JPS6080764A - 微小粒子を識別する方法及びその装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は細胞、細胞内の高分子等の生体粒子又は有機高
分子等の微小粒子を識別（区分又は選別）する方法およ
び該方法を実施する装置に関する。

更に詳しくは連続的に流動している懸濁液中の微小粒子
にレーザー光等の強光線のＡ’ルス光を照射してその粒
子から螢光や燐光等≠＃を発光せしめその特定波長毎の
発光強度の時間変化又は発光スペクトルの時間変化を迅
速かつ自動的に測定、演算して微小粒子を識別する方法
およびその装置に関する。

従来技術 細胞学の分野においては、細胞の自動分析および分別の
要求が増大しつつある。現在、細胞標本のスクリーニン
グ、例えばガン細胞又は悪性細胞の発見は主として２種
またはそれ以上の方法によってなされている。先ず最初
に細胞サンプルは視覚的にスクリーニングされて、異常
細胞を含有していると思われる細胞サンプルが捜し出さ
れる。

これらの細胞サンプルは保管され細胞検査技師又は病理
学者等の専門家によってその細胞が真にガン細胞である
か否かの判断を下す。このような方法は現在のところ適
切に行なわれてはいるが、多くの欠点を有している。す
なわち手間がかかシ、非常な熟練を要するために高価な
ものとなり更に異常性の判断の基準は大部分主観的なも
のであるため定量的でない。又、時間と費用のために、
この方法を美大な数のサンプルに対して適用することは
困難である。

流動システム分析法は、生体微小粒子の分析の場合、フ
ローサイトメトリ（Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）と
称されるが、この流動システム分析法と称される方法は
、以上の欠点を幾分でも克服することのできる可能性を
もっている方法である。７０−ザイトメトリーは、細胞
懸濁液から光学的、電気的信号を検出し、細胞の性質、
構造を解明する方法である。これに基づくフローサイト
メーター（Ｆｌｏｗ　Ｃｙ’ｔｏｍｅｔｅｒ　）は、小
さな検出容量内を高速で流れる細胞懸濁液に光を照射し
、細胞からの光学信号や電気信号を検出し解析する装置
である。

これによれば多数の細胞を短時間に観察して正常細胞と
異常細胞を識別することができ、従って自動的な細胞の
スクリーニングを迅速に行なうことができる可能性があ
る〇 照射光としては連続のレーザ光が通常用いられ、細胞を
観察するために使用されるｉ４ラメ−ターは、例えば細
胞の大きさのみのように単一のものでは不十分であるこ
とが知られておシ、今日ではこの外、細胞の光吸収・螢
光・光散乱あるいはそれらの組合せがパラメーターとし
て用いられるようになってきている。ここに、パラメー
ターが例えば細胞の大きさであるというのは、正常細胞
と異常＋ｔｌＥ胞とで細胞の大きさが異なる場合に、細
胞の大きさを観察して、正常のものと異常のものとを識
別することをいう。細胞の大きざの比較だけでは正常の
ものと異常のものとが識別できないような種類の細胞の
場合には、他の識別できるようなパラメーターが使用さ
れるわけである。しかして、多くのパラメーターを使用
することによってスクリーニングの精度が上ることとな
る。

更に、細胞からの光学信号、電気信号を検出、区分する
にとどまらず、信号解析により細胞のグループ分け、例
えば正常細胞のグループと異常細胞のグループへのグル
ープ分け、のできるように振り分ける機能をもつ装置も
セルソーター（Ｃｅ　ｌ　１Ｓｏｒｔｏｒ　）と呼ばれ
実用化されている。

以上のフローサイトメトリーおよびセルソーターについ
ては、例えば電子技術総合研究所業報第４４巻第３号（
１９８０年）に野口によって報告され、セルソーターに
ついては特公昭４６−２７１１８号、特公昭５６−１３
２６６号公報にも記載されている。

フローサイトメーターを用いる流動システム分析法は、
顕微鏡下又は試料セルにおける細胞分析とは異なり細胞
を流しながら、特定の性質をもつ細胞を、短時間に、大
量に識別でき、従って統計的処理を可能にした点ですぐ
れている。しかし、まだ細胞の形態に関する情報、分子
生物学的情報又は分子化学的情報等の細胞の異常に直接
結びっきうる高価値の情報によって識別するようなパラ
メーターはなかった。このような高価値の情報は、細胞
の異常の原因に直接係るものであるため、パラメーター
の増加に基づきスクリーニングの精度向上による臨床的
有用性が増すだけでなく、基礎医学への有用性が生れる
こととなる。

本発明者は、流動システム分析法本来の優れた機能に前
記高価値の情報によって微小粒子を識別できるような新
だなパラメーターを付加することについて探究を行った
。

他方、レーザの技術分野において、今日短パルス列可同
調レーザの技術が確立しつつある。近年色素溶液をレー
ザの媒質とする色素レーザ等の出現によって、紫外から
赤外におよぶ広い範囲にわたり任意の波長に同調可能な
レーザ光が得られるようになシ、更にこの可同調レーザ
によって非常に短かい時間軸のパルス光が得られるよう
になった。

このような短パルス光を得る方法としてモード同期法が
ある。モード同期を達成させるには種々の方法があるが
最も広く容易に用いられている方法は、シンクロナスモ
ード同期法である。この方法では色素レーザを励起する
励起光源として例えばモード同期アルゴンイオンレーザ
の短パルス光を用い、そのパルス列の周期に対応して色
素レーザの共振器長を設定することによって色素レーザ
の利得を周期的に変調して超短パルス列光を発生させる
方法である。

このモード同期法を用いることによりノ母ルス幅τが数
ナノ秒（ｉｏ−９秒）から数ピコ秒（１０−１２秒）の
オーダーの高出力、単色性、指向性の可同調短パルス列
レーザ光を得ることができる。その周期はキャビティダ
ンプ法によって数ミリ秒乃至数ナノ秒の範囲で可変にで
きる。

これらのレーザ光はレーザ共振器内に用いられている光
学素子がプリー−スター角で設定されているためにおよ
び励起レーザ光が直線偏光であるために出力も直線偏光
であるのが一般的である。

このような高速で変化する光を物質に照射して物質を発
光させる場合、その発光の時間変化も相当に高速である
から、その発光の時間変化の観測側も高度の時間精度を
もたなければならない。

その変化時間領域がサブナノ秒よシ長い場合には、被測
定光の時間変化をフォトダイオードや光電子増倍管等の
光電検出器で受けて電気的な信号に変換して、その電気
パルス信号を必要に応じ信号処理、例えばオッシロスコ
ープに入力してブラウン管上に描かせる方法がちる。

しかしピコ秒又はサブピコ秒の超高速時間領域のパルス
光の測定では、これらの光電検出器ではその応答速度ま
たは感度の点で問題となるので流しとりカメラ（ストリ
ークカメラ）が用いられる。

なかでも微弱で繰返しかつ超高速の発光の時間変化を測
定するにはシンクロナススキャンストリークカメラ法が
適当である。ストリークカメラは、被測定光の受光部か
らの光電子を加速、偏向することにより、時間変化が電
子の結像螢光面上の空間位置の変化となるようにした装
置である。

前述の短ノ々ルス列レーザー励起による過渡的な発光強
度の時間変化の測定がヘモグロビンの錯体等の光化学反
応物質でなされ、更に生体高分子への適用が提案され、
その局所構造の解析に有用であることが期待されている
が、まだその有用性をチェックするだめの試料セル中の
基礎研究にとどまっている。

本発明者は、流動システム分析にこれを組込み、いわゆ
るオンラインで生体粒子又は有機高分子粒子等の微小粒
子の分子レベルの局所構造にまでたちかえってその違い
によって微小粒子の識別すなわち、微小粒子の区分の検
出を行うかまだはその区分に応じて微小粒子の選別を行
う可能性について探究を行った。

発明の目的 本発明の目的は、照射用強光線として強パルス光を用い
、／４’ルス光の照射による特定波長毎の発光強度の時
間変化又は発光スペクトルの時間変化を測定するという
構想にもとづき、微小粒子の発光による識別を高価値の
識別情報によシ、大量のサンプルにつき迅速に高精度に
行うことのできる方法および装置を実現することにある
。

発明の構成 本発明においては、基本的形態として、微小粒子の懸濁
液を実質的に前記粒子を１個ずつ間隔をもたせて含む粒
子流とし、前記粒子流に強光線を照射し、次いで強光線
を照射された前記粒子流を液滴となし、強光線照射によ
る粒子の発光の強度によって前記液滴中にある粒子を識
別する方法において、前記強光線として強パルス光を用
い、パルス光の照射による特定波長毎の発光強度の時間
変化又は発光スペクトルの時間変化によって微小粒子を
識別する方法、が提供される。

また本発明においては、（１）流動チャンバー、（２）
微小粒子の懸濁液を前記流動チャンバーに送り込み実質
的に該粒子を１個ずつ間隔をもたせて含む粒子流とする
手段、（３）強パルス光を発生させる手段、（４）前記
流動チャンバーで前記強パルス光を前記粒子流に照射す
る手段、（５）前記粒子流を液滴とする手段、（６）前
記照射による粒子流の発光を分光する手段、および（７
）特定波長毎の発光強度の時間変化を計測する手段、を
具備する微小粒子を識別する装置、が提供される。

また、本発明においては、（１）流動チャンバー、（２
）微小粒子の懸濁液を前記流動チャンバーに送り込み実
質的に該粒子を１個ずつ間隔をもたせて含む粒子流とす
る手段、（３）強パルス光を発生させる手段、（４）前
記流動チャンバーで前記強パルス光を前記粒子流に照射
する手段、（５）前記粒子流を液滴とする手段、（６）
前記照射による粒子流の発光を分光する手段、および、
（７）発光スペクトルの時間変化を計測する手段、を具
備する微小粒子を識別する装置、が提供される。

本発明による方法におい又は、前記の従来の流動システ
ム分析の技術、可同調短パルス光の技術および高速光現
象の測定技術を新たな高速実時間データ処理技術によっ
て結合し、微小粒子の識別すなわち、微小粒子の区分の
検出又はその区分に応じての粒子の選別を行う。

本発明による方法においては、微小粒子そのもの又は、
色素を結合した微小粒子の懸濁液を細流とし、その後更
に細流をノズルから噴出させて噴出流としてから液滴と
なし、その細流又は噴出流に微小粒子の吸収帯に同調し
た強いパルス光を照射し、それによって発生する螢光等
のパルス光を受光して、発光の予め選択された特定波長
の強度の時間変化又は各波長毎のそれを同時に高速下に
検出し、かつ予め設定された該強度の時間変化に関する
区分の値と比較し、該区分の値との隔シの程度の区分に
応じたパルス波形に関する情報の電気信号を発生させ、
一方噴出流の液滴となる瞬間に荷電電極によって帯電さ
れ、次いで偏向板を通過して試料受器に採取され、この
とき、前記電気信号は、パルス光の照射を受けた粒子が
通過するときに荷電電極又は偏向板に送られ、粒子は前
記区分に応じて帯電又は偏向されて選別される。

本発明による方法においては、従来の流動システム分析
法および装置に比較して、照射光として、強パルス光を
用い、該パルス光の照射による予め選択された特定波長
の発光強度の時間変化又は特定波長毎のそれを同時に測
定することにょシ、更に又は発光ス被りトルの時間変化
を測定することによシ、微小粒子を識別する。

本発明による方法および装置は下記の事実にその基礎を
おくものである。

まず、微小粒子内に発光成分を有する粒子、例えば発光
する生体構成物質などの粒子そのもの又は染色用色素を
結合した微小粒子は、その微小粒子に含まれる分子の吸
収帯に同調した強い光即ちパルス光を受けて励起され、
螢光や燐光等の光を発し、失活する。

とのノ４ルス光励起にょシ分子から発した特定波長の光
は、その分子又は分子同志の相互作用に固有な強度の時
間変化をみせる。また、特定波長を逐次に連続的に選べ
ば発光のス被りトルの時間変化が各分子などに固有であ
シ、従ってそれを包含する微小粒子に固有である。

ここに各粒子に固有とは、例えば大部分の正常な細胞の
グループと、ガン細胞又は悪性細胞等の異常な細胞のグ
ループにそれぞれに固有であることを云い、従って細胞
に固有な特定波長の発光強度の時間変化あるいは発光ス
ペクトルの時間変化を検知することができれば、正常な
細胞と異常なそれとを区分することが可能である。

微小粒子に含着れる分子の吸収帯には、大略、分子骨格
、例えばＤＮＡ塩素の公子骨格、が光吸収する吸収帯と
、色素、例えばアクリジン染料等の色素が光吸収する吸
収帯があり、そのどちらの吸収帯に同調するＡ）レス光
を照射するかによって得られる情報が異なってくる。

第１図は、光照射に対する発光および失活についての説
明図であり、縦軸にエネルギレベル（Ｅ、Ｌ、）をとる
。実線矢印はレーザー光吸収、励起（ＥＸ）を、屈曲状
矢印は螢光（ＦＬ）を、破線矢印はエネルギトランスフ
ァー（ＴＲ）をそれぞれあられず。（ａ）は分子骨格の
吸収帯に同調するパルス光を照射した場合であって、分
子骨格自身と色素からの両方から異種の光が発せられる
。（ｂ）は分子骨格に対して、２つの色素が結合され、
エネルギーのドナーとなる色素の吸収帯に同調するパル
ス光を照射した場合であって、ドナー色素とアクセプタ
ー色素とからなる異種の光が発せられる。（ｃ）は２つ
の色素（例えばドナー色素とアクセプター色素）が結合
された分子骨格の吸収帯に同調するパルス光を照射した
場合であって、分子骨格自身と、２つの色素から異種の
光が発せられる。

以上の発光は、パルス光であるが、これらを微小粒子の
識別のパラメーターとするためには、これら発光を分光
して、粒子を特徴とする特定波長について、発光の立上
９時間、減衰時間あるいは発光ス波りトルの時間変化を
測定することとなる。

更に照射するノ？ルス光が直線偏光である場合には、光
の電気ベクトルの方面に遷移モーメントをもった分子が
選択的に励起される。この分子は熱運動によって回転し
、励起直後の異方性を失い、等方向になっていく。この
配向緩＞ＦＩ＋の様子は、励起分子からの螢光等の発光
の特定波長毎の偏光の時間変化あるいは特定波長を逐次
に連続的に選んだときの偏光のスペクトルの時間変化を
観測することとなり、これらの時間変化（以下配向緩和
時間という）は各分子に固有であり、分子の大きさ、そ
れを取り囲む溶媒や他分子との相互作用の程度によυ異
なり、配向緩和時間を測定することができれば粒子の識
別が可能となる。この場合の１例を掲げると、細胞膜は
異方性に敏感であるだめ、細胞膜に関する細胞の識別に
この／４’ラメーターは有効である。

なお励起パルス光の偏光角に対し、並行方向（０°）と
直角方向（９０°）に生ずるそれぞれの発光強度をＩ（
０）、Ｉ　（９０）とすると各波長毎の発光偏光ｉｐは で定義される。これらの時間変化を粒子区分のパラメー
ターとすることができる。

実施例 本発明の方法および装置を、正常細胞と異常細胞を識別
（区分又は選別）することを−態様として、以下に更に
詳しく説明する。

第２図は、本発明の一実施例としての微小粒子の識別（
区分又は選別）を行う装置の全体的な構成を示す図であ
る。第３図および第４図は第２図装置における流動チャ
ンバーの構造の例を示す図である。

細胞サンプルは必要ならばまず適切な螢光色素によシ染
色される。適切な色素とは、細胞と結合してパルス光の
吸収帯をもつような、そして好ましくは異常細胞の異常
部位に選択的に結合するようなものである。例えばフォ
イルゲン染料やアクリジン染料などが用いられる。また
モノクローナル抗体と称し、特定細胞の特定部位にしか
つかない抗体を細胞につけ、その抗体に色素を吸着させ
るようなことも選択的な結合に有用である。

そして細胞サンプル又は適切な螢光色素によυ染色され
た細胞サンプルは生理食塩水の如き液に懸濁させ水性懸
濁液とし、沖過して大きなくずやかたまシを除去して試
料容器２に入れられる。試料容器から懸濁液は、加圧さ
れて、管５を通じて流動チャンバー６に送られる。加圧
の手段の一例は第２図の管３２に示されるような空気等
の気体による加圧である。又他の例は脈動のない又は脈
動の消去されたポング加圧である。流動チャンパ−６に
送られた懸濁液は、そのチャンバー内で細流となる。細
流は、流動チャンバー内で、細流中の細胞が装置の中心
軸にくるようにするため、又細胞の区分又は選別が可能
な間隔をとるだめに包囲鞘としての役割をするシース液
６３、例えば生理食塩水に同心円的に包囲されて流動チ
ャンバー６の出口ノズル６２から注入される。

シース液は、容器１から加圧され管４を通って流動チャ
ン・ダー内の出口ノズルを同軸的に包囲するシース管に
送られる。シース液と懸濁液との圧力調整は、細胞が実
質的に１個ずつ出口ノズルを通過できるようになされる
。

流動チャンバーの型式には、第３図の細流の段階でノ々
ルス光の照射を受けるように光源の投射口と観測口を有
し、出口ノズルを有する液中測定型のものがある。また
第４図のように流動チャンバーは噴出流を形成するもの
であって、流動チャ／バーから噴出された噴出流がパル
ス光の照射を受けるような空中測定型のものがある。本
発明では、このいずれの型でも適用できる。そしていず
れにしても液滴となシ落下する。

流動チャンバーの上部には流れ出てくる液体噴出流を規
則的に振動させることによって均一な液滴を生ぜしめる
ために機械的に接続された振動手段６１、例えば圧電型
結晶が設けられる。全ての液滴に細胞を含むとは限らず
、又ある液滴には複数個の細胞を含むこともあるが、統
計的には大部分の細胞は、１つの液滴に１個に単離され
ることが理想的であるが、現実には、数個の液滴に細胞
が１個という風に若干希釈される。

これらの調節は細胞懸濁液とシース液の加圧の程度と、
圧電型結晶に印加される周波数と電圧、通常では周波数
４０〜５０　ｋＨｚ　、電圧１５Ｖを制御することによ
ってなされる。

前述のように細流又は噴出流となった細胞流は、パルス
光の照射を受ける。光源は、例えば−モード同期により
パルス光となる機構を備えたアルゴン・イオンレーザ１
０と波長可変およびパルス幅の極小化を行なう色素レー
ザ１１およびパルス列周期のコントロールを行なうキャ
ビティダンパー１２によシ構成される。

光源としてはいずれもパルス光を使用するが、使用する
光ビームとしては、アルゴンイオンレーザの発振波長、
主として４８８ｎｍまたは５１４．５　ｎｍが強くその
他紫外領域の波長、および、色素レーザよシ出てくる波
長、例えば色素としてローダミン６Ｇを用いた場合は６
００ｎｍ前後の波長、の両者を使用する。これら両者の
波長を用いると、ダブルビームの光源となり、細胞への
最適励起波長の選択が容易となる。

このパルスブＣのレーザビーム、例えばパルス幅として
１０ｐｓｅｃ〜１０ｎｓｅｃのレーザビームを、Ｓ／Ｎ
比を向上させるだめに、そのウェストポイントが細胞流
の部分にくるように集光して、細胞流にほぼ直角に照射
する。

照射光の細胞流をつきぬけた側に、照射光源に向けたフ
ォトダイオード１６２は、細胞が検出範囲に入った事を
検知し、例えばストリークカメラ２０のシャッターを開
閉するだめの信号を取シ出すために使用される。フォト
ダイオード１６２への入射光は通常パルス動作をしてい
るが、細胞がノクルス光に入ってくると吸収が起り信号
に変化が起きるのでこれをシャッター開信号とする。

細胞がノ！ルス光を横切らないときには、螢光は発せら
れないのでストリークカメラ２０からはベースノイズ以
外の信号は出力されないが、このベースノイズを消去す
るためにフォトダイオード１６２の出力信号をストリー
クカメラ２ｏに入力して、細胞がパルス光をさえぎらな
いときには、ストリークカメラ２０の加速電圧を０とし
、チャンネルグレートの操作電圧を０とするようなシャ
ッター同期信号を発せしめる。シャッターを開いて加速
電圧およびチャンネルグレートが動作開始した後シャッ
ターを閉じる信号は、例えばパルスが１００個通過して
のち、又は、１μＢ経過後に発せられる。

パルス光と細胞流が交わる点に細胞が流れてくると、そ
こで細胞内の生体高分子又はそれに結合した色素が励起
され、パルス状の螢光が発せられる。この螢光の列は、
細胞流とパルス光の照射方向の双方にほぼ直交する方向
にて、できるだけ広角で集光レンズ１５３で集め、分光
器１９又は特定波長のバンドパスフィルター１７３，１
７４等の分光手段を介してストリークカメラ２０および
／または光電子増倍管やフォトダイオード１６３゜１６
４に送られ、必要ならば、これらの検知手段の前には偏
光板（図示せず）が置かれる。

但し、第１図装置における流動チャンバーが第３図、第
４図に例示したものでなく、細胞流が入射光軸に平行し
て流れるタイプのもの、又は斜めに入射されるタイプの
ものの場合には、螢光の検知は、前記細胞流とパルス光
の照射方向の双方に直交する必要はなく入射光の影響を
受けないように螢光が検知されればよい。

光電子増倍管やフォトダイオードは、応答時定数が大き
いため、その時定数より短いパルス光は、検知できない
。逆にストリークカメラの時定数は長くできない場合が
ある。従って、検知手段として両者を選択使用すればよ
いこととなる。なお例えば入射パルス光のパルス幅が０
．１ｎｓｅｃでくシ返し間隔が１０ｎｓｅｃとすると、
細胞がパルス光を通過する間に受けるパルスの数は、細
胞流速によるが１００〜１，０００個となる。

ストリークカメラ２０の動作が第５図を参照しつつ説明
される。発光パルスはまず光電面２０１に入射して、そ
の刻々の光の強さくＩ）に応じ、光電子を放出する。入
射光の横軸が波長となる。刻々の光電子は、加速電極２
０２で初速度を揃えて加速されてチャンネルプレート２
０４に向う一方、電子ビームの進行方向に垂直な、偏向
電極２０３による偏向電場で上下方向に偏向される。

この偏向電極２０３には、シンクロスキャン方式を用い
て、はぼ発光パルスに同期する高速掃引電圧が印加され
ており、従って遅れて発生する光電子は例えばチャンネ
ルグレートの下方に入射することとなυ、その後電子増
倍されて螢光面に衝突し、再び光に変換される。結局こ
の螢光面には、時間ｔを縦軸とし、波長λを横軸として
螢光パルスの強度が輝度（Ｌ）として表わされた像が与
えられる。この光像は、光電子ビームが螢光パルス毎に
発生し、高速掃引されるけれども、螢光面の残像効果の
だめに、パルスの累積されたもの、すなわち、細胞毎の
像である。

この光像は、出力リレーレンズ、オプティカルファイバ
ー等２１を通して撮像管又はダイオードアレイ等の受光
素子２２に結像する０この結果、受光素子を掃引して得
られる電気信号は、励起発光パルスの強度の時間変化又
は発光スペクトルの時間変化を示すものとなる。

前記発光パルスに同期する偏向電極２０３の高速掃引電
圧は、同期源としては、照射ノ２ルス光の一部をフォト
ダイオード１６１で受けたときの出力を用いた掃引同期
回路によって得られる。

配向緩和時間は次のようにしてストリークカメラによっ
て検知できる。即ち、発光パルスを０゜および９０°の
２つの偏光板を通る光路に分け、ある特定波長のそれぞ
れを各々のス）　ＩＪ−クカメラで検知する方法や、偏
光板を通した偏光角Ｏ０および９０°の２つの偏光螢光
パルスをある特定波長のそれぞれを１台のストリークカ
メラの左半分および右半分に別けて入光し、チャンネル
プレートの後の螢光面の左右に別けてそれぞれの光像を
描かせ、別々にそれぞれの光像の電気信号を得る方法で
ある。

前記したように、励起パルス光がレーザパルスである場
合には、パルス光も直線偏光であることが一般的である
が、この場合、発光パルスについて偏光の効果を除いて
、発光の載設時間を測定するには、偏光角がマジックア
ングルと呼ばれる５４．７°に設定された偏光板を通し
て観測すればよい。

光電子増倍管やフォトダイオードアレイ１６３゜１６４
を発光パルスの検知手段に使用する場合は、１つの細胞
について数多く発せられる螢光パルスの１つを検知して
、直接に、発光の立上り時間、減衰時間や、配向緩和時
間を検知することができる。高感度を得るために数個の
ｉ４ルスの平均値をとってもよい。

ストリークカメラ又は、光電子増倍管やフォトダイオー
ドからの電気信号は、後記される時定数計時回路によっ
て特定波長の発光の立上り時間、減衰時間、配向緩和時
間又は発光スペクトルの時間変化が演算される。

第２図装置における信号処理部７の構成が第６図に示さ
れる。

時定数計時回路７００ａ、７００ｂの演算出力である発
光の立上少時間、減衰時間、配向緩和時間はデータマル
チプレクサ７１及びソーティングマルチプレクサ７２に
送られる。

データマルチプレクサは、中央処理ユニット（ＣＰＵ　
）　７４０指令に基づき、各センサーの信号を順次切換
えてメ七り７３に書き込む。メモリ７３に書き込まれた
信号は、微小粒子の識別の表示として、ＣＰＵ７４の指
令によりＣＲＴ等のディスプレイ８１上に測定値あるい
はグラフ等のデータとして表示し、まだ、印字装置にそ
れらのデータを印字し、ハードコピーを作成する。

一方、ソーティングマルチプレクサ７２は、ソーティン
グ（分取）ずべき要素、例えは波長、立上少時間、減衰
時間、配向緩和時間等の要素が設定さ：冗ると、ＣＰＵ
　７４からの指令により１つ又は複数の要素の信号源選
択され、１つ又は複数の上限あるいは下限比較器７５．
７６に送られる。ここであらかじめ設定された値又はス
ペクトルと測定値又は測定スペクトルが比較され、所定
の範囲（例えば上限以下でかつ下限以下）にあるときは
、信号処理部７の動作により荷ｔ／”ルス発生回路８２
は一定の遅延時間、例えは５００〜１，０００μＳ程度
をもたせて偏向信号を出力する。

このようにして１個の細胞の特定波長の螢光の立上少時
間、減衰時間、発光スペクトルの時間変化又は配向緩和
時間が正常な細胞のもつこれらの基準値（前記設定値又
は設定スペクトル）と比較され、その基準値との隔シに
応じて識別され偏向信号が細胞のソーティング（分散）
のために出力されることとなる。

細胞流が液滴を形成する所に、細胞流をはさんで荷電電
極２３が設けられており、荷電電極には１．９　ルス幅
５０〜２００μＢ、電圧±５０〜３００ｖのノ２ルスが
荷電パルス発生回路から印加されている。そして液滴が
形成される瞬間に液滴はその荷電パルスに応じて荷電さ
れる。この荷電パルスは、前記のように細胞が・マルス
光の照射を受けて、螢光等を検知され、比較演算された
のち遅延されているので、その細胞が丁度荷車電極を通
過するときには、比較演算の結果としての荷電を受ける
ようにされている。

次いで液滴は、液滴流をはさむ形で２〜５ａｎの間隔で
対向しておかれている２枚の偏向板２４の間を通過する
。偏向板には±１５００〜２０００　Ｖの電圧が加えら
れておυ、荷電された液滴は、静電気力により偏向され
偏向板の４〜５ｃｒｎ下方の細胞受器２５に集められる
。荷電されていない液滴はそのまま偏向されずに落下す
る。

なお偏向信号を荷電ノやルス発生回路から出力させる代
りに、荷電電極では一定の荷電状態として、偏向板の電
場を駆動する回路を用いて偏向電場の強さを変化させる
ようにしてもよい。

第１図装置における粒子流、照射するパルス光、発生す
る発光パルス、ストリークカメラのシャッター用ゲート
、ストリークカメラの掃引電圧、液滴にかける荷電電場
、相互間の時間的関係が第７図の波形図を参照しつつ説
明される。

第７図の（１）は微粒子がパルス光を横切るときをＨレ
ベル、そうでないときをＬレベルとして粒子流の状態を
示したものである。第７図の（２）は照射する・ぞルス
光を示し、第７図の（３）は発生する発光・やルスを示
している。第７図の（４）および（５）はそれぞれスト
リークカメラのシャッター用ゲートと、ストリークカメ
ラの掃引電圧を示し、第７図の（６）は荷電電極にかけ
る電圧を２つのレベルで示している。第７図の（２）か
ら（３）の間は、発光の立上り時間だけ少し遅れ、ピー
クに達したあと、緩やかに減衰する。

第７図の（５）の周期は、発光源からストリークカメラ
までの光の到達時間だけの遅れを生じるが、図では無視
した。第７図の（６）は、微小粒子がパルス光の照射を
受けてから、荷電電場に至る時間差だけ遅れる。光の遅
れを問題とする第７図の（２）〜（５）の遅れに比べれ
ば比較にならない程の遅れとなるが、便宜上図では若干
大きく画くことにとどめた。

第６図回路における時定数計時回路の構成が第８図およ
び第９図に示される。時定数計時回路が発光パルスの立
上シ時間、又は減衰時間を演算する場合の時定数計時回
路は第８図のように構成される。

第８図回路において、発光の立上り時間の測定は、光像
を変換した電気信号Ｓ　（ＯＰＴ　）をまず前置増幅し
、スムージング等の前処理を行なったのち、第１比較器
７０３により立上シの基準レベルを定め、これを信号５
（７０３）とする。信号５（７０３）とする立上υの基
準レベルは、しきい値設定器により任意の値に設定５（
７０２）できるものとする。このしきい値は、発光信号
の無信号時からの変化点、光学系あるいはこの回路に入
る迄の電気系のノイズ等を勘案して決められる。

立上り時間の測定上信号がピーク値に到達した時の信号
が必要となるが、これには第２比較器７０５により作成
される信号５（７０５）を用いる。即ち発光信号とその
ピークホールド回路の信号を第２比較器で比較し、発光
信号の方が小さくなるときのピーク点の信号を得る。こ
の５（７０３）。

８（７０５）の２つの信号発生時点の時間差を立上シ時
間計時回路にて計測する事により発光の立上り時間を測
定できる。

発光の減衰時間の測定は、凍ず第２比較器７０５によシ
前記ピーク点となるべき時間をとらえる。

それには発光信号とピークホールド回路を通った信号を
比較すれば発光信号の方が小さくなった所で第２比較器
７０５の出力が逆転するので、これを４Ｍ号５（７０５
）として時間測定回路の時間計Ｓ＋開始の４６号として
使用する。

減衰時間とは、通常、信号ピーク値からの値が１／ｅ　
（６３％　）になるまでの時間を採用ずればよいがこの
１／ｅ又はその他の値を減衰比設定器に設定し、これと
発ブＣ信号を第３比較器７０８に入れ、大きさの逆転す
る時出力信号５（７０８）が得られる。減衰時間の測定
は、この信号５（７０５）。

５（７０８）を用い、減衰時間測定回路により計測され
る。ＳＴＴは計時開始を、ＳＴＰは計時停止を、それぞ
れあられす。

立下シ時間計時回路の計時終了信号ＣＯＭＰＬにより、
ピークホールド回路および２つの計時回路をリセッ）　
Ｒ８Ｔする。このようにして第８図回路により立上り時
間計時信号５（７０７）、立下り時間計時信号５（７０
９）が得られる。

以上は特定の一波長に関する時定数計時回路であるが、
特定波長が複数ある場合には、特定波長の数に応じてそ
れぞれの波長について同様の処理を行なえばよい。また
、第８図回路が用いられる場合においては、信号５（７
０７）、信号５（７０９）の一方を省略することが可能
である。

時定数計時回路が配向緩和時間を演算する場合の時定数
計時回路は、第９図のように構成される。

第９図回路において、光像検出器よりの偏光角０゜およ
び９０°の電気信号８　（ＯＰＴ　）を前置増幅を行々
りたのち、前記偏光を示す換算値、例えば発光偏光度を
演算させる。その回路よシの出力を前記減衰時間計時と
同様に処理するものである。このようにして第９図回路
によシ配向緩和時間計時信号５（７ｉ６）が得られる。

複数の特定波長については、その各々に同様の処理を行
なえばよい。

第２図装置においては、微小粒子の区分、選別のパラメ
ーターは、微小粒子の分子レベルの局所構造の違いに基
づくものである。具体的には、生体微小粒子について言
えば、分子生物学的又は分子化学的な細胞レベル、染色
体レベル更には生体分子レベルにまでたちかえったもの
である。更に具体的には、まず第１に各構成分子、部位
の接近度、例えば核酸−塩基ベアの距離、染色用色素分
子−分子骨格の距離、ドナ色素分子とアクセプタ色素分
子との距離等であり、第２に核酸、タンパク質などの粒
子の大きさや型で・あり、第３に分子の構造に関し、例
えば２重らせんのピッチ、分子の内部振動、ブラウン運
転、鎖のベンディング、分子の局部的な回転運動等の情
報である。

第４に光化学反応を含む生化学反応の過渡中間生成物の
検出であり、第５に細胞の領域の情報であって、例えば
、細胞膜とタンパク質との結合状態や膜の厚さである。

第６に細胞の融合状態、表面レクチオンリセプターの分
オｌｉ％クロメージョン接近などの生体微小粒子のその
他の性質に関する情報である。

これらは、生体微小粒子の異ｎ因子に直接係わる高価値
の情報である。第２図装置においては、これらの高価値
の情報によって生体微小粒子を区分、選別でき、しかも
それを大量のサンダルを短時間でオンラインで行なうこ
とが可能である。このことは、第２図装置の医学分野に
おける臨床的有用性と、その基質医学への有用性を意味
し、またその他の微小粒子の区分、選別への有用性をも
意味する。

本発明の実施にあたっては、前述の実施例のほか、種々
の変形形態をとることが可能である。まだ、本発明の方
法および装置には、前記特公昭５６−１３２６６号公報
に記載されたようなコウルターオリフィスを使用する容
量検知システムやパルス光照射による粒子からのパルス
状の螢光や散乱光を連続光としてならしてその強弱を検
知し、それらを粒子の区分、選別のパラメーターとする
こと、即ち、従来の流動システム分析の手法を併用する
ことは勿論可能である。

発明の効果 本発明によれば、微小粒子の発光による識別を高価値の
識別情報により、大量のサンプルにつき迅速に高精度に
行うことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、光照射に対する粒子の発光および失活の状況
を説明する図、第２図は、本発明の一実施例としての微
小粒子の識別（区分又は選別）を行う装置の全体的な構
成を示す図、第３図および第４図は流動チャンバーの構
造例を示す図、第５図はストリークカメラの動作を説明
する図、第６図は第２図装置における信号処理部の構成
を示す図、第７図は、第１図装置における各部の信号の
時間的関係を示す波形図、第８図および第９図は、第６
図回路における時定数計時回路の構成を示す図である。 １・・・シース液容器、２・・・試料容器、４．５・・
・管、６・・・流動チャンバー、７・・・信号処理部、
１０・・・アルゴンイオンレーザ、１１・・・色素レー
ザ、１２・・・キャビティダンパー、１９・・・分光器
、２０・・・ストリークカメラ、２３・・・荷電電極、
２４・・・偏向板、２５・・・細胞受器、３２・・・管
、６１・・・振動手段、６２・・・出口ノズル、６３・
・・シース液、８１・・・ディスプレイ部、８２・・・
荷ｔパルス発生部、８３・・・掃引同期回路、８４・・
・シャッター同期回路、１３１〜１３３・・・ハーフミ
ラ−１１３４，１３６・・・グイクロイックミラー、１
４１゜１４２・・・全反射ミラー、１５１〜１５８・・
・レンズ、１６１．１６２・・・フォトダイオード、１
６３゜１６４・・ブＣ電子増倍管又はフォトダイオード
、１７３〜１７４・・・バンドパスフィルタ。 第１図 ＤＮＡ塩基　色素 ＤＮＡ塩基　ドナー色素　アクセプター色素ＤＮＡ塩基
　ドナー色素　アクセプター色素第３図 第４図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、微小粒子の懸濁液を実質的に前記粒子を１個ずつ間
   隔をもたせて含む粒子流とし、前記粒子流に強光線を照
   射し、次いで強光線を照射された前記粒子流を液滴とな
   し、強光線照射による粒子の発光の強度によって前記液
   滴中にある粒子を識別する方法において、前記強光線と
   して強パルス光を用い、ノソルス光の照射による特定波
   長毎の発光強度の時間変化又は発光ス被りトルの時間変
   化によって微小粒子を識別する方法。 ２、（１）　流動チャンバー、 （２）ｇ、小粒子の懸濁液を前記流動チャンバーに送り
   込み実質的に該粒子を１個ずつ間隔をもたせて含む粒子
   流とする手段、 （３）強パルス光を発生させる手段、 （４）前記流動チャンバーで前記強パルス光を前記粒子
   流に照射する手段、 （５）前記粒子流を液滴とする手段、 （６）前記照射による粒子流の発光を分光する手段、お
   よび （７）特定波長毎の発光強度の時間変化を計測する手段
   、 を具備する微小粒子を識別する装置。 ３、（１）　流動チャンバー、 （２）微小粒子の懸濁液を前記流動チャンバーに送シ込
   み実質的に該粒子を１個ずつ間隔をもだせて含む粒子流
   とする手段、 （３）強パルス光を発生させる手段、 （４）前記流動チャンバーで前記強ｉ４ルス光を前記粒
   子流に照射する手段、 （５）前記粒子流を液滴とする手段、 （６）前記照射による粒子流の発光を分光する手段、お
   よび （７）発光スイクトルの時間変化を計測する手段、 を具備する微小粒子を識別する装置。