JPH0379666B2 - - Google Patents

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JPH0379666B2
JPH0379666B2 JP55094578A JP9457880A JPH0379666B2 JP H0379666 B2 JPH0379666 B2 JP H0379666B2 JP 55094578 A JP55094578 A JP 55094578A JP 9457880 A JP9457880 A JP 9457880A JP H0379666 B2 JPH0379666 B2 JP H0379666B2
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Peetaa Hansen Daburyuu
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OOSO DAIAGUNOSUTEITSUKU SHISUTEMUZU Inc
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、自動化された血液学的計器に関し、
さらに詳しくは、血球の特異性化亜綱、たとえ
ば、ある型のリンパ球の同定および計数に関す
る。 血液中のリンパ球の集団個体数（population）
は、免疫応答において明確な役割を演ずるある数
の亜綱（subclass）で定められる。たとえば、
種々の亜綱中のリンパ球の相対的数は、病気の状
態を変えるようである。従つて、種々の亜綱の計
数および同定は特に血液のコンステイチユエンシ
ー（constituency）ばかりでなく、一般に有機体
の相対的な良好な存在について指示を与える。 機能的に異なるリンパ球の少なくともいくつか
の特定の亜綱は、細胞表面上の抗原性決定基
（antigenic determinant）に基づいて同定できる
ことは知られている。特に、かなり学究的且つ臨
床的な興味がＴリンパ球について起こつてきた。
なかでも、Ｔリンパ球はそれらの表面上の特定の
同定可能な抗原性決定基により特徴づけられ、そ
れらの決定基は亜綱の細胞を他の血球と、また他
のリンパ球の亜綱の細胞と区別する。しかして、
興味あるリンパ球亜綱と選択的に反応性の抗体を
含む試薬を同定し且つ生成することにおいて高い
興味が持たれている。 人間および動物の免疫系統に含まれるリンパ球
の２つの主要な群が存在することを理解すべきで
ある。これらの第１群（胸腺誘導細胞、すなわち
Ｔ細胞）はヘモポイエチン細胞からの胸腺中で分
化する。胸腺内に存在する間、分化する細胞は
「胸腺細胞」と名付けられる。成熟したＴ細胞は
胸腺から出て、組織、リンパ管および血流の間を
循環する。これらの細胞は再循環する小さいリン
パ球のプールの大きい比率を形成する。それらは
免疫学的特異性を有し、細胞媒介免疫応答（たと
えば、移植拒絶）において奏効体・細胞として直
接関与する。Ｔ細胞は液性抗体を分泌しないが、
それらは後述するリンパ球の第２群によるこれら
の抗体の分泌に時々要求される。Ｔ細胞のいくつ
かの型は、免疫系統の他の面において調整機能を
はたす。細胞共同（cell cooperation）のこの過
程の機構は、また完全には理解されていない。 リンパ球の第２群（骨髄誘導細胞、すなわちＢ
細胞）は、抗体を分泌するものである。それらは
またヘモポイエチン幹細胞から発生するが、それ
らの分化は胸腺によつて決定されない。鳥におい
て、それらはフアブリキウス嚢（Bursa of
Fabricius）と呼ばれる胸腺に類似する器官中で
分化される。しかしながら、哺乳動物において、
同等の器官は発見されておらず、これらのＢ細胞
は骨髄内で分化すると考えられている。 現在、Ｔ細胞は「ヘルパー（helper）」「サプレ
ツサー（suppressor）」および「キラー（killer）」
Ｔ細胞と呼ばれる、少なくともいくつかの亜類型
に分割されることが認められており、これらのＴ
細胞は（それぞれ）反応を促進し、反応を抑制
し、或いは異質細胞を殺す〔分離する（lysing）〕
機能を有する。これらの亜綱はネズミの系統につ
いてよく理解されているが、それらは人間の系統
について記載されたのはほんの最近になつてから
である。たとえば、Ｒ，Ｌ，Evans，et al.，
Journal of Experimental Medieine、Vol.145、
221〜232、1977；およびL.ChessおよびS.F.
Schlossman−“Functional Analysis of
Distinct Human Ｔ Cell Subsets Bearing
Unique Differentiation Antigeus”、
“Contempory Topics in Immunobiology”、
O.Stutman編、Plenum Press，1977、Vol.7、
363〜379参照。 Ｔ細胞の綱または亜綱を同定または抑制する能
力は、種々の免疫調整障害または状態診断または
処置に重要である。 たとえば、ある種の白血球およびリンパ腫は、
それらがＢ細胞またはＴ細胞に由来するかどうか
に依存して、異なる予後を有する。こうして、病
気の予後の評価は、これらのリンパ球の２つの群
を区別することに依存する。たとえば、A.C.
AisenberyおよびJ.C.Long、The American
Journal of Medicine、58：300（1975年３月）；
D.Belpomme、et al．，“Immunolgical
Diagnosis of Leukemias and Lymphomas”、
S.Thierfelder、et al.編、Springer，Heielberg、
1977、33〜45；およびD.Belpomme et al.，
British Journal of Haematology、1978、38、
85参照。ある種の病気の状態（たとえば、幼年リ
ウマチ様関節炎およびある種の白血病）は、Ｔ細
胞の亜綱の不釣合いに関連する。自己免疫病は一
般に「ヘルパー」Ｔ細胞の過剰またはある種の
「サプレツサー」Ｔ細胞の欠乏に関係するが、亜
性腫瘍は一般に「サプレツサー」Ｔ細胞と関連す
ることが示唆されている。ある種の白血病におい
て、過剰のＴ細胞は発育の抑圧段階において生成
される。こうして診断はこの不釣合い、すなわち
過剰を検知する能力に依存する。たとえば、Ｊ，
Kersey，et al.，“Surface Markers Define
Human Lymphoid Malignacies with
Differing Prognoses”，Haematology and
Blood Tranfusion，Vol.20、Springer−
Verlag，1977、17〜24およびその中に含まれる
引用文献参照。 最近、単クローン性（monoclonal）抗体技術
が、種々のリンパ球亜綱に対する高度に精製され
た抗体を大量に生成させるために使用されてい
る。このような抗体を使用することにより、個々
のリンパ球を検定して、種々の亜綱中の細胞の相
対的数を決定することが可能であることが明らか
にされた。さらに、直接的技術または間接的技術
を用いることにより、抗体を螢光的に標識付けし
（tag）、これによつて考慮する試料を流れ血液計
算分析に従わせることができる。 普通の免疫螢光技術は、現在、リンパ球を他の
リンパ球から物理的に単離することを予備工程と
して含む。この工程は、非特異性的に着色された
単球細胞または顆粒球細胞として計数されうると
いう可能性を排除する。しかしながら、この初期
のリンパ球単離工程は、長く、困難であり、実
事、リンパ球を着色または分析する比較的簡単な
工程よりも非常に長い。明らかなように、臨床の
舞台において、気速な反復的分析についてかなり
のプレミアムが存在し、リンパ球を他のリンパ球
から単離することの必要性は実際上克服し難しい
障害である。さらに、時間がそれほどプレミアム
ではない研究の応用に対してさえ、初期のリンパ
球の単離工程は、単球細胞および顆粒球細胞の除
去の間、多少のリンパ球の損失の危険を含み、こ
れは引き続く分析に不確実性と不精確性をもたら
す。相応して単離しようとするリンパ球から他の
血球を完全に除去しないと、誤差を生ずる危険が
かなり生じ、そしてこのような他の細胞が存在す
ると、引き続く分析において誤差が生ずることが
よくある。 したがつて、本発明の目的は、リンパ球の特異
性亜綱を同定および計数し、同時にリンパ球の他
の血球からの前もつての分離の必要性を回避する
方法を提供することである。関連する目的は、同
様な抗原特性を含む他の型の血球のためのこのよ
うな方法を提供することである。 相応して、本発明の目的は、現在の技術よりも
かなり速く、そして他の細胞からの異物データ
（artifact data）に伴う欠陥のある分析、或いは
試料からのリンパ球の損失によるデータの損失を
実質的に排除する方法を提供することである。さ
らに本発明の目的は、速度がはやく且つ比較的簡
単であるため、リンパ球の亜綱の同定および計数
を有効な臨床的道具とするこのような方法を提供
することである。 本発明は、光学および信号の処理により従来の
流れ細胞螢光測定装置を選択的に変更することを
包含し、この装置で興味ある亜綱の選択的免疫螢
光着色（直接または間接）を利用することがで
き、そして全血液試料〔必要に応じて、淡黄膜
（buflycoat）層または抗凝固処理した全血液〕を
一度に１つの細胞について分析する。 好ましい態様において、流れ細胞螢光測定装置
の直角螢光チヤネルの１つは直角散乱のための波
長特異性センサとして働らくように適合されてい
る。全血液または淡黄膜層の試料インキユベート
（incubate）して興味ある亜綱のリンパ群の表面
上の特異性抗原を一定の照明（たとえば、アルゴ
ンイオンのレーザーから集束された干渉性の光）
に前もつて決定した螢光応答性を有する抗体と結
合させ、これによつて興味ある亜綱の細胞自体を
効果的にこのような入射光に対して螢光応答性と
する。次いで、試料の細胞を流れ細胞メーターの
流れチヤンネルに通過させる。これ流れ細胞メー
ターは、前方光散乱器、ならびに直角光散乱器お
よび螢光を監視する能力を有する。ある前方散乱
条件を、それが認められるとき、直角光散乱条件
と組み合わせて使用して、検知された螢光をゲー
ト（gate）する。一定の色（たとえば、緑色）の
特異性螢光を検出したとき、出力信号が生成され
て一定の亜綱のリンパ球の存在を示す。それか
ら、このデータは正しく記憶および／または表現
（たとえば、あるヒストグラムの形に）できる。
さらに、この分野で知られているように、細胞の
分類技術を使用して一定の亜綱のリンパ球を物理
的に単離できる。 以下、本発明を添付図面を参照しながらさらに
詳しく説明する。 まず第１図を参照すると、本発明の原理に従つ
て使用できる装置が様式化されて機能的および構
造的に表示されている。事実、第１図の装置は、
商品名CYTOFLUOROGRAPH で商業的に入
手できる特定のシステム（Ortho Instruments，
410 University Avenue，Westwood，
Massachusetts 02090製）である。第１図の装置
は、細胞分析のための流れ血球計算の原理を組み
入れ、そして特定の型の照明に対する細胞螢光応
答を感知する能力を含む。 第１図の装置の焦点に流れチヤンネル１０６が
存在し、ここにおいて懸濁液中の細胞は単一の列
で急速に（たとえば、2500細胞／秒で）感知帯域
を通る。感知帯域は、細胞流と入射光ビーム、典
型的は気体レーザーからの集束された干渉性の光
との交差によつて定められる。細胞が感知帯域を
通過するとき、それは入射光と色々な方法で相互
作用する。ある光は、もちろん、細胞により吸収
され、他の光は入射光の軸に対して比較的に狭い
角度で散乱し、そしてなお他の光は入射光の軸か
らの非常に発散した角度、たとえば、入射光に対
して直角に散乱される。さらに、細胞自体の性
質、および細胞があらかじめ受けることができる
染色または着色に依存して、螢光放射も起こりう
る。 したがつて、細胞流および入射レーザー光に関
して種々の方向で位置する光センサは、各一定の
型の細胞に対して独特の組の応答の検知を可能と
する。こうして、第１図は、イオン・レーザー１
０１およびヘリウム・ネオン・レーザー１０２を
含み、各レーザーから放射された干渉性の光は鏡
１０３および１０４ととレンズ１０５により流れ
チヤンネル１０６の感知帯域へ種々に反射され
る。この分野において知られているように、細胞
の試料流を流れる流体の鞘内で層流で運んで、単
一細胞が感知帯域において一定時間において照明
されることを確保する。それゆえ、各細胞がレン
ズからの光により照明されたとき、細胞と光との
相互作用が感知される。 第１図に示すように、吸光センサ１０８は細胞
が遮断した光の量を検知し、そして前方光散乱は
光センサ１０９および１１０によりほぼ半角20゜
の円錐において検知される。センサ１０８，１０
９および１１０によつて発生された電気信号は、
増幅器１２０および１２１に接続される。これら
の増幅器１２０および１２１は適当な振幅の電気
信号になどを引き続く分析および／または表示の
ため提供する。 第１図の装置において、螢光応答により細胞か
ら放射した光は、細胞の流れの方向および入射光
の軸の両方に対して、ほぼ直角で感知される。球
面鏡１２５および集光レンズ１０７はこの光をほ
ぼ半角20゜の円錐で集め、この光を開口１１１を
通して、連続的に二色鏡１１２および第２鏡１１
３へ伝える。第１色フイルタ１１４（たとえば、
比較的長い波長の光を通すため）は、選択した光
を二色鏡１１２から光センサ１１７（たとえば、
光電子増倍管）へ運ぶ。第２フイルタ１１５は異
なる色の光（たとえば、比較的短かい波長の光）
を第２鏡１１３から第２センサへ選択的に通す。
それぞれの細胞からの光に相当するパルスの形の
センサ１１６および１１７からの電気信号は、増
幅器１１８および１１９へ結合され、これによつ
てまた適当な処理に適合する信号を生成する。 第１図の態様に示すように、センサ・セレクタ
１２２は増幅器１１８〜１２１からの信号を利用
する出力ヒストグラムを発生する。たとえば、出
力の１つの有用な形は、センサ１１６からの、緑
の螢光の振幅に対する、プロツトである。このよ
うなヒストグラムは表示１２３に示されており、
ヒストグラム上の各点は個々の細胞を表わす。ヒ
ストグラム上のインジケータの集団または集合
は、同様な型の細胞の群を表わす。非常に明らか
なように、当業者は緑の螢光の強さに対する狭い
前方角の散乱のヒストグラム、軸方向の光の吸収
に対する狭い角度の散乱のヒストグラムなどをつ
くることに有用性を見い出すであろう。 第１図の装置の既知の応用に従えば、センサ１
１７からの、いわゆる第１螢光チヤンネル１１９
は、主として長い波長の螢光を測定するために使
用されるが、また、広い角度の散乱を検知するた
めに、ある場合において有用である。このような
場合は、本発明の原理に従い、そしてこの因子を
強調するために、普通の赤フイルタ・ブロツク１
１４の代わりに、レンズ１０５からの入射光の軸
に対して直角に散乱するレーザー１０１からの青
のレーザー光をセンサ１１７に向けるのに適する
フイルタを使用することが好ましい場合である。
光電子増幅倍管１１７および増幅器１１９の設計
パラメーターの適用は、当業者の能力に従い、継
続処理のための適当な特性の信号を生成するため
に、要求される。 第２図は、本発明の原理に従う好ましい信号処
理面のブロツク線図の相を記載するが、その装置
は本発明の次の理論的および方法的面を詳細に考
察すると、多分一層よく理解できるであろう。 本発明の原理に従う血液試料の適切な調整は、
試料を興味ある亜綱に対する抗体で刺激し且つ試
料を含み、この抗体は入射レーザー光で照明した
とき螢光を放射するという要求される特性を有す
る。１つのアプローチにおいて、正常のヒトの提
供者からの全血液を抗凝固処理し（たとえば、
EDTAで）、遠心分離し、淡黄膜を単離する。別
法として、抗凝固処理した全血液を利用する。適
当な抗体を用いる刺激を達成し、次いで赤血球を
試料から普通の方法で溶解する。次いで、初期の
抗体が適切に螢光に対して活性であると仮定する
と、試料は希釈し、流れ細胞測定分析に使用でき
る状態にある。間接的免疫螢光着色を含む場合、
第２刺激を第１抗体に対する第２抗体を用いて実
施し、そしてこの第２抗体は要求される螢光特性
を有する。 試料が流れチヤンネルを通過し、照明されると
き、吸光、前方光散乱、直角光散乱および螢光の
光学的パラメーターを同時に検知するが、信号処
理の観点から、種々のパラメーターの意味を相対
的優先を基準にして考慮する。すなわち、前方の
狭い角度のパルス（任意であるが、かならずしも
吸光信号を含まない）および直角散乱パルスの両
方は、動作すべき緑の螢光信号を使用するための
それぞれの範囲内に存在しなくてはならない。次
いで、結合した抗体などからの偽の螢光計数につ
いて補正した後、緑の螢光パルスの存在は特異性
化亜綱のリンパ球の存在を示す。このアプローチ
が働く理由は、次の通りである。すなわち、前方
散乱のための「窓」は白血球を血小板、部分的に
溶解した赤血球、および溶液中の残屑と判別する
効果もち、そして直角に関する「窓」はリンパ球
を単球および顆粒球と判別するからである。狭い
角度の散乱および直角散乱を有する細胞の検知は
それぞれの案内でパルスし、これによつて効果的
にリンパ球の存在の検知に対応する。 リンパ球の所望の亜綱の主インジケーターは、
特定の色の螢光である。もちろん、試料が為のイ
ンジケーターを含む場合、このようなインジケー
ターの効果を計数することが必要であろう。１つ
のこのようなインジケーターは溶液中の螢光分子
を含み、これらの螢光分子は試料を流れ細胞分析
前に洗浄することによつて排除できる。偽のイン
ジケーターの他のクラスは、螢光抗体の細胞への
非特異性結合によつて生ずる。いずれかの型のイ
ンジケーター（または両方）についての１つのア
プローチは、手に１つの対照材料を維持すること
であり、これは偽のまたは実際の螢光データの効
果のモデルである。他のアプローチはこのような
対照の応答に相当する計器のデータを維持するこ
とである。明らかなように、真の読みは実際の検
知された試料の信号を対照フアクターの導入によ
り、典型的には対照の応答を実際のゲートした
（gated）螢光信号と組み合わせること〔たとえ
ば、引き算またはデイコンボリユージヨン
（deconvolution）〕により得ることができる。同
様な方法で、対照試料または対照データを使用し
て、当業者によつて検知できる種々の条件につい
て補正できる。 第２図を参照すると、本発明の原理を用いる機
能的ブロツク線図が示されている。第２図におい
て、前方散乱の参照「窓」は２０１で示し、そし
て直角散乱参照「窓」は２０４で示されている。
これらの参照値は、固定されたまたは調整可能な
電位計により、簡単に、或いは種々の環境因子、
試料採取した血液中に含まれる処理の型または量
と関連する変数などを考慮する記憶されたプログ
ラム制御のような複雑かつ難解なアプローチによ
り、維持できる。いずれの場合においても、２０
１および２０４における「窓」は、それぞれ、対
応する前方散乱または直角散乱のパルスが可能な
白血球を定めるところの振幅の範囲を定める。前
方散乱パルス信号２０２、たとえば、狭い角度の
光センサ１０９および１１０から第１図の増幅器
１２０において生成するようなもの、はコンパレ
ータ２０３に接続される。コンパレータ２０３
は、２０２における関連するパルスが２０１に定
める窓内に落下するとき、アンド・ゲート２０７
へ動作信号を与える。同様に、２０５における直
角散乱のパルス信号はなお他のコンパレータ２０
６に結合され、その他方の入力へは２０４からの
直角散乱のための参照「窓」から供給を受ける。
再び、２０５における直角の散乱パルスが直角散
乱窓内にあるとき、動作信号はコンパレータ２０
６からアンド・ゲート２０７へ運ばれる。それゆ
え、前方散乱参照窓内に前方散乱パルス、そして
直角散乱窓内に直角パルスが同時に生ずると、ア
ンド・ゲート２０７は２０８における測定を動作
し、緑の螢光チヤンネル２０９からの緑の螢光パ
ルス（たとえば、第１図の装置の増幅器１１８か
ら）の発生を確認する。 次に、パルス高さ分析器２１１が示されてお
り、この分析器は緑の螢光チヤンネルからのデー
タを色々に補正し、そして適当な表示および出力
のデータを生成する。前述のように、補正は偽で
あるが予測された螢光信号による強度のある量を
引き算するように簡単であることができ、或いは
対照試料の先の分析または引き続く分析によるデ
ータの生成のように複雑であることができる。一
般に、２１１におけるパルスの高さの分析は、当
業者により容易に可能であるように、普通のアプ
ローチに従い適当な増幅、フイルタ、および信号
の処理を構成する。２１２における出力データの
表示は、同様に当業者の能力の範囲内である適当
なヒストグラムなどの作製を含む。 ここで使用するように、「螢光応答性抗体」は、
それら自体螢光を発生する抗体、あるいは特異性
刺激のもとに螢光に対して標識付けされる抗体を
意味する。 第２図の略図は、本発明の原理の機能的面を単
に表わし、そして当業者の能力の範囲の多数の変
法を包含することを理解すべきである。同様に、
ここに記載する方法および装置は、本発明の原理
の好ましい且つ例示的態様を構成するが、多数の
変法は本発明の精神または範囲を逸脱することな
く当業者に容易に考えられうることを理解すべき
である。 実施例 材料および方法： Ａ 細胞の調製 正常人の提供者からの全血液をEDTAで抗凝
固処理した。淡黄膜層を取り出し、そして淡黄膜
層中の白血球の濃度を測定し、リンパ球の百分率
を、下に説明するように、変形したサイトフルオ
ログラフ（Cytofluorograph）（Ortho
Instruments，Westwood，MA）で推定した。
リンパ球濃度が10000／mm3より大である場合合、
淡黄膜層をリン酸塩緩衝塩溶液（すなわち、
“PBS”）（Dulbeco）で希釈して10000リンパ球／
mm3の濃度にした。 Ｂ 間接的免疫螢光着色 100μの淡黄膜層を100μの適当に希釈した
単球抗体（マウス−抗リンパ球亜綱）と共に40℃
において30分間インキユベートした。このインキ
ユベーシヨンの終りにおいて、細胞を２〜４mlの
緩衝した等張塩化アンモニウム（NH4Cl、16.58
ｇ／、EDTA二ナトリウム0.074ｇ／、重炭
酸カリウム、2.00ｇ／、PH＝7.3）で処理した。
５分後、赤血球は溶解してしまい、そしてこの懸
濁液を200×Ｇで５分間遠心分離した。上層を取
り出し、白血球と残留する血小板および幻影赤血
球を含有するペレツトをPBS中で１回洗つた。
このペレツトをおだやかに分散し、４℃において
30分間100μの螢光処理したヤギ−抗−マウス
7S（Meloy Laboratories，Spingfield，VA）、
Ｐ／Ｐ＝2.5、の40：１希釈液でインキユベート
した。このインキユベーシヨンの後、必要に応じ
てPBSでさらに洗つた後、細胞を１mlの最終体
積に希釈し、これによりこれは流れ血球計の分析
に使用できる状態となつた。 Ｃ 流れ細胞分析 サイトフルオログラフ（Cytofluorograpy）
FC200／4800A（Ortho Instruments，
Westwood，MA）を使用して、試料中の各細胞
の前方および直角の光散乱および緑の螢光を同時
に測定した。この計器を変形して、赤の螢光を検
出するのに通常使用される光量子増倍管中への入
射ビームに対して直角で散乱する青のレーザー光
を検出するのに適当なフイルターを、「赤」フイ
ルタ・ブロツクの代りに、使用した。緑のフイル
タ・ブロツクはFITCフイルタを含有した。通常
存在する前方散乱の信号と一緒に直角散乱信号
を、4800A分析器上にサイトグラムとして表示し
た。この器具に対照を用いることにより、前方お
よび直角の光散乱の特定の組み合わせを有する明
胞についてゲート・パルスを生成させた。4800A
へ付加した別のモジユールにより緑の螢光を電気
的に積分し、そして積分した螢光パルスをパルス
高さ分析器（2102型、Ortho Instruments，
Westwood，MA）に記録した。4800Aからのゲ
ート・パルスを用いることにより、特定の光散乱
特性を有する細胞のみからの螢光を記録すること
ができた。 Ｄ 結果 白血球の同定法を、第３Ａ図および第３Ｂ図に
図解する。ここに使用するように、「サイトグラ
ム（cytogram）」はデータの表示であり、ここで
各点は単一の細胞を表わし、そして点の位置は座
標で与えられ、これらの座標は選択したパラメー
ター、たとえばサイトグラフ中の細胞により生ず
る直角および前方の光散乱の強さに比例する。第
３Ａ図中の試料は、塩化アンモニウム溶解試薬で
希釈した全血液であつた。点すなわち細胞の４つ
の集団を区別できる。集団１は血小板と幻影赤血
球の群集または多重線による。集団２〜４はそれ
ぞれリンパ球、単球および顆粒球による。白血球
の集団の同定は、各集団中の相対的計数値と手に
よる微分白血球計数値との比較に基づく。同様な
集団を赤（HeNe）のレーザーを用いて原型細胞
分類器で観測した。対応する集団中の細胞の分
類、細胞のアクリジンオレンジを用いる細胞の着
色および螢光顕微鏡による細胞の観察は、集団が
正しく同定されたことをさらに証明した。第３Ｂ
図は、全血の密度こう配分離によつて調製した
「単核細胞」の試料のサイトグラムである。血小
板の集合、リンパ球および単球の集団は第３Ａ図
のそれらに類似するが、顆粒球の集団は、期待さ
れるように存在しない。第３Ａ図および第３Ｂ図
から明らかなように、リンパ球は顆粒球と容易に
区別される。それらは集団２および３においてリ
ンパ球と単球との少量の重復が存在しうるが、現
在の目的に対して、集団２がリンパ球のみを含
み、そして集団３が単球だけを含有すると十分に
みなされた。 前方光散乱は、第３Ａ図および第３Ｂ図から、
リンパ球を血小板および幻影赤血球と判別するの
に主として有用であることがわかる。計器の限界
値を、典型的にはこれらのより小さい細胞を排除
するようにセツトして、白血球だけ計数されるよ
うにした。これをなしたとき、直角の光散乱パラ
メーター単独は白血球の型をきわめて良好に判別
する。第３Ｃ図中のヒストグラム“Ａ”および
“Ｂ”は、それぞれ第３Ａ図および第３Ｂ図中に
示すサイトグラムに相当する。ピーク１〜３は、
それぞれリンパ球、単球および顆粒球に相当す
る。 免疫螢光着色法は淡黄膜層に応用すると、最終
の細胞の調製は第３Ａ図に示すものと本質的に同
一の光散乱集団を生成する。リンパ球、単球およ
び顆粒球は直角光散乱に基づいて区別されうるの
で、緑の螢光対直角散乱のサイトグラムはこれら
の白血球の型のいずれが着色されるかを示すであ
ろう。第３Ｄ図および第３Ｅ図は、対照、第３Ｄ
図、または抗Ｔ細胞、第３Ｅ図、抗体で培養した
血液試料についてのこのようなサイトグラムを示
す。対照は非抗体生成クローンからの上層であ
り、一方抗Ｔ細胞抗体はモノクローン性抗体であ
つた。対照の場合において、顆粒球だけが有意の
螢光を示した。 しかしながら、抗Ｔ抗体を用いて着色した血液
は、比較的強い螢光をもつ明確なリンパ球の集団
を示した。この「Ｔ」集団は77％のリンパ球（光
散乱で定められるような）を含有し、明らかなよ
うにＴ−リンパ球のみを含有する。 第３Ｆ図は、リンパ球の集団（第３Ａ図中の集
団）からの青色螢光のヒストグラムを示す。第３
Ｆ図のヒストグラムＡは対照抗体を有する試料に
ついてのものであり、一方第３Ｆ図のヒストグラ
ムＢは抗Ｔ抗体を有する試料についてのものであ
る。Ｔ細胞は第３Ｆ図のヒストグラムＢにおいて
明確なピークを生成する。Ｔ細胞は非常に明確な
ピークを形成する。すべての白血球からの緑の螢
光のヒストグラムは、Ｔリンパ球のピークと部分
的に重なる顆粒球によるピークを有する。 数人のヒトの提供者からの血液を用いる、いく
つかの異なるリンパ球−亜綱特異性抗体を使用し
た実験は、上に報告したものに類似する性質の結
果を与えた。抗Ｔ細胞がリンパ球の集団中に70〜
80％の細胞を典型的には有したと特徴づけられた
抗体を用いて試験した血液は、有意な螢光を生成
する。抗Ｂ細胞がリンパ球集団中に20％の細胞を
典型的には有したと特徴づけられた抗体を用いて
試験した血液は、有意な螢光を生成する。これら
の結果は、Ｔ細胞およびＢ細胞の百分率の正常の
範囲にある。
【図面の簡単な説明】
第１図は、商業的に入手できる流れ螢光装置の
様式化した相を示す。第２図は、信号処理装置の
略線図であり、この装置により第１図に示した型
の装置を、本発明の原理と組み合わせて、リンパ
球の特異性亜綱を同定および計数できる。第３Ａ
〜３Ｆ図は、本発明の原理の応用を図解するヒス
トグラムを示す。 図中、１０１……アルゴン・イオンのレーザ
ー、１０２……He−Neレーザー、１０３……
鏡、１０４……二色鏡、１０５……レンズ、１０
６……流れチヤンネル、１０７……集光レンズ、
１０８……吸光センサ、１０９，１１０……光セ
ンサ、１１１……開口、１１２……二色鏡、１１
３……鏡、第２の鏡、１１４……フイルタ、第１
の色フイルタ、赤フイルタ・ブロツク、１１５…
…フイルタ、第２のフイルタ、１１６……第２の
光センサ、１１７……光センサ、光電子増倍管、
１１８……増幅器、１１９……増幅器、第１の螢
光チヤンネル、１２０，１２１……増幅器、１２
２……センサ・セレクタ、１２３……表示、１２
５……球面鏡、２０１……前方散乱参照「窓」、
２０２……前方散乱パルス信号、２０３……コン
パレータ、２０４……直角散乱参照「窓」、２０
５……直角散乱パルス、２０６……コンパレー
タ、２０７……アンド・ゲート、２０８……緑の
螢光パルス、２０９……緑の螢光チヤンネル、２
１０……緑の螢光補正（制御または記憶データ）、
２１１……パルス高さ分析器、２１２……出力デ
ータの表示。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ ａ 検査すべき血液から試料容量を準備し、 ｂ 該試料容量を血液中のリンパ球の選択した亜
    綱の細胞の表面上の明瞭な抗原決定基と選択的
    反応性である抗体と共にインキユベートして、
    該亜綱の細胞を選択的に標識付けし、該抗体は
    一定の光学的刺激に対して前もつて決定した蛍
    光応答を有し、 ｃ 該試料容量から赤血球を分離し、 ｄ 該試料容量を、一度に実質的に一つの細胞ず
    つ、該一定の型の集束された光学的刺激の領域
    を通過させ、その間該細胞から散乱および放射
    された光を検知し、 ｅ 該検知された光における該前もつて決定した
    蛍光応答の発生に、少なくとも部分的に基づい
    て該亜綱の細胞を分別する、 工程からなることを特徴とする、血液中のリンパ
    球の選択した亜綱の細胞を同定および計数する自
    動化された方法。 ２ 該準備工程が抗凝固処理されているが、他の
    方法では実質的に処理されていない全血液を準備
    することからなる特許請求の範囲第１項記載の方
    法。 ３ 該準備工程が、全血液の試料を準備し、該試
    料を一定期間遠心分離し、該試料から淡黄膜層を
    単離し、そして該単離された淡黄膜層を該試料容
    量として準備することからなる特許請求の範囲第
    １項記載の方法。 ４ 該標識付け工程が、一定波長の光学的刺激に
    より照射されたとき、既知の強さおよび振動数範
    囲内で蛍光を発生する、該試料容量を抗−Ｔ型リ
    ンパ球の特異性化亜綱抗体と共にインキユベート
    することからなる、Ｔ型リンパ球の特異性化亜綱
    の同定および計数に適合させた、特許請求の範囲
    第１項記載の方法。 ５ 該通過工程が、該領域においてアルゴンレー
    ザーの集束を準備することからなる特許請求の範
    囲第４項記載の方法。 ６ 該通過工程が、 前方光散乱と直角散乱のそれぞれの参照範囲を
    準備し； 一定の細胞について前方および直角の散乱パル
    スを検知し； それぞれの検知されたパルスを対応する参照範
    囲と比較し； 両方の該検知されたパルスがそれらの該対応す
    る範囲内にあるとき、該前もつて決定した応答の
    直角蛍光の検知を可能とする、 ことをさらに含む特許請求の範囲第１項記載の方
    法。 ７ 該標識付け工程が、あらかじめ蛍光染料と会
    合させたある量の該抗体と共に該試料容量をイン
    キユベートすることからなる特許請求の範囲第１
    項または第４項記載の方法。 ８ 該標識付け工程が、非蛍光的に応答性の抗体
    で該試料容量をインキユベートし、次いで該前も
    つて決定した蛍光応答性をもち且つ該非蛍光的に
    応答性の抗体と反応性である抗体試薬で該試料容
    量をインキユベートすることからなる特許請求の
    範囲第１項または第４項記載の方法。
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