JPH0372873A - ネコ×マウスヘテロハイブリドーマおよびネコ免疫グロブリンλ鎖の定常領域をコードする遺伝子断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 を 本発明は、ネコ免疫グロブリンを産生ずる新規なネコ×
マウスヘテロハイブリドーマ、およびこのハイブリドー
マを用いたネコ免疫グロブリン遺伝子の調製法、さらに
ネコ免疫グロブリンの定常領域をコードする遺伝子断片
に関する。

匙艷曵１遣 ネコはベットとして昔から人間に愛着のある動物である
が、近年の欧米では、　「伴侶、仲間、相棒としての動
物Ｊ　　（Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ　５ｐｅｃｉｅｓ　）と
称され、人間社会の一員としての地位を獲得しつつある
。

一方では、医学、薬学、畜産学、獣医学から心理学にい
たる実験動物としての貢献度は従来から大きなものであ
ったが、近年では医薬品の効果検定や安全性試験にｍｉ
ｎｉｍａｌ　ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃａｔなどの呼称のもと
て更に貢献度が高まっている。いずれの場合にも当然の
事として、これらのネコの疾病、特に伝染病に関するよ
り確実な知識がますます必要となり、その診断、治療、
予防のための方法が確立される事が要求されている。

ネコのウィルス性疾患は多く、なかでもネコ鼻気管炎ウ
ィルス、ネコバルボウイルス、ネコ伝染性腹膜炎ウィル
ス等の疾患は急性で致死率が高い。

予防としてのワクチンは開発されているものの、感染・
発症したネコの治療法としては、抗生物質、サルファ剤
等の二次細菌感染予防の対症療法しかないこと等、現在
の治療法には問題を残している。

従来より治療法として高度免疫血清や血清由来の免疫グ
ロブリンが使用され有、効な実績を残してきた。しかし
、現在では、動物愛護思想の高まりと共に、ネコ血清原
料の入手が困難になりこの治療法は使いたくとも使用で
きない状況になっている。

従って、従来の高度免疫血清に代わって感染ウイルスを
中和できるモノクローナル抗体が出来れば、これらウィ
ルス性疾患の治療に大きく貢献することが可能である。

藍来肢韮 上記のような高度免疫血清の代替品として、ウィルス中
和活性を有するモノクローナル抗体の使用が考えられる
。モノクローナル抗体作製に関する基本的な技術は、こ
れまでに主としてマウス型モノクローナル抗体において
確立されている。ハイブリドーマ等の細胞が産生ずるモ
ノクローナル抗体は大量にしかも半永久に得られ、原料
不足の問題を解消できうる。しがし、ここにおけるモノ
クローナル抗体は、副作用（マウスモノクローナル抗体
をネコに使用した場合、異種タンパクとしてアナフィラ
キシ−ショックや血清病などの副作用を起こすことが考
えられる）をなくす意味がら、従来のマウスモノクロー
ナル抗体ではなくネコモノクローナル抗体でなければな
らない。

これらのネコウィルス性疾患の治療薬としてのネコモノ
クローナル抗体の作製法には次のようなものが考えられ
る。（１）ネコ×ネコハイブリドーマを用いる方法、（
２）ある種のウィルス及び化学薬剤等でトランスフオー
ムさせたネコリンパ球を用いる方法、（３）ネコ×マウ
スヘテロハイブリドーマを用いる方法、（４）ネコ×マ
ウスヘテロハイブリドーマを親株としたネコ×（ネコ×
マウス）ハイブリドーマを用いる方法、（５〉キメラモ
ノクローナル抗体（抗原と結合する可変（Ｖ）領域はウ
ィルス中和活性を有するマウスモノクローナル抗体から
、抗原性あるいは免疫原性及び生理活性に関与する定常
（Ｃ）領域はネコモノクローナル抗体からなる、マウス
（ｖ）−ネコ（Ｃ）キメラモノクローナル抗体〉を遺伝
子組換えで作製する方法、等であるが、これらのいずれ
の方法に関しても成功例は一切報告されていない。

ここで、（１）については融合効率が低いことや適当な
ミエローマ親株がないこと、（２）についてはヒトの場
合のＥＢウィルスに相当する適当なウィルスや適当な化
学薬剤がないこと、さらに、（３）　（４）の方法では
ヒト型モノクローナル抗体作製例から考えて、目的のネ
コ型モノクローナル抗体を高効率に得るまでには多くの
困難が予想される〈例えば、安定性の問題等〉、従って
、（５〉のキメラモノクローナル抗体法がより実現性の
高い方法であると考えられる。

このキメラモノクローナル抗体は、可変（Ｖ）領域の原
料となるマウスモノクローナル抗体を産生ずるマウス×
マウスハイブリドーマからクローニングしたそのＶ遺伝
子と、定常（Ｃ）領域の原料となるネコモノクローナル
抗体を産生ずるネコ抗体産生細胞からクローニングした
Ｃ遺伝子とを結合させたマウス（ｖ〉−ネコ（Ｃ）キメ
ラ抗体遺伝子を含むプラスミドベクターを、動物細胞（
例えば、マウスミエローマ）宿主中で発現させ、その培
養上清中に得られるものである。ヒトにおいてはすてに
キメラ抗体に関するいくつかの報告が見受けれる（特開
昭６０−１５５１３２号、特開昭６１−４７５００号）
。

このようにネコキメラ抗体の作製には、目的の抗原と結
合能を持つ抗体分子の可変（Ｖ）領域のアミノ酸配列を
コードする遺伝子とネコ免疫グロブリンの定常（Ｃ）領
域のアミノ酸配列をコードする遺伝子が必要となる。キ
メラ抗体の可変（Ｖ）領域遺伝子は、前述した種々のネ
コウィルス等に対して中和活性を有するマウスモノクロ
ーナル抗体を産生ずる細胞から得られるもので、この細
胞は従来のマウス×マウスハイブリドーマ法で比較的容
易に作製することが出来る。しかしながら、キメラ抗体
の定常領域遺伝子となるネコ免疫グロブリンＣ領域遺伝
子については現在のところ全くその構造が知られておら
ず、遺伝子もクローニングされていない、従って、ネコ
キメラ抗体を作製するためには、ネコ免疫グロブリンの
定常（Ｃ）領域のアミノ酸配列をコードする遺伝子を見
いだすことが非常に重要な要素となっている。

また、前述の（１）から（４）までの方法は目的の特異
性をもったモノクローナル抗体を作るには多くの問題点
があるが、（５）のキメラ抗体作製のための有効な材料
（細胞株〉を提供することが可能である。

すなわち、ネコ免疫グロブリンを産生じている細胞であ
れば、その特異性に関係なく、キメラ抗体を作製するた
めのネコ免疫グロブリン遺伝子のＣ領域を提供する好ま
しい材料となり得るからである。

免監△且旬 このような状況にあって、本発明者らは、ネコ免疫グロ
ブリンを産生しているネコ×マウスヘテロハイブリドー
マを作製することに成功した。さらにこの細胞からネコ
免疫グロブリンの定常領域のアミノ酸配列をコードして
いる遺伝子を単離することに成功した。また、さらにネ
コ免疫グロブリンの定常領域をコードする遺伝子断片の
塩基配列の解析により、ネコ免疫グロブリンλ鎖定常領
域特有のアミノ酸配列を見いだし本発明を完成するに至
った。

すなわち、本発明は、これまでに−切報告されていない
ネコ免疫グロブリン産生ネコ×マウスヘテロハイブリド
ーマを提供することを目的とする。

さらに、本発明のもうひとつの目的は、これまでに−切
遺伝子解析がなされていないネコ免疫グロブリン遺伝子
λ鎖の定常領域をコードするＤＮＡ断片を提供するもの
である。さらに、本発明は、ネコモノクローナル抗体を
構成するネコ免疫グロブリンλ鎖の定常領域をコードす
るＤＮＡ断片を提供するものであり、このＤＮＡ断片を
用いて作られるネコキメラ抗体は、ネコの疾病、特に伝
染病に対して副作用のない診断薬、治療薬・予防薬への
応用を可能にするものである。

新規なネコ免疫グロブリンＣ領域遺伝子を単離する方法
としては、主として２つの方法が考えられる。

ひとつは、ネコ細胞の染色体ＤＮＡから常法［例えば、
Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ”　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　
Ｌａｂ、　　（１９８２）　ｅ照］に従ってライブラリ
ーを構築しＣ領域遺伝子をクローニングする方法であり
、もう一方は、ネコ細胞のメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲ
ＮＡ）を材料として常法［例えば、Ｄ、　Ｍ、　Ｇｌｏ
ｖｅｒｌ集　ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｏｌ、　Ｉ　
”　ＩＲＬ　ｐｒｅｓｓ　（１９８５）］によりｃＤＮ
Ａを合成してライブラリーを構築しＣ領域遺伝子をクロ
ーニングする方法である。

いずれの場合にしても、ネコ型の抗体蛋白を産生じてい
る細胞を材料にしてクローニングすることがクローニン
グ効率の面からも望ましく、特に後者のメツセンジャー
ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する方法においては必須の条
件となる。このような抗体産生細胞を確立する方法とし
て次に示すようないくつかの方法が考えられる。■ネコ
×ネコハイブリドーマを作る方法、■ある種のウィルス
及び化学薬剤等でネコリンパ球をトランスフオームさせ
る方法、■ネコ×マウスヘテロハイブリドーマを作る方
法、■ネコ×マウスヘテロハイブリドーマを親株とした
ネコ×（ネコ×マウス）ハイブリドーマを用いる方法、
等である。しかしながら、従来技術の説明の欄でも示し
た通り、■、■の方法では現実には非常に難しく、■の
方法においても■のネコ×マウスヘテロハイブリドーマ
が必要となり、結論的には■のネコ×マウスヘテロハイ
ブリドーマを得ることが重要な鍵となる。

以下、ネコ×マウスヘテロハイプリドーマの調製法につ
いて詳細に説明する。まず、ネコに免疫を行い、ネコ抗
体の産生に関するリンパ球を活性化する。免疫方法は、
アジュバント免疫のみの非特異免疫、あるいは、ネコバ
ルボウイルス粒子（又は精製抗原）、ネコ鼻気管炎ウィ
ルス粒子（又は精製抗原〉、ネコ伝染性腹膜炎ウィルス
粒子（又は精製抗原）等の特異抗原（アジュバント混合
液）を用いた特異免疫のいずれも可能である。非特異免
疫又は特異免疫したネコより、牌臓、又はリンパ節を得
る。これらの牌臓、又はリンパ節から得られた各リンパ
球を単離し、培養浮遊液とした後、ホークライードマイ
トジェン（ＰＷＭ）のようなリンパ球活性化物質を加え
て活性化する。この時、ＰＷＭと共に前記ウィルス抗原
を加えて、特異免疫を増強させることも可能である。こ
のようにして得られたネコリンパ球を回収し、このリン
パ球と親株であるマウス骨髄腫細胞〈マウスＢＡＬＢ／
ｃに由来するＸ６３−Ａｇ８−６．５．３、Ｐ３−Ｘ６
３−Ａｇ８−０１．　　ＳＰ２１０Ａｇ１２等の骨Ｊ１
１腫細胞〉とを融合剤を加えて融合し、ネコ×マウスハ
イブリドーマを形成させる。融合方法は、公知の如何な
る方法でもよいが融合剤として、ポリエチレングリコー
ル等を例示することが出来る。融合したハイブリドーマ
の選択は、例えば、３７℃、５　％　ＣＯ２存在下テグ
ルタミン添加ＲＰＭ１１６４０＋　１０％牛脂児血清＋
）［ＡＴ　（ヒボキサンチン＋アミノプテリン＋チミジ
ン）のようなＨＡＴ選択培地で達成される。

ネコＩｇＧ抗体を産生しているハイブリドーマは、例え
ば、抗ネコＩｇＧ抗体をコーティングしたプレートを用
いたサンドイツチェンザイムイムノアッセイ（ＥｒＡ）
法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法等により測定し
て確認できる。また、前記のような特異抗原に対して特
異性を有するネコＩｇＧ抗体（特異ネコＩｇＧ抗体〉を
産生じているバイブリドーマも、特異抗原をコーティン
グしたプレートを用いたＥｒＡ法又はＥｒＡ法により測
定して確認できる。かくして、選別されたネコＩｇＧ抗
体又は特異的ネコｒｇＧ抗体産生のネコ×マウスハイブ
リドーマは、限界希釈法により単一クローン化され、単
一のネコＩｇＧモノクローナル抗体を産生ずる単一クロ
ーンとして確立される。さらに安定な抗体産生クローン
を確立するためには、早い時期にこのクローニング操作
を数回、繰り返し行うことが必要である。このような方
法により本発明者らは、ネコモノクローナル抗体を産生
じているネコ×マウスへテロハイブリドーマＦＭ−Ｔ１
．Ｔ２およびＴ３の確立に成功した。このようなネコ×
マウスへテロハイブリドーマの好ましい一例として、出
願人は、ＦＭ−ＴＩ　（微工研菌寄第１００７７号）細
胞を微工研に寄託している。この細胞は、本発明の以下
の遺伝子調製に用いる最も望ましい細胞株として挙げら
れる。

マウスやヒトの場合、免疫グロブリン遺伝子は抗原との
結合部位である可変領域（Ｖ領域）遺伝子と補体や特定
の細胞と相互作用等に関与した生理活性をもつ定常領域
（Ｃ領域）遺伝子により形成されていることがよく知ら
れている。さらに、■領域遺伝子は、数あるＶ遺伝子断
片群、Ｄ遺伝子断片群（Ｌ鎖ではまだ見つかっていない
〉及びＪ遺伝子断片群の中からそれぞれ１個が選ばれこ
の順序で並んで結合することによって形成される。さら
に、各クラスのＣ領域遺伝子とクラススイッチにより結
合し、発現系の免疫グロブリン遺伝子となる。［利根用
進。

Ｎａｔｕｒｅ、　３０７．　ｐ５７５　（１９８３）；
本庶佑、　Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１．　ｐ４９９　（１９８３）参照
］、すなわち、活性型の発現可能な（ｍＲＮＡに転写さ
れ、さらに蛋白質に翻訳されている）Ｃ領域遺伝子であ
れば、免疫グロブリン遺伝子の特徴である遺伝子の再配
列を終えているはずである。そこで、抗体産生細胞とそ
の親株の染色体ＤＮＡを用いて、常法［例えば、　Ｔ。

Ｍａｎｉａｔｉｓ　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ”　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ
ｂ、　（１９８２）参照］に従ってサザンハイプリダイ
ゼーションを行い、抗体産生細胞に特異的な免疫グロブ
リン遺伝子を同定すれば、Ｃ領域遺伝子を含む免疫グロ
ブリン遺伝子を決定することが出来る。このようにネコ
抗体産生細胞を用いれば、より速く目的の抗体遺伝子を
同定することが出来る。

目的の遺伝子を染色体ＤＮＡから調製した場合には、遺
伝子の中にイントロンと呼ばれる介在配列を含んでいる
。

抗体遺伝子を単離するためには、前述の２つのクローニ
ング方法におけるスクリーニングの方法として、主とし
て３つの方法が可能である。■；　ネコ抗体産生細胞の
産生ずる抗体蛋白を精製し、これを材料にこの蛋白質の
アミノ酸配列を解析し、このアミノ酸配列に相当する核
酸塩基配列を合成して、スクリーニング（ハイブリダイ
ゼーション）のプローブとする方法、■；すでに報告さ
れているマウス及びヒトの免疫グロブリン遺伝子の遺伝
子断片、あるいはその核酸塩基配列［例えば、坂野ら、
Ｎａｔｕｒｅ、　　２８６．　　ｐ６７６、　　（１９
８０）；　　Ｅ、　　Ｅ、　　Ｍａｘら、　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２５６．　ｐ５１１６．　（
１９８１）；　Ｊ、　Ｗ、Ｅｌｌｉｓｏｎら、　Ｎｕｃ
、　　Ａｃ１ｄｓ、　　Ｒｅｓ、、　　１０．　　ｐ４
０７１．（１９８２）；　　Ｐ。

Ａ、　Ｈｅ１ｔｅｒら、Ｃｅ１ｌ、　　２２．　ｐ１９
７　（１９８０）］を参照して合成したＤＮＡ等をプロ
ーブに用いてクロスハイブリダイゼーションによりスク
リーニングする方法、■；　λｇｔｌ１等の発現ベクタ
ーに組み込まれたネコ抗体遺伝子を大腸菌あるいは動物
細胞において発現させ、発現産物をネコ抗体蛋白に対し
て作られた抗血清（あるいはモノクローナル抗体）を用
いてスクリーニングする方法である。　　ｃＤＮＡクロ
ーニング法では■■■のいずれの方法も使用可能であり
、染色体ＤＮＡクローニング法では■■の方法が使用可
能である。

このようにしてクローニングされたネコ免疫グロブリン
のＣ領域をコードする遺伝子断片の配列と、他の動物種
の免疫グロブリンのＣ領域遺伝子の配列とを比較し遺伝
子解析を行った結果、ネコ免疫グロブリンＣ領域をコー
ドする本発明の遺伝子断片は、λ鎖に属する遺伝子断片
であることが分かった。

免疫グロブリンのλ鎖としては、すでにヒト［Ｐ。

＾、Ｈｉｅｔｅｒら、　Ｎａｔｕｒｅ、　　２９４．ｐ
５３６　　（１９８１）；　　Ｇ、Ｆ。

Ｈｏ１ｌｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ、　２９６．　ｐ３２１
　（１９８２））及びマウス［Ｂ、　　Ｂｌｏｍｂｅｒ
ｇら、　Ｎａｔｌ、Ａｃ１ｄ、　　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７
９゜ｐ５３０　　（１９８２）；　　Ｊ、　　Ｍｉｌｌ
ｅｒら、　Ｎａｔｕｒｅ、　　２９５．　　ｐ４２８（
１９８２）］で発見され、さらに、他の動物種のλ鎖で
は、ウサギ［Ｄｕｖｏ　ｉｓ　ｉｎ、　ＭＲ，Ｍ、ら、
Ｊ、　Ｉ＋ｕ＋ｕｎｏ１．　、　ｔ３６、ｐ４２９７−
４３０２　（１９８６）ｌ　　等が報告されているが、
本発明に記載しているネコ＾鎖及びそれらをコードする
アミノ酸配列、核酸塩基配列については一切その報告例
はなく、本発明により初めて開示されるものである。

このようにして本発明で得られた、ネコ免疫グロブリン
λ鎖定常領域をコードするＤＮＡ断片の塩基配列を解析
し、該定常領域のアミノ酸配列を見いだし、これをこれ
までに報告されているヒト、マウス、ウサギ等の免疫グ
ロブリンλ鎖定常領域のアミノ酸配列と比較検討したと
ころ、ネコ免疫グロブリンλ鎖定常領域に特異的なアミ
ノ酸配列として、該λ鎖定常領域ポリペプチドのＮ末端
側から最初のシスティンのＮ末端側のアミノ酸配列が下
記（Ａ）のアミノ酸配列であることが見いだされた。

（Ａ）　　−３ｅｒ−＾１　ａ−ｘｘｘ−ｘｘｘ−ｘｘ
ｘ−ｘｘｘ−ｘｘｘ−ｘｘｘ−Ｃｙｓ−（ｘｘｘは任意
のアミノ酸残基） 本発明者らは、本発明により解析されたネコの免疫グロ
ブリンλ鎖定常領域のアミノ酸配列、本発明者らが別途
解析したイヌの免疫グロブリンλ鎖定常領域のアミノ酸
配列およびこれまでに解析されている種々の動物の免疫
グロブリンλ鎖定常領域のアミノ酸配列を比較すること
により、上記のシスティンのＮ末端側に存在する一３ｅ
ｒ−＾１ａ−の領域は、ネコ、マウス、ヒト等の種の違
いによっていずれも異なるアミノ酸配列となっている領
域であることを見いだした。また、同時にこの領域は、
例えばヒトのλ鎖定常領域のアミノ酸配列としては、サ
ブタイプ間で極めてよく保存されていることも見いだし
、今回本発明により明らかにされた上記の配列は、ネコ
免疫グロブリンλ鎖定常領域特有の配列であると推測さ
れた。尚、本発明においてクローニングされたこの領域
のアミノ酸配列は下記の通りであり、このアミノ酸配列
（Ｂ）がネコ免疫グロブリンλ鎖定常領域に存在する特
有のアミノ酸配列の好ましい一例として挙げられる。

（Ｂ）　　−３ｅｒ−＾１ａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−＾１ａ
−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−本発明のネコ×マ
ウスへテロハイブリドーマは、上記（Ａ）または（Ｂ）
のアミノ酸配列を有するλ鎖Ｃ領域ペプチドを含むネコ
免疫グロブリンを産生ずることを特徴とする。さらに、
本発明のネコ免疫グロブリンλ鎖定常領域をコードする
遺伝子断片においても、上記（Ａ）または（Ｂ）のアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡ配列をその一部に有するこ
とを特徴とする。このような上記のλ鎖に含まれるアミ
ノ酸配列は、ネコ免疫グロブリンλ鎖のＣ領域を決定す
る重要なアミノ酸配列と考えられ、本発明により初めて
明らかにされた。また、ネコλ鎖の定常領域ポリペプチ
ドのＣ末端から２番目のシスティンのＮ末端側１１個目
から９個目のアミノ酸配列においても、前記と同様に、
ネコ、イヌ等の種の違いによりアミノ酸配列が変化する
領域と思われ、本発明のネコ免疫グロブリンλ鎖定常領
域では、−Ｐｒｏ−＾５ｎ−Ｇｌｕ−をその特有の配列
として有することが見いだされた。このようなネコ免疫
グロブリンλ鎖のＣ領域をコードする遺伝子として、第
７図のアミノ酸配列をコードする遺伝子断片がその好ま
しい一例として挙げられる。また、そのような遺伝子の
具体的核酸塩基配列の一例としては、第６図に示された
塩基配列が挙げられる。このような本発明の遺伝子断片
は、ネコ抗体産生細胞由来のものに限らず、ネコ肝臓等
の細胞等から調製されたものも含む、しかしながら、前
述の抗体産生細胞（ネコ×マウスヘテロハイブリドーマ
）を用いれば、抗体遺伝子をより迅速に同定することが
可能になり、Ｃ領域遺伝子のクローニングをより容易に
行うことが出来る。また、本発明のλ鎖遺伝子を用いて
ネコ染色体ＤＮＡとサザンハイブリダイゼーションを行
った結果、本発明のλ鎖以外に、同じネコλ鎖に属して
いる他のサブタイプのＣ領域遺伝子がいくつか存在して
いることが示された。ヒトとマウスの例［Ｐ、　Ａ、旧
ｅｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、　２９４．　ｐ５３６（１
９８１）；　　Ｇ、　　Ｆ、　　Ｈｏ１ｌｉｓら、　Ｎ
ａｔｕｒｅ、　　２９６．　　ｐ３２１（１９８２）；
　　Ｂ、　　Ｂｌｏｍｂｅｒｇら、　Ｐｒｏｃ、　　Ｎ
ａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、　　７９．　　ｐ５３０　　（１９８２）；　
　Ｊ、　　Ｍｉｌｌｅｒら、　Ｎａｔｕｒｅ。

２９５、　ｐ４２８　（１９８２）］からも、ネコλ鎖
にもいくっがのサブタイプが存在すると思われる０本発
明のネコ免疫グロブリンλ鎖の定常領域をコードする遺
伝子断片は、このようなサブタイプの異なるアミノ酸配
列をコードする。遺伝子断片をも包含するものである。

このようなサブタイプの異なるＣ遺伝子のクローニング
は、本発明に開示されている塩基配列の一部をプローブ
として用いて行うことも可能である。

本発明のネコ免疫グロブリンλ鎖のＣ領域遺伝子を直接
用いてマウス−ネコキメラ抗体を作製することが出来る
が、さらに本発明の中で開示されている塩基配列の一部
をプローブとして、染色体ＤＮ＾ライブラリィからジェ
ノミックな免疫グロブリンλ鎖Ｃ領域遺伝子をクローニ
ングし、これを用いてキメラ抗体を作製することも出来
る。キメラ抗体の作製方法はすでにマウス−ヒトキメラ
抗体で示された方法［渡辺ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅ
ａｒｃｈ、　４７．　ｐ９９９−１００５．　（１９８
７）］に準じて行うことが出来る。すなわち、キメラ抗
体遺伝子は、基本的にＶ領域遺伝子とＣ領域遺伝子の２
種類の遺伝子断片を結合させることにより構築される。

さらに、遺伝子の単離法に応じて、主として２つの結合
の組合せがある。すなわち、染色体ＤＮＡから単離した
ＶとＣ領域遺伝子、ｃＤＮＡから単離したＶとＣ領域遺
伝子の組合せである。

例えば、マウス染色体ＤＮＡから単離したＶ領域遺伝子
を、ネコ染色体ＤＮＡから単離したＣ領域遺伝子と結合
させた場合、マウスＶ領域遺伝子には発現に必要なプロ
モーターやエンハンサ−等の発現調節領域を含んでいる
ことが好ましい、ただし、プロモーターやエンハンサ−
等はマウス由来である必要はなく、ネコ由来でもヒト由
来でもウィルス由来でも差しつかえない、また、プロモ
ーターはＶ領域の５′上流域に位置し、エンハンサ−は
Ｖ領域遺伝子とＣ領域遺伝子の間に位置するのが好まし
いが、エンハンサ−については必ずしもこの位置に限定
されるものではない、一方、マウスｃＤＮＡから単離し
たＶ領域遺伝子を、ネコｃＤ）ＩＡから単離したＣ領域
遺伝子と結合させる場合、その結合部分は適当な制限酵
素サイトや、必要であれば適当な合成リンカ−を用いて
、■領域遺伝子のコードしているアミノ酸配列とＣ領域
遺伝子のコードしているアミノ酸配列がずれないよう、
またＶ領域アミノ酸配列とＣ領域アミノ酸配列が変化し
ないよう結合しなければならない、さらに、動物細胞中
で発現を可能にするための適当なプロモーターやエンハ
ンサ−等の発現調節領域を遺伝子の５゛上流域に付加し
てやる必要がある。このようにして作製したキメラ抗体
遺伝子を、例えば、ｐＳＶ２−ｇｐｔ［Ｒ，Ｃ，Ｍｕｌ
ｌｉｇａｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ１ｄ、　
Ｓｅｔ、　ＵＳＡ、　７８．　ｐ２０２７　（１９８１
）１、ｐｓＶ２−ｎｅｏ［Ｐ、　　Ｊ、　　５ｏｕｔｈ
ｅｒｎら、　Ｊ、　　Ｍｏ１．　　＾ＰＰＩ。

Ｇｅｎｅｔ、、　１．　ｐ３２７　（１９８２）］等の
選択マーカーの付いた適当なベクタープラスミドに、あ
るいは、宿主細胞内でプラスミド状態で増殖できるウィ
ルス遺伝子の一部〈パピローマウィルスなど〉を持った
ベクタープラスミドに、Ｈ鎖遺伝子とＬｇＩ遺伝子を別
々に、あるいは同時に組み込み、キメラ抗体遺伝子プラ
スミドを構築することが望ましい、マウスネコキメラ抗
体を得るためには、このようにして調製されたキメラ抗
体遺伝子を含むプラスミドを用いて宿主動物細胞を形質
転換することが必要である。宿主動物細胞としては、不
死化されたマウス及び他の動物細胞、好ましくはＢリン
パ系細胞株［例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８・６５３　　（
ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８０）、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ・１
　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５９７）、Ｐ３／ＮＳＩ／Ｉ　
Ａｇ４−１　（ＡＴＣＣＣＲＬ１８）、Ｓｐ２１０−Ａ
ｇ１２　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５８１）等の形質細胞腫
、ハイプリドーマ］である。　　ＤＮＡによる細胞の形
質転換方法としては、ＤＨＡＥ−デキストラン法、燐酸
カルシウム共沈降法、プロドブロスト融合法、エレクト
ロポレーション法等の方法［例えば、Ｂ。

Ｄ、　Ｈａｍｅｓら編集”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”　ＩＲＬ　Ｐｒｅ
ｓｓ　（１９８４）参照］があり、いずれの方法でもよ
い、［（鎖とＬＭのキメラ抗体遺伝子を同時に持つプラ
スミドで形質転換を行う場合には選択マーカーは１種類
でよいが、Ｈ鎖り鎖別々の場合には２種類のマーカーが
必要である。この場合には、１つのプラスミドで形質転
換を行った後に、さらにもう一方のプラスミドで形質転
換を行う二重形質転換法を用いるのが好ましい、このよ
うにして形質転換された細胞を通常のハイブリドーマと
同じ適当な条件下（例えば、１０％牛脂児血清を含むＲ
１’Ｍ１１６４０培地中）で培養すれば、この細胞から
通常のハイブリドーマの産生ずる抗体と同様にキメラ抗
体が分泌産生される。このキメラ抗体は通常の抗体と同
様な方法により精製することが出来る。

本発明であるネコ免疫グロブリンλ鎖Ｃ領域をコードす
る遺伝子を用いて、上述のようにして得られるマウス−
ネコキメラ抗体は、ネコの疾病に対して、これまでにな
かった実質的に有効な診断、予防及び治療剤となりうる
ちのである。さらに、本発明により提供されるネコ免疫
グロブリンをコードする遺伝子断片は、ネコ免疫グロブ
リンλ鎖のＣ領域の特異的アミノ酸配列もしくはＤＮＡ
配列を開示するものであり、今後、さらに同じλ鎖に属
する他のサブタイプのＣ領域遺伝子を単離することを可
能にするものである。

次に、その実施例を示すが本発明は何等これに限定され
るものではない。

まず、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ：デイフコ
社製）５−をネコに皮下及び腹腔的注射して、非特異免
疫を行った。さらに、２〜３週間の間隔で同操作を数回
繰り返して免疫を増強した。このようにして免疫したネ
コより、最終免疫２〜３週間後に肺臓及びリンパ節を得
た。これらの肺臓及びリンパ節を１００ＩＵのペニシリ
ン（萬有製薬社製）−ストレプトマイシン（明治製菓製
〉を補充したＲＰＭ１１６４０培地（日永製薬社製）中
でよく洗浄し、その後ＲＰＭＩ−１６４０中で細片に砕
き、ピンセットでさらに細かくし、ピペッティングにて
細胞浮遊液とした０次いで、赤血球除去液にて赤血球を
除き、数回の遠心処理後、ネコリンパ球を得た。ネコ１
匹の肺臓からは１〜５Ｘ１０Ｇ細胞個、リンパ節からは
１〜５Ｘ１０”細胞側のリンパ球が得られた。さらに、
これらのリンパ球をＬ−グルタミン（フローラボラトリ
イ社製）添加ＲＰＭ１１６４０＋　１０％牛脂児血清（
ハイクローン社製〉の完全培地に５〜ｌ０ＸＩＯ’細ｍ
／ａＱにて懸濁し、２．５μ９／１１５１量のホークラ
イードマイトジェン（ＰＷＭ：ギブコ社製〉を加え、３
７℃、５％ＣＯ２存在下で、２〜５日間刺激培養し活性
化した。

マ　　ス 本発明に使用した骨髄腫細胞は、すてにケーラーらが、
Ｎａｔｕｒｅ、　２５６．　　ｐ４９５　（１９７５）
及びＰｉｕｖ、　Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　６．　ｐ２９２　（１９７６）に記
載しているマウスＢＡＬＢ／ｃ由来の骨髄腫細胞系で、
特に、亜株のＸ６３−＾ｇ８−６．５．３及びＰ３−Ｘ
６３−Ａｇ８−Ｉｌｌ、　ＳＰ２１０Ａｇ１２である。

これらをグルタミン添加Ｒ１’Ｍ１１６４０＋　１０％
牛脂児血清の完全培地にて増殖培養し、融合直前に回収
し、ＲＰＭ１１６４０培地で２回洗浄後、同培地に再混
濁し、融合に用いた。

コ１′パ　　マ　ス　　　　　　　　　　ム前記のネコ
リンパ球混濁液とマウス骨髄腫細胞混濁液とを混合しく
ネコリンパ球：骨髄腫細胞＝１０：ｌ又は５：１の割合
、ネコリンパ球＝ＩＸ１０１１又は２×１０＠細胞個）
、１５００ｒｐｍ、５分間遠心分離した細胞ベレットに
ＲＰＭ１１６４０で希釈した４５％ポリエチレングリコ
ール液（シグマ社製１）Ｉ（７，６分子量３６５０、又
はセルバ社製ＰＨ７，６分子量４０００）１−を室温に
て１分間で加えた。３７℃、５〜１０分間靜分間左置、
４０−のＲＰＭ１１６４０を６分間かけて加え、細胞を
静かに再混濁し、融合を停止した１次いで、細胞を１１
０００ｒｐ、１０分間遠心分離し、上清を吸引除去した
後、グルタミン添加ＲＰ！４１１６４０＋　１０％牛脂
児血清＋■ＡＴ（Ｈ：ヒボキサンチン１３．０刈／＋ａ
ｌｌ、Ａニアミノプテリン０，１８μ９／−１Ｔ：チタ
ジン３．８７μｑ／ｄ　　全てシグマ社製〉にリンパ球
濃度として２〜ＩＯＸ　１０’細胞個／−に再混濁せし
めた。これを９６六マイクロタイタープレート中に２０
０ｄ　／穴として分注し、３７℃、５％ＣＯ２存在下に
て培養した。５〜７日後、同培地で５０％培地交換を行
い、さらに、融合後１０〜２８日後にかけて、・５〜６
回の培地交換を繰り返した。かくして、ハイブリドーマ
のみが増殖し、スクリーニングアッセイが出来るまで培
養を継続した。

ハイブリドーマの増殖が充分に進行したことを確認し、
ネコＩｇＧ抗体を産生しているクローンを検出するため
、スクリーニングアッセイを行った。

スクリーニングアッセイは、エンザイムイムノアッセイ
（ＥＩＡ）にて行った。即ち、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体く
カッベル社製）をコーティングし、牛アルブミン（シグ
マ社製〉で非特異吸着を阻止した９６穴プレートを作製
し、ハイブリドーマ培養プレートの多穴からの培養上清
を５０Ｊ加え、３７℃、１〜２時間インキュベートした
後、ＰＢＳ−Ｔ［０，０１％Ｔｗｅｅｎ　（片目化学社
製）、０．ＯＩＭ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、　　ｐＨ７，
２，０，１５Ｍ　ＮａＣ１］にて４回洗浄し、ペルオキ
シダーゼ標識ヤギ抗ネコＩｇＧ抗体（カッベル社製　１
００００倍希釈）を５０１Ａ添加、３７℃、１時間イン
キュベートした。そのｆ＆ＰＢｓ−Ｔにて５回洗浄し、
ＴＭＢＺ基項溶液（ＴＭＢＺ：　同上化学社製０．４■
／１ａｌｌ、過酸化水素水：三菱瓦斯化学社製０、００
６％）を５０ｄ添加して発色させた。１０〜１５分後、
０、３Ｎ　ｌ［２ｓＯ４（片目化学社製）５０ＪＡを加
えて反応を停止し、これらの発色程度を分光光度計（波
長：４５０）にて測定した。このようにして選別したネ
コＩｇＧ産生穴中のハイブリドーマを限界希釈法にて単
一クローン化（クローニング）を行った。クローンが９
６穴プレートの多穴に増殖してきた後に、ネコＩｇＧ産
生クローンを検出するために、前記と同様のエンザイム
イムノアッセイ（Ｆ、ＩＡ）を行った。このクローニン
グ操作を少なくとも３回以上繰り返して、安定にネコＩ
ｇＧを産生するネコ×マウスハイブリドーマクローンを
得た。さらに、このハイブリドーマクローンを順次拡張
培養し、グルタミン添加ＲＰＭＩ−１６４０＋　ＨＡＴ
＋１０％Ｄ１４ＳＯ（和光純薬）の細胞凍結用培地にて
、液体窒素中に凍結保存した。

確立されたネコ×マウスハイブリドーマは、ＥＩＡ法に
よるネコ抗体産生量測定の結果、１年以上の長期にわた
って、ネコＩｇＧモノクローナル抗体を１０〜３．０μ
９／＋１１１１の量で安定に産生じており、抗体産生能
において何ら異常が認められないことを確認している。

確立されたネコ×マウスハイブリドーマが産生するネコ
モノクローナル抗体は、免疫沈降法［免疫実験操作法　
日本免疫学会編　参照］により、ネコＩｇＧであること
が明らかになった。この抗体はヤギ抗マウス１ｇ抗血清
及びヤギ抗ヒトＩｇ抗血清とは全く沈降物を形成せず、
ヤギ抗ネコＩｇＧ抗血清とのみ沈降物を形成することか
ら、該モノクローナル抗体は、ネコＩｇＧ抗体であると
判断される。さらに、該モノクローナル抗体が完全なネ
コ型モノクローナル抗体であることを証明するために、
免疫沈降法より感度の高いＥＩＡ法を用いて精査した。

その結果、該モノクローナル抗体は、いずれも抗ネコＩ
ｇＧ抗体とのみ特異的に反応し、抗ヒトＩｇＧ抗体及び
抗マウスＩｇＧ抗体とは反応しないことにより、ネコＩ
ｇＧ抗体であることが証明されたく第１図）、さらに、
ウェスタンプロットアッセイ法［免疫実験操作法日本免
疫学会編　参照］により、該モノクローナル抗体は抗体
の重鎮（■鎖）フラグメント、軽鎖（Ｌ鎖）フラグメン
ト共に抗ネコＩｇＧ抗体とのみ特異的に反応し、抗ヒト
ＩｇＧ抗体、抗マウスＩｇＧ抗体とはＨ鎖、Ｌ鎖フラグ
メント共に全く反応しないこと、さらに、該モノクロー
ナル抗体のＨ鎖、Ｌ鎖フラグメントは、標準ネコＩｇＧ
抗体のＨ鎖、Ｌ鎖フラグメントと分子量的に同一のもの
であることから、ネコＩｇＧ抗体のＩ【鎖、Ｌ！！Ｉフ
ラグメントを有する完全なネコＩｇＧモノクローナル抗
体であることが証明された（第２図）。

又、該ハイブリドーマクローンの細胞質内蛍光抗体染色
アッセイ法［免疫実験操作法　日本免疫学会編　参照］
により、細胞質内ネコＩｇＧ抗体の合成を調べた結果、
いずれのクローンも抗ネコＩｇＧ抗体でのみ特異的に細
胞質内染色され、他の抗ヒトＩｇＧ抗体及び抗マウスＩ
ｇＧ抗体では染色されないことにより、該ハイブリドー
マクローンは、その細胞質内において完全なネコＩｇＧ
モノクローナル抗体を合成していることが証明された。

このようなネコモノクローナル抗体を産生ずるネコ×マ
ウスヘテロハイブリドーマＦＭ−Ｔｌ細胞は、微工研菌
寄第１００７７号として本出願人より寄託されている。

この細胞を以下に述べる実験に使用した。

ＤＮ　− ヘテロハイブリドーマＦＭ−ＴＩ細胞から全ＲＮ＾をグ
アニジウムチオシアネート法［Ｊ、　Ｍ、　Ｇｈｉｎｇ
ｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　１８．　　
ｐ５２９４　（１９７９）］により分離し、さらにオリ
ゴｄＴカラム（ファルマシア）を用いてポリ＾十ＲＮＡ
に精製した。この精製ポリＡ＋ＲＮＡからｃＤＮＡ合或
シ合成ムプラス（アマジャム）を用いて　ＦＭＴｌ細胞
のｃＤＮＡを台底した０合成したｃＤＮＡのＥｃｏＲ１
サイトをＥｃｏＲＩメチレース（宝酒造：　以下本実施
例で使用した試薬は、特に断りのない限り宝酒造製か東
洋紡製を使用した〉を用いてメチル化した後、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼを用いてＥｃｏＲＩリンカ−を付加した。

さらにこのｃＤＮＡを制限酵素ＨｃｏＲＩで完全消化し
、バイオゲル＾５０■カラム（バイオ・ラット〉を用い
てＥｃｏＲＩリンカ−の付加したｃＤＮＡを精製した６
次にこのｃＤＮＡとλｇｔｌｌベクターＤＮＡ　（スト
ラタジーン社）のＥｃｏＲＩアームとをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼにより連結させ、ストラタジーン社のキットを用い
て、ｉｎ　ｖｉｔｒｏパッケージングを行い、ＦＭ−Ｔ
ｌ細胞のｃＤＮＡライブラリィを得た。

上述のように構築したＦＭ−Ｔｌ細胞のｃＤＮＡライブ
ラリィから、１枚のＬＢプレート［１，５％　Ｂａｃｔ
ｏ−ａｇａｒ（ジフコ社製）、１％ｌ１ａｃｔｏ−ｔｒ
ｙｐｔｏｎｅ　（ジフコ社製）、　０．５％Ｂａｃｔｏ
−ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　（ジフコ社製）、０．
２５％　ＮａＣＩ（和光紬薬）、　ｐ［［７，５の入っ
た角２号シャーレ（米研器財社製）］当たり５００００
個のλｇｔｌｌプラークが出来るように大腸菌ｙ１０９
０にファージを感染させて播き、４２℃で３時間培養す
る。その後、１０ｍＭ　ＩＰＴＧ　　（和光紬薬〉を染
み込ませたニトロセルロースフィルター（ＮＣフィルタ
ー、　　Ｓ＆Ｓ社製　Ｃｏｄｅ　ＢＡ８５）をかぶせ、
さらに３７℃で４時間培養を続ける。その後ＮＣフィル
ターをプレートからはがし」バッファー［ＷＢ：　　７
ｍＭＴｒｉｓ　ｐＨ７，２，１５０ｄ　ＮａＣ１，０，
００５Ｘ　Ｔｗｅｅｎ２０］で洗い、ＢＬＯＴＴＯ［５
％スキムミルク、　　１０ＩＡ／１００−＾ｎｔｉｆ。

ａｍＡ］に４℃で一晩浸す０次に１０μ９／−抗ネコＩ
ｇＧ抗体くカッペル社製）［１％Ｅ、ｃｏｌｉライセー
ド（バイオラッド社製〉で４℃−晩処理］の入ったＢＬ
ＯＴＴＯに交換し、室温で２時間反応させる。ＶＢで５
回洗浄した後、５０００倍希釈したペルオキシダーゼ標
識ヤギＴｇＧ抗体（カッペル社製）［１％Ｂ、　ｃｏｌ
ｉライセード（バイオラット社製）で４°Ｃ−晩処理］
の入ったインキュベーションバッファー［ＰＢＳ　ｐＨ
７，２，０，Ｏ０５％Ｔｗｅｅｎ２０，１％Ｂ５Ａｌ　
に浸け、室温で２時間反応させる。　　ＷＢで５回洗浄
した後＋　５％　ＩＩＲＰ　ｃｏｌｏｒ　ｄｅｖｅｌｏ
ｐｍｅｎｔ　ｒｅａｇｅｎｔ（バイオラッド社製〉と０
．５％Ｈ２Ｏ２（和光紬薬）を含んだ発色液に浸し、発
色させた。　　ＮＣフィルター上で発色したプラークに
対応するファージを選び、クローニングを重ねた。この
ようにして抗ネコＩｇＧ抗体と反応するクローンを選択
し、最終的にＴｌ−６２を得た。このクローンは約０．
７ｋｂのサイズで、後述する核酸塩基配列分析の結果か
ら、免疫グロブリンλ鎖に属する遺伝子であると思われ
た。その制限酵素切断点地図を第３図に示す、このクロ
ーンのＦ、ｃｏＲＩ挿入断片をＴｈｏ＠ａｓとＤａｖｉ
ｓの方法［Ｍ、　Ｔｈ。

１０１５とＲ，Ｗ、　　Ｄａｖｉｓ、　　Ｊ、　　Ｍｏ
１．　　Ｂｉｏｌ、、　　９１．　　ｐ３１５　　（１
９７４〉参照］によりファージＤＮＡより単離し、さら
にｐＵｃ１８ベクターのＥｃｏＲＩサイトにサブクロー
ニングした。

初めにこのＴｌ−６２を用いたサザンプロット分析を行
った。ネコ肝臓細胞の染色体ＤＮＡ１０μ９を制限酵素
ＥｃｏＲＴで切断し、このＤＮＡを電気泳動で０．７％
アガロースゲルに展開し、ナイロンメンブレンフィルタ
ー（シーンスクリーンプラス、ＮＥＷ・リサーチ・プロ
ダクト）に転写後、ネコＣλ鎖領域を含んだ［３２ｐ］
標識Ｔｌ−６２プローブとサザンハイプリダイゼーショ
ンを行った。サザンハイブリダイゼーションの方法はシ
ーンスクリーンプラスに付属していたマニュアルのプロ
トコールに従った０分子サイズはλフアージＤＮＡを旧
ｎｄｍで切断したマーカーＤｌｆＡによって算出した。

結果は、第４図に示すように、バンドが約２〜２０ｋｂ
まで色々なサイズにわたって検出された。このことはネ
コＣλ領域遺伝子が１種類のサブタイプだけでないこと
を示唆している。又、Ｃλ領領域１種類でないことはヒ
ト及びマウスの例［Ｐ、　　Ａ、　　Ｈ４ｅｔｅｒら、
　Ｎａｔｕｒｅ、　　２９４．　　ｐ５３６　　（１９
８１）；Ｇ、Ｆ、Ｈｏ１ｌｉｓら、　Ｎａｔｕｒｅ、　
　２９６．　　ｐ３２１　　（１９８２）：　　ＢＢｌ
ｏｍｂｅｒｇら、　Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ
ｄ、　　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　　７９ｐ５３　　（１９８
２）：Ｊ、　　ＭＮＩｅｒら、　Ｎａｔｕｒｅ、　　２
９５．　　ｐ４２８（１，９８２）］からも推定できる
。さらに野生のマウスではＣＡ領域遺伝子が増幅してい
ることが知られており　　　［Ｃ，Ｌ、　　　５ｃｏｔ
ｔ　ら、　　　Ｎａｔｕｒｅ、　　　３００．　　　ｐ
７５７　　　（１９８２）］このネコＣλ領域遺伝子も
同様に増幅を受けていることが考えられる。

次にノーザンプロット分析を行った。ハイブリダイゼー
ションに使用したＲＮＡはネコ肺臓細胞及びｐ）！−Ｔ
ｔｉ胞から全ＲＮＡをグアニジウ、ムチオシアネート法
［Ｊ、　　Ｍ、　　Ｇｈｉｎｇｗｊｎら、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ、　　１８．　　ｐ５２９４　（１９７９
）］により分離し、さらにオリゴｄＴカラム（ファルマ
シア）を用いてポリＡ＋ＲＮ＾に精製したものである。

このＲＮＡ２μ９を電気泳動により３％ホルムアルデヒ
ドを含む０．７５％アガロースゲルに展開し、ナイロン
メンブレンフィルター（シーンスクリーンプラス）に転
写後、［３２ｐｌ標識Ｔｌ−６２１０−ブとノーザンハ
イブリダイゼーションを行った。ノーザンハイプリダイ
ゼーションの方法はシーンスクリーンプラスに付属のマ
ニュアルのプロトコールに従った。その結果、両方の細
胞ともこのプローブにより約１．３ｋｂの位置にバンド
が検出されたく第５図〉。

このサイズはマウス及びヒトで知られている免疫グロブ
リンλ鎖遺伝子のサイズとほぼ同じである。

これら２つの結果より、このＴｌ−６２３１１伝子は機
能的なネコＣλ領域を含む活性な遺伝子であることが推
定された。

　− ＴＩ−６２の核酸塩基配列を調べるために、Ｔｌ−６２
がら、　ＥｃｏＲＩ　−３ａｃ　ｌ、　　Ｓａｃ　Ｉ　
−Ａｃｃ　ＩＩ　　、　Ａｃｃ　［１−ＥｃｏＲＬＥｃ
ｏＲＩ　−Ｈｈａ　ｒの各小ＤＮＡｗｆＴ片を１ｌｌｌ
製した（第３図）。

これらの各小断片を７４−ＤＮＡポリメレースを用いて
切断面を平滑末端に変えた後、Ｍ１３ｍｐ１９ベクター
のＳｉａ　Ｉサイトに宝ライゲーションキットを用いて
挿入した。東洋紡インストラクトマニュアルの方法に従
い、Ｊ１４１０１のコ、ンピテント細胞を調製し、Ｃλ
遺伝子を挿入したＭ１３ｍｐ１９　ＤＮＡで形質転換さ
せ、本鎖ＤＮ人を抽出精製した。さらにこの−本鎖ＤＮ
Ａの核酸塩基配列決定は、タカラＭ１３シークエンスキ
ットと富士・ジェンサー・ゲル・システムを用いて行っ
た。核酸塩基配列を行った方向は第３図に示す。

核酸塩基配列決定の結果、ＶＪＣの各領域からなるネコ
λ鎖遺伝子が確認された。第６図にその結果を示す、さ
らに、この核酸塩基配列を基にアミノ酸に変換したとこ
ろ、この遺伝子がオープンリーディングフレームをとり
、疑似遺伝子でないことが示されたく第７図〉、尚、出
願人は、このＤＮＡ断片を組み込んだベクターにより形
質転換された大腸菌Ｈｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ
　ＦＣＬ−Ｔ１６２　（Ｗ１工研菌寄第１０９４２号）
を寄託している。

このＴｌ−６２の核酸塩基配列をもとに遺伝子解析ソフ
ト（Ｇｅｎｅｔｙｘ　　Ｖｅｒ、６；　　ソフトウェア
開発社製）を用いて、ＬＡＳＬとＥＭＢＬのデータベー
スをホモロジー検索したところ、ヒト免疫グロブリンλ
鎖と一番高いホモロジーを示し、免疫グロブリン＾鎖遺
伝子以外の遺伝子とはホモロジーは示さなかった。

Ｔ　１．−６２″ｉｉ伝子のＣ＾領領域マウス及びヒト
のＣλ領領域ホモロジー比較すると、核酸レベルでマウ
スとは７５．８％、ヒトとは８１．３％であり、アミノ
酸レベルでマウス６９．５％、ヒトとは７７．１％であ
った。

以上の結果より、Ｔｌ−６２遺伝子は間違いなくネコλ
鎖に属する遺伝子であり、マウス−ネコキメラ抗体作製
を可能にする遺伝子である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明で作成されたネコ×マウスハイブリド
ーマの産生ずるＩｇＧが、ネコ型モノクローナル抗体で
あることを確認した抗ネコ抗体を用いたＥＩＡの結果を
示す。 第２図は、本発明で作成されたネコ×マウスハイブリド
ーマの産生ずるＩｇＧが、ネコ型モノクローナル抗体で
あることを確認した抗ネコ抗体を用いたウェスタンプロ
ットの結果を示す。 第３図は、本発明においてクローニングされたネコ免疫
グロブリンλ鎖定常領域をコードするＤＮＡ断片（Ｔｌ
−６２）の制限酵素切断地図および塩基配列解析を行っ
た領域（→）を示す。 第４図は、本発明においてクローニングされたネコ免疫
グロブリン＾鎖定常領域をコードするＤＮ＾断片（Ｔｌ
−６２）とネコ肝臓細胞染色体ＤＮＡ（ＥｃｏＲｒ消化
）のサザンハイブリダイゼーションの模式図である。 第５図は、本発明においてクローニングされたネコ免疫
グロブリンλ鎖定常領域をコードするＤＮＡ断片（ＴＩ
−６２）とＦ１４−ＴＩｌｌｌｌｌ胞のポリＡ十ＲＮＡ
　（レーン１）またハネコ１ｖＵＡホリＡ＋ＲＮＡ（レ
ーン２）トノノーザンハイブリダイゼーションの模式図
である。 第６図は、本発明においてクローニングされたＤＮＡ［
ｉ片（Ｔｌ−６２）中に存在するネコ免疫グロブリンλ
鎖定常領域をコードするＤＮＡ塩基配列を示す。 第７図は、本発明においてクローニングされたＤＮＡ１
１７ｒ片（Ｔ１．−６２）中にコードされるネコ免疫グ
ロブリンλ鎖定常領域の全アミノ酸配列を示す。

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）ネコ免疫グロブリンを産生するネコ×マウスヘテ
   ロハイブリドーマ。
2. （２）該ネコ免疫グロブリンのＬ鎖のクラスがλである
   前記第（１）項のハイブリドーマ。
3. （３）該λ鎖の定常領域ポリペプチドのＮ末端側から最
   初のシステインのＮ末端側のアミノ酸配列が下記のアミ
   ノ酸配列である前記第（２）項のハイブリドーマ。 【遺伝子配列があります】 （ｘｘｘは任意のアミノ酸残基）
4. （４）該システインのＮ末端側の配列が、下記のアミノ
   酸配列である前記第（３）項のハイブリドーマ。 【遺伝子配列があります】
5. （５）該λ鎖の定常領域ポリペプチドのＣ末端から２番
   目のシステインのＮ末端側１１個目〜９個目のアミノ酸
   配列が、−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−である前記第（２
   ）項のハイブリドーマ。
6. （６）該λ鎖の定常領域ポリペプチドのアミノ酸配列が
   、下記のアミノ酸配列である前記第（２）項記載のハイ
   ブリドーマ。 【遺伝子配列があります】
7. （７）ネコ免疫グロブリンを産生するネコ×マウスヘテ
   ロハイブリドーマのポリＡ＋ＲＮＡからｃＤＮＡを合成
   し、これを発現ベクターに組み込み宿主細胞で発現させ
   、抗ネコ免疫グロブリン抗体を用いて形質転換体をスク
   リーニングすることを特徴とするネコ免疫グロブリン遺
   伝子の調製法。
8. （８）ネコ免疫グロブリンλ鎖の定常領域をコードする
   ＤＮＡ配列を含有する遺伝子断片。
9. （９）該λ鎖の定常領域ポリペプチドのＮ末端側から最
   初のシステインのＮ末端側のアミノ酸配列が下記のアミ
   ノ酸配列である前記第（８）項の遺伝子断片。 【遺伝子配列があります】 （ｘｘｘは任意のアミノ酸残基）
10. （１０）該λ鎖の定常領域ポリペプチドのＮ末端側から
    最初のシステインのＮ末端側のアミノ酸配列が下記のア
    ミノ酸配列である前記第（９）項の遺伝子断片。 【遺伝子配列があります】
11. （１１）定常領域ポリペプチドのＣ末端から２番目のシ
    ステインのＮ末端側１１個目から９個目のアミノ酸配列
    が、−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−である前記第（８）項
    の遺伝子断片。
12. （１２）定常領域ポリペプチドが下記のアミノ酸配列で
    ある前記第（８）項の遺伝子断片。 【遺伝子配列があります】
13. （１３）下記のＤＮＡ配列を含む前記第（１０）項記載
    の遺伝子断片。 【遺伝子配列があります】
14. （１４）下記のＤＮＡ配列を含む前記第（１２）項記載
    の遺伝子断片。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】