JPH0372238A - 高感度顕微多波長分光装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生物発光、化学発光、励起光による極微弱蛍
光等の可視領域から赤外に至る極微弱光のスペクトル分
析を顕微鏡による像サイズで行うことができる明るい小
型の操作性に優れた高感度顕微多波長分光装置に関する
。

〔従来の技術〕

顕微多波長分光装置は、従来より、顕微鏡的な大きさの
試料の吸収分光特性等を測定し、それによりその試料中
に含まれる吸収物質等を量的あるいは質的に調べる装置
として使用されており、最近は、生物発光、化学発光、
励起光による極微弱蛍光等を呈する微小物体からの極微
弱発光の分光特性を測定する装置としても開発されてき
ている。

これらのなかで、励起光の試料による吸収分光特性や反
射分光時性を求めるものとして、回折格子を用いた分光
器を利用した顕微分光測光法やフーリエ変換分光器を利
用した顕微測定用フーリエ変換分光法が実用化されてい
る。これらは、励起光の各波長当り強度の数桁下の強度
を検出できれば分光特性が求められ、たとえ測定困難な
試料でも励起光を強くしたり、試料濃度を希釈すれば測
定可能であるため、極微弱光を超高感度で検出できる最
高感度の測定系を必要としない。

一方、励起光による試料からの顕微鏡下での蛍光やラマ
ン散乱の測定は、細胞内カルシウムの濃度測定用として
の顕微蛍光法や、干渉計を採用したフーリエ変換分光法
による顕微蛍光分光法、さらに顕微鏡下でのマイクロラ
マン分光法として実用化されている。しかしながら、蛍
光やラマン散乱は、試料の吸収分光特性を求めるため透
過光を測定するのに比較してはるかに弱い光を検出する
ため、できる限り明るい顕微分光が要求される。

さらに、生物からの極微弱な発光の生物フォトンや化学
発光のような励起光のない発光の分光もできる限り明る
い顕微分光が要求される。すなわち、顕微蛍光分光や顕
微ラマン分光、顕微発光分光は、いずれも微小部分の発
光を顕微鏡で拡大して分光を行うため、拡大に逆比例し
て光量は少なくなる。したがって、拡大率を大きくする
につれてますます顕微分光は困難となる。そこで、高感
度な顕微分光装置が要求される。

しかし、このような極微弱光の分光を顕微鏡下で行うた
めには、できるだけ光の損失を少なくして測定すること
が望ましい。そのためには、光束利用率（スルーブツト
）を大きくするために出射立体角を大きくとれる光学系
にして、−度に多数の波長の光を測定する同時測光の優
位性を有する検出系がよい。すなわち、コリメーター系
、集光系とも明るい光学系を採用するとともに、波長走
査を行わないで同時に多波長のスペクトル分析ができる
ポリクロメーターの設計思想をとり入れた高感度多波長
分光装置が必要である。しかしながら、従来の分光装置
にあってはこの要求を満足するものはなかった。

すなわち、従来の回折格子を用いた分光器は、基本的に
モノクロメータ−であるため、入射スリットと出射スリ
ットが必須であり、そのため波長走査が必要となり、そ
のとき出射スリット以外の光は捨ててしまっているため
同時測光の優位性はない。また、出射面にスペクトル分
布を検出する１次元又は２次元光分布検出器を配する構
成となっていないため、単に出射スリットをはずして検
出器をつけただけでは、焦点面の問題、収差の問題があ
りうまくいかない。そして、コリメーター系、集光系と
もに反射鏡を軸外しで用いているため、収差によるスペ
クトル線像の曲がりが生じ、Ｆナンバーはあまり小さく
できず、分光器の明るさには限界があり、Ｆ＝３以下の
ものは実用化されていなかった。このような従来の分光
器の反射鏡として放物面鏡を用いて、Ｆ＝１の分光器が
最近開発された。しかしながら、集光鏡（放物面鏡）を
軸外しの状態で用いているため、スペクトル線像が曲が
ってしまい、１次元又は２次元光分布検出器を配置して
正確なスペクトル分布を求めることは困難であるという
大きな問題の他、高感度で検出器を用いるため検出面を
冷却する必要が生じ、そのため検出面の結露を防ぐため
の手段として、１次元又は２次元光分布検出器の光電面
の前面に比較的厚さのある断熱用の真空チャンバーを配
置しなければならないことから生じる、集光用の放物面
鏡の焦点距離を長くしなければならないという問題があ
る。さらに、凹面回折格子を用い、検出器としてアレイ
状の検出器を用いたポリクロメーターが最近販売された
が、凹面回折格子の直径、曲率半径に限界があるため、
明るさに限界があり不充分である。一方、極微弱発光の
分光分析のために、三面コモンパス干渉計、四角コモン
パス干渉計、複屈折偏光干渉計等を用いた静止型干渉分
光法を利用することが提案されているが、その後の検討
の結果、発光試料面の面積がとれるので、分光器より明
るいとの指摘に疑問が出てきた。また、これらの干渉計
においては、従来の分光器より明るい光学系を採用して
いるが、これは鏡の代わりにより明るいレンズを使用し
ていることによるものであり、干渉計の特性ではない。

そして、回折格子の横幅より検出器アレイの横幅が小さ
い現状では、これらの幅の大きさがそれぞれの分光シス
テムの分解能を決定するものであるところから、静止型
干渉分光法の分解能は分光器より悪く、また、エネルギ
ーの点からは、分光器の場合、入射スリットの幅を広げ
ると分解能１ま悪くなる代わりにエネルギーはかせげる
が、静止型干渉分光法ではこのようなことはできない。

そして、例えば、従来のレーザーラマン分光装置と顕微
鏡とを組み合わせ、１μｍ程度の局所領域のラマン分光
スペクトルを測定できるようにしたものとして、第１１
図に示したブロック構成図を有する顕微ラマンシステム
が開発されているが、この顕微ラマンシステムは顕微鏡
部分とレーザーラマン分光装置部分との結合機構が複雑
になっている。

〔発明が解決しようとする課題〕

以上のとおりの現状であるため、従来の分光器ないし分
光法を用いて、生物発光、化学発光、励起光による極微
弱蛍光等を呈する微小物体からの極微弱発光の分光分析
、特に同時に多波長のスペクトル分布を求めることは困
難であった。

したがって、本発明の目的は、上記した従来の分光器な
いし分光法を用いた顕微分光装置の欠点を克服し、極め
て明るく、小型で、生物発光、化学発光、励起光による
極微弱蛍光等の極微弱光のスペクトル分布を波長走査な
しに同時に求めることができるポリクロメーターの技術
思想による新規な高感度多波長分光装置を用いた高感度
顕微多波長分光装置を提供することである。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の高感度顕微多波長分光装置は、試料の拡大像を
形成する顕微鏡光学系と、試料の拡大像の微小領域又は
ある程度の広がりのある領域からの光を点状ないし線状
に限定して射出する光学系、この限定して射出する光学
系の点状ないし線状の射出端を焦点としそこから出る光
をとり入れて平行にする明るいコリメーターレンズ、コ
リメーターレンズによって平行にされた光を回折して分
光する反射型回折格子、反射型回折格子によって分光さ
れた平行光を像面上にスペクトル像として結像する結像
レンズ、及び、結像レンズの像面上に配置された高感度
１次元又は２次元光検出器からなる高感度多波長分光装
置とから構成されていることを特徴とするものである。

そして、励起光による極微弱発光の分光のためには、顕
微鏡光学系が、波長固定（し７ザー）又は波長遺沢可能
な試料の励起用光源を有し、その励起用光源により照射
された試料の再放出光の拡大像を形成するように構成さ
れているものである。

生物発光、化学発光等の極微弱な自然発光の分光検出の
ためには、高感度多波長分光装置が、反射型回折格子と
してブレーズド回折格子を用い、分光装置の各構成要素
を一１次の回折光をスペクトル像としてとり出し可能に
配置することが望ましく、ラマン散乱、蛍光等の励起光
による極微弱発光の分光検出のためには、反射型回折格
子としてブレーズド回折格子を用い、分光装置の各構成
要素を＋１次の回折光をスペクトル像としてとり出し可
能に配置することが望ましい。

上記の高感度多波長分光装置の変形として、コリメータ
ーレンズと結像レンズとを１つの兼用レンズによって兼
用させ、この兼用レンズを反射型回折格子の前面に平行
に配置し、兼用レンズの焦点面上に試料の拡大像の微小
領域又はある程度の広がりのある領域からの光を点状な
いし線状に限定して射出する光学系の点状ないし線状の
射出端を位置させて、兼用レンズの像面上に高感度１次
元又は２次元光検出器を配置するようにすることもでき
る。

また、試料の拡大像の微小領域又はある程度の広がりの
ある領域からの光を点状ないし線状に限定して射出する
光学系としては、スリットないしピンホールを用いても
よいし、光コンセントレイターをを用いてもよい。

さらに、上記のような高感度多波長分光装置の高感度１
次元又は２次元光検出器を除いた分光器を同種又は種類
を異ならして２以上多段に配置し、加分散又は差分散の
配列にすることにより、数回回折光を利用して、角分散
を制御することにより、より分解能を向上させた高感度
多波長分光装置にすることができる。

〔作用〕

本発明の高感度顕微多波長分光装置に用いられている高
感度多波長分光装置においては、試料の拡大像の微小領
域又はある程度の広がりのある領域からの光を点状ない
し線状に限定して射出する光学系が、顕微鏡光学系によ
って形成された試料の拡大像からの光を点状又は線状光
源としてコリメータレンズに入射させ、コリメータレン
ズは試料の拡大像からの光を漏れなく平行度の高い平行
光線にして反射型回折格子に入射させる。したがって、
反射型回折格子はその分解能を十分に発揮するとともに
極微弱光を分光するようになる。また、コリメータレン
ズと結像レンズとは、反射型回折格子に極近接して配置
できるので、装置の小型化が実現できる。そして、コリ
メータレンズと結像レンズとして、Ｆナンバーが可能な
限り小さい明るいレンズを使用することができるので、
両レンズの合成糸となる高感度多波長分光装置全体の明
るさを十分に大きくすることができ、高感度１次元又は
２次元光検出器と組み合わせることにより、生物発光、
化学発光、励起光による極微弱蛍光等の極微弱光の同時
多波長分析が可能になり、特に、生物発光、化学発光、
励起光による極微弱蛍光等を利用した生体、微量成分の
研究手段として有効なものである。したがって、本発明
の高感度顕微多波長分光装置は、多波長分光装置として
、上記のような生物発光、化学発光、励起光による極微
弱蛍光等を呈する微小物体からの極微弱光の多波長同時
分光分析を簡便に行うことのできる高感度多波長分光装
置を用いるので、明るく、極微弱光の検出ができ、小型
で操作性の優れたものとなり、特に、生物発光、化学発
光、励起光による極微弱蛍光等を利用した生体の研究手
段として有効なものとなる。

〔実施例〕

本発明の高感度顕微多波長分光装置は、顕微鏡光学系と
多波長分光装置を組み合わせていて、その顕微鏡光学系
自体は、従来の顕微分光装置と同様に、対物レンズと接
眼レンズないし結像レンズからなる種々の態様の顕微鏡
光学系を使用することができる。しかしながら、従来の
ものより明るく高感度な分光装置をしかも多波長同時検
出装置として用いている。

すなわち、多波長分光装置において、生物発光、化学発
光、励起光による極微弱蛍光等の極微弱光を分光分析す
るためには、顕微鏡光学系によって拡大された試料の発
光点からの光を可能な限り多く分光系に入射させるよう
に光学系を選択する必要がある。そのため、光学系が極
微弱光発光点を見込む立体角を可能な限り大きくする必
要がある。

一方、分光系によって分光されたスペクトル線像は可能
な限り直線状に結像されなければならない。

このような要求を満足する光学系としては、現在のとこ
ろ光学ガラスレンズの組み合わせからなるＦナンバーの
小さい光学レンズしかない。光学レンズにおいては、収
差のないＦナンバーがｌ以下のものも容易に人手できる
。したがって、本発明に用いる高感度多波長分光装置に
おいては、このようなＦナンバーの小さい光学レンズを
用いる。

そして、この光学レンズによって平行にされた光束を分
光する分光系として反射型の回折格子を用い、さらに、
回折された光を結像して、スペクトル分布像を与えるた
めにも明るい光学レンズを用い、その像面にスペクトル
強度分布像を電気的に検出する高感度１次元又は２次元
光検出器を配置して、各波長の光強度を同時に検出する
。

第１図は、本発明の高感度顕微多波長分光装置の全体の
構成の１例を示したものである。この図面に示した高感
度顕微多波長分光装置は、試料Ｓの拡大像を形成する顕
微鏡光学系ｒと、その拡大像の分光すべき部分からの光
を分光検出する分光検出光学系（高感度多波長分光装置
）■とからなっており、その顕微鏡光学系Ｉは、試料Ｓ
の照明光源（図示せず。試料自身が極微弱光を発生する
場合には必要ない。）、試料載置台（図示せず）、像側
焦点Ｆｌを有する対物レンズ系１、及び、像側焦点Ｆ２
を有する接眼レンズ系２からなっている。この顕微鏡光
学系■においては、試料Ｓの中間像Ｓａが対物レンズ系
１により、対物レンズ系の像側焦点Ｆｌから距離１１の
位置に結像し、さ°らに、その拡大像ｓｂが接眼レンズ
系２により、接眼レンズ系の像側焦点Ｆｌから距離２□
の位置に形成されるようになっている。

第１図の顕微鏡光学系Ｉは発光試料又は吸収試料を分析
する際に用いるものであるが、第２図に示した本発明の
高感度顕微多波長分光装置のように、試料Ｓの励起用光
源Ｌｓを備え、励起用光源Ｌｓにより照射された試料Ｓ
の蛍光、ラマン放射光等の拡大像を形成するようにして
もよい。これにより、局所領域の試料の蛍光分析、ラマ
ン分析等をすることが可能となる。この場合、励起用光
源Ｌｓとしては、蛍光分析、ラマン分析等に使用する公
知の励起用光源を用いることができるが、特に、波長固
定のレーザーや波長選択可能なものが使用できる。

分光検出光学系■は、このような顕微鏡光学系Ｉにより
形成された試料Ｓの拡大像ｓｂの微小領域又はある程度
の広がりのある領域からの光を点状ないし線状に限定し
て射出する光学系３、この点状ないし線状に限定された
位置を焦点とし、そこから出る光を可能な限り多くとり
入れて平行にするＦナンバーの小さいコリメーターレン
ズ４、コリメーターレンズ４によって平行にされた光を
回折して分光する反射型回折格子５、及び、反射型回折
格子５によって分光された平行光を像面Ｐ上にスペクト
ル像として結像する結像レンズ６からなる分光器と、ス
ペクトル像面上に配置された高感度１次元又は２次元光
検出器７とから構成されているものである。高感度１次
元又は２次元光検出器７の出力側にはコンピュータ８が
接続されていて、それからの出力に基づいてスペクトル
分析を行う。なお、反射型回折格子５は、検出スペクト
ル範囲を調整するために、点Ｃを中心として、図示した
矢印のように回転調節可能に構成されている。

この場合、拡大像ｓｂの微小領域又はある程度の広がり
のある領域を点状ないし線状に限定して射出する光学系
３としては、試料の拡大像ｓｂの微小領域又はある程度
の広がりのある領域からの光を点状あるいは線状にして
とり出せるものであれば特に制限はない。例えば、第３
図に示した分光検出光学系■のように、拡大像ｓｂの像
面上にピンホール又はスリット３ａを配置し、拡大像Ｓ
ｂからの光を絞るようにしてもよいし、あるいは、第４
図に示した分光検出光学系Ｈのように、拡大像ｓｂから
の光を集光窓から集光し、点状又は線状の射出端に射出
する光コンセントレイク−３ｂにより構成してもよい。

ただし、拡大像Ｓｂの微小領域又はある程度の広がりの
ある領域を点状ないし線状に限定して射出する光学系３
の大きさは、穴の大きさにより、例えば直径りの丸穴と
したとき、λ／Ｄの回折角の広がった光束として分光器
の方に入射する。すなわち、拡大像ｓｂの空間分解能を
高めるため、穴の直径りを小さくすると回折角は大きく
なり、広がった光束となって分光器に入射する。一方、
穴の直径りを大きくすると、回折角は小さくなり、顕微
鏡のレンズ系で決まる広がり角の光束になるため、光束
の損失は少ないが、空間分解は悪くなる。空間分解と試
料の発光により、光学系３の直径を選択することが、感
度をよくする上で考慮する必要がある。

このような、高感度多波長分光装置Ｈにあっては、回折
格子５の格子間隔をｄ、回折格子４への入射角を１、回
折格子５からの回折角をβ、波長をλ、回折次数をｍと
すると、 ｓｉｎ　ｉ　＋ｓｉｎβ＝ｍλ／ｄ の関係を満足するように、試料Ｓの拡大像ｓｂからの極
微弱な入射光が回折され、高感度１次元又は２次元光検
出器７上にスペクトル分光された像が結像されるので、
高感度１次元又は２次元光検出器７からの出力をコンピ
ュータ８によって分析し、その像の座標とその点の像強
度を求めることによって、生物発光、化学発光、励起光
による極微弱蛍光等を呈する微小物体からの極微弱発光
の分光特性を同時に測定することができる。ところで、
上記式において、ｍ−−１の関係を満足させるように、
結像レンズ６及び高感度１次元又は２次元光検出器７を
配置する基本タイプ（−１次斜入射分光型）と、ｍ−＋
１の関係を満足させるように、結像レンズ６及び高感度
１次元又は２次元光検出器７を配置する基本タイプ（＋
１次斜入射分光型）とがある。第５図（ａ）に−１次斜
入射分光型を、第５図（′ｂ）に＋１次斜入射分光型を
示す。これらの場合、反射型回折格子４としてはブレー
ズド回折格子を用い、図示のように配置する。

第５図（ａ）の−１次斜入射分光型及び第５図（ｂ）の
＋１次斜入射分光型分光器におけるコリメーターレンズ
４と結像レンズ６の口径の関係を考えてみる。第６図（
ａ）は−１次斜入射分光型について検討するための光路
図であるが、コリメーターレンズ４の直径をＤ１％回折
格子の幅をｌ、中心波長の回折角をβｃ１、結像レンズ
６の直径をＤｏとするＤｉ　　＝ｊ７ｃｏｓ　　ｉ Ｄ、　＝ｊ’ｓｉｎ　（２／π−βｃ、）＝ｆｆｌｃｏ
ｓ　βＣ。

ところで、このタイプの場合、光検出器７に有効に光が
達するためには、Ｉ〈βｃ８であるから、Ｄｉ＞Ｄｏ の条件を満足するように結像レンズ６の口径を選ぶこと
が必要である。同じようにして、第６図ゎ）の＋１次斜
入射分光型について検討すると、Ｄ、　＝ｊｉ！ｃｏｓ
　１ Ｄｏ＝ｊ！ｃｏｓβＣ。

このタイプの場合、光検出器７に有効に光が達するため
には、ｉ〉β。であるから、 Ｄｉ＜Ｄｏ の条件を満足するように結像レンズ６の口径を選ぶこと
が必要である。この検討に基づいて、分光すべき光の種
類に応じて何れのタイプを選択すべきかを検討する。−
１次斜入射分光型は、ブレーズド回折格子を第６図（ａ
）に示したように、短い回折面にも入射光が当たるよう
に配置しなければならないため、この面から反射光が生
じて迷光となり、バックグラウンド光を増加させる。こ
れに対して、＋１次斜入射分光型は、第６図（ｂ）に示
すように、ブレーズド回折格子の短い回折面には光が当
たらないように回折格子が配置されるため、迷光は生じ
ないが、上記したように結像レンズ６の口径がコリメー
ターレンズ４のそれより大きい必要がある。ところが、
本発明に用いる高感度多波長分光装置においては、コリ
メーターレンズ４の口径は可能な限り大きなものである
ので、それ以上の口径のレンズを結像レンズとして用い
ることは困難である。したがって、＋１次斜入射分光型
のものは、結像レンズ６としてコリメーターレンズ４の
口径程度のものを用いる場合、損失の大きいものという
ことができる。以上のとおりであるから、生物発光、化
学発光のような極微弱な自然発光の分光検出のためには
、−１次斜入射分光型のものが適していると言える。こ
れに対して、迷光の影響が重大なラマン散乱、蛍光等の
励起光による極微弱発光の分光においては、多少のロス
はあっても、迷光が信号光を隠さない＋１次斜入射分光
型のものがより適していると言える。なお、当然ながら
、レンズの設計において、自由にコリメーターレンズ、
結像レンズの口径、Ｆナンバーが実現できるなら、生物
発光、化学発光のような極微弱な自然発光の分光検出の
ためにも、＋１次斜入射分光型のものがより優れている
と言うことができる。また、分解能をよくする必要があ
るときも、＋１次斜入射分光型のものがよい。

なお、コリノーターレンズ４、結像レンズ６としては、
球面レンズからなるＦナンバーの小さいレンズだけでは
なく、非球面レンズ、フレネルレンズを用いてもよい。

このような高感度多波長分光装置Ｈにより試料の拡大像
Ｓｂからの光を分光分析するに際しては、上記第１〜３
図に示したように、結像レンズ６から射出する回折光が
０次光以外に一１次光、＋１次光等の光を含むので、さ
きに述べたように適当な次数の回折光の中心波長が高感
度１次元又は２次元光検出器７の中心にくるように結像
レンズ６を配置するとともに、回折格子５の角度を調節
する。

ところで、高感度多波長分光装置Ｈについて、第１図に
示した基本タイプの変形として、コリメーターレンズと
結像レンズとを１つのレンズによって兼用させる分光装
置が考えられる。第７図（ａ）に示すように、反射型回
折格子５の前面にＦナンバーの小さいコリメーター・結
像兼用レンズ９を平行に配置し、この兼用レンズ９の焦
点に入射スリット３を位置させ、回折格子５による回折
光の兼用レンズ９による像位置に高感度１次元又は２次
元光検出器７を配置して、試料からの光を垂直に入射さ
せるものである（垂直入射分光型）。入射スリット３と
高感度１次元又は２次元光検出器７との配置位置を交換
して、第７図〜〉のように試料からの光を斜め方向から
入射させるように配置してもよい（斜入射分光型）。図
の（ｂ）の斜入射分光型のものが、図の（ａ）の垂直入
射分光型のものより、回折光の角度分解能に優れており
、光束利用では、図の（ａ）の垂直入射分光型のものが
優れていまた、高感度１次元又は２次元光検出器７とし
ては、第８図に示したように、２次元光子計数管と低残
像ビジコンを組み合わせたもの（ＶＩＭＳ）、第９図の
ような光子計数型画像計測装置（ＰＩＡＳ）、さらには
、ダイオード光検出器をアレー状に並べたアレー光検出
器、ＣＣＤ等が含まれる。

この中のＶ　ＩＭＳとＰＩＡＳについて、簡単に説明す
ると、第８図において、２次元光子計数管２１の光電面
２２に入射した光子は光電子に変換され、この光電子は
メツシュ２３、電子レンズ２４を経て２段接続のマイク
ロチャンネルプレート（ＭＣＰ）２５に入射して増幅さ
れ、出射面の蛍光面２６に当って輝点を形成する。この
輝点はレンズ２７によって低残像ビジコン２８の光電面
に結像し、ビジコン２８の出力から光子が対応する輝点
の２次元の位置がパルス信号とし求められるので、この
輝点の分布を得ることによって極微弱光スペクトル分布
画像が求められる。

また、第９図のＰＩＡＳにおいては、光電面２２からＭ
ＣＰ２５に至るまでの構成は第８図のものと同様であり
（もっとも、第９図のＭＣＰ２５は３段接続である）、
ＭＣＰ２５から出る電子群はその後に配置されたシリコ
ン半導体装置検出器（ＰＳＤ）２９に入射し、電子衝撃
効果によってさらに増幅され、パルス信号としてＰＳＤ
２９から出力される。ＰＳＤ２９はその周辺に４個の信
号出力電極３０を持つ電荷分配型の位置検出器であり、
ＰＳＤ２９内部で発生した電荷は、表面の抵抗層を経て
これら４個の電極３０にその発生位置に応じて分配され
る。この結果、ＰＳＤ２９に入射する電子群の重心位置
すなわち、輝点位置に対応する信号が４個の電極３０か
ら得られる。ＰＳＤ２９から得られるパルス信号はアン
プ３２で増幅された後、位置演算装置３１に導かれる。

ここで、これらパルス信号を積分回路３３で積分して各
電極３０からの電荷量を求める。次に、これらの信号を
加減算回路３４に導き、ウィンドゲート３５を介して除
算器３６に導いて位置信号に変換し、ＡＤ変換器３７で
ＡＤ変換して出力する。

この出力信号を処理して輝点の分布を求め、極微弱光ス
ペクトル分布画像を得ることができる。なお、第８図、
第９図において、符号り。は入射光子（矢印）を光電面
２２上に結像させる対物レンズを示している。

ところで、高感度多波長分光装置■として、第１〜７図
に示したものに限らず、分光器を２以上多段に配置して
、角分散を数回回折光を利用して加分散配列に下ること
により、全体の分解能を向上させたものを用いることも
できる。もちろん、差分散の配列もできる。このような
多重多波長分光装置の構成例を第１Ｏ図に示す。図中（
ａ）は、第５図（ａ）の−１次斜入射分光型分光器Ａ１
〜Ａ、を４段直列に配列して、全体として方形に構成し
たものであり、同じ＜　（ｂ）のものは、第５図（ｂ）
の＋１次斜入射分光型分光器Ａ１〜Ａ４を４段直列に配
列して、全体として方形に構成したものであり、（Ｃ）
のものは、＋１次斜入射分光型分光器Ａ１〜Ａ、を３段
直列に配列して構成したものである。なお、段数は上記
に限られるものではない。

以上のように、本発明の高感度顕微多波長分光装置にお
いて、拡大像ｓｂの微小領域又はある程度の広がりのあ
る領域を点状ないし線状に限定して射出する光学系３、
Ｆナンバーの小さいコリメータレンズ４、反射型回折格
子５、結像レンズ６、高感度１次元又は２次元光検出器
７を有する高感度多波長分光装置■は、生物発光、化学
発光、励起光による極微弱蛍光等を呈する微小物体の拡
大像ｓｂからの極微弱光の分光分析に際して、次のよう
な優れた作用を実現する。すなわち、光学系３が拡大像
ｓｂからの光を点状又は線状光源としてコリメータレン
ズ４に入射させるので、コリメータレンズ４は拡大像ｓ
ｂからの光を漏れなく平行度の高い平行光線にして反射
型回折格子５に入射させる。したがって、反射型回折格
子５はその分解能を十分に発揮するとともに極微弱光を
分光するようになる。また、コリメータレンズ４と結像
レンズ６とは、反射型回折格子５に極近接して配置でき
るので、装置の小型化が実現できる。さらに、コリメー
タレンズ４と結像レンズ６にはＦナンバーの可能な限り
小さい明るいレンズを使用することができるので、両レ
ンズの合成糸となる装置全体の明るさを十分に大きくす
ることができ、高感度１次元又は２次元光検出器７と組
み合わせることにより、従来困難であった生物発光、化
学発光、励起光による極微弱蛍光等の極微弱光の多波長
同時分析が可能になる。

〔発明の効果〕

以上、詳しく説明したように、本発明の高感度顕微多波
長分光装置は、その多波長分光装置として、生物発光、
化学発光、励起光による極微弱蛍光等を呈する微小物体
からの極微弱光の多波長同時分光分析を簡便に行うこと
のできる高感度多波長分光装置を用いるので、明るく、
極微弱光の検出ができ、小型で操作性の優れたものとな
り、特に、生物発光、化学発光、励起光による極微弱蛍
光等を利用した生体の研究手段として有効なものである
。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の高感度顕微多波長分光装置の１実施例
の光学配置図、第２図は他の実施例の光学配置図、第３
図は本発明の高感度顕微多波長分光装置に用いる高感度
多波長分光装置のｌ実施例の光学配置図、第４図は高感
度多波長分光装置の他の実施例の光学配置図、第５図は
第３図の高感度多波長分光装置の２つの基本タイプの光
学配置図、第６図は第５図の基本タイプを検討するため
の光路図、第７図は本発明の高感度顕微多波長分光装置
に用いる高感度多波長分光装置の他の実施例の光学配置
図、第８図は本発明において用いる２次元光子計数管と
低残像ビジコンを組み合わせたものの断面図、第９図は
他の光子計数型画像計測装置の断面図、第１０図は本発
明において用いる高感度多重多波長分光装置の光学配置
図、第１１図は従来の顕微ラマンシステムのブロック構
成図である。 Ｓ：試料、■：顕微鏡光学系、■：高感度多波長分光装
置、１：対物レンズ系、２：接眼レンズ系、Ｓａ　；試
料の中間像、Ｓｂ：拡大像、Ｌｓ　：励起用光源、分光
器Ａ　Ｉ””Ａ　４　　：分光器、３：試料の拡大像の
微小領域又はある程度の広がりのある領域からの光を点
状ないし線状に限定して射出する光学系、３ａ：入射ス
リット、３ｂ：光コンセントレイター、４：コリメータ
ーレンズ、５：反射型回折格子、６；結像レンズ、７；
高感度１次元又は２次元光検出器、８：コンピュータ、
９：コリメーター・結像兼用レンズ、２１：２次元光子
計数管、２２：光電面、２３：メツシュ、２４：電子レ
ンズ、２５：マイクロチャン不ルプレート（ＭＣＰ）　
、２６　：蛍光面、２７：レンズ、２８：低残像ビジコ
ン、２９：シリコン半導体装置検出器（ＰＳＤ）　、３
０　：信号出力電極、３１：位置演算装置、３２：アン
プ、３３：積分回路、３４：加減算回路、３５：ウィン
ドゲート、３６：除算器、３７：ＡＤ変換器、Ｌｏ　：
対物レンズ

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）試料の拡大像を形成する顕微鏡光学系と、試料の
   拡大像の微小領域又はある程度の広がりのある領域から
   の光を点状ないし線状に限定して射出する光学系、この
   限定して射出する光学系の点状ないし線状の射出端を焦
   点としそこから出る光をとり入れて平行にする明るいコ
   リメーターレンズ、コリメーターレンズによって平行に
   された光を回折して分光する反射型回折格子、反射型回
   折格子によって分光された平行光を像面上にスペクトル
   像として結像する結像レンズ、及び、結像レンズの像面
   上に配置された高感度１次元又は２次元光検出器からな
   る高感度多波長分光装置とから構成されていることを特
   徴とする高感度顕微多波長分光装置。
2. （２）顕微鏡光学系が、波長選択可能な試料の励起用光
   源を有し、その励起用光源により照射された試料の再放
   出光の拡大像を形成するように構成されていることを特
   徴とする請求項１記載の高感度顕微多波長分光装置。
3. （３）高感度多波長分光装置が、生物発光、化学発光等
   の極微弱な自然発光の分光検出のために、反射型回折格
   子としてブレーズド回折格子を用い、分光装置の各構成
   要素を−１次の回折光をスペクトル像としてとり出し可
   能に配置したことを特徴とする請求項１記載の高感度顕
   微多波長分光装置。
4. （４）高感度多波長分光装置が、ラマン散乱、蛍光等の
   励起光による極微弱発光の分光検出のために、反射型回
   折格子としてブレーズド回折格子を用い、分光装置の各
   構成要素を＋１次の回折光をスペクトル像としてとり出
   し可能に配置したことを特徴とする請求項１又は２記載
   の高感度顕微多波長分光装置。
5. （５）高感度多波長分光装置が、コリメーターレンズと
   結像レンズとを１つの兼用レンズによって兼用させ、こ
   の兼用レンズを反射型回折格子の前面に平行に配置し、
   兼用レンズ７の焦点面上に試料の拡大像の微小領域又は
   ある程度の広がりのある領域からの光を点状ないし線状
   に限定して射出する光学系の点状ないし線状の射出端を
   位置させ、兼用レンズの像面上に高感度１次元又は２次
   元光検出器を配置したことを特徴とする請求項１又は２
   記載の高感度顕微多波長分光装置。
6. （６）高感度多波長分光装置が、試料の拡大像の微小領
   域又はある程度の広がりのある領域からの光を点状ない
   し線状に限定して射出する光学系として、スリットない
   しピンホールを用いたことを特徴とする請求項１から５
   のいずれかに記載の高感度顕微多波長分光装置。
7. （７）高感度多波長分光装置が、試料の拡大像の微小領
   域又はある程度の広がりのある領域からの光を点状ない
   し線状に限定して射出する光学系として、光コンセント
   レイターを用いたことを特徴とする請求項１から５のい
   ずれかに記載の高感度顕微多波長分光装置。（８）高感
   度多波長分光装置が、請求項１、３〜７のいずれかに記
   載の、試料の拡大像の微小領域又はある程度の広がりの
   ある領域からの光を点状ないし線状に限定して射出する
   光学系、コリメーターレンズ、反射型回折格子、及び、
   結像レンズからなる分光器を、同種又は種類を異ならし
   て２以上多段に配置し、加分散又は差分散の配列にする
   ことにより、数回回折光を利用して角分散を制御するこ
   とを特徴とする高感度顕微多波長分光装置。