetraciclina) obtém~se um chamado plasmideo de alta segurança”.

A estratégia preferivel para a construção de um plasmideo de acordo com o invento, partindo do plasmideo pBR 322 (ou de outro dos plasmideos conhecidos que são aqui mencionados), modificado da maneira acima referida, prevê, como passo seguinte, a introdução de um sitio de clonação múltipla, entre os sitios de restrição de Eco RI e Hind III. Este sitio de clonação múltipla (ver a figura 2) apresenta uma sequência fixa de sitios de restrição, sendo as bases que se encontram entre eles esco71 072

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lhidas arbitrariamente, com a excepção da·sequência entre Xba

I e Me I, a qual contém o sítio de ligação aos ribossomas Se (sequência Shine-Dalgarno) do operão/B. subtilis Xyl,5¹-AAGGAG-3’ (4), assim como uma distância fixa entre a sequência S.D. e o codão de iniciação ATG. As bases GAAAT, que seguem a sequência S.B., foram retiradas a partir de (4) e ligadas a CATATG, um sítio de restrição de Me I. Desta forma, a distância entre a sequência S.D. e ATG é de 8 pares? de bases. As distâncias en tre os sítios de restrição individuais e o sítio de clonação · múltipla devem'?: ser, por razões técnicas de clonação, de pelo menos, cerca de 20 nucleótidos, o que facilita?-, a eliminação dos fragmentos intermediários.

Por meio deste sítio de clonação múltipla introduzem-se no plasmídeo sítios de restrição que - convenientemente, depois da colocação de um terminador de transcrição - tornam possível a colocação sucessiva de sequências parciais do gene estrutural de scu-PA, começando, de preferência, a partir do terminal C da proteína desejada, isto, é , a partir do terminal 3’ da cadeia de ADN do gene estrutural a produzir, assim como a colocação, por exemplo de um promotor trp, sintético ou isolado de um outro plasmídeo ou de tipo comercial. A sequência de nucleótidos completa do gene estrutural de scu-PA, assim obtido, é represen tada na figura 15, com indicação dos aminoácidos que correspondem aos codões individuais.

Outros plasmídeos de acordo com o invento podem ser obtidos a partir de um plasmídeo construído como acima descrito, por exemplo, por obtenção do gene estrutural de scu-PA, sintético com todas as unidades de regulação, por meio de cortes feitos por Eco RI e Hind III, e introdução, a seguir, num outro plasmídeo capaz de se multiplicar de maneira autónoma em enterobacteriáceas, particuiarmente em B.coli, plasmídeo esse que foi, para este fim., linearizado e encurtado por meio de cortes com Eco.RI e Hind III. De modo em princípio igual, mas aproveitando os sí tios de restrição de Eco RI e Xba I, é também possível, por exem pio, trocar, num dos plasmídeos de acordo com o invento, o promotor trp pelo promotor tac (e vice-versa).

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-8De modo análogo, é, também, possível partir de outros pias mídeos conhecidos que tenham sítios de restrição . unicos- · de Eco RI e Hind III como, por exemplo, pUO 9, pUC 12, pUG 13, pUC 18, pUG 19, e outros.

Plasmídeos de acordo com o invento, com uma distância pro longada entre a sequência Shine-Dalgarno e o codão de iniciação ATG, podem ser obtidos por cisão com Nde I de um plasmídeo cons truído como acima descrito, no qual, por exemplo, a distância mencionada é de 8 nucleótidos, por preenchimento dos sítios de restrição resultantes, e por ligação, a seguir, dos terminais rombos resultantes, sendo formado um plasmídeo de acordo com o invento, no qual, por exemplo, a distância entre a sequência

S.B. e o codão de' iniciação é de 10 nucleótidos.

Gomo já foi dito, bactérias transformadas com os plasmíde os de acordo com o invento conseguem uma taxa de expressão mui to mais elevada do que as que se podem conseguir com os plasmí deos de acordo com o nível actual da tecnologia. A transforma ção de organismos hospedeiros competentes, apropriados, realiza-se de maneira, em princípio, conhecida. Organismos particularmente apropriados para a expressão dos plasmídeos de acordo com o invento, são estirpes da espécie E.coli e de enterobacteriáceas aparentadas como, por exemplo, estirpes de Pseudomonas, Salmonella, Enterobacter, Klebsiella, ou Seratia.

Organismos hospedeiros preferidos são estirpes de espécie E.coli como, por exemplo, E.coli GRT-1 e, particularmente, estirpes de E.coli do subgrupo K12 como, por exemplo, E.coli K12 JM101 (ATOO 33876), E.coli K12 JM103 (ATOO 39403), E.coli K12 JM105 (DSM 4162), a estirpe de E.coli K12 ATGG 31446, ou também E.coli K12 EH1 (ATCC 33849).

A iniciação da expressão, em sistemas de expressão de E. coli que contêm o promotor tac, pode ser provocada, por exemplo, pela adição de lactose ou pela extracção de glucose, mas. de preferência, pela adição de isopropil-β -D-tiogalactopiranósido. No entanto, no caso de estar presente no plasmídeo o promotor trp, realiza-se a indução, de preferência, com ácido indolaerí lico, indolacrilacético ou indolacrilpropiónico. Naturalmente, é possível utilizar da mesma maneira outros indutores conhecidos,

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Apos a indução, e depois de se ter alcançado uma densidade celular previamente determinada, as células são centrifugadas e o resíduo da centrifugação é transferido, por exemplo, depois um de ser suspenso numa solução salina, para/homogeneizador, no qual se faz romper as células através de diferenças de pressão. Após uma outra centrifugação obtém-se no resíduo a proteína precurso ra do rscu-PA, juntamente oom detritos celulares insolúveis em água,etc.. A proteína precursora é dissolvida por tratamento com uma solução de hidrocloreto de guanidina e, apés uma nova centrifugação, a solução restante é tratada com um sistema redox (contendo, por exemplo, glutationa reduzida e oxidada), pelo que é provocado o desenvolvimento da conformação natural, ^.uer dizer, a formação do rscu-PA desejado. Este encontra-se,então dissolvi do na mistura reaccional podendo ser isolado, puro, por procedimentos de purificação usuais (por exemplo, por cromatografia e liofilização subsequentes).

Para fins analíticos é conveniente proceder-se de maneira a fermentar as estirpes de E.coli transformadas com o plasmídeo a examinar e, depois de a suspensão celular ter alcançado uma densidade óptica previamente determinada, induzir a expressão da proteína precursora de rscu-PA, com um indutor apropriado.

Após a respectiva duração de fermentação, são retiradas partes aliquotas de células e, a seguir, as oélulas assim separadas são rompidas por centrifugação, por meio de lisozima (1 mg de lisozima por ml de tampão Tris-Hcl 50'mM, pH 8,0, EDTA 50 mM, e 15$ de sacarose). 0 homogeneizado das células lisadas é solubilizado em solução de hidrocloreto de guanidina 4 - 5 M e, após uma diluição ate hidrocloreto de guanidina 1,2 M, e adicionando um agente de redução (glutationa, mercaptoetanol ou cisteína, e submetido à reacção derenaturação durante 2-5 horas (ver tam bóm, por exemplo, Winkler et al. em (11) ). 0 rscu-PA de cadeia simples assim obtido ó transformado, pela adição de plasmina, em rtcu-PA de cadeia dupla, cuja actividade se determina depois com o substrato S2444 (piroGlu-Gli-Arg“P“nitroanilida; Kabi Diagnostika, Suécia), o qual só ó cortado por uroquinases activas de cadeia dupla. Esta activação do rscu-PA com plasmina realiza-se

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em tampão Tris 50 mM, cloreto de sódio 12 mM, 0,02 % Tween 80, a um pH de 7,4, a 37^eC. A relação de rscu-PA para plasmina de veria ser cerca de 100 - 1500 para 1, em termos de molaridade, ou cerca de 8 000 - 36 000 para 1, em termos de unidades enzimaticas ensaio de incubação realiza-se em tampão Tris 50 mM, cloreto de sódio 38 mM, a um pH de 8,8, em presença de aprotinina 0,36 y«M (para a inibição da plasmina) e S 2444 0,27 mM, a 37^SC. Conforme o teor em rscu-PA da amostra faz-se parar a reacção após uma incubação de 5 a 60 minutos pela adição de ácido acético a 90 e mede-se a absorvância aos 405 nm. Pro cedendo desta maneira, uma alteração da absorvância de 0,05 por minuto, aos 405 nm, significa, de acordo com as indicações do produtor do substrato S 2444, uma actividade de 25 unidades Ploug/ml de solução de ensaio.

Os rendimentos de rscu-PA que foram obtidos a partir da proteína precursora, obtida com a utilização de diferentes pias mídeos de acordo com o invento, em diferentes bactérias, são re presentados nas figuras 10, 12 e 14.

Como resulta da figura 11, assim como das indicações dos exemplos que seguem mais abaixo - sobretudo a tabela 1 do exem pio 2 - os plasmídeos de acordo com o invento realizam., particularmente em estirpes de E.coli, a formação de proteína precursora de rscu-PA,com uma taxa de expressão de 10 a 25 por cento em peso, de toda a proteína formada. Utilizando os pias míde os de acordo com o invento, a taxa de expressão é portanto, pelo menos, 10 a 15 vezes mais alta do que a que é possível ob ter com plasmídeos conhecidos como, por exemplo pUK 54 trp 207-1.

Ás figuras anexas mostram:

As figuras la e lb: Construção do plasmídeo pBF 158 a par tir do plasmídeo pBR 322, de tipo comercial. Neste caso, são eliminadas, sucessivamente, a região nic/bom e uma grande parte do gene de resistência a tetraciclina.

Figura 2: A sequência de nucleótidos do sítio de clonação múltipla sintético.

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-11Figura 3: Construção do plasmídeo pBF 158-01. É represen tada a introdução do sítio de clonação múltipla sintético no plasmídeo pBF 158, entre os sítios de restrição de Eco RI e Hind III.

Figura 4: Construção do plasmídeo pBP 158-01 T. 0 fragmento de Cia I x Hind III é substituído pelo respectivo fragmento *'T” do plasmídeo pRT 61 (5) , no qual se encontra o termi nador tet A/orf L de Tn 10 (6).

As figuras 5a a 5g: Sequências de nucleotidos dos fragmen tos sintéticos para o gene que codifica scu-PA humano (cuja in trodução num plasmídeo de acordo com o invento, para formação do gene estrutural para o scu-PA» partindo do plasmídeo pBP 158-01 T, é descrita nos exemplos ld a lf e representada nas figuras 6, 7, β 9).

As figuras 6a a 6c: Construção dos plasmídeos pBP 158-02 T a pBP 158-06 T, pela introdução dos fragmentos de oligonucleótidos M 4 a M 8, a partir do terminal C da proteína deseja da (correspondendo ao terminal 3’ da cadeia de ADN), começando com o plasmídeo pBP 158-01 T.

As figuras 7a a 7c: Construção do plasmídeo pBP 158-08 T, através de uma construção auxiliar no plasmídeo pUC 19 (comparar o exemplo le).

Figura 8: Sequência de nucleotidos do promotor trp sintético .

Figura 9: Construção do plasmídeo de expressão para a pro teína precursora do rscu-FA humano, pBF 160. 0 gene estrutural para o scu-PA é representado pela barra preta entre os sítios de restrição de Nde I e Cia I.

Figura 10: Taxas de expressão da proteína precursora do rscu-PA humano (determinadas como actividade de rtcu-PA após renaturação e activação) em diferentes estirpes de E.coli transformadas com o plasmídeo pBF 160(0--0) ou com o plasmídeo pUK 54 trp 207-1 (10) (·-·), sob controlo do promotor trp, em função do tempo, após indução com ácido indolacrílico no instante.0. São indicadas as actividades de rtcu-PA determinadas com o substrato S 2444, em unidades Ploug por ml

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de um meio de fermentação com a densidade óptica igual a 1 aos 578 nm.

Figura 11: Densitograma de uma SDS-PAGE de proteínas obti das a partir de células de E.coli K 12 JM 103 transformadas com pBF 161, após fermentação, antes (A) e 6 horas depois (B) da adição de ácido indolacrílico como indutor.

Figura 12: Taxas de expressão da proteína precursora do rscu-PA humano (determinadas como actividade de rtcu-PA após renaturação e activação) em B.coli K12 JM103 transformada com pBF 171, isto é, sob controlo do promotor tac. A indução rea lizou-se no instante 0 com IPTG. B indicada a actividade de rtcu-PA determinada em relação ao substrato S 2444, em unidades Ploug por ml de um meio de fermentação com a densidade ópti ca igual a 1, aos 578 nm.

Figura 13; Prolongamento da distância entre a sequência Shine-Dalgarno (SD) e o codão de iniciação ATG de 8 a 10 bases, pelo preenchimento dos sítios de restrição de Kde I e pela ligação subsequente dos terminais rombos resultantes.

Figura 14: Taxas de expressão da proteína precursora do rscu-PA humano (determinadas como actividade de rtcu-PA após renaturação e activação) sob controlo do promotor trp, em B.co li GRT-1 transformada com o plasmideo pBF 161 (0-0)ou pBF

163 (/\---/\) . A indução realizou-se com ácido indolacrílico imediatamente a seguir ao instante 0. São indicadas as activi dades de rtcu-PA₉determinadas com o substrato S 2444, em unida des Ploug por ml de um meio de fermentação com a densidade óptica igual a 1, aos 578 nm.

As figuras 15a e 15b: A sequência completa de nucleotidos do gene estrutural de scu-?A» com indicação dos aminoácidos correspondentes aos codões individuais.

As enzimas de restrição utilizadas na realização dos exem pios são de tipo comercial (ver, por exemplo, Nachr. Chem.

Techn. Lab. 35, 939, 1987).

meio nutritivo utilizado nos exemplos para a selecção dos clones contém, por litro : . 7,8 g de peptona obtida a partir de carne, 7,8 g de peptona obtida a partir de caseína, 10 g de de cloreto de sódio, e 10 g de glué misturado com 10 g de ágar por

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O 1903-13 extracto de levedura, 5,6 g cose. Este meio, aquecido, litro e fundido em placas.

Exemplo 1

Construção do plasmideo de expressão pBF 160 para a proteína precursora do rscu-PA com gene de scu-PA sintético, sob controlo do promotor trp.

a) Construção do plasmideo pBF 158

i) É eliminada do plasmideo pBR 322 (Pharmacia, Nr. 27-4902, 4363 pb) a região nic/bom, a qual se encontra entre as bases 2207 e 2263 (l), da seguinte maneira (ver também a figura 1): o pBR 322 e cortado junto da base 2298 com Nde I e, deste modo, linearizado. Os terminais protuberantes são preenchidos por uma reacção de preenchimento de maneira a se obterem terminais rombos (2). Depois disto, corta-se junto da base 2068 com Pvu II e tornam-se a ligar os dois terminais rombos da parte restante de pBR 322, de acordo com a técnica usual, por meio de ligase T4. A seguir, transformam-se células competentes de E. coli K12 JM 103 (ATCC 39403) (3) com a preparação de ligação.

As células transformadas são cultivadas no meio nutritivo, sob adição de 150 /‘g de ampicilina/ml. Dos clones obtidos escolhem-se os que contêm o plasmideo pBF 157, que difere do plasmideo de partida, pBR 322, pelos fragmentos de a) Pst I x BspM II,

b) Pst I x Bal I, c) Pst I x Ava I, 22B nucleétidos mais pequenos. 0s dois sítios de restrição singulares de PvuII e Nde I do pBR 322 já não existem no plasmideo pBF 157.

ii) Do pBF 157 é eliminada uma grande parte do gene de resistência à tetraciclina pelo corte com Eco RV x Nru I e a ligação subsequente dos terminais rombos resultantes. Apés uma transfor „ em maçao de E. coli K12 JM 103 e cultivo/meio nutritivo com 150 y-tg de ampicilina/ml são obtidos clones dos quais se escolhem os que contêm o plasmideo pBF 158. Este é 787 nucleétidos mais pe queno que o pBF 157, diferindo dele, além disso, pela ausência de um sítio de restrição de Bam HI. A transformação de estirpes bacterianas com pBF 158 nao proporciona a estas₇qualquer resistência à tetraciclina.

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-14b) Construção do pBF 158-01, introdução de utn sítio de clonação múltipla sintético

Do pBF 158 é eliminado, pela cisão com Eco RI x Hind III, um fragmento de 31 nucleótidos, e um sítio de clonação múltipla sintético, cuja sequência está representada na figura 2, é liga do no espaço livre. Após a transformação de E. coli K12 JM103 pela preparação de ligação e cultivo no meio nutritivo com 150 /»g de ampicilina/ml, são escolhidos os clones que contem o pla£ mídeo pBF 158-01. Este difere de pBF 158 nos sítios de restrição únicos- · adicionais de Xba I, Hde I, Sac I, Eag I,

Κρη I, Spe I, assim, como por um segundo sítio de restrição de Pst I (figura 3).

⁰) Construção do pBF 158-01 T, introdução de um terminador de transcrição

É eliminado do pBF 158-01 o fragmento de Cia I x Hind III do sítio de clonação múltiplace substituído pelo fragmento de Cia I x Hind III de pRT 61 (5), no qual se encontra o terminador tet A/orf L de Tn 10 (6).

Após a transformação da estirpe E.coli K12 JM103 e cultivo no meio nutritivo, com 150 y,g de ampicilina/ml, são escolhidos os clones que contem o plasmideo pBF 158-01 T. Este difere de pBF 158-01 por um fragmento de Cia I x Hind III 297 nuoleóti dos mais comprido (figura 4).

d) Introdução dos fragmentos sintéticos M 4 - M 8 para o gene de scu-PA, construção dos plasmideos pBF 158-02 T - pBF

158-06 T

Todos os fragmentos sintéticos que sao descritos nas figuras 5a - 5g, são introduzidos nos respectivos vectores como fra gmentos de cadeia dupla com um comprimento de cerca de 200 nucle ótidos. Para isso, os vectores são cortados com as enzimas de restrição, que correspondem aos respectivos sítios de restrição mencionados e separados do fragmento a eliminar pela electroforese em gel de agarose, electroeluição, e purificação através de DE 52. Depois disto, realiza-se a ligação ao fragmento sintético de cadeia dupla que lhe corresponde, por meio de ligase T4, transformação de E.coli K12 JM 103 (figuras 6a - 6c) e

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G 1903-13 selecção em meio que contém ampicilina.

i) Ligação do fragmento M 8 entre BarnHI e Gla I no piasmídeo pBF 158-01 T.

resultado é o plasmideo pBF 158-02 T.

oligonucleótido 019 codifica a sequência C-terminal do scu-PA. & jusante do codão de terminação TAA encontra-se um sítio de restrição de Nhe I, seguido por sequências de termina çao de transcrição adicionais do terminador trpA (8) até Gla I.

ii) ligação do fragmento M 7 entre Spe I e Bam Hl no plasmíde o pBF 158-02 T.

resultado é o plasmideo pBF 158-03 T.

iii) Ligação do fragmento M 6 entre Κρη I e Spe I no plasmíde o pBF 158-03 T.

resultado é o plasmideo pBF 158-04 T.

iv) Ligação do fragmento M 5 entre Eag I e Κρη I no plasmídeo pBF 158-04 T.

resultado é o plasmideo pBF 158-05 T.

v) Ligação do fragmento M 4 entre Sac I e Eag I no plasmí deo pBF 158-05 T.

resultado é o plasmideo pBF 158-06 T.

Dos clones i - v obtidos, são escolhidos, sempre, os que diferem do respectivo precursor pela existência na sequência ^rcorrecta, verificada, do novo fragmento introduzido.

e) Introdução dos fragmentos sintéticos M 2 e M 3 para o gene de scu-PA, construção de pBF 158-08 I Como é necessário, para a introdução dos fragmentos M 2. β M 3, um corte de Pst I porque, no plasmideo até aqbi utilizado, pBF 158, ainda há um sítio de restrição de Pst I (no gene de resis tência á ampicilina) que perturbaria t aso ssguirrtes, procede-se de modo seguinte (figuras 7a a 7c):

i) Do plasmideo de tipo comercial (por exemplo, Pharmacia) pUC 19 eliminam-se o sítio de clonação múltipla e, adicionalmen te, 212 nucleótidos a montante, como fragmento de Nde I x Hind

III. No espaço livre resultante liga-se, a seguir, o sítio de clonação múltipla sintético do plasmideo pBF 158-04-3 T como fragmento de Nde I x Hind III. Este plasmideo pBF 158-04-3 T

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é obtido a partir do plasmideo pBF 158-02 T (ver o exemplo Idi), pela introdução do fragmento de oligonucleótidos M 6, e corresponde ao plasmideo pBP 158-04 T sem o fragmento M 7. Após a transformação de células de E.coli K 12 JM 103 e cultivo no meio nutritivo com 150 y«g de ampicilina/ml, são escolhidos os clones que contém o plasmideo pUC 19-04-3. Este difere de pUO 19 pela existência de um fragmento de Nde I x Hind III de 712 nucleótidos . ii) De pUC 19-04-3 é eliminado o fragmento de Pst I x Sac I, o vector linearizado.é isolado e ligado ao fragmento de oligonucleótidos M 3. Após a transformação de E.coli K12 JM 103 e cultivo no meio nutritivo com 150 yg de ampicilina/ml, são esco lhidos os clones que contêm o plasmideo pUG 19-07. Este difere tsi?

de pUC 19-04-3 por/um fragmento de Nde I x Sac I de 189 nucleótidos, o qual contém o fragmento M 3 com a sequência correcta.

iii) Do plasmideo pUC 19-07 acima descrito é eliminado o fragmento de Nde I x Pst I e ligado no espaço livre, o fragmen to M 2. Após a transformação de E.coli K12 JM 103 e cultivo no meio nutritivo com 150 y>g de ampicilina/ml, são escolhidos os clones que contêm o plasmideo pUG 19-08. Este difere de pTJG 19-07 pela existência do fragmento de Nde I x Pst I, M 2, de 246 pb, com a sequência correcta verificada.

iv) Do plasmídeo pUO 19-08 são eliminados os fragmentos

M 2 e M 3, como fragmento de Nde I x Sac I, e ligados, na parte maior de pBE 158-06 T obtida após cortes com Nde I x Sac I. Após a transformação de E.coli K12 JM 103 e cultivo no meio nu tritivo com 150 yt/g de ampicilina/ml, são escolhidos os clones que contêm o plasmídeo pUG 19-08 T. Este difere de pBP 158-06 T pela existência de um fragmento de Nde I x Sac I de 435 nucle ótidos.

f) Construção do plasmídeo pBP 160, introdução do promotor trp sintético

Á sequência do promotor trp descrita em (9) ó aproveitada ate o sítio de restrição de Xba I e prolongada no terminal 5’ pela sequência 5’-AAT10TGAAAT-3’, Desta forma, fica construído um sítio de restrição de Eco RI. (figura 8, fragmento Μ 1). As cadeias individuais 021 e 021 A são temperadas e ligadas ao

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plasmídeo pBP 158-08 T cortado com Eco RI x Xba I (figura 9). Após a transformação de E.coli K12 JM 103 e cultivo no meio nutritivo com 150y»g de ampicilina/ml, são escolhidos os clones que contêm o pBP 160. 0 plasmídeo pBP 160 difere de todos os precursores acima descritos, por estirpes de bactérias E.coli com ele transformadas exprimirem, após a adição de ácido indol acrílico, a proteína precursora do rscu-PA.

g) Teste de expressão i) Fermentação

Diferentes estirpes de E.coli, transformadas com o plasmídeo pBP 160, por exemplo E.coli GRT-1, E.coli K12 JM103, assim como E.coli K12 ATOO 31446, sao, respectivamente, fermentadas, em condições iguais, num meio consistindo em sulfato de amónio 38 mM, tampão fosfato 56 mM,. pH de 7,0, sulfato de magnésio 1 mM, l/ de extracto de levedura, 1 $ de glucose, e. contendo .

150 mg de ampicilina por litro, e é induzida a expressão da. pro teína precursora do rscu-PA com ácido indolacrílico 62 mg /l. Para fazer uma comparação, as estirpes acima mencionadas são transformadas com um plasmídeo já conhecido, que contém o gene da pró-uroquinase humana, proveniente de um banco de AUNcnobdoido a partir de ARNm de células Detroit 562 (10), plasmídeo esse que é chamado pUK trp 207-1, e depois, sob as mesmas condições, fermentadas e submetidas à indução.

Antes da indução, e hora a hora depois da indução, até se completarem 6 horas, são separadas, por centrifugação, células que correspondem a 1 ml de uma suspensão de células, com a densidade óptica (0D) de 1, aos 578 nm, e utilizadas para o teste da taxa de expressão.

ii) Renaturação da proteína precursora dando como resultado o rscu-PA, cisão deste último tendo como resultado o rtcu-PA, e medição de actividade.

As células separadas por centrifugação são lisadas, comò descrito acima, com lisozima, sendo, depois, o homogeneizado das células lisadas utilizado para a determinação da actividade, como descrito acima.

As taxas de expressão, determinadas desta maneira após a medição da actividade do rtcu-PA formado a partir do rstu-PA

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(obtido a partir da proteína precursora), são representadas na figura 10. Daí resulta que as estirpes de E.coli transformadas por meio do plasmideo.pBF 160 tivessem um rendimento de expressão 10 - 15 vezes maior do que as mesmas estirpes de E. coli transformadas por meio do plasmideo, conhecido a partir da literatura, pUK trp 207-1 (10). Além disso, resulta que o rendimento da expressão tem, em todas as estirpes, dependendo do plasmideo utilizado na expressão, aproximadamente os mesmos valores, isto é as estirpes, nomeadamente, transformadas com o plasmideo pBP 160 (independentemente da estirpe de E.coli indi vidual) apresentaram sempre uma taxa de expressão muito mais elevada do que as estirpes idênticas transformadas com o plasmídeo pUK 54 trp 207-1, conhecido.

Exemplo 2

a) construção do plasmideo de expressão pBP-161 para a proteína precursora do rscu-PA com gene de scu-PA sintético sob controlo do promotor trp.

plasmideo pBR 322 é cortado com Eco RI e Hind III. 0 fragmento resultante, com um comprimento de 31 nucleótidos, é separado por uma electroforese preparativa em gel de agarose.

A parte restante do pBR 322 é eluida do gel por., electroeluição e purificada através de cromatografia sobre DE 52. 0 pias mídeo pBF 160 (exemplo lf) é igualmente cortado com Eco RI e Hind III. e o fragmento de Eco RI x Hind III, com um comprimen to de 1684 nucleótidos, . contendo.·'.' o gene de scu-PA sintético com todas as unidades de regulação (promotor trp), é separado por electroforese em gel de agarose e eluído e purificado como · descrito acima.

Os fragmentos assim obtidos são ligados de maneira usual com ligase T4, e, depois, transformam E.coli K12 JM 103. Após cultivo no meio nutritivo com 150 y^g de ampicilina/ml, são escolhidos os clones que contêm um fragmento de Eco RI x Hind III com um comprimento de 1684 nucleótidos e que produzem, após uma adição de ácido indolaerílico, proteína precursora de rscu-PA. Estes clones contêm o plasmideo pBP 161.

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b) Teste de expressão

E. coli GRT-1, E.coli K12 JM 103, e E. coli K 12 ATOO 31 446 são transformadas com pBP 161, e, depois, é feita uma fer mentação e testado o resultado de expressão, como no exemplo lg) descrito. Os rendimentos de proteína precursora de rscu-PA, determinados como actividade de rtcu-PA, 1-6 horas após a indução, são comparáveis aos valores de rendimento represen? tados na figura 10 que se referem à utilização do plasmideo pBP 160 para na transformação.

A pelota celular obtida por centrifugação, em analogia com o exemplo lgi). pode, também, ser Usada fazendo-a ferver num tampão Tris-HOl 0,25 M, pH 8,0, com 4/ de SBS, 1 $ de mer captoetanol e 20 % de glicerina. As proteínas assim dissolvi·? das são separadas através de SDS-PAGE e visualizadas pela coloração com azul de Coomassie (12). Os geles coloridos são avaliados densitometricamente, sendo integradas as áreas sob os valores máximos. A quantidade de proteína precursora de rscu-PA,formada após a indução com ácido indolacrílico^determinsda pela subtracção da área das bandas identificadas como proteína precursora antes da indução, da que foi obtida depois da indução. Na figura 11 é representado um densitograma para proteínas obtidas a partir de células de E.coli K 12 JM 103. No pre sente exemplo, a quantidade de proteína precursora de rscu-PA após a indução 0^,9 % em peso de toda a proteína bacteriana. Na tabela 1 indicam-se mais exemplos.

Tabela 1

Quantidade de proteína precursora de rscu-PA em relação à proteína total (em percentagem)

Estirpe de E.coli transformada com

	pBP 161	pUK54 trp 207-1 (10)
K 12 ATCC 31446	14	1,5
K 12 JM 103	17,9	1,9
GRT-1	17,8	1,7

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Exem.pl o 3

Construção de um plasmídeo de expressão para a proteína precursora do rscu-PA com gene de scu-PA sintético sob contro lo do promotor trp em pBR 322 com deleção do gene da resistên cia à tetraciclina.

a) Construção do plasmídeo pBR 322 del plasmídeo pBR 322 é cortado por meio de Eco RV e Nru I.

fragmento resultante, com um comprimento de 787 nucleótidos, é separado por electroforese em gel de agarose, a parte restan te do pBR 322 é eluída do gel por electroeluição e purificada sobre DE 52. Os terminais rombos da parte restante do pBR 322 Eco RV x Nru I são ligados de maneira usual com ligase de T4. Após a transformação da E.coli K12 JM 103 e cultura no meio nu tritivo com 150jug de ampicilina/ml recolhe-se a alíquota de clones que depois de ser transferida para um meio com 25 /vg de tetraciclina/ml, não cresce nela.,-j isto é nao possui nenhuma resistência à tetraciclina. Os clones contêm o plasmídeo pBR 322 del, o qual difere de pBR 322 por ser 787 nucleótidos mais pequeno e por já não poder ser cortado por Eco RV e Nru I. b) Construção do plasmídeo pBP 162 pBR 322 del é cortado com Eco RI e Hind III. 0 fragmento resultante com um comprimento de 31 nucleótidos é separado por uma electroforese preparativa em gel de agarose e a parte? restante do pBR 322 del é eluída do gel por electroeluição e pu rifiçada sobre DE 52.

A partir de pBP 160 é obtido, da mesma maneira, o fragmen to de Eco RI x Hind III com um comprimento de 1684 nucleótidos, que contém o gene de scu-PA sintético com todas as unidades de regulação (promotor trp).

Ambos os fragmentos são ligados de maneira usual com ligase T4 e depois transformam células de E.coli K12 JM 103. Após cultivo no meio nutritivo com 150 /g de ampicilina/ml são escolhidos os clones que contêm um fragmento de Eco RI x Hind III com um comprimento de 1684 pb e que produzem, após uma adição de 62yí«g de acido indolacrilico/ml^proteina precursora de rscu-PA. Estes clones contêm o plasmídeo pBP 162.

c) Teste de expressão

E.coli GRT-1 é transformada com pBP 162, e, depois, é

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feita uma fermentação e testado o resultado da expressão, como no exemplo lg) descrito. 0 rendimento em proteína precursora de rseu-?A, determinado eomo actividade de rtcu-PA, 6 horas após a indução, é de 1300 PU/ml de uma suspensão celular com a densidade óptica 1, e β comparável aos valores de rendimento representados na figura 10 que se referem à expressão após uma transformação de E.coli GRT-1 por meio do plasmideo pBF 160.

Exemplo 4

a) Construção do plasmideo de expressão pBF-171 para a proteína precursora do rscu-PA com gene de scu-PA sintético sob controlo do promotor tac. .....

plasmideo pBF 161 é cortado com Eco RI e Xba I. 0 fra gmento resultante, com um comprimento de 74 nucleotidos, é se parado por uma electroforese preparativa em gel de agarose, e a parte restante do plasmideo é eluída pela electroeluição e purificada sobre DE 52.

É isolado do plasmideo ptac SDT (DSM 5018) o fragmento de Eco RI e Xba I, que contém o promotor tac. Para este fim, o ptac SDT e cortado com Eco RI x Xba I e o fragmento separado por PAGE preparativa. 0 fragmento é eluído da poliacrilamida mecanicamente fragmentada, por aquecimento a 65®G num tampão de acetato de amónio/SDS com um pH de 8,0, e purificado por extracção repetida com fenol saturado com um tampão Tris 1 M, pH 8.

Ambos os fragmentos assim obtidos são ligados de maneira usual com ligase T4 e, depois, transformam E.coli K 12 JM 103. Após cultivo no meio nutritivo com 150 /g de. ampicilina/ml_;são escolhidos os clones que, após uma adição de IPTG, produzem a proteína precursora de rscu-PA. Estes clones contêm o plasmideo pBE 171.

b) Teste de expressão

E.coli K 12 JM 103 é transformada com pBF 171, e depois é feita uma fermentação e testado o resultado da expressão, como no exemplo lg) descrito. Á indução realiza-se no entanto, com IPTG (concentração final 0,5 mM).

Os rendimentos em proteína precursora de rscu-PA, determi nados como actividade de rtcu-PA, 1-6 horas após a indução,

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-22são representados na figura 12. São comparáveis aos valores de rendimento representados na figura 10 que se referem à uti lização do plasmídeo pBP 160 na mesma estirpe de E.coli.

a) Construção do plasmídeo de expressão pBF-172 para a proteína precursora do rscu-PA com gene de scu-PA sintático sob controlo do promotor tac em pBR 322, com deleção do gene de resistência á tetraciclina.

plasmídeo pBR 322 del (ver o exemplo 3a) é cortado com Eco RI x Hind III. 0 fragmento resultante com um comprimento de 31 nucleotidos é separado por uma electroforese preparativa em gel de agarose, a parte restante de pBR 322 del é eluída do gel por electroeluição e purificada sobre DE 52.

A partir de pBF 171 (exemplo 4a) á obtido, da mesma maneira, o fragmento de Eco RI x Hind III que contém o gene scu-PA sintético com todas as unidades de regulação (promotor tac) .

Ambos os fragmentos assim obtidos são ligados de maneira usual com ligase T4 e depois transformam células de E.coli .

K 12 JM 103. Após cultivo no meio nutritivo com 150 y<g de ampicilina/ml, são escolhidos os clones que produzem, em presença de IPTG 0,5 mM,/proteína precursora de rscu-PA· Estes clones contêm o plasmídeo pBP 172.

b) Teste de expressão

E.coli K12 JM 103 é transformada com pBP 172, e depois é feita uma fermentação e testado o resultado da expressão, como no exemplo Ig) descrito. A indução realiza-se, no entanto, com IPTG (concentração final 0,5 mM). Os rendimentos em proteína precursora de rscu-PA, determinados como actividade de rtcu-PA,

1-6 horas após a indução, são cerca de 1100 PU/ml de suspensão celular de densidade óptica 1, sendo comparáveis aos valores de rendimento representados na figura 10 que se referem á utilização do plasmídeo pBF 160 na mesma estirpe de E.coli.

Exemplo 6

Modificação da distância entre a sequência Shine-Dalgarno e o codão de iniciação num plasmídeo de expressão para a proteí

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na precursora de rscu-PA.

Em todas as construções descritas nos exemplos 1 - 5, o codão de iniciação ATG faz parte de um sítio de restrição de Nde I “CATATG-. 0 Nde I corta a seguir ao primeiro A da sequência de hexanucleótido, fornecendo terminais 5' protuberan tes em 2 bases. No caso de se prencher o terminal 3’, isto é, no caso de se construírem, assim, terminais rombos, e, depois disto . se tornar a ligar₅ a respectiva sequência é prolongada em 2 pares- de bases. Ao mesmo tempo fica eliminado o sítio de Nde I. Gomo se vê na figura 13, no exemplo aí representado, a distância desde a sequência S.D. até ao còdão de iniciação é prolongada, de 8 a 10 pares:; de bases. Em seguida ilustra-se a realização experimental por meio de um exemplo:

a) Construção do plasmideo pBP 163 plasmideo pBP 161 é cortado com Nde I, e depois são preenchidos os terminais protuberantes com o fragmento de Klenow da ADN polimerase I (2). Depois disto, é ligado o ADN, de maneira usual, com ligase T4 e, a seguir, transforma E.coli K 12 JM 103. Depois de cultura num meio contendo ampicilina, são escolhidos os clones que contêm o plasmideo pBP 163. Este dlfe re de pBP 161 pela ausência de um sítio de Nde I e pela existên cia daç^ases adicionais -TA-, na área do sítio de Nde I anterior (comparar a figura 13).

c) Teste de expressão

E. coli GRT-1 é transformada com o plasmideo pBP 163, e de pois é feita uma fermentação e o resultado da expressão é testa do como descrito no exemplo lg). Os rendimentos em proteína precursora de rscu-PA, determinados, após renaturação e activação, como actividade de rtcu-PA por ml de uma suspensão celular com a densidade óptica 1, uma a seis horas depois da indução com ácido indolacrílico 62 mg/l, são representados na figura 14. São comparáveis aos valores de rendimento representados na figura 10 que se referem â utilização do plasmideo pBP 160, na mesma estirpe de E.coli.

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Claims

-REIVINDICAÇÕESl^â. - Processo para a produção de plasmídeos úteis na obten ção de um activador de plasminogénio, nos quais o operão apresen ta um promotor regulável, uma sequência de Shine-Dalgarno, que funciona como sítio de ligação aos ribossomas, um codão de inicia ção, um gene estrutural sintático para o activador de plasminogenio da urina, ”scu-PA”, de uma só cadeia, que contém 411 resíduos de aminoácidos, e um ou dois terminadores a jusante, em relação ao gene estrutural, e que são apropriados para a expressão de proteína precursora do rscu-PA ©m enterobacteriáceas, de preferên cia em estirpes de Escherichia coli, caracterizado por se introduzir no plasmideo pBR 322, do qual foram eliminadas a região nic/bom e/ou, pelo menos, uma parte do gene de resistência à tetraciclina, entre os sítios de restrição de Eco RI e Hind III, um sítio de clonação múltipla, com a sequência de nucleotidos

EcoRI <---------------------------------BI-----------------------AATTCATTCTGGTCTGCGATGCTAGTCTAGATAAGGAGGAAATCATATGAGCAATGAACT

GTAAGACCAGACGCTACGATCAGATCTATTCCTCCTTTAGTATACTCGTTACTTGA <-----------------------------B1A---------------------------------X-------------------------------B2-------------TCATCTGCAGCAAGTTCCATCGAACGAGCTCAAATTCCAGTGCGGTCAGCGGCCGTTCTC AGTAGACGTCGTTCAAGGTAGCTTGCTCGAGTTTAAGGTCACGCCAGTCGCCGGCAAGAG -------------------><-----------------------B2A-------------------------------><--------------------------------------GTCTCAACTCTGGTACCTCTTGCGATTTCACAGGTACTAGTTTGCTCTCGCCAGCGTGGA CAGAGTTGAGACCATGGAGAACGCTAAAGTGTCCATGATCAAACGAGAGCGGTCGCACCT -----------------------------><----------------------------B3--------------------------------:-------->

TCCGTTCTCACACCAAAGAAATCGATGACCTTCAAGTTCTGCA AGGCAAGAGTGTGGTTTCTTTAGCTACTGGAAGTTCAAGACGTTCGA B3A-----------’-------------------------------->

Hindlll

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G 1903-13 instalando, com a sua ajuda, um terminador de transcrição, iniciando-se as sequências- parciais sintéticas do gene estrutural de scu-PA, de preferência, no terminal 3’G do gene estrutural, assim como o promotor trp sintético.
2^a. - Processo para a produção de plasmídeos úteis na obtenção de um activador de plasminogénio, nos quais o operão apresenta um promotor regulável, uma sequência de Shine-Dalgarno,que fun ciona como sítio de ligação aos ribossomas, um codão de iniciação, um gene estrutural sintético para o activador de plasminogénio da urina, scu-PA, de uma só cadeia, que contém 411 resíduos de aminoácidos, e um ou dois terminadores, a jusante, em relação ao gene estrutural, e que são apropriados para a expressão de proteína pre cursora do rscu-PA em enterobacteriáceas, de preferência em estirpes de Esoheriohia coli, caracterizado por se introduzir o fragmen to Eoo RI x Hind III de um plasmídeo obtido de acordo com a reivindicação 1, como cassette de expressão, num outro plasmídeo capaz de se multiplicar de maneira autónoma em enterobacteriáceas, de preferência em E.coli.
3^a. - Processo para a produção de plasmídeosúteis na obtenção de um activador de plasminogénio, nos quais o operão apresenta um promotor regulável, uma sequência de Shine-Dalgarno, que fun ciona como sítio de ligação aos ribossomas, um codão de iniciação, sendo grande a distância entre a sequência de Shine-Dalgarno e o codão de iniciação, um gene estrutural sintético para o activador de plasminogénio da urina, scu-PA”, de uma só cadeia, que contém 411 resíduos de aminoácidos, e um ou dois terminadores, a jusante, em relação ao gene estrutural, e que são apropriados para a expres são de proteína precursora do rscu-PA em enterobacteriáceas, de preferência em estirpes de Esoheriohia coli, caracterizado por se cindir, por meio de Nde I, um plasmídeo obtido de acordo com as rei vindicações 1 ou 2, por se tornar a preencher os sítios de restrição resultantes, e por se ligarem, a seguir, os terminais rombos.
4^a. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a distância entre a sequência de Shine-Dalgarno e o codão de iniciação se elevar a 6 - 12, de preferência, a 8 - 10 nucleôtidos.

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5^a. - Processo de acordo com as reivindicações 3 e 4, caracterizado por o promotor regulável ser um promotor trp ou tac.
6-. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracteriza do por o promotor regulável ser um promotor trp sintático com a seguinte sequência de nucleótidos <----------------------------------021--------------AATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGC gactttactcgacaactgttaattagtagcttgatcaattgatcatgcg <--------------------------------02 IA-----------AAGTTCACGTAAAAAGGGTAT

TTCAAGTGCATTTTTCCCATAGATC
7^a. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracteriza do por o promotor regulável ser o promotor tac do plasmideo ptac SDT (DSM 5018).
8^a. - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 7, caracterizado por estarem presentes, no operão, como terminadores su cessivos, o terminador trp A e/ou o terminador tet A/orf L de Tn 10.
9^a. - Processo de acordo com as reivindicações 1 a θ, caracterizado por se utilizarem, no gene estrutural, como codões para arginina, o tripleto GGT, para leucina o tripleto GTG, para valina o tripleto GTT, para prolina o tripleto GGG, e/ou para glicina o tripleto GGT.

10^a. - Processo de acordo com as reivindicações 1-9, caracterizado por .o gene estrutural ter a seguinte sequência de nuele ótidos.

71 072

ST-PN/Dr. Hg-Kl

G 1903-13

Glu

Ser Asn Glu Leu His 5 CACGTAAAAAGGGTATCTAGATAAGGAGGAAATCATATG AGC AAT GAA CTT CAT 53 Vai Pro Ser Asn Cys Asp Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Vai Ser 21 GTT CCA TCG AAC TGT GAC TGT CTA AAT GGC GGA ACC TGC GTT TCT 106 Lys Tyr Phe Ser Asn Ile His Trp Cys Asn Cys Pro Lys Lys Phe 37 AAA TAT TTC TCT AAC ATC CAC TGG TGT AAC TGC CCG AAA AAA TTC 154 Gly Gin His Cys Glu Ile Asp Lys Ser Lys Thr Cys Tyr Glu Gly 53 GGT CAG CAC TGC GAA ATC GAC AAA TCT AAA ACC TGC •TAC GAA GGT 202 Gly His Phe Tyr Arg Gly Lys Ala Ser Thr Asp Thr Met Gly Arg 69 GGT CAC TTC TAC CGT GGT AAG GCT TCT ACC GAC ACC ATG GGT CGT 250 Cys Leu Pro Trp Asn Ser Ala Thr Vai Leu Gin Gin Thr Tyr His 85 TGC CTG CCG TGG AAC TCT GCT ACC GTT CTG CAG CAG ACC TAC CAC 298 His Arg Ser Asp Ala Leu Gin Leu GlV Leu Giy Lys His Asn Tyr 101 CAC CGT TCT GAT GCA TTG CAG CTG GGT CTG GGT AAA CAC AAC TAC 346 Arg Asn Pro Asp Asn Arg Arg Arg Pro Trp Cys Tyr Vai Gin Vai . 117 CGT AAC CCG GAC AAC CGT CGT CGT CCG TGG TGC TAC GTT CAG GTT 394 Leu Lys Pro Leu Vai Gin Glu Cys Met Vai His Asp Cys Ala Asp 133 CTG AAA CCG CTA GTT CAG GAA TGC ATG GTT CAC GAC TGC GCT GAC 442 Lys Lys Pro Ser Ser Pro Pro Glu Glu Leu Lys Phe Gin Cys Gly 149 AAA AAA CCG TCT TCT CCG CCG GAA GAG CTC AAA TTC CAG TGC GGT 490 Lys Thr Leu Arg Pro Arg Phe Lys Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr 165 AAA ACC CTA CGT CCG CGT TTT AAA ATC ATC GGT GGT GAG TTC ACC 538 Ile Glu Asn Gin Pro Trp Phe Ala Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg 181 ATC GAA AAC CAG CCG TGG TTC GCT GCT ATC TAC CGT CGT CAC CGT 586 Gly Ser Vai Thr Tyr Vai Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys 197 GGT TCT GTT ACC TAC GTT TGC GGT GGT TCT CTG ATC TCT CCG TGC 634 Vai Ile Ser Ala Thr His Cys Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu 213 GTT ATC TCT GCT ACC CAC TGC TTC ATC GAC TAC CCG AAA AAA GAA 682 Tyr Ile Vai Tyr Leu Gly Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gin 229 TAC ATC GTT TAC CTC GGC CGT TCT CGT TTA AAC TCT AAC ACC CAG 730 Glu Met Lys Phe Glu Vai Glu Asn Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr 245 GAA ATG AAA TTC GAA GTT GAA AAC CTG ATC CTG CAC AAA GAC TAC 778 Ala Asp Thr Leu Ala His His Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile 261 GCT GAC ACC CTG GCT CAC CAC AAC GAC ATC GCT CTG CTA AAA ATC 826 Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala Gin Pro Ser Arg Thr Ile Gin Thr 277 TCT AAA GAA GGT CGT TGC GCT CAG CCG TCT CGT ACC ATC CAG ACC 874 Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn Asp Pro Gin Phe Gly Thr Ser Cys 293 TGC CTG CCG TCT ATG TAC AAC GAC CCG CAG TTC GGT ACC TCT TGC 922 Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu Asn Ser Thr Asp Tyr Leu Tyr Pro 309 ATC ACC GGT TTC GGT AAA GAA AAC TCT ACC GAC TAC CTG TAC CCG 970 Gin Leu Lys Met Thr Vai Vai Lys Leu Ile Ser His Arg Glu Cys 325 CAG CTG AAA ATG ACC GTT GTT AAA CTG ATC TCT CAC CGT GAA TGC 1018 Gin Pro His Tyr Tyr Gly Ser Glu Vai Thr Thr Lys Met Leu Cys 341 CAG CCG CAC TAC TAC GGT TCT GAA GTT ACC ACC AAA ATG CTG TGC 1066 Ala Asp Pro Gin Trp Lys Thr Asp Ser Cys Gin Gly Asp Ser Gly 357 GCT GAC CCG CAG TGG AAA ACC GAC TCT TGC CAA GGT GAC TCT GGT 1114 Pro Leu Vai Cys Ser Leu Gin Gly Arg Met Thr Leu Thr Gly Ile 373 CCA CTA GTT TGC TCT CTC CAG GGT CGT ATG ACC CTG ACC GGT ATT 1162 Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala Leu Lys Asp Lys Pro Gly Vai Tyr 389 TCT TGG GGT CGT GGT TGC GCT CTG AAA GAC AAA CCG GGT GTT TAC 1210 Arg Vai Ser His Phe Leu Pro Trp Ile Arg Ser His Thr Lys Glu 405 CGT GTT TCT CAC TTC CTG CCG TGG ATC CGT TCT CAC ACC AAA GAA 1258

Glu Asn Gly Leu Ala Leu 411

GAA AAC GGT CTG GCT CTG TAAGCTAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTATCGAT 1316

71 072

ST-PN/Dr. Hg-Kl

G 1905-15

-29“

11^a. - Processo de acordo com as reivindicações 1 - 10, cara cterizado por os plasmídeos conterem o operão no plasmideo pBR 522, do qual se eliminou a região nic/bom.
12^a. - Processo de acordo com as reivindicações 1-10, cara cterizado por os plasmídeos conterem o operão no plasmideo pBR 522, do qual se eliminou o gene de resistência á tetraciclina, to tal ou parcialmente, de maneira a què o plasmideo não seja capaz de transferir ás estirpes de bactérias, com ele transformadas, ne rihuma resistência á tetraciclina.

15^a. - Processo de acordo com as reivindicações 1-11, caracterizado por conterem o operão no plasmideo pBR 322, do qual se eliminou a região nic/bom e, pelo menos, útna parte do gene de resistência á tetraciclina, de tal modo que o plasmideo não seja capaz de transferir ás estirpes de bactérias, com ele transforma das, nenhuma resistência á tetraciclina.
14^a. - Processo de acordo com as reivindicações 3 e 6, cara cterizado por se prepararem os plasmídeos pBF 160, pBF 161, pBF 162 e pBF 163, com um gene de scu-PA sintético, sob controlo do promotor trp sintético.
15^a. - Processo de acordo com as reivindicações 3 e 7, cara cterizado por se prepararem plasmídeos pBF '171, pBF 172 e pBF 173, com um gene de scu-PA sintético, sob controlo do promotor tac do plasmideo ptac SPT (ÓSM 5018).
16^a. - Processo de acordo com as reivindicações 1-3, cara cterizado por se preparar o plasmideo pBF 160 com o seguinte mapa de restrição

EcoRI ^xbal Ndel

Pstl

BamHl

Saci

L-Eagl * Kpnl Spel

Hindlll

Ciai

71 072

ST-PN/Dr. Hg-Kl

G 1903-13

-3017-. - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 16, cara cterizado por os plasmideos terem a caracteristica adicional de efectuarem, em estirpes de E.coli, de preferência do subgrupo E. coli K12, a formação da proteína precursora de rscu-PA com uma ta xa de expressão, em percentagem em peso de, pelo menos, 10 por cento de toda a proteína formada.
18&. - processo de acordo com as reivindicações 14 a 16, caracterizado por os plasmideos terem a caracteristica adicional de efectuarem, em estirpes de E.coli. de preferência do subgrupo E. coli K12, a formação da proteína precursora de rscu-PA com uma ta xa de expressão, em percentagem em peso de, pelo menos, 14 por cento de toda a proteína formada.
19^a. - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 18, cara cterizado por os plasmideos terem a caracteristica adicional de efectuarem, em estirpes de E.coli, de preferência do subgrupo E. coli K12, a formação da proteína precursora de rscu-PA com uma ta xa de expressão, em percentagem em peso de, pelo menos, 10 a 25 por cento, particularmente 14 a 20 por cento de toda a proteína formada.
20^a. - Processo de obtenção de um activador de plasminogénio, caracterizado por se transformar, com um plasmídeo, definido nas reivindicações 1-19, uma estirpe de enterobacteriáceas, de preferência uma estirpe de E.coli, por se induzir a expressão do gene estrutural de scu-PA, por se separar a proteína precursora de rscu-PA do meio e das células bacterianas lisadas, por se solubilizar a proteína precursora, e por se redobrar a referida proteína, a seguir, pela acção de um sistema redox, obtendo“se como resultado o rscu-PA.
21^a, - Processo de acordo com a reivindicação 20,,caracterizado por se transformar uma estirpe de espécie E.coli, de preferência uma estirpe de E.coli K12, com o referido plasmídeo, proce dendo a seguir de acordo com a reivindicação 20.