JPH037236A - ヘルペスウイルスの吸着阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヘルペスウィルスの細胞への吸Ｍ　阻害剤に関
する。

〔従来の技術〕

ヘルペスウィルスが種々の疾患の原因となることはよく
知られている。ヘルペスウィルスの一例として単純ヘル
ペスウィルスが挙げられるが、それは水痘−帯状庖疹ウ
ィルス、サイトメガロウィルス、ＥＢウィルス等からな
る、ヘルペスウィルス属の最も代表的なウィルスである
。分子量８５−１００ＸＩＯダルトンの二重鎖ＤＮＡを
有し、正２０面体のカプシド及びエンベロツブがこれを
包んでいる。エンベロツブ上には抗原性の異なる特異的
糖蛋白を６−８分子種持つことが知られている（ロング
ネッカー等Ｐｒｏｃ、、；、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、５
ｃｉＵＳＡ８４４３０２１９８７）。本ウィルスの亜型
として１型と２型が有り、前者は主に口内炎を、後者は
主に陰部ヘルペスを起こすとされているが、厳密な区別
はない。本ウィルスが原因とされている疾病の主なもの
分列記すると、前述した２疾患のほか、角膜炎、髄膜炎
、上下気道感染、顔面神経性麻痺と多岐にわたっている
。本ウィルスは、初感染を起こした後、不顕性感染を成
立させ、成人のほとんどが抗体陽性となる。しかし、近
年成人の抗体陰性率が増加しており、特に妊産婦の初感
染はきわめて重篤な疾患を胎児に起こすことが明らかに
されている。現在まで皿々の抗ウィルス剤の開発が本ウ
ィルスを対象に進められてきているが、臨床的にその有
効性が確立されている薬剤は少なく、アデニンアラビノ
シドとアシクロビルの２剤のみである。

また、近年、椎茸の成分が有する抗腫瘍性成分が臨床に
供されている。たとえば、クレスチン（柳川等瘤と化学
療法１１　２１５５　１９８５）、レンチナン（菅等Ｃ
ａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４４　５１６２１９８
４）がこれに相当し、その糖蛋白、あるいは多糖成分が
生理活性を示すとされている。また、硫酸根を有する多
糖類、たとえばテキストラン硫酸力、抗エイズウイルス
活性を示すことが報告された（満屋等５ｃｉｅｎｃｅ２
４［）　　６４Ｇ１９８ｇ　）。

さらに、椎茸菌糸体培養物の水抽出物はＬ　Ｅ　Ｍと略
称され、その製造法は特公昭５３−１０１１７号公報に
記載されている。Ｌ　Ｅ　Ｍはタバコモザイクウィルス
の抑制に有効な農薬として利用され、肝炎に対する治療
効果も示、唆されている（原円ら、肝胆膵１４巻、２号
、３２１頁；菅野ら、ＣａｎｃｅｒＬｅｔｔｅｒｓ　　
１７　、１０９頁（１９８２）ｉ鈴木ら、医学のあゆみ
１３８４４１．１９８６　）。ＬＥＭは、試験管内では
、鳥骨髄腫ウィルス由来逆転写酵素の活性を、タバコモ
ザイクウィルスの几ＮＡを基質として測定する時、その
活性の阻害を示すことが確認された。本薬剤の糖組成を
分析すると、極端にアラビノース、キシロース含量が高
く、きわめて特徴的であることも明らかになった。これ
は、その糖含量のほとんどをグルコースとするクレスチ
ン、レンチナンとは、明らか（（性格を異にするもので
あった。

〔辛明の解決しようとする課題〕

しかし、有効性が高いとされている前記のアシクロビル
等も他の核酸のアンタゴニストの例に漏れず、毒性の高
いものである。そこで、異なった作用機序で治療効果を
示し、より安全で効果的な薬剤が待ち望まれている。

そして、人体に重篤な副作用を与えずに、単純ヘルペス
ウィルスを始めとするヘルペスウィルス属による感染と
効果的に阻害する薬剤で満足できるものはいまだない。

本発明は、まったく新たな見地から、核酸アナログに類
しない、きわめて毒性の低い薬剤を提供しヘルペスウィ
ルスが細胞に吸着するのを阻害してウィルスの増殖を阻
止しようとするものである。

（課題を解決するための手段〕 本発明者らはＬＥＭについて研究を続けた結果、驚くべ
きことに、本物質が極めて強い単純ヘルペスウィルスの
吸着阻害活性を有することを発見した。すなわち、本発
明者らは、種々の濃度に希釈したＬＥＭを種々のウィル
スの希釈液と１ないし３時間３７°Ｃで反応させた後、
３０分ないし２時間それぞれのウィルスに感受性のある
動物細胞と接触させた。ウィルス液を洗いだしだ後１な
いし１４日間組織上のプラークの形成の有無、その数を
観察した。その結果、ＬＥＭは、種々のウィルスの中で
、極めて強くヘルペスウィルス類によるプラークの形成
を阻害した。たとえば、単純ヘルペスウィルスに対して
は、猿腎由来Ｖｅｒｏ細胞上において、５−１０μ／ｍ
ｌで５０％の阻害を示した。クレスチン及びレンチナン
中には、まったくこのような活性は検出されなかった。

この方法を指標として、ＬＥＭの分画精製を進めた。本
物質の水溶液を中性に調整した後有機溶媒、たとえば、
メタノール、エタノールなどで沈澱させ、その沈澱を、
水または緩衝液、たとえばリン酸緩衝液に溶解した後イ
オン交換クロマトグラフ法および疎水クロマトグラフ法
を利用して分画した。それぞれの分画は、さらにゲルろ
過クロマトグラフ７によって分画された。その結果、本
物質中、電気的に中性領域（ｐＨ５−８，５）で、分子
量は、１０，０００−１，０００，０００ダルトンに相
当する分画に強い活性を示すことが明らかになった。さ
らに、本物質を除蛋白した際にその活性が減弱されるこ
と、分子量分布、蛋白質分布及び糖の分布が相関するこ
とから、活性物質の本質は、糖蛋白あるいはプロテオグ
ルカンである可能性が示唆された。また、このようにし
て得られた分画のうちには、１型ＨＳ　Ｖに対して１μ
ｇ　７ｍ　ｌの濃度で５０％阻害を示すものもあった。

この活性は２型Ｈ８Ｖに対しても同様であった。デキス
トラン硫酸をこの系で測定した時、活性は示すものの、
５（１％阻害洸は、最低でも５μｇ　７ｍ　ｇの濃度が
必要であり、又、２型に対しては更に高濃度が必要であ
った。ＬＥＭの経口投与における急性毒性はラットおよ
びマウスで測定した時、ＬＤｓｏが１５ｇ／ｋｇと、極
めて毒性の低い物であった。亜急性毒性試験では、消化
不良と推定される軟便の例が若干認められた以外に、用
量相関性の変化は見られなかった。

本発明は上記の発見に基づくもので、椎茸菌糸体培養物
の水抽出物または分子量１０，０００ないしｉ、ｏｏｏ
、ｏｏｏダルトンに相当するその分画を含有してなるヘ
ルペスウィルス疾患の治療剤または同ウィルスの吸着阻
害剤である。

椎茸菌５糸体の培養は、子実体を採取する目的で広く行
われているが、子実体形成前の段階で培養物を水で抽出
するのが好ましい。その培養や抽出を特公昭５３−１０
１１７号公報の記載に準じて行い　バガスと米ぬかより
なる培地に椎茸菌を培養して、得られる抽出物（ＬＥＭ
）を本発明における抽出物として用いてもよい。

水抽出物の分子ｉ１０，０００ないし１，０００．００
０ダルトンに相当する分画は、水抽出物をゲルろ過クロ
マトグラフィに付して得ることができる。

前記の水抽出物または精製分画はヘルペスウィルスの細
胞への吸着を阻害するために非経口的にまたは経口的に
投与されうる。

ヘルペスウィルスの侵襲による皮膚症状を治療したり、
ウィルスの吸着を阻害するには本発明の水抽出物または
分画をウィルスの侵襲したあるいはその可能性のある皮
膚、粘膜などに局所的に適用するに適した外用剤の形に
調製して用いるのがよい。そのような皮膚や粘膜の位置
は、たとえば口腔、咽喉、鼻腔、眼瞼、肛門、直腸、尿
道、腟のような人体の開口部または外傷部ならびにそれ
らの周辺である。

外用剤の形における本発明の治療剤または吸着阻害剤は
、必要に用じて、原剤、ゼリー　クリーム、パｙプ剤、
軟膏、硬膏、擦剤、液剤、噴霧剤、エアゾル剤または外
用粉剤などの網形で投与され得る。これらの外用剤はそ
れ自体既知の方法で調製することができる。水分による
有効成分の保存中の分解を防ぐためには、水抽出物また
は分画をたとえば凍結乾燥し、用に臨んで水を加えるの
が望ましい。

本発明の水抽出物または分画は、所望により、粉剤、顆
粒剤、火剤、錠剤などの形態で経口投与してもよい。こ
れらの製剤は常法により調製することができる。

また、精製分画は水溶液として注射用に供することもで
きる。

本発明の水抽出物または精製分画は外用剤中に、ＬＥＭ
として、０．１〜５％程度用いるのが好ましく、経口用
には１同量１０ないし？０，０００ｒｒ＋ｇ　を用いる
のが好ましい。精製分画はＬＥＭの数分の−の量に減ら
して用いることができる。

注射用には精製分画をＩ　−１，０００ｍｇ程度の１回
量で用いることができる。注射は筋肉内または皮下投与
により行うのが好ましい。

〔作用〕

本発明において、椎茸菌糸体の水抽出物あるいはその分
画を含む製剤はヘルペスウィルスの標的細胞との結合を
阻害し、それによって該ウィルスの感染、ウィルスに起
因する疾患の発症あるいは患部の広がりが阻止される。

以下の実施例に用いたＬＥＭは、千葉県野田市の野田食
菌工業（株）において調製され、販売されているもので
ありその物理化学的性状その他は以下に示すとｂ′りで
ある。

名称　椎茸菌糸体培養抽出物（ＬＥＭ）成分　糖　　　
　３０−３８％ 蛋白　　　１０−１２係 灰分　　　１６−１８％ 糖組成 性　　状 溶解度 水分　　　６−８％ アラビノース　　　　　３５．６−３９．０％キシロー
ス　　　　２８．８−３０．８％グルコース　　　　１
６．３−２０．０％マンノース　　　　　７．６−８．
４％ガラクトース　　　　　　４．９−６ｊ％フコース
＋ラムノース　　　　　　０４　−　１．７％淡褐色−
暗褐色の粒または粉末で味は 苦い。

水晶は水にきわめて溶けに＜＜、エタ ノール、エーテルにほとんどとけない。

水晶は吸湿性である。

を第２表に示す。

第１表　ＬＥＭの分画 ＬＥΔ１１２０ｇ 吸湿性 実施例Ｉ ＬＥＭに含まれる活性物質の性状を検討するためにその
精製を行なった。ＬＥＭ１２０ｇを蒸留水１Ｌに溶解し
、不溶物を遠心して除いた後、その上清をフェニルセフ
ァロースをもちいた疎水性クロマトグラフ法およびセフ
ァクリルＳ−３００をもちいたゲルろ過性によって分画
した。分画の方法を第１表の流れ図に、得られた分画の
糖組成リン酸緩Ｉ！Ｊ液溶出 エチレングリコール溶出 〉１０Ｇ １０Ｂ−１０８１０４−１０５ ＞２ｘｌＯ［ｌ　５ｘ１０６−　１０６−２Ｘ１０６　
　５Ｘ１０５ １０← ０５ 数字は分子量の範囲を示す 砕 実施例２ ＬＥＭによるウィルスの吸着阻害の強さを測定した。猿
腎由来Ｖｅｒｏ細胞をヌンク製２４穴組織培養用プレー
トに生育させた。単純ヘルペスウィルス１型（アラバマ
大学つィルス学教室、ホイットリイ教授より分与）Ｆ株
を０．１ｍｌ中に５０ないし１００プラーク形成単位含
むように、１係の血清（大日本製薬）を含むイーグルｋ
ｉ　Ｅ　Ｍ　（日水製薬）からなる培地で希釈した。Ｌ
　Ｅ　Ｍあるいはその分画を段階希釈したものおよび比
較したい薬剤を段階希釈したものをウィルス希釈液と等
量混合し３１°Ｃで１ないし２時間反応させた。ダルベ
ツコ−処方のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ。

日水製薬）で、プレート中の細胞を洗った後、反応液０
．１ｍｌずつを各人に加え、１時間細胞と接触させた。

細胞をＰＢＳで洗った後、０２％の寒天を含む前述した
培地を重層し固化した上で、２日間炭酸ガス静卵器中で
培養した。プラークの計数に当たって、各人の細胞は、
１ｍｌずつの１０チホルマリン（和光純薬）で固定し、
０．５ｍｌずつの０．０３％メチレンブルー（シグマ）
で染色した。結果を図１に示す。同図において、縦軸は
ＬＥＭの各希釈液で処理した細胞で得られたプラークの
数をＬＥＭで処理していない細胞で得られたプラークの
数で除して百分率で表現し、横軸に試料の濃度をとった
。それぞれロ：レンチナン、−二クレスチン、△：テキ
ストラン硫酸、〇二ＬＥＭ１・：分画４、を表わしてい
る。結果が示していることはＬＥＭが５μｇ／ｍｌ、分
画４が１μｇ　／　ｍ　１３の濃度（それぞれ糖製換算
）で、処理細胞上のプラークの形成を、コントロールの
５０％に阻害し得ることである。分画４は並行して行な
ったクレスチン、レンチナン、より５００倍以上強力で
、更にデキストン硫酸より低濃度で活性を示した。

実施例３ 実施例１で得た分画４の５，０００ｍｌ　（５０ｆｉ　
Ｆｌ／ｍｌ　）を０．９チ（Ｗ／Ｖ）の塩化ナトリウム
を含む０．０２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，８）に溶解
し、ミリポアフィルタ−を用いて除菌ろ過した後、２ｍ
ｌずつ分注し、凍結乾燥することにより注射用製剤を得
た。

実施例４ ＬＥＭ粉末を５ｇずつ分包し、経口用製剤を得た。

実施例５ １ｇの分画４に生理食塩液１０ｍ１を加え溶かした後、
親水軟膏を少量ずつ加えて練り合わせ、全量１００ｇの
軟膏を得た。

〔発明の効果Ｊ 本発明によれば、ヘルペスウィルスの細胞への吸着を阻
止できる安全性の高い薬剤が提供される。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例３における吸着阻害の強さの測定の結果
をまとめたもので、縦軸は各試料希釈液で処理した細胞
で得られたプラーグの数を無処理の細胞で得られたプラ
ーグ数で除した数値を百分率で表わし、横軸は試料の濃
度を１ｍｌ中の試量の量で表わし、口はレンチナン、閣
はクレスチン、△はデキストラン硫酸、○はＬＥＭｌ・
は分画４を表わす。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　椎茸菌糸体培養物の水抽出物または分子量１０，０
   ０００ないし１，０００，０００ダルトンに相当するそ
   の分画を含有してなるヘルペスウィルスの吸着阻害剤。 ２　椎茸菌糸体培養物の水抽出物がバガスに脱脂米ぬか
   を加えた培地に椎茸菌を培養し、子実体形成前に温水で
   抽出した抽出物である請求項１記載の吸着阻害剤。 ３　水抽出物の糖組成がアラビノース、キシロース、グ
   ルコース、マンノース、ガラクトース、フコースおよび
   ラムノースであり、分画の糖組成がアラビノース、キシ
   ロース、グルコース、マンノースおよびガラクトースで
   ある請求項１または２記載の吸着阻害剤。 ４　ウィルスが単純ヘルペスウィルスである請求項１ま
   たは２記載の吸着阻害剤。