JPH0390095A - デオキシマルトオリゴシド誘導体、これを有効成分とするα―アミラーゼ活性測定用試薬及びこれを用いたα―アミラーゼ活性の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、新規な６−デオキシマルトオリゴシド誘導体
、該誘導体を有効成分とするσ−アミラーゼ活性測定用
試薬及び該誘導体を用いてα−アミラーゼ活性を効率よ
く、かつ正確に測定する方法に関するものである。

従来の技術 従来、血清、尿、膵液、唾液などの体液を対象とするα
−アミラーゼ活性の測定は、臨床診断上極めて重要であ
り、特に急性や慢性の肝炎、膵臓ガン、流行性耳下腺炎
などの鑑別診断においては必須の測定項目となっている
。

このα−アミラーゼ活性の測定方法については、従来よ
り種々の方法、例えば（１）デンプン又は色素結合デン
プンを基質とし、還元力あるいは吸光度を測定する方法
、（２）マルトテトラオース、マルトペンタオースなど
の一連のマルトオリゴ糖を基質として利用し、α−アミ
ラーゼにより切断しｌ；のち、共役酵素系を作用させ、
生皮するマルトース、グルコース又はグルコース−６−
リン酸を定量する方法、（３）各種置換フェニルマルト
オリゴシト類を基質として利用し、α−アミラーゼによ
り切断したのち、共役酵素系を作用させ、生皮する置換
フェノール類をそのままあるいは必要に応じてｐＨを変
化させたのち、あるいは縮合反応を行ったのち比色定量
する方法、（４）非還元末端グルコースの６位及び／又
は４位をアリール基、アルキル基等で修飾した、各種置
換フェニルマルトオリゴシト類を基質として利用し、（
３）と同様に比色定量する方法などが知られている。

しかしながら、（１）の方法においては、基質に用いら
れるデンプンの品質により、測定値にバラツキが生じる
。また、酵素切断部位が多数存在するため、α−アミラ
ーゼ反応を真に化学量論的反応として測定できないなど
の欠点を有している。

これに対し、（２）の方法は、均一な基質を使用するた
めに、前記（１）の欠点を補うことができるが、あらか
じめ試料中のマルトース、グルコースなどの糖質を完全
に消去することが必要である上、酵素反応で生皮するグ
ルコースをグルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ
、クロモゲン系を用いて測定する場合に、試料中のグル
コースの影響を補正する必要があるとともに、多量のグ
ルコースオキシダーゼを必要とし、さらに、試料中に存
在するアスコルビン酸、ビリルビンなどの還元物質の影
響を免れないなどの欠点がある。

一方、（３）の方法、特に２−クロロ−４−ニトロフェ
ニル−β−マルトペンタオシドを基質として使用する方
法は、現在最も優れた方法として広く普及しているが、
基質が共役酵素に分解されるため、正の誤差を生じやす
く、また、共役酵素量を減らすとラグタイムが長くなる
という欠点を有している。そこで、（３）の方法におけ
る欠点を改良するｔ；めに共役酵素で分解されない前記
（４）の方法が開発されている。

しかしながら、これらの基質は、水に対する溶解度が低
い、α−アミラーゼに対する親和性が低い、α−アミラ
ーゼによる分解速度が低い、化学的に不安定で長期間保
存することができないなどの多くの欠点を有している。

発明が解決しようとする課題 本発明は、このような従来のσ−アミラーゼ活性の測定
試薬及びそれを用いる測定方法が有する欠点を克服し、
ａ−アミラーゼ活性を効率よく、かつ正確に測定しうる
試薬として好適な新規化合物を提供するとともに、これ
を試薬とした新規なα−アミラーゼ活性の測定方法を提
供することを目的としてなされｔこものである。

課題を解決するための手段 本発明者らは、前記目的を遠戚するために種々研究を重
ねた結果、α−アミラーゼ活性測定用試薬として特定の
新規６・デオキシマルトオリゴシド誘導体が極めて好適
であり、これを用いてα−アミラーゼ活性を測定するこ
とにより、その目的を遠戚しうろことを見出し、この知
見に基づいて本発明を完膚するに至った。

すなわち、本発明は、一般式 （式中のＲは芳香族発色性基であり、 ｎは２〜 ６の整数である） で表わされる６−デオキシマルトオリゴシド誘導体、一
般式（１）の化合物を有効成分とするａ−アミラーゼ活
性測定用試薬、及びα−アミラーゼ含有試料に、一般式
（Ｉ）の化合物と、ａ−グルコシダーゼ及び／又はグル
コアミラーゼと必要に応じβ−グルコシダーゼを添加し
て酵素反応を行わせ、遊離する芳香族発色性化合物を定
量することを特徴とするα−アミラーゼ活性の測定方法
を提供するものである。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明の前記一般式（Ｉ）の６・デオキシマルトオリゴ
シド誘導体における６−ジオキシマルトオリゴ糖部とし
ては、例えば、σ−及び／又はβ・６４−デオキシ−Ｄ
−マルトテトラオースからａ−及び／又はβ−６１−デ
オキシ−Ｄ−マルトオクタオースまでに対応するものが
全て使用できる。これらの中でも特に６５−デオキシ・
Ｄ−マルトペンタオース、６＠−デオキシ−Ｄ・マルト
ヘキサオース、６フーデオキシ・Ｄ−マルトヘプタオー
スが好適である。なお、上記化合物におけるデオキシの
前に付した記号６”、６’−６・−などは、それぞれマ
ルトオリゴ糖を構成するグルコース単位の還元末端側か
ら４番目、５番目、６番目のグルコースの６位の水酸基
が水素原子に置換されていることを意味する。

前記一般式（Ｉ）で表わされる６−デオキシマルトオリ
ゴシド誘導体において、還元末端グルコースの１位の水
酸基に置換されるＲは、芳香族発色性基であって、この
ようなものとしては、例えば以下のものが挙げられる。

（Ｒｌ　＃　ＲＩは水素原子、アルキル基、アリル基、
アリール基、アシル基、カルボキシル基、シアノ基、ホ
ルミル基、アルコキシ基、ニトロ基、ニトロソ基、アミ
ノ基、アジド基、スルホン酸基、スルホキシル基、スル
ホニル基、又はハロゲン原子であり、それぞれ同一であ
ってもよいし、また異なっていてもよく、 またＲ１とＲ′、 又はＲ２とＲ３が結 合して、 縮合芳香環を形成してもよい。

ただし、 ＲＩ　Ｍ／　Ｒ１は同時に水素原子ではない）６ （Ｒ１は水素原子又はアルキル基である）（Ｒ７は水素
原子又はハロゲン原子である）（Ｒ８〜ＲＩ５は水素原
子、 アルキル基、 アリル基、 アリール基、 アシル基、 カルボキシル基、 シアノ 基、ホルミル基、アルコキシ基、ニトロ基、ニトロソ基
、アミノ基、アジド基、スルホン酸基、スルホキシル基
、スルホニル基、又はハロゲン原子であり、それぞれ同
一であってもよいし、また異なっていてもよく、またＲ
８とＲ９、及び／又はＲＩＯとＲ１１が結合して、縮合
芳香環を形成してもよく、さらにＲ１とＲｌｅ、及び／
又はＲ１３とＲ１４が共通の酸素原子となって縮合エー
テル環を形成してもよく、またＺは窒素原子又はＮ−４
０である）そして、前記一般式ＣＩ）で表わされる６−
デオキシマルトオリゴシド誘導体はａ−アノマー又はβ
−アノマーのいずれでもよい。

したがって、前記一般式（１）で表される化合物トシて
は、例えハ２−クロロー４−二トロフェニル−６２−デ
オキシ−β−Ｄ−マルトペンタオシド、４−ニトロフェ
ニル−６ｓ−デオキシ−σ−Ｄ−マルトペンタオシド、
フェノールインド−３′−クロロフェニル−６ｓ−デオ
キシ−β−Ｄ−マルトペンタオシド、４−ニトロフェニ
ル−６’−チオキシ−β−Ｄ−マルトヘプタオシド、２
−クロロ・４−ニトロフェニル−６７−デオキシ−β−
Ｄ−マルトヘプタオシド、メチルランベリフェロニル−
６５−デオキシ−β−Ｄ−マルトペンタオシド、レザズ
リニル−６フーデオキシーβ−Ｄ・マルトヘプタオシド
などが挙げられる。

本発明の前記一般式（Ｉ）で表わされる６−ジオキシマ
ルトオリゴシド誘導体は、いずれも文献未載の新規化合
物であって、例えば次に示す各種方法（Ａ−Ｄ法）によ
り製造することができる。

Ａ法ニ一般式 （式中のれは４〜６の整数である） で表わされる６・デオキシシクロデキストリンに、ある
種のシクロデキストリナーゼを作用させることにより、
一般式 （式中のＸは、ｉｔ’ｌｌが水素原子で、他のｎ＋１個
が水酸基であり、ｎは４〜６の整数である）で表わされ
る種々の位置に６−ジオキシグルコース残基を有する６
−ジオキシマルトオリゴ糖の混合物を主成分とする反応
液を得る。

出発物質である、前記一般式（ｎ）で表わされる６−デ
オキシシクロデキストリンは、分岐体、修飾体などの誘
導体なども包含するシクロデキストリン骨格を有するシ
クロデキストリン類、例えば市販のα−１β−１γ−シ
クロデキストリン（グルコース重合度が各々６，７．８
）などから公知の方法で得ることができる。例えば、シ
クロデキストリンをピリジンなどの溶媒に溶解じ、トシ
ルクロリドを７〜１４倍モル添加して、１５〜３０°Ｃ
で４〜６時間反応させてトシル化し、必要に応じ常法に
より精製して６−トシルシクロデキストリンを得る。次
いで、これをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメ
チルホルムアミド（ＤＭＦ）などの有機溶媒に溶解し、
水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ＊）などの還元剤を
１０〜３０倍モル加えて、４０〜６０℃で１０〜２０時
間反応させて還元し、必要に応じ、常法により精製して
６−デオキシシクロデキストリンを得る〔例えば「カル
ボハイドレーツ・リサーチ（Ｃａｒｂｏｈｙｄ、Ｒｅｓ
、）Ｊ　、第１８巻、第２９〜３７ページ（１９７１）
参照〕。

このようにして、出発物質として好適な、例えば６−ジ
オキシ−α−１６−ゾオキシーβ−１６−ジオキシ−ツ
ーシクロデキストリンなどを得ることができる。中でも
酵素反応速度の点から、６−ジオキシ−β−シクロデキ
ストリンが特に好適である。

この方法において用いられるシクロデキストリナーゼは
以下の理化学的性質（イ）〜（ト）により特定されるも
のである　（特願平１−１４６８９１号参照）４（イ）
作　用ニ ジクロデキストリンを開裂し、そのシクロデキストリン
のグルコース重合度に由来するマルＬオリゴ糖を生成さ
せる作用を有する。

（ロ）　基質特異性ニ ジクロデキストリンに対する氷解速度又は親和性が、多
糖類あるいはシクロデキストリンと同じ重合度の直鎖オ
リゴ糖よりも大きい基質特異性を有する。

第１表及び第２表に、それぞれ基質特異性の具体例及び
シクロデキストリン類とマルトオリゴ糖についての反応
速度のパラメーターを示す。

第 １ 表 第 表 （ハ）至適ｐｔ＋及び安定ｐＨ範囲： β−シクロデキストリンを基質とした場合Ｎ　ｐ）（８
，０近傍に至適ｐＨを有し、かつ安定ｐＨ範囲が５．５
〜９．５である。

第１図は、１００ｍＭ濃度の酢酸緩衝液、リン酸緩衝液
及びホウ酸緩衝液それぞれ０．４８ｍＱ、　２％（ｖ／
ｖ）濃度のβ−シクロデキストリン溶液０．５０＋ｍＯ
及び酵素液０．０２ｍＱを混合し〔基質のβ−シクロデ
キストリン濃度１％（ｖ／ｖ））　、４０　’０で１時
間反応を行った場合におけるｐｌ（と相対活性との関係
を示すグラフである。この図において、破線は酢酸緩衝
液、実線はリン酸緩衝液、点線はホウ酸緩衝液を用いた
場合である。この第１図から、ｐＨ８，０近傍に至適ｐ
Ｈを有することが分る。

第２図は、１００ｍＭ濃度の酢酸緩衝液、リン酸緩衝液
及びホウ酸緩衝液それぞれＯ−０−２Ｏ及び酵素液０．
０５ｍ１２を混合し、各ｐｕにおいて、２５℃で２４時
間処理を行い、この処理液０．ｌＯ＋ｍｆｆ、　１００
ｍＭ濃度のリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）０．４０＋＋＋
Ｑ及び２％（ｗ／ｖ）濃度のβ−シクロデキストリン溶
液０−５０ｄを混合して、４０℃で１時間反応を行った
場合における処理ｐＨと相対活性との関係を示すグラフ
である。この図において、破線は酢酸緩衝液、実線はリ
ン酸緩衝液、点線はホウ酸緩衝液を用いた場合である。

この第２図から、安定ｐＨ範囲は５．５〜９．５である
ことが分る。

（ニ）作用適温： ４０°Ｃ近傍に作用適温を有する。

第３図は、２％（ｗ／ｖ）濃度のβ・シクロデキストリ
ン溶液０．５０ｍ１２５１００ｍＭ濃度のリン酸緩衝液
（ｐＨ７，５）０．４ｈ＋２及び酵素液Ｑ、Ｑ２ｍ１２
を混合し、各・温度で１０分間反応させた場合における
温度と相対活性との関係を示すグラブである。この第３
図から、４０’Ｏ近傍に作用適温を有することが分る。

（ホ）　失活性： ５０℃以上の温度で１５分間の処理により、はぼ失活す
る性質を有する。

第４図は、酵素を含有する１００ｍＭ濃度のリン酸緩衝
液（ｐｌ（７，５）０．０５＋＊ｆｆを各温度で１５分
間処理したのち、この処理液０．０２ｍ１２、ＬＯＯｍ
Ｍ濃度のリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）０．４８ｍＱ及び
２％（ｗ／ｖ）濃度のβ−シクロデキストリン溶液０．
５０ｍαを混合し、４０’Ｏで１時間反応させた場合に
おける処理温度と相対活性との関係を示すグラフである
。この第４図から、１００ｍＭ濃度のリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）中、１５分間処理で、４５°Ｃまで活性は安
定であるが、５０°Ｃ以上ではほぼ失活することが分る
。

（へ）阻害及び活性化性： Ｈ１４、Ｃｕ”、Ｚｎ”、Ｎｉ”及びＦｅ”１などによ
り９０％以上阻害され、Ｃａ”“及びＭｇ２＋により１
０〜３０％活性化される性質を有する。

第３表に、金属イオンによる酵素活性への影響を示す。

第 ３ 表 この第３表から、二価の金属イオンであるＨ１ゝＣｕ”
、Ｚｎ”、Ｎｉ”及びＦｅ”により９０％以上阻害され
、Ｃａ２＋及びＭ１＋により１０〜３０％活性化される
ことが分る。

（ト）分子量ニ ゲルろ適法による分子量が１４４．０００で、ＳＤＳ　
ＰＡＧＥ法による分子量が７２．０００である。すなわ
ち、該酵素は分子量７２，０００のサブユニットから戊
る二量体である。

なお、該酵素の力価は、２％（ｗ／ｖ）濃度のβ−シク
ロデキストリン溶液５００μα及び適当量の該酵素を含
有するｌｏＯｍＭ濃度のリン酸緩衝液（ｐＨ７，５）５
００μＱを混和し、温度４０℃で適当時間反応させたの
ち、１０分間煮沸することにより反応を停止し、高速液
体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと略称する）法
によって、生皮しｔ；マルトヘプタオースを定量するこ
とにより求めた。また、酵素量が少量の場合には、グル
コースを標準としたソモギーネルソン法により還元力を
定量することにより求めた。

咳酵素の酵素単位については、１分間に１マイクロモル
のマルトヘプタオースを生皮する酵素量を１単位とした
。

次に、本発明で用いる前記シクロデキストリナーゼの製
造方法について説明する。この酵素を産生ずる微生物に
ついては、バチルス属に属し、該酵素を産生ずるもので
あればよく、特に制限されず、例えばバチルス・スフエ
リカス（Ｂａｃ　ｉ　ｌ　１ｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ
）　Ｅ−２４４菌株を挙げることができる。

このバチルス・スフエリカスＥ−２４４菌株は土壌中か
ら取得した野生株であって、以下に示す菌学的性質を有
している。

バチルス・スフエリカスＥ−２４４菌株の菌学的性只 （ａ）形態 （１）細胞の形及び大きさ＝０．６〜０．８Ｘ　１．６
〜４．０μｍの桿曹である。

（２）細胞の多形成の有無：認められない。

（３）運動性の有無：周鞭毛を有し、運動性あり。

（４）胞子の有無：あり 胞　子　嚢：膨出 大　き　さ：　０．８〜０．９Ｘ　１．１”　１．２μ
ｒｔｒ形　　：楕円形 位　　　置：亜端立 （５）ダラム染色性：陽性 （６）抗　酸　性：陰性 （ｂ）　　各培地における生育状態 （１）　　肉汁寒天平板培ＩＩ： 無色の拡散性集落を形威し、その集落は平滑で周縁はな
めらかであり、色素の産生は認められない。

（２）肉汁寒天斜面培養； 菌苔は平滑で周縁はなめらかであり、色素の産生は認め
られない。

（３）肉汁液体培養： 培地全体に生育が認められるが、沈殿は認められない。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養： 培地上部にのみ生育し、液化は認められない。

（５）　リドマス・ミルク： 凝固は認められず、酸、アルカリの産生も認められない
。

（ｃ）　　生理学的性質 （１）　　硝酸塩の還元　　　：還元しない（２）脱窒
反応　　　　　：なし く３）ＭＲテスト　　　　：陰性 （４）ＶＰテスト　　　　−陰性 （５）インドールの生成　：生成しない（６）硫化水素
の生成　　：生成しない（７）デンプンの加水分解：分
解しない（８）クエン酸の利用　　：利用せず （９）無機窒素源の利用　：利用せず （１０）色素の生成　　　　：生成しない（１１）ウレ
アーゼ　　　　：陰性 （１２）オキシダーゼ　　　：陽性 （１３）カタラーゼ　　　　：陽性 （１４）生育の範囲　　温度＝１３〜３８°ＣｐＨ：６
〜１０．５ （１５）酸素に対する態度：好気性 （１６）　　Ｏ−Ｆテスト：陰性〈酸の産生を認めず）
（１７）糖類に対する態度二 Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、
Ｄ−マンノース、Ｄ−７ラクトース、Ｄ−ガラクトース
、麦芽糖、ショ糖、乳糖、トレハロース、Ｄ−ソルビッ
ト、Ｄ−マンニット、イノジット、グリセリン及びデン
プンからの酸生成及びガス生成はいずれも認められない
。

（ｄ）　　フェニルアラニンの脱アミノ反応：陽性この
バチルス・スフエリカスＥ−２４４菌株は、胞子を形成
するグラム陽性桿菌であることからバチルス属に属する
細菌であると同定した。さらに、糖からの酸及びガスの
生成は認められないこと、ＶＰブロスのｐＨが７．０以
上であること及びフェニルアラニンの脱アミノ反応が認
められることからパージエイズ・マニュアル・オブ・シ
スティマチイック・バタテリオロジー、第２巻（１９８
４年）に基づき、バチルス属のスフエリカス種に属する
細菌であると同定した。

なお、バチルス・スフエリカスＥ　−２４４は、工業技
術院微生物工業技術研究所に微工研条寄第２４５８号（
ＦＥＲＭ　ＢＰ−２４５８）として寄託されている。

この菌株の培養は、原則的には一般微生物の好気的培養
で採用される方法と同じであるが、通常は、液体培地に
よる振とう培養法、又は通気か゛くはん培養法などが用
いられる。培地としては、適当な窒素源、炭素源、ビタ
ミン、ミネラルなど及び該酵素の誘導基質であるシクロ
デキストリンなどを含んだものが用いられる。ｐＨは、
前記苗株が生育するｐ）ｌ域ならばいずれでもよいが、
通常は６〜８の範囲が好ましい。

培養は、通常２０〜４０℃の範囲の温度において、１６
時間ないし４日間程度振とう培養又は通気かくはん培養
することによって行われる。

このようにして得られＩ；培養物から所望の酵素を得る
には、例えばまず遠心分離や膜濃縮などにより集菌した
のち、菌体を超音波処理又は界面活性剤処理などにより
破砕し、曹残渣を遠心分離などで除いて粗酵素液を得、
次いでこの粗酵素液をイオン交換クロマトグラフィー、
疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過などのカラムクロマ
トグラフィーを適宜組み合わせて実施することにより、
該酵素の精製品を得る方法を用いることができる°。

このようにして得られた本発明に係るシクロデキストリ
ナーゼと従来公知のシクロデキストリナーゼとの理化学
的性質の相違点を第４表に示す。

次に、酵素反応の際の６−ジオキシシクロデキストリン
の基質濃度としては、前記のシクロデキストリナーゼの
基質に対するＫｍ値以上の濃度を用いるのが好ましい。

前記のシクロデキストリナーゼを、６−ジオキシシクロ
デキストリンに作用させる反応条件は、該シクロデキス
トリナーゼの作用ｐＨ及び温度範囲の中で、適宜選択さ
れるが、通常ｐＨ７，０〜９．０で、温度３５〜４５℃
の範囲が用いられる。この際必要に応じて、エタノール
、ジメチルスルホキシドなどの有機溶媒を用いることも
できる。反応時間は、反応生成物の安定性により異なる
が、通常は３０分〜４８時間程度である。酵素量として
は特に制限がなく、反応時間内に生成物が最大になるよ
うな必要量を添加すればよいが、通常は６−ジオキシシ
クロデキストリンに対し、０．５〜５単位／ｇが用いら
れる。

このようにして前記したとおり一般式（１！［）で表わ
される各種６−ジオキシオリゴ糖の混合物を得るが、出
発物質が６−ジオキシ−β・シクロデキストリンの場合
には、６フーデオキシマルトヘグタオース、６＠・デオ
キシマルトヘプタオース、６ｓ−デオキシマルトヘプタ
オース、６４−デオキシマルトへブタオース、６３−デ
オキシマルトヘプタオース、６′・デオキシマルトヘプ
タオース、６−デオキシマルトヘプタオースの混合物を
主成分とするものが、また、６−ジオキシ−α−シクロ
デキストリンの場合には、同様にして６１−デオキシマ
ルトヘキサオース、６ゝ−デオキシマルトヘキサオース
、６４・デオキシマルトヘキサオース、６３−デオキシ
マルトヘキサオース、６′−デオキシマルトヘキサオー
ス、６−デオキシマルトヘキサオースの混合物を主成分
とするものを得る′。

次に、これにエキソ型糖化酵素類を作用させて６−ジオ
キシグルコースの残基が非還元末端となるように、非還
元末端側のグルコース残基を加水分解させる。この際の
エキソ型糖化酵素類としては、例えば公知のａ−グルコ
シダーゼ、グルコシダ−ゼなどを単独で用いてもよいし
、それらを組み合わせて用いてもよい。なお、必要に応
じ、β−アミラーゼを作用させてもよい。

この酵素反応によって、一般式 （式中、ｎは２〜６の整数である） で表わされる各種６・デオキシ−マルトオリゴ糖（すな
わち、６１−デオキシマルトテトラオース、６’−デオ
キシマルトペンタオース、６＠−デオキシマルトヘキサ
オース、６フーデオキシマルトヘプタオース、６ローデ
オキシマルトオクタオース）、６３−デオキシマルトト
リオース、６′−デオキシマルトース、６−ジオキシグ
ルコース及びグルコースの混合物が得られる。

エキソ型糖化酵素類としてβ−アミラーゼを併用しｌ；
場合には、上記の化合部の他に６−デオキシマルトース
も生成する。このエキソ型糖化酵素類は、前記のシクロ
デキストリナーゼと共存させて酵素反応を同時的に行わ
せてもよいが、出発原料にシクロデキストリナーゼを作
用、させた後で、さらに作用させるのが好ましい。特に
好ましいのは、出発原料にシクロデキストリナーゼを作
用させて、例えば生成物が最大になった際に、酸又は熱
処理などによりいったん反応を停止させ、さらに例えば
オクタデシル化シリカゲル（００５）カラムに通液して
未反応の原料を吸着除去するなどの精製処理を施したの
ち、エキソ型糖化酵素類を作用させる方法である。シク
ロデキストリナーゼとエキソ型糖化酵素類を共存作用さ
せる場合の反応条件としては、両酵素に共通する作用ｐ
Ｈ，温度範囲を適宜選択する必要があるが、通常ｐＨ７
，０〜９，０．３５〜４５℃で、０．５〜４８時間の条
件が用いられる。

また、前記のシクロデキストリナーゼの作用後、エキソ
型糖化酵素類を作用させる場合の反応条件としては、用
いる酵素の作用ｐＨ，温度範囲の中から適宜選択される
が、通常はｐＨ４，０〜７．５．３５〜４５℃で、０．
５〜４８時間の条件が用いられる。

この捺のエキソ型糖化酵素類の使用量には特に制限はな
いが、通常６−デオキシシクロデキストリンに対しｔｏ
−１００単位／ｇの範囲が用いられる。この酵素反応は
、例えば酸又は熱処理などによって停止される。

次に、このようにして得られた６−ジオキシマルトオリ
ゴ糖含有反応液から、９的化合物の前記−数式（１）で
表わされる６・デオキシマルトオリゴ糖を得るには、通
常のオリゴ糖分離方法、例えば、反応液から未反応の６
−デオキシシクロデキストリンを除き、さらに活性炭カ
ラムクロマトグラフィ、シリカゲルカラムクロマトグラ
フィー、薄層クロマトグラフィーなどを用いて分画採取
する方法によって分離、精製する。また、未反応の６・
デオキシシクロデキストリンの除去は、例えば冷却処理
、有機溶媒添加処理、吸着カラム処理などの公知の方法
によって行うことができる。

このようにして得られた前記−数式（ＩＶ）で表される
６−ジオキシマルトオリゴ糖の水酸基を公知の方法でア
セチル化すれば、−数式 （式中のれは２〜６の整数である） で表わされるアセチル・６−ジオキシマルトオリゴ糖、
例えば、ヘキサデカ−Ｏ−アセチル・６Ｓ−デオキシマ
ルトペンタオース、ノナデカ−〇−アセチル−６ローデ
オキシマルトヘキサオース、ドコサ−Ｏ−アセチル−６
フーデオキシマルトヘプタオースなどが得られる。

このアセチル化法としては、例えば６−ゾオキシマルト
オリゴ糖に、ピリジン、トリエチルアミンなどの有機塩
基の存在下で、無水酢酸又はハロゲン化アセチルなどを
１００〜２００倍モル加え、１０〜４０℃で１０〜８０
時間反応させる方法を挙げることができる〔「ジャーナ
ル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．
Ｂｉｏｌ−）第７２巻、第２１９ページ（１９７２）参
照）。

次に、このものの還元末端グルコースの１位を、公知の
方法でブロム化してアセチル−６・デオキシマルトオリ
ゴシルプロミド（例えばａ−ペンタデカ・０・アセチル
−６ｓ−デオキシマルトベンタオシルブロミド、α−オ
クタデカ−０・アセチル・６′・デオキシマルトへキサ
オシルブロミド、σ−ヘンエイフサー〇−アセチル−６
フーデオキシマルトへブタオシルブロミドなど）を得る
。

このブロム化法としては、例えばアセチル−６・デオキ
シマルトオリゴ糖に、ジクロロメタンなどの非極性溶媒
中で、必要に応じて触媒量の水の存在下、三臭化りン又
は三臭化チタンなどを０．５〜３倍モル添加し、１０〜
４０℃で２〜５０時間反応させる方法などが用いられる
（例えば特開昭６０−２０２８９３号公報参照）。

次いで、このものに公知の方法で前記芳香族発色性基を
有する芳香族化合物を作用させて還元末端グルコースの
１位をグルコシル化し、アセチル６−デオ、キシマルト
オリゴシト誘導体を得る。この誘導体としては、例えば
２−クロロ・４−ニトロフェニルペンタデカ−Ｏ−アセ
チル−６Ｓ−デオキシ−β−Ｄ−マルトペンタオシド、
フェノールインド−３’−クロロフェニルベンタデカー
Ｏ・アセチル−６′−デオキシβ−Ｄ−？ルトヘンタオ
シト、４・ニトロフェニルヘンエイコサ・０−アセチル
−６フーデオキシ・β−Ｄ−マルトヘプタオシド、２−
クロロ−４−ニトロフェニルヘンエイコサ−〇−アセチ
ルー６７〜デオキシーβ−Ｄ−マルトヘプタオシドなど
が挙げられる。

このグルコシル化法としては、例えばアセチル−６−デ
オキシマルトオリゴシルプロミドに、アセトニトリル、
ニトロメタンなどの非プロトン性溶媒中で、必要に応じ
て酸化銀、炭酸銀などの銀化合物の存在下で、前記芳香
族化合物又はそのアルカリ金属塩を２〜ｌＯ倍モル添加
し、２０〜５０°Ｃで５〜５０時間反応させる方法など
が用いられる（例えば特公昭６２−２８３９８９号公報
参照）。

次に、前記誘導体を、公知の方法で脱アセチル化して前
記−数式（１）で表わされる６−デオキシマルトオリゴ
シド誘導体を得る。この脱アセチル化反応としては、例
えばアセチル・６−ジオキシマルトオリゴシド誘導体に
、メタノールなどのアルコール類中で、アンモニア水を
１００〜２００倍モル添加し、２０〜５０℃で５〜５０
時間反応させる方法などが用いられる〔「カナデイアン
・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Ｃａｎ、Ｊ、Ｃｈ
ｅｍ、）Ｊ　、第４９巻、第４９３ページ（１９７１）
参照〕。

Ｂ法ニ一般式 （式中のＲは前記と同じ意味を有し、ｎは２〜６の整数
である） で表わされるマルトオリゴシト誘導体、例えば２−クロ
ロ・４−ニトロフェニル゛・β−Ｄ・マルトペンタオシ
ド、４−ニトロフェニル−ａ−Ｄ・マルトヘプタオシド
、フェノールインドフェニル−β−Ｄ−マルトペンタオ
シドなどに、 一般式 （式中のＲ１４、Ｒ１７は水素原子又は炭化水素基であ
り、それらは互いに結合して環を形成してもよい） で表わされるカルボニル化合物又はそのアセタールを反
応させて、−数式 （式中のＲｌｍ、ＰＩＦ、Ｒ及びｎは前記と同じ意味を
有する） で表わされるアルキリデン−又はアルキリデン・マルト
オリゴシト誘導体、例えば２・クロロ−４−二トロフェ
ニル、ベンジリデン・β・Ｄ・マルトペンタオシド、４
−ニトロフェニル、インプロピリデン−ａ−〇−マルト
ヘプタオシド、フェノールインド−３′−クロロフェニ
ル、エチリデン−β・Ｄ−マルトテトラオシドなどを得
る。

前記−数式（Ｖｌ）で表わされるマルトオリゴシト誘導
体と、前記−数式（■）で表わされるカルボニル化合物
又はそのアセタールとの反応は、例えばジメチルホルム
アミド、ジメチルスルホキシド、エチレングリコールジ
メチルエーテルなどの非プロトン性極性溶媒中において
、硫酸、塩化水素、ｐ−トルエンスルホン酸、無水塩化
亜鉛のような触媒の存在下で行う。このようにして得ら
れた前記−数式（■）で表わされるアルキリデン−又は
アリーリデアーマルトオリゴシド誘導体をアシル化して
アシルアルキリデン−又はアルキリデン・デアマルトオ
リゴシド誘導体、例えば２−クロロ−４−二トロフェニ
ル、テトラデカ・Ｏ・アセチル−ベンジリデン−β−Ｄ
−マルトペンタオシド、４−ニトロフェニル、エイコサ
−Ｏ−ペンゾイルーイングロビリデンーα−Ｄ−マルト
ヘプタオシド、フェノールインド−３′−クロロフエニ
ル、ウンデカ−０−ブチリル−エチリデン−β−Ｄ−マ
ルトテトラオシドなどを得る。この際、アシル化剤とし
ては、例えば酢酸、モノクロロ酢酸、プロピオン酸、σ
−クロロプロピオン酸、β−クロロプロピオン酸、ｎ−
酪酸、安息香酸などや、これらの酸無水物、酸クロリド
、エステルなどの反応性誘導体が用いられる。アシル化
反応の条件については特に制限はなく、従来アシル化に
おいて慣用されている条件を用いることができる。

次いで、このようにして得たアシルアルキリデン−又は
アシルアリーリデアーマルトオリゴシド誘導体に、脱ア
ルキリデン化又は脱アジーリデア化反応を行い、一般式 （式中のＲ１はアシル基であり、Ｒ及びｎは前記と同じ
意味を有する） で表わされる部分アシル化マルトオリゴシト誘導体、例
えば２・クロロ−４−ニトロフェニル−０−（２，３・
ジ・Ｏ・アセチル−σ−Ｄ−グルコピラノシル）・（１
−４）トリス〔０・（２，３，６−トリー〇・アセチル
−σ−Ｄ−グルコピラノシル）−（１−４））・２．３
．６−　トリー〇・アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシ
ド、４・ニトロフェニル−〇・（２，３−ジ・０・ベン
ゾイル・ＶＤ−グルコピラノシル）−（１→４）−ペン
タキス（０−（２，３，６−トリー〇−ベンゾイルーａ
−Ｄ−グルコピラノシル）−（１−４））　−２，３，
６−トリー〇−ベンゾイル−α・Ｄ−グルコピラノシド
などを得る。

上記の脱アルキリデン化反応又は脱アジーリデア化反応
の条件については特に制限はなく、公知の方法、例えば
酢酸又はギ酸を作用させる方法〔例えば「ジャーナル・
オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Ｊ、Ａ
ｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、）Ｊ、第８４巻、第４３０ペー
ジ（１９６２）参照〕を用いて行うことができる。

次に、このようにして得た前記−数式（ｆｆ）で表わさ
れる部分アシル化マルトオリゴシト誘導体に、−数式 （式中、ＲＩｇ〜Ｒ１３は水素原子、アルキル基、ニト
ロ基又はハロゲン原子を示し、それらはそれぞれ同一で
あっても良いし、また互いに異なっていてもよく、また
Ｒ１１とＲ１０又はＲｔｏとＲａ＋が互いに結合して縮
合芳香環を形成してもよい。またＹはハロゲン原子を示
す） で表わされるアリールスルホニルハライドを反応させて
前記−数式（ｆｆ）における非還元末端グルコースの６
位の水酸基をアリールスルホン化してアシルアリールス
ルホニルマルトオリゴ糖、例えば２・クロロ・４・ニト
ロ７眞ニル、テトラゾカー〇−アセチルー６３−デオキ
シ−ｐ・トルエンスルホニル−β−Ｄ−マルトペンタオ
シド、４−ニトロフェニル、エイコサ−０・ベンゾイル
−５７＋　チオキシ−β−ナフタレンスルホニル−α・
Ｄ−マルトヘプタオシド、フェノールインド・３′−フ
ルオロフェニル、ウンデカ−〇−ブチリル・６１−デオ
キシ−２，４，６・トリメチルベンゼンスルホニル・β
−Ｄ・マルトテトラオシドなどを得る。

前記−数式（Ｘ）で表わされるアリールスルホニルハラ
イドとしては、例えばＩ）−トルエンスルホニルクロリ
ド、β−ナフタレンスルホニルクロリド、２．４−ジニ
トロベンゼンスルホニルプロミＦ、２，４．６−トリメ
チルベンゼンスルホニルクロリドなどが挙げられる。こ
のアリールスルホニル化反応の条件について特に制限は
ないが、通常ピリジン中室温下でアリールスルホニルハ
ライドを２〜２０倍モル作用させることによって行われ
る。次いで、上記アシルアリールスルホニルマルトオリ
ゴ糖を還元的に脱アリールスルホン化して前記−数式（
ＩＩ）における非還元末端グルコースの６位の水酸基が
水素原子で置換されＩ；部分アシル化６−ジオキシマル
トオリゴシド誘導体、例えば２・クロロ−４・ニトロフ
ェニル、テトラゾカー〇−アセチル−６ローデオキシー
β・Ｄ−マルトペンタオシド、４−ニトロフェニル、エ
イコサ−０−ベンゾイル−６フーデオキシーα−〇−マ
ルトヘプタオシド、フェノールインド−３′・クロロフ
ェニル、ウンデカ−Ｏ−ブチリル・６４−デオキシ−β
−Ｄ−マルトテトラオシドなどを得る。

この還元的脱スルホニル化反応の条件については特に制
限はないが、通常ジメチルスルホキシド、ジメチルホル
ムアミドなどの非プロトン性極性溶媒中で、４０〜６０
℃の温度でＮａＢＨ，又はＮａＢＨ，ＣＮ等を２Ｏ−１
００倍モルの割合で作用させて行う。

最後に、上記部分アシル化６−ジオキシマルトオリゴシ
ド誘導体を脱アシル化して、前記−数式（Ｉ）で表わさ
れる目的化合物６−ジオキシマルトオリゴシド誘導体を
得る。

この脱アシル化反応の条件についても特に制限はないが
、例えば前記Ａ法における脱アセチル化反応がそのまま
用いられる。

Ｃ法ニ一般式 Ｑち仲 （式中のＲは前記と同じ意味を有する）で表わされる公
知のアリールグルコシド誘導体に、前記−数式（ＩＩ）
で表わされる６−ジオキシシクロデキストリンを加え、
公知の酵素シクロデキストリングルコシルトランスフェ
ラーゼを作用させて、−数式 （式中のＸは１個が水素原子で、ｎ個が水酸基であり、
Ｒ及びｎは前記と同じ意味を有する）で表わされる６・
デオキシマルトオリゴシド誘導体の混合物を得、次いで
これに前記エキソ型糖化酵素類を作用させることにより
、前記−数式（Ｉ）で表わされる目的とする６−デオキ
シマルトオリゴシド誘導体を得る。

前記−数式（ｎ）で表わされるアリールグルコシド誘導
体としては、例えば２・クロロ−４−ニトロフェニル−
β・Ｄ−グルコシド、４・ニトロフェニル・α−Ｄ−グ
ルコシド、フェノールインド−３’、５’−ジクロロフ
ェニル・β・Ｄ−グルコシドなどが挙げられる。

この反応は、水溶液中で緩衝剤の存在下で行われる。こ
の際の前記−数式（■）で表わされる化合物の濃度は、
通常０．０１〜１９／ｌｌＩ２、好ましくは０．０２〜
０．２ｇ／鳳ａの範囲で選ばれ、一方、６−ジオキシシ
クロデキストリン類の濃度は、通常１〜２００ｍｇ／ｍ
Ｑ、好ましくは１００〜２００ｍ！９／　ｒｔｒＱ（１
）範囲で選ばれる。また、シクロデキストリングルコシ
ルトランスフェラーゼの起源については特に制限はない
が、例えばバチルス・マセランス、バチルス・メガテリ
ウム、バチルス・サーキュランスなどから得られたもの
が好ましい。その濃度は、通常０．３〜３単位／貢Ｑ１
好ましくは０．５〜１．５単位／ｍＱの範囲で選ばれる
。

Ｄ法： 前記−数式（ｎ）で表わされる公知のアリールグルコシ
ド誘導体と前記−数式（■）（ただし、式中のｎは１〜
３の整数を示す）で表わされる６−ジオキシ−マルトオ
リゴ糖とを混合し、これに公知酵素マルトテトラオース
生成アミラーゼ、マルトペンタオース生成アミラーゼな
どを目的化合物との関連で適宜選択して作用させて転移
反応を行わせることにより、目的とする６・デオキシマ
ルトオリゴシド誘導体を得ることができる。

これらの転移反応の条件については特に制限はないが、
それぞれのマルトオリゴ糖生成酵素に適した温度、濃度
、液性、反応時間を選択することにより適確な反応条件
を得ることができる。

以上のように各種製法により得られた前記−数式（１）
で表わされる６−デオキシマルトオリゴシド誘導体は、
ａ−アミラーゼ活性の測定に極めて有用であり、この６
・デオキシマルトオリゴシド誘導体を用いてσ−アミラ
ーゼ活性を測定することができる。

前記したように、−数式（１）で表される６−デオキシ
マルトオリゴシド誘導体には、α−アノマーとβ−アノ
マーが存在するが、α−アミラーゼ活性の測定に際して
、α−アノマーのみを用いる場合には、共役酵素系とし
てσ−グルフシダーゼ及び／又はグルコアミラーゼを用
いることが必要であり、またβ−アノマーのみあるいは
σ−アノマーとβ−アノマーの混合物を用いる場合には
α−グルコシダーゼ及び／又はグルコアミラーゼに加え
てさらにβ−グルコシダーゼを併用することが必要であ
る。

ａ−アミラーゼ活性を測定するための有利な系としては
、例えば−数式（Ｉ）で表わされるα−及び／又はβ−
６−デオキシマルトオリゴシド誘導体１〜２０ｍＭ及び
緩衝剤２〜１００ｍＭを含有し、かつ共役酵素としてａ
−グルコシダーゼ及び／又はグルコアミラーゼをそれぞ
れ１５〜１５０単位／ｍＱ。

該誘導体がβ−アノマーを含むときは、ざらにβ−グル
コシダーゼ５〜５０単位／ｍＱとを含有するｐｔ＋４〜
ＩＯの系が挙げられる。この系に用いられる緩衝剤とし
ては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス−（ヒ
ドロキシメチル）−アミノメタン、ホウ酸塩、クエン酸
塩、ジメチルグルタル酸塩などが挙げられる。α・グル
コシダーゼは動物、植物、微生物などいかなる起源のも
のを用いてもよいが、特に酵母起源のものが基質特異性
の点から好ましい。また、グルコアミラーゼもいかなる
起源のものを用いてもよいが、例えばリゾプス属（Ｒｈ
ｉｚｏｐｕｓ　ｓｐ）などに由来するものが好適である
。

また、β−グルコシダーゼもいかなる起源のものを用い
てもよく、例えばアーモンドの種子から得たものが用い
られる。

本発明においては、このような系に、前記成分以外に、
本発明の目的をそこなわない範囲で、さらに必要に応じ
て慣用の種々の添加成分、例えば溶解補助剤、安定化剤
としてグリセリン、牛血清アルブミン、ａ−又はβ−シ
クロデキストリン、トリトンｘｔｏｏなどを加えてもよ
い。　さらに、ａ−アミラーゼ活性剤として、ＮａＣｌ
、ＭｇＣ１，，１１１ｇ５ｏ、、ＣａＣＩｚｌＣａＣｌ
、　ｊ　２Ｈ２０などの形で用いられるＣＩ−イオン、
Ｃ１＋イオン、ｌＪｇ”＋イオンなどを加えてもよい。

これらの添加成分は１種用いてもよいし、２種以上を組
み合わせて用いてもよく、また、前記系調製の適当な段
階で加えてもよい。

本発明の試薬は、乾燥物あるいは溶解した形で用いても
よいし、薄膜状の担体、例えばシート、含浸性の紙など
に含浸させて用いてもよい。このような本発明の試薬を
用いることにより、各種の試料に含有されるα−アミラ
ーゼ活性を簡単な操作で正確に、かつ高感度で測定する
ことができる。

次に、本発明のα・アミラーゼ活性の測定方法の好適な
１例について説明すると、先ず、α−アミラーゼを含む
試料に、共役酵素としてのσ・グルコシダーゼ及び／又
はグルコアミラーゼをそれぞれ１５〜１５０単位／ｍＱ
、好ましくは３０〜７０単位／ｌｌａ加え、前記−数式
（Ｉ）で表わされる６−ゾオキシマルトオリゴシド誘導
体がβ−アノマーを含む場合は、さらにβ・グルコンダ
ーゼを５〜５０単位／ｍＱ、好ましくは５〜１５単位／
ｍＱ加え、同時又は順次に該誘導体１〜２０ｍＭ、好ま
しくは２〜６ＩＩＩＭ及び緩衝剤を添加しｔ；のち、温
度２５〜５０°Ｃ１ｐ８４〜ｌＯの条件にて１分間以上
、好ましくは２〜６０分間酵素反応させ、次いで生皮す
る芳香族発色性化合物を常法によりそのままあるいは必
要によりｐＨを変化させｔ；のち、又は縮合反応を行っ
たのちに、適当な吸光波長で連続的もしくは断続的に吸
光度値を測定し、あらかじめ測定したα−アミラーゼ標
品の吸光度値と対比させて試料中のα−アミラーゼ活性
を算出する。

本発明に用いられるσ・アミラーゼ含有試料については
、α−アミラーゼを含有するものであればよく、特に制
限はないが、具体的には微生物の培養液、植物の抽出液
、あるいは動物の体液や組織及びそれらの抽出液などを
用いることができる。

ａ・アミラーゼ含有試料が固体の場合には、いったん緩
衝液に溶解又は懸濁させるのがよい。この緩衝剤として
は、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、１−リス・（ヒ
ドロキシメチル）−アミノメタン、ホウ酸塩、クエン酸
塩、ジメチルグルタル酸塩などが挙げられる。

発明の効果 本発明の前記−数式（Ｉ）で表わされる６−ジオキシマ
ルトオリゴシド誘導体は、新規な化合物であって、σ−
アミラーゼ活性測定用試薬として極めて有用であり、こ
のものを用いることにより、試料中に含まれるグルコー
ス、マルトース、ビリルビン、ヘモグロビンなどの影響
を受けることなく、α−アミラーゼ活性を自動分析法、
用手法などにより、精度よく短時間で容易に測定するこ
とができる上に、共役酵素を共存させても長期間にわた
って安定状態を維持しうるという利点がある。

実施例 次に、実施例により本発期をさらに詳細に説明する。

ドの製造 （１）６−トシル−β−シクロデキストリンの合成市販
のβ−シクロデキストリン〔和光純薬工業（株）製）　
５．００９　（４，４１ｍｍｏｌ）をピリジン５０ｍＱ
に溶解したのち、これにトシルクロリド１０．０ｇ（５
２，４ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間かきまぜながら
反応させた。ついでこの反応液のピリジンを減圧下に留
去させたのち、残渣に水１００ｍｆｆ及びベンゼン１５
０ｍＱをかきまぜながら添加し、固形物を析出させｔ；
。

次に、この固形物をグラスフィルターでろ別し、アセト
ン５０ｍＱで２回洗浄したのち、ろ取物をＯＤＳカラム
クロマトグラフィーにより精製し、エタノール−水混合
液（容量比ｌ：９）で溶出した目的画分を濃縮して、水
から再結晶することにより、６−トシル−β−シクロデ
キストリン１．６３９　（１，２６ｍｍｏｌ、収率２８
．６％）が得られた。

このものの融点、赤外吸収スペクトル及び核磁気共鳴ス
ペクトルを次に示す。

融点（’Ｏ）　　；　１７２．０〜１７４．０（分解）
赤外吸収スペクトル（ｃｍ’−’）　：　３４００，２
９３０，１６４２゜１６３２、１６００．１４２４．１
３６０．１３００．１１７８゜１１５６．１０７８．１
０２８ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＬ）ｐｐｍ　：　（Ｄ
ＭＳＯ−ｄｓ）２．４４（３Ｈ，ｓ）、３．１！ｒ４．
４５（ｍ）、４．７６（２Ｈ，ｂｒ、ｓ）、４．８５（
５Ｈ，ｂｒ、ｓ）、７．４４（ＩＨｄ、Ｊ　−８，８８
Ｚ）、７．７５（ＩＨ，ｄ、Ｊ　＝　８．８８Ｚ）（２
）６−デオキシ・β−シクロデキストリンの合成法に、
このようにして得られた前記６−トシル−β−シクロデ
キストリン１．２７ｇ（０，９８５ｍｍｏｌ）をジメチ
ルスルホキシド（ＤＭＳＯ）　２０ｍＱに溶解したのち
、これに水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ＊　）　３
８４ｍ＋９　（１０，２ｍｍｏりを加え、５０°Ｃで１
２時間反応させた。次いで、この反応液に水１０１００
Ｏ＋を加え、ＯＤＳカラムクロマトグラフィーに供して
ＤＭＳＯを除去したのち精製し、エタノール−水混合液
（容量比ｌ：９）で溶出した目的画分を濃縮して、メタ
ノールから再結晶することにより、６−ジオキシ−β−
シクロデキストリン８３９．６ｍｇ（０，７５０ｍｍｏ
ｌ、収率７６．１％）が得られた。

このものの融点、赤外吸収スペクトル、核磁気共鳴スペ
クトル及び元素分析値を次に示す。

融点（’（：ｌ）　：２８０．０〜２８１．０（分解）
赤外吸収スペクトル（ｃ＋＋＋−→　：　３３７０，２
９２０．１１５２１０８０．１０２０ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤＭＳ
Ｏ−ｄ、）：１．２０（３Ｈ，ｄ、Ｊ　＝　６．１Ｈ＝
）、２．８０＝４．０５（ｍ）４．８４（７Ｈ，ｂｒ、
ｓ） 元素分析値：　Ｃ＊２ｔ（ｙｏｏ３＊としてＨ 理論値（％）　　　４５．０８　　６．３１実測値（％
）　　　４４．９９　　６．４５（３）シクロデキスト
リナーゼの調製 １％（ｗ／ｖ）β−シクロデキストリン、１％（Ｗ／Ｖ
）ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣＩ２及び０．１
％（ｗ／ｖ）イーストエキスから戒る液体培地（水道水
使用、ｐＨ７，０）１（）Ｏｍｆｆを５００ｍ！２容坂
ロフラスコにいれ、１２０００で２０分間殺菌処理を行
っｌ；。これに、バチルス・スフエリカスＥ−２４４菌
株（ＦＥＲＭ　ＢＰ−２４５８）の保存スラントより１
白金耳接種し、３０℃で１日間振とう培養した。この培
養液５０ｍ＋２を前記と同様の培地組成と殺菌条件によ
り調製した。２０００ｍＱの培地を含有する３０００ｍ
Ｑ容ミニジャーに接種して３０℃、ｌ　ｖｖｍ。

３５Ｏｒ、ｐ、ｍの条件で２日間通気かくはん培養を行
い、培養後、この培養液から８０００ｒ、ｐ、ｍ、　２
０分間の遠心分離法処理により菌体を分離し、２％（ｗ
／ｖ）　トリトンＸ−１００を含有する１０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７，０）５００ＸＱ１２に菌体を懸濁して
２５℃で１日間かきまぜた。該懸濁液から１２００ｏｒ
、ｐ、ｍで２０分間の遠心分離処理により笛体残渣を除
去したのち、上溝液を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）に対して１６時間透析した。得られた透析物を１２
０００ｒ、ｐ、ｍで２０分間遠心分離処理して不溶物を
除去し、上溝を粗酵素液（１）とじｔ；。

次いで、この粗酵素液（１）約５００＋Ｑ（総活性２０
０単位、タンパク量２０８３ｍｇ、比活性０．１．　ｐ
Ｈ７，０）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平
衡化したＤＥＡＥセファロース充填カラム（−３４Ｘ　
１７０ｍｍ）に供し、酵素を吸着させたのち、０〜０．
５Ｍ　ＮａＣＱグラジェント勾配により溶出を行った。

このＤＥＡＥセファロースカラムクロマトグラフィーの
溶出パターンを第５図に示す。第５図において、◎印は
活性（Ｕ／ｍＱ）、○印はタンパクｆｎ　（ｍｇ／ｍＱ
）である。また、この際の溶出条件は次のとおりである
溶出条件 溶離液＋１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）溶　出：
　ＯＭ−０，５Ｍ　ＮａＣ！ 分取量：Ｌ２ｍＱ／フラクション 流速：　６ｍ＋２／ｍｉｎ 温度：室温 このようにして得られた活性フラクシヨンを集めて粗酵
素液（２）１０５ｍ＋２（統治性１４５単位、比活性０
．５８、収率７２．５％）を得た。

次いでこの粗酵素液（２）２０　ｍＱ　（統治性３１単
位、タンパク量２９ｍｇ）をＩＭ硫酸ナトリウム含有１
００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したエー
テル５ＰＷ充填カラム（１２１，５Ｘ　１５０問）に供
し、酵素を吸着させたのち、ＩＭ−０Ｍ硫酸ナトリウム
のグラジェント勾配により溶出を行った。この溶出パタ
ーンを第６図に示す。第６図において、◎印は活性（Ｕ
／ｍＱ）、○印はタンパク量（ｍ＊／ｍａ）である。ま
た、この際の溶出条件は次のとおりである。

溶出条件 溶離液：　１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐｌ（７，０）溶
　出：　ＬＭ−Ｏｈｌ　Ｎａ２ＳＯ４（１ｈｒ）分取量
：５ｍＱ／フラクション 流速：５ｍ１２／ｍｉｎ 圧　カニ　３５〜５０　ｈｉｔ／ｃｍ”温度：室温 このようにして得られた活性フラクションを集めて粗酵
素液（３）５０ｍ１２（統治性７２単位、比活性２．９
３、収率３６％）を得た。

次いでこの粗酵素液（３）をコロジオンバッグにより１
．５ｍ１２にまで限外濃縮したのち、０．２ｍＱ　（１
ｍ活性８単位、タンパクｊ１１．２ｍｇ）をＴＳＫ　ｇ
ｅｌ　Ｇ３０００ＳＷ（カラムＩ　７．５Ｘ　６００ｍ
ｍＸ　２　）を用いたゲルろ過に供し、０．２Ｍ　Ｎａ
ＣＱ含有１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出
した。この溶出パターンを第７図に示す。

第７図において、◎印は活性（０７ｍ１２）　、　Ｏ印
はタンパク量Ｃｍｇ／ｍａ）である。また、この際の溶
出条件は次のとおりである。

溶離液：１００中Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　＋０
．２Ｍ　ＮａＣＱ 分取量：１ｍ＋２／フラクシヨン 流速：　０．７ｍＱ／　ｍｉｎ 圧　カニ約７０ｋｇ／ｃｍ” 温　度：室温 このようにして得られた活性７ラクシヨンを集めて精製
酵素液１．４＋＋＋Ｑｌ＞、活性２．２単位、タンパク
ｆｌ）０．２４＋＋＋ｇ、比活性９．１７、収率１％）
を得ｔ；。第８図に、この酵素のＳＯＳ　ＰＡＧＥの結
果を示す。この図から分るように、該酵素はＳＤＳ　Ｐ
ＡＧＥ的に単一であ−ｔ：。

（４）　　６’−デオキシ−Ｄ−マルトペンタオースの
整量 前記（２）と同様にして得た６−デオキシ・β−シクロ
デキストリフ１５ｇを１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７
゜０）１００（ｈ＋＋Ｑに溶解したのら、前記（３）で
得た粗酵素液を約２４単位添加して、４０°Ｃで４８時
間酵素反応を行わせ、反応液を得た。

この反応液に塩酸を添加してｐＨを約２．０にすること
により反応を停止させたのち、水酸化ナトリウム溶液を
加えて中和し、次いで、これをＯＤＳカラムに通液して
、未反応の６−ジオキシ−β−シクロデキストリンを吸
着させ、通液画分を得た。この操作を４回繰り返して、
合計６３ｇの６・デオキシ−β・シクロデキストリンを
処理した。

この通液画分を１／１０の液量の１００ｍＭ酢酸緩衝液
（ｐＨ４，５）と混合したのち、さらに１００ｍＭ酢酸
によりｐｌ（を４．５に調整しｔ二。次いで、これにグ
ルコアミラーゼ２５００単位を添加して４０°Ｃで８時
間酵素反応を行わせたのち、この反応液に塩酸を添加し
てｐＨを約２．０にすることにより反応を停止させ、次
いで水酸化ナトリウム溶液を加えて中和した。

次に、この液を活性炭カラムに通液したのち、０〜３５
％のエタノールグラジェントにより６−ジオキシマルト
オリゴ糖を溶出させ、次いで約２５％のエタノール溶出
画分を凍結乾燥して、純度約９８％の６５−デオキシ−
Ｄ−マルトペンタオース約２．５ｙヲ得ｔこ。

このものの赤外吸収スペクトル、核磁気共鳴スペクトル
、高速液体クロマトグラフィー及び元素分析値を次に示
す。

赤外吸収スペクトル（ａｍ””）　：　３４２０．２９
２５，１６２８゜１４１２．１３６Ｂ、１１５０゜ １０８０．１０４０ 核１ｉ１ｆｉ共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（
Ｄ２０）　：１．２７（３Ｈ，ｄ、Ｊ＝　６．３Ｈｚ）
、３．１６（ＩＨ，ｔ。

Ｊ＝９．０Ｈｚ）、３．２９（ＩＨ，ｔ、Ｊ−９，０Ｈ
ｚ）。

３．５０〜４．１０（ｍ）、４．６５　（０，５Ｈ，ｄ
、Ｊ−８，１Ｈｚ、　ａ　−Ｈ）、５．２３（０，５Ｈ
，ｄ、Ｊ＝　３．４Ｈｚ、β−Ｈ）、５．２７（ＩＨ，
ｄ、Ｊ＝　３．２Ｈｚ）。

５．３５（３Ｈ，ｄ、Ｊ　−３，９Ｈｚ）高速液体クロ
マトグラフィー〔東ソー（株）製〕ＴＳＫ　ｇｅｔ　Ａ
ｍ１ｄｅ−８０カラム（４，６ｍ＋ｎ１ＤＸ　２５０ｍ
）、Ｒ１検出、溶離液ニアセトニトリル／水−３／２（
Ｖ／Ｖ）　、流速：　１．ｏｍ４／ｍ１ｎ）　　：　’
Ｒ−８．７ｍ１ｎ元素分析値二Ｃ１゜Ｈｓ、０□として ＣＨ 理論値（％）　　　４４．３４　　６．４５実測値（％
）４４．４５　　６．４５ （４）で得た６５−デオキシマルトペンタオース８２１
ｍ９（１，０ｉｎ＋ｏｌ）をピリジン３０ｒｎＱに溶解
し、無水酢酸１５　ｍ１２（０，１５９ｍｏｌ）を加え
、室温で２日間反応させる。次いで反応液のピリジン、
無水酢酸、酢酸を留去したのち、残炎をシリカゲルカラ
ムクロマトグラフィーにより精製し、メタノール−ジク
ロロメタン混液（容量比１．５：９８．５）で溶出した
目的区分を濃縮してヘキサデカ−〇−アセチルー６′−
デオキシマルトペンタオース（α体：β体−約ｉ　：　
ｌ）１．３６９ｇ（０，９２３ｍＭ、収率９２．３％）
を得た。

赤外線吸収スペクトル（ａｍ−’）　：　３４８０．２
９７０，１７５４゜１３７２、１２３６，１０３８，９
４６．８９８核磁気共鳴スペクトル（２００１ＪＨｚ）
ｐｐｍ（ＣＤＣＩｓ）　：１、１５（３ｆ（、ｄ、Ｊ　
−６，１）１ｚ）　、　１．７５〜２．２５（４８Ｈ，
ｅａｃｈｓ）　、　３．７０〜５．１０（ｍ）　、　５
．７６（ｃａ、ｏ、５Ｈ、ｄ、、　Ｊ　−８，１Ｈｚ、
　ａ　−Ｈ）、　６．２４（ｃａ、０．５Ｈ，ｄＪ−３
，５Ｈｚ、β−Ｈ）高速液体クロマトグラフィ　〔牛丼
化学薬品（株）製ＣＯ５ＭＯＳ　Ｉ　ＬＣｒ　ａカラム
（４，６ｍｍ１ＤＸ　１５０ｍｍ）　、Ｒ１検出、溶離
液ニアセトニトリル／水−３／２　（Ｖ／Ｖ）流速：　
１．ｏｍ（１／ｍｉｎ］　：　’Ｒ＝９．４ｍ１ｎ（６
）α−ペンタデカ−Ｏ−アセチル−６ｓ−デオキシマ（
５）で得たヘキサデカ−〇−アセチル・６ｓ−デオキシ
マルトペンタオース１．３２１？（０，８８９ｍｏｌ）
をジクロロメタンｌ□＋Ｑに溶解し、三ＪＬ化！Ｊ　７
８４−５μａ（０，８９２ｍｏ１）と水３５．２μα（
１，９６ｍｏｌ）を加え、室温で２２時間かきまぜなが
ら反応させた。次いで反応液に無水炭酸カリウム８６０
＋＋１９を加え、室温で１５分間かきまぜながら反応さ
せた。不溶物をグラスフィルターでろ別し、これをジク
ロロメタン２０ｍＱで３回洗い、ろ液と洗液を合わせた
のち、ジクロロメタンを留去した。次いで残炎をシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、ジクロロ
メタン−酢酸エチル混液（容量比７：３）で溶出した目
的区分を濃縮し、ジエチルエーテルから再結晶してａ−
ペンタデカ・Ｏ−アセチル・６５−デオキシマルトペン
タオシルプロミド６０４ｍｇ（０，４０１ｍｏｌ、　収
率４５．１％）を得た。

融点（’Ｃり　：　１１８．０〜１２０．０赤外吸収ス
ペクトル（ｃｍ−’）　：　１７５６，１３７２，１２
４０゜１．０４２．９４６．９０２ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＣＤＣ
Ｉ、）　：１．１５（３Ｈ，ｄ、Ｊ＝　６．４Ｈｚ）、
１．８５〜２．４０（４５Ｈ，ｅａｃｈｓ）、３．７０
〜５．７０（ｍ）、６．５１（ｌ）ｌ、ｄ、Ｊ・３．９
Ｈｚ）オシドの合皮 （６）で得たσ−ペンタデカーＯ−アセチルー６ｓ−デ
オキシマルトペンタオシルプロミド５７４ｍｇ（０，３
８１ｒｓｏｌ）をアセトニトリル１Ｏｒｎ１２に溶解し
、２−クロロ−４・ニトロフェノール１９９ｍｇ（１，
１４ｍｏｌ）を加えたのち、さらに酸化銀（Ａｇ２０）
２６６ｍｇ（Ｌ、１４ｍｏｌ）を加え、３５℃で１７時
間かきまぜながら反応させた。次いで反応液をグラスフ
ィルターでろ過し、これをジクロロメタン２０ｍＱで３
回洗い、ろ液と洗液を合わせて減圧下濃縮し、アセトニ
トリルとジクロロメタンを留去した。次いで残炎にジク
ロロメタンｌＯＯｍＱを加え、綿栓ろ過しＩ；のち、０
．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液５０ｍ（ｉで１回、飽和
食塩水容々５０ｍＱで３回洗い、次いで無水硫酸ナトリ
ウム５ｇを加えて乾燥し、綿栓ろ過しｔ；のち、減圧下
濃縮し、ジクロロメタンを留去した。次いで残炎をシリ
カゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、ジクロ
ロメタン−メタノール眞液（容量比９８．５：１．５）
で溶出した目的区分を濃縮し、ジエチルエーテルから再
結晶して２−クロロ・４・ニトロフェニルペンタデカ−
０−アセチル−６％−デオキシ−β・Ｄ−マルトペンタ
オシド４９４ｍ９（０，３０９ｍｏｌ、収率８１．０％
）を得た。

融点（’Ｏ）　：　１２６．０〜１２８．０紫外部・可
視部吸収スペクトル： ”Ａ収積大波長［Ｊ（ｌＸ（３ＣＮ］（ｎｍ）−２８０
（１０９ｔａｘ ＝　３．９７）、２２７（ｓｈ）、２０Ｂ（ｌｏｇ＋’
−４，２１）赤外吸収スペクトル（ａｍ”）　：　３４
７０．２９６０．１７５４゜１５３０、１３７２．１３
５０．１２３４．１０３８．９４６．８９８核磁気共鳴
スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＣＤＣ１ａ）　：
１．１５（３８，ｄ、Ｊ−６，１Ｈｚ）、１．９０〜２
．３０（４５Ｈ。

ｅａｃｈ　ｓ）、３．７０〜５．５０（ｍ）、７−２９
（Ｉ　Ｈ，ｄ、Ｊ＝９．０Ｈｚ）、　　８．１６　　（
Ｉ　　Ｈ，ｄｄ、Ｊ−９，００２゜２．７）１ｚ）、８
．３０（Ｉ　Ｈ，ｄ、Ｊ＝２．７Ｈｚ）高速液体クロマ
トグラフィー［牛丼化学薬品社製ＣＯ３ＭＯＳ　Ｉ　Ｌ
Ｃ＋　ａカラム（４，６ｍｍ　ＩＤ　Ｘ　１５０ｍｍ）
。

ＵＶｚａａｓｓ検出、溶１ｌｉＩＩ液ニアセトニトリル
／水−７／３　（Ｖ／Ｖ）　、流速：１．ＯｍＱ、／ｍ
１ｎｌ　：　’Ｒ＝９．１ｍ１ｎ比旋光度（Ａａ　１零
）　：　（ＣＯ，５０，１，４−ジオキサン）ニー１．
５゜ （７）で得り２−クロロ−４−二トロフェニルペンタデ
カー〇−アセチル−６ｓ−デオキシ−β−Ｄ−マルトペ
ンタオシド４６０ｍｇ（０，２８８ｍｏｌ）をメタノー
ノｌ、ｌ（３ｍＱに溶解し、２８％アンモニア水ｇｍ１
２と水４ｒｎＱを加え、３５℃で２０時間かきまぜなが
ら反応させた。

次いで反応液を減圧下濃縮し、水とメタノールを留去し
た。次いで残炎をＯＤＳゲルカラムクロマトグラフィー
により精製し、エタノール−水混液（容量比ｌ：４）で
溶出した目的区分を濃縮し、水カラ再結晶して２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル−６５−デオキシ−β−Ｄ−マ
ルトペンタオシド１９６ｍｇ（０，２０３ｍｏｌ、収率
６８．３％）を得た。

融点（’Ｃ）　：　１８７．５〜１９０．５紫外部・可
視部吸収スペクトル： 吸収極大波長［ＪＭｏ”ｌ（ｎｍ）−２８８（Ｉｏ９ｇ
ａｘ ＝　４．０２）、２２８（ｓｈ）、２０７（ｌｏｇｔ　
−４，２７）赤外吸収スペクトル（ｃｍ−つ：　３４３
０，２９４０，１６４４゜１５８８．１５２２．１４８
８，１３５２，１２７６．１２５２．１１５４，１０８
２゜１０４６．１０２６ 核磁気共鳴スペクトル（２００１ＪＨｚ）ｐｐｍ（Ｄｚ
Ｏ）　：１．２８（３Ｈ，ｄ、Ｊ−５，９Ｈｚ）、３．
１４（ＩＨ，ｔ、Ｊ＝８．６Ｈｚ）。

３．５０〜４．ＯＯ（ｍ）、５．２８（１８，ｄｊ＝３
．４Ｈｚ）、５．３５（３Ｈ，ｍ）、５．４３（１８，
ｄ、Ｊ　−６，８Ｈｚ）、７．４０（ＩＨ，ｄ、Ｊ−９
，２Ｈｚ）、８．２２（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ＝９．２Ｈｚ、
２．７Ｈｚ）、８．４０（ＩＨ，ｄ、Ｊ−２，７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィー［東ソー（株）製ＴＳＫ　
ｇｅｌ　Ａｍ１ｄｅ−３０カラム（４，６ｍ＋　ＩＤｘ
　２５０ｍｍ）。

Ｕｖ、。、１検出、溶離液ニアセトニトリル／水−３／
ｌ（Ｖ／Ｖ）、流速：１．Ｏｍ＋２／ｍ１ｎｌ　二’Ｒ
−９．２ｍ１ｎ元素分析値：　Ｃｘａｌｆｓ４Ｃ１２Ｎ
ＯｚｙとしてＣＨＮ 理論値（％）４４．６６　　５．６２　　１．４５宙Ｍ
＋Ｉ／１Ｖ（０１）ＡＡ　　（ＯＭ　　７１’ｌ　　　
　　ｌ　　ＡＡ比旋光度（［ａ　１”）　：　　（ｃ　
Ｏ，３７，ＨｚＯ）　：　＋０．９５゜エタノールグラ
ジェントによる約２９％のエタノール溶出画分を採取し
たこと以外は実施例１の（１）〜（４）と同様の操作を
行い、純度９９．５％の６フーデオキシマルトヘブタオ
ース約２．７ｇを得た。

赤外線吸収スペクトル（ｃｍ−’）　：　３４２０．２
９３０．１６２８゜１４１２、１３６４．１１５０，１
０７８．１０２２核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ
）ｐｐｍ（Ｄ、Ｏ）　：１．２５（３Ｈ，ｄ、Ｊ−６，
４Ｈｚ）、３．１６（ＩＨ，ｔ、Ｊ　−８，７Ｈｚ）。

３．２７（ＩＨ，ｔ、Ｊ　＝　８．７Ｈｚ）、３．４５
−４．１０（ｍ）、４．６４（０，５Ｈ，ｄ、Ｊ　−８
，０Ｈｚ、　ａ　−Ｈ）、５．２０（０，５Ｈ，ｄ、Ｊ
　−３，５Ｈｚ、β−Ｈ）、５．２６（ＬＨ，ｄ、Ｊ　
−３，１Ｈｚ）、５．３５（５Ｈ。

ａ、Ｊ−３，７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィーし東ソー（株）製ＴＳＫ　
ｇｅｌ　Ａｍ１ｄｅ−８０カラム（４，６ｚｍ　ｌＤＸ
２５０ｍｍ）、Ｒ１検出、溶離液ニアセトニトリル／水
＝　３／　２（Ｖ／Ｖ）　。

？！茸　、ｉ　　ｎ’ｍｎ　／、、１ｉｎ１　”Ｄ−１
９，１ｍｉｎ元素分析値：　Ｃ＋ＪｙｉＯｚａとしてＣ
）１ 理論値（％）４４．３７　　６．３８ 実測値（％）　　４４．４０　　６．３５（１）で得た
６フ一デオキシマルトヘブタオース１１４０ｍｙ（１，
ｏＯｍｏｌ）に、実施例１の（５）と同様の操作を行っ
てドコサ−Ｏ・アセチル−６フーデオキシマルトヘプタ
オース（α体：β体・約１　：　１　）１２０８ｍｇ（
０，５８６ｍｏｌ、収率５８．６％）を得た。

赤外吸収スペクトル（ｃｍ””）　：　３４９０．２９
７０，１７５４゜１４３０、１３７４．１２３８．１１
３６．１０３８．９４６，８９８核磁気共鳴スペクトル
（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＣＤＣ１，）　：１−１５（
３Ｈ，ｄ、Ｊ□６．１Ｈ２）、１．８０〜２．４０（６
６Ｈ，ｅａｃｈｓ）、３．７０〜５．５５（ｍ）、５．
７５（ｃａ、０．５Ｈ，ｄ、Ｊ−８，０Ｈｚ、　ａ　−
Ｈ）、６．２４（Ｃａ、０．５Ｈ，ｄ、Ｊ＝　３．２Ｈ
ｚ、β−Ｈ）高速液体クロマトグラフィー［半押化学薬
品社製Ｃ０５Ｍ０ＳＩＬＣ＋　ｍカラム（４，６ｍｍ　
ＩＤＸ　１５０ｍｍ）、ＲＩ検出、溶離液ニアセトニト
リル／水−７／　３（Ｖ／Ｖ）　。

流速＋１．０ｍ１２／ｍｉｎ］　：　’Ｒ−５，４ｍ１
ｎ（２）で得たドコサ−Ｏ−アセチル−６フーデオキシ
マルトへブタオース１１７７ｍｇ（０，５７１ｍｏｌ）
に、実施例１の（６）と同様の操作を行ってα・ヘンエ
イコサ−０・アセチル−６７・デオキシマルトへブタオ
シルブロマイド４０１ｍｇ（０，１９３ｍｏｌ、収率３
３．８％）を得た。

融点（”Ｏ）　：　１２０．０〜１２１．５赤外吸収ス
ペクトル（ｃｍ−’）　：　３５１０．２９９０．１７
５６゜１４３２、１３７２．１２４０．１０４２，９４
８，８９８核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐ
ｍ（ＣＤＣ１，）　：１．１５（３Ｈ，ｄ、Ｊ＝５．９
Ｈｚ）、１．９０〜２．３０（６３Ｈ。

ｅａｃｈ　ｓ）、３．７０〜５．７０（ｉ）、６．５０
（ｌ　Ｈ，ｄ、Ｊ−３，９Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィー［半押化学薬品社製ＣＯ５
ＭＯＳ　Ｉ　ＬＣ＋　ｍカラム（４，６ｍｍ　１０　Ｘ
　１５０ｍｍ）、ＲＩ検出、溶離液ニアセトニトリル／
水−７／３（Ｖ／Ｖ）。

流速：１．０＋＋＋１２／ｍｉｎ］　：　’Ｒ＝６．５
ｍ１ｎザー０−アセチル−６フーデオキシーβ−Ｄ−マ
ル実施例２の（３）で得たα−ヘンエイコサ−Ｏ−アセ
チル−６フーデオキシマルトへブタオシルブロマイド４
０１ｍｇ（０，１９３ｍｏｌ）に、実施例上の（７）と
同様の操作を行い、メタノールから再結晶して２・クロ
ロ−４−二トロフェニルーヘンエイコサ一〇−アセチル
−６′−チオキシ−β−Ｄ−ｙルトヘプタオシド３６５
ｍ１？（０，１６８ｍｏｌ。

収率８７．０％）を得た。

融点（’Ｏ）　　７１２５．０〜１２７．０紫外部・可
視部吸収スペクトル： 吸収極大波長［λ鵞テ１（ｎｍ）　：　２８２（ｌｏｇ
＋　−４，００）、２２８（ｓｈ）、２０７（ｌｏｇ＋
　＝　４．２５）赤外吸収スペクトル（ａｍ−→：　３
４７０，２９５０．１７４６゜１５８２、１５２６．１
４８２．１４２６．１３６８．１３４６．１２３０．１
０３２核磁気共鳴スペクトル（２００ｔＪＨｚ）ｐｐｍ
（ＣＤＣ１ｘ）　＋１．１５（３Ｈ，ｄ、Ｊ＝６．１Ｈ
ｚ）、１．９８〜２．２０（６３Ｈ，ｅａｃｈｓ）、３
．７０−５．５０（ｍ）、７．２８（（ＩＨ，ｄ、Ｊ　
”　９．０Ｈｚ）。

７．１６（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ＝９．（）Ｈｚ、２．７Ｈｚ
）、８．２９（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝　２．７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィーＦ牛丼化学薬品社製Ｃ０５
ＭＯ３Ｉ　ＬＣｒ　ｍカラム（４，６ｍｍ　ＩＤＸ　１
５０ｍｍ）。

ＵＶ、、。０．、検出、溶離液ニアセトニトリル／水−
７／　３（Ｖ／Ｖ）　、流速：　１．ＯｍＬ’ｍ１ｎｌ
　：　’Ｒ−１４，２ｍ１ｎ比旋光度（［αｌ”ｊ）　
：　（ｃ　０−５１．１．４−ジオキサン）：＋１．２
゜ 実施例２の（４）で得ｌ；２−クロロー４−二トロフェ
ニルヘンエイコサーＯ−アセチル−６フーテオキシーβ
−Ｄ−マルトヘプタオシド３３６ｍ９（０，１５５ｍｏ
ｌ）に、実施例１の（８）と同様の操作を行って２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル−６フーデオキシ・β−Ｄ−
マルトヘプタオシド１４８ｍ９（０，１１５ｍｏｌ、収
率７４．１％）を得た。

融点（’Ｏ）　：２０９．０〜２１０．０　（分解）紫
外部・可視部吸収スペクトル： 吸収極大波長［λ’ｍａ　ｘ］（ｎ”’　）　−２８２
（’　ｏ　ｇ　ｔ　＝４．００）、２２８（ｓｈ）、２
０７（ｌｏｇε−４，２５）赤外吸収スペクトル（ｃｍ
−’　）　：　３４００　、２９３０　、１６３４　。

１５８４．１５１８．１４８４，１３４８，１２７６．
１２５４．１１５４１Ｑ８０．１０４２，１０２４ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（Ｄ２０
）　：１．２７（３Ｈ，ｄ、Ｊ＝５．９Ｈｚ）、３．１
５（ＩＨ，ｔ、Ｊ　−８，５Ｈｚ）、３．５５〜４．ｌ
Ｏ（ｍ）、５．３０（ＩＨ，ｂｒｓ）。

５．３８（５Ｈ，ｂｒｓ）、５．４３（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝
６．８Ｈｚ）。

７．３９（ＬＨ，ｄ、Ｊ　−９，０Ｈｚ）、８．２２（
１Ｈ，ｄｄｊ　−９，０Ｈｚ、２．５Ｈｚ）、８．３９
（ＩＨ，ｄ、Ｊ　＝　２．５Ｈｚ）高速液体クロマトグ
ラフィー［東ソー（株）製Ｔ’ＳＫ　ｇｅｔ　Ａｍ１ｄ
ｅ−８０カラム（４，６ｍｍ　ＩＤＸ　２５０ｍｍ）。

ＵＶ２．。、□検出、溶離液ニアセトニドリル／水−７
／３（Ｖ／Ｕ、流速：　１．ｏｍＱ／ｍ１ｎｌ　：　’
Ｒ−１１，０ｍ１ｎ元素分析値：　Ｃ＋５ＨｘＣＱＮＯ
３７としてＣＨＮ 理論値（％）　　４４．６０　５．７７　１．０８実測
値（％）　　４４．４５　５．８０　１．１１比旋光度
ＣＣａ　１　”ｄ）　：　（ＣＯ，４８，Ｈ２Ｏ）：　
＋　１．２゜実施例３ ６−ジオキシマルトトリオシド誘導体はａ−アミラーゼ
の作用をほとんど受けないのに対し、本発明における６
−ジオキシマルトオリゴシド誘導体は極めて順調にその
作用をうけるが、この点について以下のとおりの試験方
法で測定した。

試験方法 （１）複笠巖Ｑ二旦里 ｌＨ’ｌＪｌで得た２−クロロ−４−ニトロフェニル−
６Ｓ−デオキシ−β−Ｄ−マルトペンタオシド（以下本
発明基質という）５０．ｈｇに、０．０５％ウシ血清ア
ルブミン含有ｌＯＩＩＩＭリン酸緩衝液（ｐＨ−７，０
）を加えて全量を２５１ＲＱとして基質液■を調製した
。

（２）近笈亘豊丑旦里 後述の方法で得た２・クロロ−４−ニトロフェニル−６
！−デオキシ−β−Ｄ−マルトトリオシト（以下対照基
質という）５０．０＋１９に、０．０５％ウシ血清アル
ブミン含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ−７−０）を加
えて全量を２５ｍＱとして基質液■を調製した。

（３）共役酵素液の調製 ０．０５％ウシ血清アルブミン含有１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）に市販の酵母由来のα−グルコシダー
ゼ、市販のアーンモド由来のβ−グルコシダーゼをそれ
ぞれ２３４０　Ｕ、及び２６０Ｕ加えて全ｆｆ１２０ｍ
４として共役酵素液を調製した。

（４）試薬液の調製 基質液及び共役酵素液をそれぞれ容量比１．５：　１で
良く混合し、試薬液を調製した。

（５）σ−アミラーゼ液の調製 市販のヒト由来のα−アミラーゼ（国際試薬社製、キャ
ブリザイム・ＡＭＹ（Ｐｕｓヨｉ：ｌ）を０．０５％ウ
シ血清アルブミン含有ＩＱｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）に加え、０，１５０．４５０Ｕ／Ｉの濃度に溶解し
てα−アミラーゼ液を調製した。

（６）α−アミラーゼ加水分解反応 試薬液２．５ｍ＋２を３７℃で５分間加温したのち、α
−アミラーゼ液１００μａを加えてかきまぜ、３７°０
で２分間加温後から２分間４００ｎｍにおける吸光度の
増加量を測定した。

その結果を第５表に示す。

第 表 ｆｔお、対照Ｍ質の２４０ロー４−ニトロフェニル−６
３−デオキシ−β−Ｄ−マルトトリオシトは次の方法に
より得た。

エタノールグラジェントによる約２１％のエタノール溶
出画分を採取したこと以外は、実施例１の（１）〜（４
）と同様の操作を行い、純度９８，６％のα−６３−デ
オキシマルトトリオース約１．１ｇを得た。次いで、該
化合物４０１ｍｇ（０，８４２ｍｏｌ）に、実施例１の
（５）と同様の操作を行い、デカー〇−アセチルー６３
−デオキシマルトトリオース（α体−β体−約１　：　
１　）６０４ｍｉ＋（０，６６５ｍｏｌ、収率８１．０
％）を得た。

次いで、この化合物５５５ｍｇ（０，６１１ｍｏｌ）に
、実施例１の（６）と同様の操作を行い、ａ−ノナ・０
−アセチル−６１−デオキシマルトトリオシルプロミド
１７３ｍ９（０，１８６ｍｏｉ、収率３０．４％）を得
た。次いで、該化合物１５０ｍ９（０，１６１ｍｏｌ）
に、実施例１の（７）と同様の操作を行い、メタノール
から再結晶して２−クロロ−４−ニトロフェニル−ノナ
ー〇−アセチル・６８・デオキシ−β−Ｄ−マルトトリ
オシト１４０ｍｇ（０，１３７ｍｏｌ。

収率８５．０％）を得ｔ；。さらに、この化合物１０８
１＋１ｇ（０，１０６ｍｏｌ）に、実施例１の（８）と
同様の操作を行い、２−クロロ−４−二トロンエニルー
ａ３−チオーｔ−シ・β−Ｄ−マルトトリオシト４２．
８ｕ（０，６６５ｍｏｌ　、収率６３．１％）を得た。

融点（℃）　：　１５０．０〜１５２．０紫外部・可視
部吸収スペクトル： 吸収極大波長［λＭ００Ｈ］（ｒｕｌｌ）　＝　２８９
（ｌｏｇ　ｔ　−ａｘ ３．９４）、２２８（ｓｈ）、２０７（ｌｏｇｇ　−４
，１７）赤外吸収スペクトル（ｃｍ−’）　：　３４２
０．２９４０．１５９０゜１５２４、１４９０．１４１
４．１３５４．１２８２．１２５６．１１５６゜１０５
０．９２４，８９６ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＤｔＯ
）　：１．２８（３Ｈ，ｄ、Ｊ−６，４Ｈｚ）、３．１
８（ｌＨ，ｔ、Ｊ−９，４Ｈｚ）、３．４５−４．００
（ｍ）、　５．２８（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝３．１Ｈｚ）、５
．３２（１Ｂ、ｄ、Ｊ　＝　３．８Ｈｚ）、５．４２（
ＩＨ，ｄ、Ｊ＝　５．９Ｈｚ）、７．４０（ＩＨ，ｄ、
　Ｊ　＝　９．０Ｈｚ）　、８．２１（ＩＨ。

ｄｄ、Ｊ　＝　９．０Ｈｚ、２．７Ｈｚ）、８．４０（
ＬＨ，ｄ、Ｊ□２．７Ｈｚ）高速液体クロマトグラフィ
ー［東ソー（株）製ＴＳＫ　ｇｅｔ　Ａｍ１ｄｅ−８０
カラム（４，６ｍｍ　ＩＤＸ　２５０ｍｍ）。

ＵＶ２＠Ｏｓｍ検出、溶離液ニアセトニトリル／水−３
／ｌ（Ｖ／Ｖ）、流速：　１．ｏｍ（２／ｍｉｎ］　：
　’Ｒ−４，３ｍ１ｎ元素分析値：　Ｃ２＋Ｈｓ＋ＣＱ
ＮＯ＋ｒとシテＣＨＮ 理論値（％）　４４．７６　　５．３２　　２．ｉ８実
測値（％）４４゜６８　　５，３５　　２．１８比旋光
度（（ｃｒ　）　５）　：　（ｃ　０−２７．８ｚＯ）
：　＋　０−５２゜市販（７）２−’）クロー４−二ト
ロフェニルーβ−Ｄ−マルトペンタオシド（第一化学薬
品社製）１５．０ｇ（１５，２ｍ０１）を無水ＤＭＦ２
２５ｍ１２に溶解し、ベンズアルデヒドジメチルアセタ
ール１１．４ｍ１２（７６，０ｍｏｌ）とトシル酸２．
２５９（１１，４ｍｏｌ）を加え、４０℃で４時間かき
まぜながら反応させた。次いで、この反応液を氷水１．
２Ｑ中へかきまぜながらゆっくりと滴下した。これに飽
和重炭酸ナトリウム水溶液を水冷下かきまぜながらゆっ
くりと加えて中和し、次いでこの混合液をジクロロメタ
ン３００ｍ１２で３回洗浄したのち、水層部を濃縮し、
ＤＭＦと水を留去した。次いで残炎をＯＤＳカラムクロ
マトグラフィーにより精製し、エタノール−水混液（容
量比２：３）で溶出した目的区分を濃縮し、インプロパ
ノ−ルーメタノールかう再結晶ｔ、て２−クロロ−４−
二トロフェニル−４’、６″−ベンジリデン−β−Ｄ−
マルトペンタオシド１１．２ｇ（１０，４ｍｃｉ、収率
６８．３％）を得た。

融点（’（り　：　１９６．０〜２００．０紫外部・可
視部吸収スペクトル： 吸収極大波長［λ鵞で（ｎｍ）　＝　２９２（＋０９ε
−３，９０） 赤外吸収スペクトル（ｃ＋＊−’）　：３４１０，２９
４０．１６３０゜１５８６．１５２０，１４８６，１３
５０．１２７４，１１５２，１０７４，１０２８９３０
．８９６ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＣＤＣ
１ｘ）　：３．２０〜５．７０（ｍ）　、　５．０５（
２Ｈ，ｄ　、　Ｊ　−３，４Ｈｚ）　、　５．１２（ｌ
Ｈ，ｄ、Ｊ　＝　４．４Ｈｚ）、５−１３（Ｌ　Ｈ，ｄ
、Ｊ　＝　４．４Ｈｚ）。

５．２５（Ｉ　Ｈ，ｄ、Ｊ　＝　７．６Ｈｚ）、５．５
６（ｌ　Ｈ，ｓ）、７．３３〜７．５５（５Ｈ，＋ｎ）
、７．３５（ｌ　Ｈ，ｄ、Ｊ　−９，０Ｈｚ）、８．１
４（ｌ　Ｈ。

ｄｄ、Ｊ　−９，０Ｈｚ、２．７Ｈｚ）、８．２９（ｌ
　Ｈ，ｄ、Ｊ　−２，７Ｈｚ）高速液体クロマトグラフ
ィー［東ソー（株）製ＴＳＫ　ｇｅｌ　Ａｍ１ｄｅ−８
０カラム（４，６ｍｒａ　ＩＤＸ　２５０＋＋＋＋＋＋
）。

ＵＶ２．。、検出、溶離液ニアセトニトリル／水−３／
１（Ｖ／Ｖ）　、流速：１．Ｏｍ（２／ｍ１ｎｌ　：　
’Ｒ−４，８ｍ１ｎ（１）で得た２−クロロ−４−ニト
ロフェニル−４ｓ、６ｓ−ベンジリデン−β−Ｄ−マル
トペンタオシド！３．３ｙ（１２，４ｍｏｌ）をピリジ
ン２００ｍ４に溶解し、無水酢酸１００ｍｆ＋（１，２
８ｍｏｌ）を加え、室温で２日間反応させた。

次いで、この反応液を減圧下濃縮し、ピリジン、無水酢
酸、酢酸を留去したのち、残渣をシリカゲルカラムクロ
マトグラフィーにより精製し、メタノール−ジクロロメ
タン混液（容量比２　：９８）で溶出した目的区分を濃
縮し、エタノールから再結晶して２−クロロ−４−ニト
ロフェニルテトラゾカー〇−アセチル−４５，＋３１−
ベンジリデン・β−Ｄ−マルトペンタオシド１８−１ｇ
（１０，９ｍｏｌ　、収率８７．９％）を得た。

融点（”Ｏ）　：１３０．Ｏｍ１３５．０紫外部・可視
部吸収スペクトル： 吸収極大波長〔λ５ｎｍ）”２９２（ｘｏｔｇ　−３，
９０）赤外吸収スペクトル（ｃｍ−’）　：　３４Ｌ０
．２９４Ｑ、１６３０゜１５８６．１５２０．１４８６
．１３５０．１２７４．ｌ！５２．１０７４゜１０２８
．９３０．８９６ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＣＤＣ
！ｓ）　：２、ＯＯ〜２．２１（４２Ｈ，ｅａｃｈ　ｓ
）、３．５５〜４．９０（ｒｎ）。

５．１５＝５．５０（ｍ）、７．３０（ｌＨ，ｄ、Ｊ−
９，２Ｈｚ）。

７．２６”７．４１（５Ｈ，ｍ）、８．１７（ＩＨ，ｄ
ｄ、Ｊ　−９，２Ｈｚ。

２．７）１ｚ）、８．３０ （１１（、ｄ、Ｊ−２，７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィー［牛丼化学薬品社製ＣＯ５
ＭＯＳ　Ｉ　ＬＣｒ　ａカラム（４，６ｍｍ　ＩＤｘ　
１５０ｍｍ）。

ＵＶ、、。１．検出、溶離液ニアセトニトリル／水−３
／ｌ（Ｖ／Ｖ）、流速：１．Ｏｍ（２／ｍ１ｎｌ　：’
Ｒ−７．７ｍ１ｎ比旋光度（［α］￥ｐ　：　（ｃ　０
−２５．１．４−ジオキサン）？　＋０．８４’ （２）で得た２−クロロ−４・ニトロフェニルテトラデ
カ・０・アセチル・４’、６’・ベンジリデン−β−Ｄ
−マルトペンタオシド！、６６９　（１，００ｍｏｌ）
を酢酸５０＋＋＋（ｌに溶解し、水１２．５ｍ（２を加
え、３０℃で３日間かきまぜながら反応させた。次いで
この反応液を氷水３００１１ｒＬ中へかきまぜながらゆ
っくりと滴下したのち、この混合液をジクロロメタン３
００Ｘｌｌ（＋で３回抽出した。次いでジクロロメタン
層を水３００ｍｆ２で３回洗浄し、ジクロロメタン層部
を無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ別したのち、ろ液を減
圧下濃縮し、ジクロロメタンを留去した。次いで残渣を
シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、酢
酸エチル−メタノール−ジクロロメタン混液（容量比６
６　：　２．５　：　３３）で溶出した目的区分を濃縮
して、２−クロロ・４−ニトロフェニル−０−（２，３
−ジー０−ア゛セチル・α・Ｄ−グルコピラノシル）（
１→４）・トリス［０−（２，３，６・トリー〇・アセ
チル・α−Ｄ・グルコピラノシル）−（１→４）】・２
．３．６・トリ・０−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノ
シド１．０４ｇ（０，６６１ｍｏｌ、収率６６．１％）
を得た。

融点（’Ｏ）　：　１２６．０〜１３０．０紫外部・可
視部吸収スペクトル： 吸収極大波長［Ａｅ５（ｎｍ）　−２８２（ｌｏｇｓ　
−３，９４）赤外吸収スペクトル（ｃｍ−つ：　３４８
０．２９７０．１７５２゜１５８８、１５３０．１４８
６．１４３２．１３７２．１３５０　、１２３６．１０
３０゜９４４．８９８ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＣＤＣ
Ｉ２．）　：１．１８〜２．１２（４２Ｈ，ｅａｃｈ　
ｓ）、３．５０−４．７４（ｍ）。

５．０５（ｍ）、７．２２（１８，ｄ、Ｊ−９，０Ｈｚ
）、８．０９（ＩＨ，ｄｄ。

Ｊ　＝　９．０Ｈｚ、２．７）１ｚ）、８．２２（ＩＨ
，ｄｊ　−２，７Ｈｚ）高速液体クロマトグラフィーＥ
半押化学薬品社製Ｃ０５Ｍ０ＳＩＬＣ＋　ａカラム（４
，ｈｖ＋　ＩＤｘ　１，５０ｍｍ）。

ＵＶ、。、検出、溶離液：アセＩ・ニトリル／水−７／
３（Ｖ／Ｖ）、流速：　１．０ｍ１２／ｍ１ｎｌ　：　
’Ｒ＝４．２ｍ１ｎ比旋光度（［ａ　］曾）　：　（ｃ
　０．２６．１．４−ジオキサン）：　＋０．８８’ ノシドの合皮 実施例４の（３）で得た２・クロロ−４・ニトロフェニ
ル・０−（２，３−ジー０−アセチル−α−Ｄ−グルコ
ピラノシル）−（１−４）−１−！Ｊ　；ｔ、　［ｏ−
（２，３，６−トリー〇−アセチル−α・Ｄ−グルコピ
ラノシル）−（１−４）］・２．’３．６−　トリー〇
−アセチルーβ−Ｄ−グルコピラノシド１．１６９（０
，７３８ｍｏｌ）をピリジン３０ｍＱに溶解し、トシル
クロリド２．１１９　（１１，ｏｍｏｌ）を加え、室温
下で５時間かきまぜながら反応させた。次いでこの反応
液中のピリジンを減圧下留去し、この残渣をシリカゲル
カラムクロマトグラフィーにより精製し、酢酸エチル−
メタノール−ジクロロメタン混液（容量比４０：１：２
０）で溶出した目的区分を濃縮して、２−クロロ−４−
ニトロフェニル・０−（２，３−ジ・０−アセチル・６
−〇−トシルーａ−Ｄ・グルコピラノシル）・（１−４
）−１−リス［０−（２，３，６−トリ・Ｏ−アセチル
・α−Ｄ・グルコピラノシル）−（１→４）］−２，３
，６−トリ・０−アセチル−β・Ｄ−グルコピラノシド
６４３Ｂ　（０，３７２ｍｏｌ、収率５０．５％）を得
た。

融点（’Ｃ）　　：　１０９．０〜１１３．５紫外部・
可視部吸収スペクトル： 吸収極大波長［λｍａ”］（ｎｍ）−２８１（ｌｏｇｔ
　＝３．９５）、２７２（ｓｈ） 赤外吸収スペクトルＣｃｙａ−’＞　：　３４９０．２
９７０．１７５２゜１５８６、１５２８．１４８６．１
４３０．１３７２．１３５０．１２４０゜１１７８、１
０３４．９４２ 核磁気共鳴スペクトル（２００ＭＨｚ）ｐｐｍ（ＣＤＣ
Ｌ）　：１．９９〜２．１７（４２Ｈ，ｅａｃｈ　ｓ）
、３．５０〜４．８０（＋）。

５、ＬＯ〜５．５０（ｍ）、７．３２（２Ｈ，ｄ、Ｊ　
−９，０Ｈｚ）。

７．３５（２Ｈ，ｄ、Ｊ−８，５Ｈｚ）、７．７９（Ｉ
Ｈ，ｄ、Ｊ−８，５Ｈｚ）、８．１５（ＩＨ，ｄｄ、Ｊ
　−９，０Ｈｚ、２．７Ｈｚ）、８．２９（ＩＨｚ、ｄ
、Ｊ　−２，７Ｈｚ） 高速液体クロマトグラフィー【半押化学薬品社製ＣＯ５
ＭＯＳ　［ＬＣ、カラム（４，６ｍｍ　ＩＤＸ　１５０
ｍｍ）。

Ｕｖｏ。０．検出、溶離液ニアセトニトリル／水−７／
３（Ｖ／Ｖ）、流速：１．０ｍｆｆ／ｍ１ｎｌ　：　’
Ｒ−１０，０ｍ１ｎ比旋光度（［α］”７）　　：　（
ｃ　０−６５．１．４−ジオキサン）：　＋０．８８゜ 実施例４の（４）で得た２・クロロ−４−ニトロフェニ
ル−〇−（２，３・ジ・０−アセチル−６−０−１−シ
ル−ａ　−Ｄ−グルコピラノシル）−（ｌ→４）−トリ
ス［０−（２，３，６−トリ・Ｏ−アセチル・α−Ｄ−
グルコピラノシル）−（１−４）］−２，３，６・トリ
ー〇−アセチルーβ−Ｄ−グルコピラノシド５００ｕ（
０−２９０ｍｏｌ）をＤＭＳＯｌ　Ｏｍ（ｌに溶解し、
水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＪ）１１０ｍ９（２，
９１ｍｏｌ）を加え、５０℃で１３時間反応する。次い
でこの反応液を氷水５００ｍ１２中へかきまぜながらゆ
っくり滴下する。次いでこの混合液をベンゼン２００ｍ
６で３回抽出し、ベンゼン層を無水硫酸ナトリウムで乾
燥した後、綿栓ろ過する。このろ液を濃縮し、含まれる
ベンゼンを留去する。精製することなく、この残渣をメ
タノール１６ｍαに溶解し、２８％アンモニア水８ｍＱ
及び水４ｍ１２を加え、３５℃で２０時間かきまぜなが
ら反応させる。次いで反応液を減圧濃縮し、ここに含ま
れる水及びメタノールを留去する。次いでその残渣をＯ
ＤＳカラムクロマトグラフィーにより精製し、エタノー
ル−水混液（容量比ｌ：４）で溶出した目的区分を濃縮
し、水から再結晶して、２−クロロ−４−ニトロフェニ
ル・６５−デオキシマルトペンタオシドが１７７ｍｇ（
０，１８３ｍｏｌ。

収率６３．１％）を得た。ここで得られた２・クロロ・
４・ニトロフェニル・６ローデオキシマルトペンタオシ
ドの物性は、実施例１で得られた２・クロロ−４−二ト
ロフェニル−６′−デオキシマルトペンタオシドの物性
と全て一致した。

実施例５　σ−アミラーゼ活性の測定法（１）基質液の
調製 実ｍ例ｉで得た２−クロロ・４−ニトロフェニル−６ｓ
−デオキシ−β−Ｄ−マルトペンタオシド５０．０ｍｇ
に、０．０５％ウシ血清アルブミン含有Ｊ、ＯｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７，０）を加えて全量を２５ｍｆ２とし
て基質液を調製した。

（２）共役酵素液の調製 ０．０５％ウシ血清アルブミン含有１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）に市販の酵母由来のα−グルコシダー
ゼ、市販のアーモンド由来のβ−グルコシダ・−ゼをそ
れぞれ２３４０Ｕ及び２６０　Ｕ加えて全量を２０ｍＱ
として共役酵素液を調製した。

（３）試薬液の調製 基質液及び共役酵素液をそれぞれ容量比ｉ、ｓ：　１で
よく混合して試薬液を調製した。

（４）　ｖＩＡ品α−アミラーゼ液の調製市販のヒト由
来のａ−アミラーゼ（Ｐ：Ｓ＝ｌ：１）を０．０５％ウ
シ血清アルブミン含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）に加え、０．２５．５０、ｌ’ｏｏ、　１５０．３
００．４５０．６００Ｕ／Ｑの濃度に溶解して標品α−
アミラーゼ液を調製した。

（５）故丑液の調製 α−アミラーゼ活性測定用試料が液体の場合はそのまま
試料液とした。まｔ；、固体の場合は試料５００ｕを正
確に秤量し、　０．０５％ウシ血清アルブミン含有１０
ｍＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を加えて全量を５ｍ
Ｑとして試料液を調製した。

（６）検量線の作成 試薬液２．５ｍＱを３７℃で５分間加温したのち、標品
α・アミラーゼ液ｌＯＯμαを加えてかきまぜ、３７°
Ｃで２分間加温後からの２分間、４００ｎｍにおける吸
光度の増加量を測定した。この時、標品σ−アミラーゼ
液活性と吸光度の増加量関係より検量線を作成した。国
際試薬社製標品α−アミラーゼ（キャブリザイム・ＡＭ
Ｙ）を用いた場合、検量線の式はＵ−５，８７５−△Ａ
　Ｘ　ｔｏ’　−３，３７［Ｕ：酵素活性Ｕ／Ｑ、△Ａ
；吸光度の増加量］となる。そのグラフを第９図に示す
。

（７）試料液中のσ−アミラーゼ活性の測定試薬液２．
５ｍ１２を３７℃で５分間加温したのち、試料液１００
μＱを加えてかきまぜ、３７℃で２分間加温後からの２
分間、４００ｎｍにおける吸光度の増加量を測定した。

この測定値と（６）で作成した検量線から算出して試料
液中のａ−アミラーゼ活性を測定することができる。な
お、試料液中の酵素活性の値が検量線の適用範囲（Ｏ〜
６００Ｕ／＋２）を超えた場合は０．０５％ウシ血清ア
ルブミン含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を用
いて相当する倍数の希釈を行った後、再測定を行う。

実施例６ 本発明の化合物が測定系内で安定に存在することを実証
するために、非還元末端非修飾体を対照として下記の試
験方法に従って共役酵素との反応を行った。

試験方法 （１）匙見里Ｑ丑旦星 実２ｉ１１１で得た２・クロロ−４−二トロフヱニルー
６５−デオキシ・β・Ｄ−マルトペンタオシド（以下本
発明基質という）５０．ｈｇに、０．０５％ウシ血清ア
ルブミン含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ−７，０）を
加えて全量を２５１１ＩＱとして基質液■を調製した。

（２）五夏菫盆立旦星 市販の２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−〇−マル
トペンタオシド（以下対照基質という）５０．０１１１
９に、０．０５％ウシ血清アルブミン含有１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ−７，０）を加えて全量２５ｍｆ２とし
て基質液■を調製した。

（３）共役酵素液の調製 ０．０５％ウシ血清アルブミン含有１０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７，０）に市販の酵母由来のａ−グルコシダー
ゼ１１７００Ｌ＋を加えて全量を５ｍ１２として共役酵
素液Ａを調製した。同様に、０．０５％ウシ血清アルブ
ミン含有１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に市販の
アーモンド由来のβ−グルコシダーゼ１８２Ｕを加えて
全量５ｍＱとして共役酵素液Ｂを調製した。

（４）共役酵素反応 基質液■、基質液■、共役酵素液Ａ及びＢを３７°Ｃで
５分間加温したのち、基質液■及び基質液■をそれぞれ
基質液：共役酵素液Ａ：共共役液液−２、ｌ　：０．５
（容量比）でよく混合し、２分後から５分間、４００ｎ
ｍにおける吸光度の増加量を測定しＩ：、。

その結果を第１０図に示した。図中の口印は基質液■、
Δ印は基質液■によるものである。これより、本発明基
質は共役酵素と反応することなく、測定系内で安定に存
在することが分る。

実施例７　測定試薬 （１）試薬の調製 精製水に以下の成分を以下の濃度で溶解することにより
試薬Ａを調製しｔ；。

成分 ２−クロロ−４−ニトロフェニル−６ｓ−デオキシ−β
−Ｄ−マルトペンタオシド σ−グルコシダーゼ β−グルコシダーゼ β−グリセロリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）ウシ血清アル
ブミン 濃　　　度 ２．０ｍＭ ６ＱＵ＃ｎＱ １０Ｕ／ｍＱ ０ｍＭ ０９０５％ 精製水に以下の成分を以下の濃度で溶解することにより
試薬Ｂを調製した。

成　　　　分　　　　　　　　　　　　　濃　　　興β
−グリセロリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）　　　　１０ｍ
Ｍウシ血清アルブミン　　　　　　　　　０．０５％（
２）邂皇迭 測定用試料が液体の場合はそのまま試料液とした。固体
の場合は試料５００層ｓｐを正確に秤量し、試薬Ｂを加
えて全量を５ｍ１２として試料液とした。次いで試薬Ａ
３．０＋ｍαを３７℃で５分間加温したのち、試料液１
００μａを加えてかきまぜ、　３７℃で２分間加温後か
ら２分間４００ｎｍにおける吸光度の増加量を測定した
。この測定値とあらかじめ作成した検量線から算出して
試料液中のα・アミラーゼ活性を測定することができる
。なお、試料液中の酵素活性の値が検量線の適用範囲を
超えた場合は試薬Ｂを用いて相当する倍数の希釈を行っ
た後、再測定を行う。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明で用いたシクロデキストリナーゼの至適
ｐｎを示すグラフ、第２図は安定性ｐＨを示すグラフ、
第３図は作用温度を示すグラフ、第４図は温度による失
活の条件を示すグラフ、第５［３！ｆＩはＤＥＡＥセフ
ァロースによるカラムクロマトグラフィーの結果を示す
グラフ、第６図はＴＳＫ　ｇｅｌエーテル　５ＰＷによ
るＨＰＬＣの結果を示すグラフ、第７図はＴＳＫ　ｇｅ
ｔ　Ｇ３０００ＳＷによるＨＰＬＣの結果を示すグラフ
、第８図はＳＤＳ　ＰＡＧＥの結果を示す図、第９図は
σ−アミラーゼ活性の測定に用いる検量線を示すグラフ
、第１Ｏ図は本発明基質と対照基質との測定系内におけ
る安定性を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中のＲは芳香族発色性基であり、ｎは２〜６の整数
   である） で表わされる６−デオキシマルトオリゴシド誘導体。 ２　請求項１記載の６−デオキシマルトオリゴシド誘導
   体を有効成分とするα−アミラーゼ活性測定用試薬。 ３　α−アミラーゼ含有試料に、請求項１記載の６−デ
   オキシマルトオリゴシド誘導体のα−アノマーと、α−
   グルコシダーゼ及び／又はグルコアミラーゼを添加して
   酵素反応を行わせ、遊離する芳香族発色性化合物を定量
   することを特徴とするα−アミラーゼ活性の測定方法。 ４　α−アミラーゼ含有試料に、請求項１記載の６−デ
   オキシマルトオリゴシド誘導体のβ−アノマー又はα−
   アノマーとβ−アノマーとの混合物と、α−グルコシダ
   ーゼ及び／又はグルコアミラーゼ並びにβ−グルコシダ
   ーゼを添加して酵素反応を行わせ、遊離する芳香族発色
   性化合物を定量することを特徴とするα−アミラーゼ活
   性の測定方法。