JPH04112900A - 魚類の成長ホルモンポリペプチドの精製、再生法 - Google Patents
魚類の成長ホルモンポリペプチドの精製、再生法Info
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- JPH04112900A JPH04112900A JP23281790A JP23281790A JPH04112900A JP H04112900 A JPH04112900 A JP H04112900A JP 23281790 A JP23281790 A JP 23281790A JP 23281790 A JP23281790 A JP 23281790A JP H04112900 A JPH04112900 A JP H04112900A
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- polypeptide
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、魚類の成長ホルモンポリペプチド、およびそ
れをコードする遺伝子を組込んだ組み換え体微生物によ
る魚類の成長ホルモンポリペプチドの優れた精製、再生
法に関するものである。
れをコードする遺伝子を組込んだ組み換え体微生物によ
る魚類の成長ホルモンポリペプチドの優れた精製、再生
法に関するものである。
魚類の成長ホルモンポリペプチドを魚類の脳下垂体から
単離する報告は多数ある。その−例を挙げると、ティラ
ピア（Ｓ、 Ｎ、 Ｆａｒｍｅｒら、Ｇｅｎ、 Ｃｏｍ
ｐ。
単離する報告は多数ある。その−例を挙げると、ティラ
ピア（Ｓ、 Ｎ、 Ｆａｒｍｅｒら、Ｇｅｎ、 Ｃｏｍ
ｐ。
Ｅｎｄｏｃｒｉｎ、 、 ３０．９１（１９７６） 、
チョウザメ（Ｓ、 Ｎ、 Ｆａｒｍｅｒら、Ｅｎｄｏｃ
ｒｉｎｏｌｏｇｙ、 １０８．３７７（１９８１）、コ
イ（Ａ、 Ｆ。
チョウザメ（Ｓ、 Ｎ、 Ｆａｒｍｅｒら、Ｅｎｄｏｃ
ｒｉｎｏｌｏｇｙ、 １０８．３７７（１９８１）、コ
イ（Ａ、 Ｆ。
Ｃｏｏｋ ら、Ｇｅｎ、 Ｃｏｍｐ、 Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎ、 、 ５０．３３５（１９８３）、シロサケ（特開
昭６０−２１４７９８号）および本発明者らのマグロ（
特開昭６３−．１３３９５１号）らである。またそのコ
ードする遺伝子の単離に成功している例も多数有り、そ
の例はシロサケ（特開昭６１−９３１９７号）、ハマチ
（Ｎ、Ｗａｔａｈｉｋｉら、Ｇｅｎ、 Ｃｏｍｐ、 Ｅ
ｎｄｏｒ ｉｎ１，７０．４０１（１９８８））および
本発明者らのマグロ（特開昭６３−７２７２３号）等で
ある。
ｎ、 、 ５０．３３５（１９８３）、シロサケ（特開
昭６０−２１４７９８号）および本発明者らのマグロ（
特開昭６３−．１３３９５１号）らである。またそのコ
ードする遺伝子の単離に成功している例も多数有り、そ
の例はシロサケ（特開昭６１−９３１９７号）、ハマチ
（Ｎ、Ｗａｔａｈｉｋｉら、Ｇｅｎ、 Ｃｏｍｐ、 Ｅ
ｎｄｏｒ ｉｎ１，７０．４０１（１９８８））および
本発明者らのマグロ（特開昭６３−７２７２３号）等で
ある。
従来、魚類の組み換え成長ホルモンポリペプチドは魚類
の成長ホルモンポリペプチドをコードする遺伝子を微生
物に取込ませ培養し、培養物を精製後、尿素または塩酸
グアニジンで再生し、活性型（２個のＳ−８環を有する
単量体の分子）にし、脱塩を透析で行ってきた。その結
果、透析中に多くの成長ホルモンポリペプチドは会合し
て沈澱する。会合した成長ホルモンポリペプチドは難溶
性であり、実際に取扱いができるのは、単量体の成長ホ
ルモンポリペプチドに限られていた。
の成長ホルモンポリペプチドをコードする遺伝子を微生
物に取込ませ培養し、培養物を精製後、尿素または塩酸
グアニジンで再生し、活性型（２個のＳ−８環を有する
単量体の分子）にし、脱塩を透析で行ってきた。その結
果、透析中に多くの成長ホルモンポリペプチドは会合し
て沈澱する。会合した成長ホルモンポリペプチドは難溶
性であり、実際に取扱いができるのは、単量体の成長ホ
ルモンポリペプチドに限られていた。
魚類の成長ホルモンは魚類の成長促進効果を有し栽培漁
業において極めて有用な物質である。しかし、現在該ホ
ルモンを安価に且つ大量に供給することは魚類の脳下垂
体を大量に必要とし、不可能に近い問題である。
業において極めて有用な物質である。しかし、現在該ホ
ルモンを安価に且つ大量に供給することは魚類の脳下垂
体を大量に必要とし、不可能に近い問題である。
本発明者等は先にマグロ類の成長ホルモンを単離し、そ
の性質と一次構造とを明らかにすると共に、このマグロ
類の成長ホルモンか硬骨魚類の優れた成長促進因子とな
り得る事を明らかにした（特開昭６３−１３３９５１号
）。また、この遺伝子を単離しプラスミドに組込み大腸
菌に導入することにより、成長ホルモンを発現させるこ
とに成功した（特願昭６３−７２７２３号）。さらに、
本発明者らは発現した成長ホルモンを再生し、活性型に
し、これを魚に投与することにより、魚の成長を促進さ
せることを明らかにした（特願平１−４３３０４号）。
の性質と一次構造とを明らかにすると共に、このマグロ
類の成長ホルモンか硬骨魚類の優れた成長促進因子とな
り得る事を明らかにした（特開昭６３−１３３９５１号
）。また、この遺伝子を単離しプラスミドに組込み大腸
菌に導入することにより、成長ホルモンを発現させるこ
とに成功した（特願昭６３−７２７２３号）。さらに、
本発明者らは発現した成長ホルモンを再生し、活性型に
し、これを魚に投与することにより、魚の成長を促進さ
せることを明らかにした（特願平１−４３３０４号）。
本発明者らは、さらに研究を進めて魚類の成長ホルモン
を安価に効率よく大量に供給する方法を開発すべく研究
を行い、組み換えＤＮＡ技法で微生物に産生させた魚類
の成長ホルモンポリペプチドを効率良く活性型の分子に
変換する方法を完成するに至った。
を安価に効率よく大量に供給する方法を開発すべく研究
を行い、組み換えＤＮＡ技法で微生物に産生させた魚類
の成長ホルモンポリペプチドを効率良く活性型の分子に
変換する方法を完成するに至った。
本発明は、遺伝子組換え微生物で産生させた魚類の成長
ホルモンポリペプチドに塩酸グアニジンを加え処理した
後、疎水性基を固定した担体、例えば、ＦＰ−ＯＴ１３
（三菱化成）を使用して脱塩処理することにより、
魚類の成長ホルモンポリペプチドを精製すると共に効率
良く活性型の単分子に再生することにある。
ホルモンポリペプチドに塩酸グアニジンを加え処理した
後、疎水性基を固定した担体、例えば、ＦＰ−ＯＴ１３
（三菱化成）を使用して脱塩処理することにより、
魚類の成長ホルモンポリペプチドを精製すると共に効率
良く活性型の単分子に再生することにある。
そして、これらの単分子の成長ホルモンポリペプチドは
、これを硬骨魚類に投与したところ、すぐれた成長促進
効果を示した。
、これを硬骨魚類に投与したところ、すぐれた成長促進
効果を示した。
上記魚類の成長ホルモンポリペプチドとしてはマグロの
成長ホルモンポリペプチドが挙げられるがその他の魚類
の成長ホルモンポリペプチドにも適応することができる
。
成長ホルモンポリペプチドが挙げられるがその他の魚類
の成長ホルモンポリペプチドにも適応することができる
。
本発明の精製・再生法は、上記したＤＮＡ組換え技術に
よって製造した魚類の成長ホルモンポリペプチドに適用
できるのみでなく、魚類から抽出法によって製造した成
長ホルモンポリペプチドに対しても広く適用することが
できる。そして、抽出法による成長ホルモンポリペプチ
ドの製造例としては、例えば、魚類の脳下垂体をホモゲ
ナイズした後に、塩基性水溶液を用いて成長ホルモンを
抽出する本発明者の発明に係る方法（特開昭６３−１３
３９５１号）か例示される。
よって製造した魚類の成長ホルモンポリペプチドに適用
できるのみでなく、魚類から抽出法によって製造した成
長ホルモンポリペプチドに対しても広く適用することが
できる。そして、抽出法による成長ホルモンポリペプチ
ドの製造例としては、例えば、魚類の脳下垂体をホモゲ
ナイズした後に、塩基性水溶液を用いて成長ホルモンを
抽出する本発明者の発明に係る方法（特開昭６３−１３
３９５１号）か例示される。
また、本発明に係る精製、再生法は、マグロのほか、サ
バ、マダイ、スズキといったスズキ魚群、ニシン、ニジ
マスその他のニシン魚群、及び中止魚群その他の硬骨魚
類についてもマグロの場合と全く同様に適用することが
できる。
バ、マダイ、スズキといったスズキ魚群、ニシン、ニジ
マスその他のニシン魚群、及び中止魚群その他の硬骨魚
類についてもマグロの場合と全く同様に適用することが
できる。
上記した遺伝子組み換え技術による魚類の成長ホルモン
ポリペプチドの製造は、特願昭６３−７２７２３号に記
載したように例えば次のように行う。
ポリペプチドの製造は、特願昭６３−７２７２３号に記
載したように例えば次のように行う。
先ず、マグロの新鮮な脳下垂体より全ＲＮＡを抽出し、
これをオリゴｄＴセルロース（ｏｌｉｇｏ ｄＴ ｃｅ
ｌｌｕ−１ｏｓｅ）カラムに導通してポリアデニル酸（
ポリＡ）を有するＲＮＡ （ポリＡ−ＲＮＡ）を調製す
る。次にこれを鋳型とし、逆転写酵素によりＲＮＡ−Ｄ
ＮＡ二重鎖を合成する。これをＤＮＡ組換え技術を用い
、オリゴｄＴ付ベクタープライマー１）ＳＶ７１８６（
ファルマシア社製）等のプラスミドＤＮＡに挿入してマ
グロ成長ホルモンをコードするＤＮＡを含むプラスミド
（例えばｐＴＴＳ３３９）を得る。
これをオリゴｄＴセルロース（ｏｌｉｇｏ ｄＴ ｃｅ
ｌｌｕ−１ｏｓｅ）カラムに導通してポリアデニル酸（
ポリＡ）を有するＲＮＡ （ポリＡ−ＲＮＡ）を調製す
る。次にこれを鋳型とし、逆転写酵素によりＲＮＡ−Ｄ
ＮＡ二重鎖を合成する。これをＤＮＡ組換え技術を用い
、オリゴｄＴ付ベクタープライマー１）ＳＶ７１８６（
ファルマシア社製）等のプラスミドＤＮＡに挿入してマ
グロ成長ホルモンをコードするＤＮＡを含むプラスミド
（例えばｐＴＴＳ３３９）を得る。
次いて、このようにして得たマグロ成長ホルモンをコー
ドするＤＮＡを含むプラスミドから該ＤＮＡを切り出し
、これをベクターＤＮＡに組込み、得られた組換え体Ｄ
ＮＡを微生物に導入し、得られる形質転換体を培養する
ことによってマグロ成長ホルモンポリペプチドを菌体中
に生成蓄積させ、これを採取することにより、マグロ成
長ホルモンポリペプチドを製造するのである。マグロ成
長ホルモンをコードするＤＮＡを含むプラスミドとして
は、上記したようにｐＴＴＳ３３９が好適な例としてあ
げられる。
ドするＤＮＡを含むプラスミドから該ＤＮＡを切り出し
、これをベクターＤＮＡに組込み、得られた組換え体Ｄ
ＮＡを微生物に導入し、得られる形質転換体を培養する
ことによってマグロ成長ホルモンポリペプチドを菌体中
に生成蓄積させ、これを採取することにより、マグロ成
長ホルモンポリペプチドを製造するのである。マグロ成
長ホルモンをコードするＤＮＡを含むプラスミドとして
は、上記したようにｐＴＴＳ３３９が好適な例としてあ
げられる。
ベクターＤＮＡとしては、挿入したＤＮＡを微生物中で
発現させることができるものなら、いかなるものでも用
いることができるが、好ましくは、ｔａｃ（ｔｒｐ−１
ａｃ）、 ｔｒｐ、 λＰＬ＋ ａｒａ、 ｒｅｃＡ
プロモーターなどを持ち、その下流にシャインダルガル
ノ（ＳＤ）配列を持つ発現ベクターに、ＳＤ配列と挿入
遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）が６−２０塩基に調整し
たベクターＤＮＡが用いられる。具体的に好適なベクタ
ーＤＮＡとしてｐＫＫ２２３−３やｐＫＫ２３３−２
（ファルマシア・ジャパン社製）をあげることかできる
。マグロ成長ホルモンをコードするＤＮＡとベクターＤ
ＮＡとの組換え体は一般的な方法である制限酵素やその
関連酵素により作成することがてき、例えば、シグナル
部分を除いたマグロ成長ホルモンをコードする遺伝子Ｄ
ＮＡを含む組換え体プラスミド（ｐＴＥＳ ８ Ｓ）を
作成する。
発現させることができるものなら、いかなるものでも用
いることができるが、好ましくは、ｔａｃ（ｔｒｐ−１
ａｃ）、 ｔｒｐ、 λＰＬ＋ ａｒａ、 ｒｅｃＡ
プロモーターなどを持ち、その下流にシャインダルガル
ノ（ＳＤ）配列を持つ発現ベクターに、ＳＤ配列と挿入
遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）が６−２０塩基に調整し
たベクターＤＮＡが用いられる。具体的に好適なベクタ
ーＤＮＡとしてｐＫＫ２２３−３やｐＫＫ２３３−２
（ファルマシア・ジャパン社製）をあげることかできる
。マグロ成長ホルモンをコードするＤＮＡとベクターＤ
ＮＡとの組換え体は一般的な方法である制限酵素やその
関連酵素により作成することがてき、例えば、シグナル
部分を除いたマグロ成長ホルモンをコードする遺伝子Ｄ
ＮＡを含む組換え体プラスミド（ｐＴＥＳ ８ Ｓ）を
作成する。
次に発現ベクターとしては、ｐＫＫ２２３−３の複製開
始点を９０Ｃ１９に置換させてなるｐＵＫｌを使用し、
これに上記した成長ホルモンをコードするＤＮＡを含む
ｐＴＥＳ ８ Ｓを挿入する。これを更に、非翻訳領域
の除去、末端平滑化した後、結合して、成熟クロマグロ
成長ホルモンをコードするプラスミドｐＵＥＳ１３Ｓを
作成する。
始点を９０Ｃ１９に置換させてなるｐＵＫｌを使用し、
これに上記した成長ホルモンをコードするＤＮＡを含む
ｐＴＥＳ ８ Ｓを挿入する。これを更に、非翻訳領域
の除去、末端平滑化した後、結合して、成熟クロマグロ
成長ホルモンをコードするプラスミドｐＵＥＳ１３Ｓを
作成する。
これと同様に処理して、マグロ成長ホルモン遺伝子を２
個含むプラスミドＩ）ＵＥＳ１３Ｓ−２を作成する。
個含むプラスミドＩ）ＵＥＳ１３Ｓ−２を作成する。
これらのプラスミドを常法によって大腸菌ＪＭＩＯ９に
形質転換して形質転換体を作成する。これらのプラスミ
ドｐＵＥｓ１３ｓ、 ｐＵＢｓ１３ｓ−２を含む大腸菌
（それぞれｐＵＥＳ １３ｓ／Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＪＭ１０９． ｐＵＥＳ１３Ｓ／Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）は、それぞれ
昭和６３年３月２２日、昭和６３年３月１６日付でそれ
ぞれＦＥＲＭ ＢＰ−１８０７，ＦＥＲＭ ＢＰ−１７
９９として工業技術院微生物工業技術研究所にブタペス
ト条約に基づく国際寄託をし、受託されている。
形質転換して形質転換体を作成する。これらのプラスミ
ドｐＵＥｓ１３ｓ、 ｐＵＢｓ１３ｓ−２を含む大腸菌
（それぞれｐＵＥＳ １３ｓ／Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＪＭ１０９． ｐＵＥＳ１３Ｓ／Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）は、それぞれ
昭和６３年３月２２日、昭和６３年３月１６日付でそれ
ぞれＦＥＲＭ ＢＰ−１８０７，ＦＥＲＭ ＢＰ−１７
９９として工業技術院微生物工業技術研究所にブタペス
ト条約に基づく国際寄託をし、受託されている。
このようにして得た組換え体プラスミドｐＵＥｓ１３Ｓ
、 ｐＵＥｓ１３−２を保持するＥ、ｃｏｌｉ ＪＭ
１０９を、例えば８％トリプトン、５％イーストエキス
トラクト、５％ＮａＣ１（ｐＨ７，２）を含むＹＴ培地
といった適宜培地で、３０分〜１０時間程度誘導培養す
れば、目的とするポリペプチドが産生される。目的とす
るポリペプチドが菌体外に産生される場合は直ちに常法
によりポリペプチドを採取することができるが、菌体内
に産生される場合は、集菌した後、菌体を破壊ないし溶
解する必要がある。
、 ｐＵＥｓ１３−２を保持するＥ、ｃｏｌｉ ＪＭ
１０９を、例えば８％トリプトン、５％イーストエキス
トラクト、５％ＮａＣ１（ｐＨ７，２）を含むＹＴ培地
といった適宜培地で、３０分〜１０時間程度誘導培養す
れば、目的とするポリペプチドが産生される。目的とす
るポリペプチドが菌体外に産生される場合は直ちに常法
によりポリペプチドを採取することができるが、菌体内
に産生される場合は、集菌した後、菌体を破壊ないし溶
解する必要がある。
このマグロの成長ホルモンポリペプチドのアミノ酸配列
は第１図の通りである。
は第１図の通りである。
このようにして得た成長ホルモンポリペプチドを塩酸グ
アニジンで処理し、該成長ホルモンポリペプチドを活性
型とする。この処理は上記工程のいずれにおいて行って
も良く、また、その回数も問わない。また、この処理は
該ポリペブチの分離、精製時、例えばクロマトグラフィ
ーの展開時、溶出時に行ってもよい。これらの処理にお
ける塩酸グアニジン溶液の濃度は、特に限定はないが好
ましくは０．１〜２０Ｍ程度がよい。
アニジンで処理し、該成長ホルモンポリペプチドを活性
型とする。この処理は上記工程のいずれにおいて行って
も良く、また、その回数も問わない。また、この処理は
該ポリペブチの分離、精製時、例えばクロマトグラフィ
ーの展開時、溶出時に行ってもよい。これらの処理にお
ける塩酸グアニジン溶液の濃度は、特に限定はないが好
ましくは０．１〜２０Ｍ程度がよい。
次に塩酸グアニジン処理した活性型の成長ホルモンポリ
ペプチドを疎水性基を固定した担体に吸着させる。塩は
吸着しないので、樹脂を水で洗浄し塩を除去する。次に
、水溶性有機溶媒で吸着している活性型成長ホルモンポ
リペプチドを溶離させる。疎水性基を固定した担体は、
例えば、直鎖アルキル基−（ＣＨ２）、 −ＣＨＩ（、
、＝１．３．５．７．９）やアミノアルキル基−（ＣＨ
２）。−ＮＨｚ（、＝２．４．６．８．１０）あるいは
フェニル基を導入した親水性ポリマーあるいはアガロー
スゲルまたはセファビーズを用いる。
ペプチドを疎水性基を固定した担体に吸着させる。塩は
吸着しないので、樹脂を水で洗浄し塩を除去する。次に
、水溶性有機溶媒で吸着している活性型成長ホルモンポ
リペプチドを溶離させる。疎水性基を固定した担体は、
例えば、直鎖アルキル基−（ＣＨ２）、 −ＣＨＩ（、
、＝１．３．５．７．９）やアミノアルキル基−（ＣＨ
２）。−ＮＨｚ（、＝２．４．６．８．１０）あるいは
フェニル基を導入した親水性ポリマーあるいはアガロー
スゲルまたはセファビーズを用いる。
水溶性有機溶媒は、例えば、メタノール、エタノール、
イソプロパツール、アセトニトリル等である。溶離液の
濃度は、特に限定はないがそれぞれ１０％から１００％
程度が好ましい。
イソプロパツール、アセトニトリル等である。溶離液の
濃度は、特に限定はないがそれぞれ１０％から１００％
程度が好ましい。
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。
実施例１ 大腸菌で産生じたマグロ成長ホルモンの精製
菌体９０ｇ（１８Ｉ！培養液）を２０ｍＭ （２，４ｇ
） ）リス塩酸、５０ｍＭ（２，９ｍｇ）塩化ナトリウ
ム、ｐＨ８，０溶液、２６０−に懸濁し、水冷中でダイ
ノミル処理し、遠心分離した（１５０００ｇ 、３０分
間、４°Ｃ）。得られた沈澱物は水に懸濁し、遠心分離
した（１５０００ｇ 、３０分間、４°Ｃ）。沈澱物は
２０ｍＭ（２，４ｇ） ）リス塩酸、５０ｍＭ（１８，
６ｇ） ＥＤＴＡ、 ０．０２％（３０ｍｇ）リゾチウ
ム、ｐＨ８，０溶液、１５０−を加え２３°Ｃで１時間
攪拌した。
） ）リス塩酸、５０ｍＭ（２，９ｍｇ）塩化ナトリウ
ム、ｐＨ８，０溶液、２６０−に懸濁し、水冷中でダイ
ノミル処理し、遠心分離した（１５０００ｇ 、３０分
間、４°Ｃ）。得られた沈澱物は水に懸濁し、遠心分離
した（１５０００ｇ 、３０分間、４°Ｃ）。沈澱物は
２０ｍＭ（２，４ｇ） ）リス塩酸、５０ｍＭ（１８，
６ｇ） ＥＤＴＡ、 ０．０２％（３０ｍｇ）リゾチウ
ム、ｐＨ８，０溶液、１５０−を加え２３°Ｃで１時間
攪拌した。
さらに、１０％（４１４，６ｇ）デイオキルコール酸ナ
トリウム溶液、３０−を最終濃度が２％溶液になるよう
に加え、２３°Ｃで１時間攪拌した。最後に、総容量の
２倍量のメタノール溶液、３６０ ｍｌを加え、２３℃
、２時間攪拌した。溶液は遠心分離（１５０００ｇ 、
３０分間、４°Ｃ） Ｌ、上溝を除去した。沈澱物は
組み換え成長ホルモン封入体で収量は５０ｇ（肉蛋白含
量：８、６ｇ）であった。
トリウム溶液、３０−を最終濃度が２％溶液になるよう
に加え、２３°Ｃで１時間攪拌した。最後に、総容量の
２倍量のメタノール溶液、３６０ ｍｌを加え、２３℃
、２時間攪拌した。溶液は遠心分離（１５０００ｇ 、
３０分間、４°Ｃ） Ｌ、上溝を除去した。沈澱物は
組み換え成長ホルモン封入体で収量は５０ｇ（肉蛋白含
量：８、６ｇ）であった。
実施例２ 大腸菌で産生じたマグロ成長ホルモンの封入
体の再生と精製 実施例１で得られた組み換え成長ホルモン封入体５０ｇ
（肉蛋白含量：８．６ｇ）に１０ｍＭ ）リス塩酸（１
，２ｇ）、 ６Ｍ塩酸グアニジン（５７３ｇ）、ｐＨ８
，０溶液、７．２１量）を加え２３°Ｃ１２日間、攪拌
した。この溶液を遠心分離後、水で平衡化したＦＰ−Ｏ
Ｔ １３樹脂（三菱化成）、４．３１にｒ−ｔＧＨ濃度
を２０００ ｐｐｍとして添加し、２３℃、１晩、攪拌
した。ＦＰ−ＯＴ １３をｐＨ７゜０または０．１Ｍ硝
酸銀溶液でクロライドイオンか検出されなくなるまで水
で洗浄し塩を除去した。吸着した組み換え成長ホルモン
は３０％イソプロパツール溶液、４．３ｉ’で溶出させ
凍結乾燥した。収量は５５５ｍｇであった。
体の再生と精製 実施例１で得られた組み換え成長ホルモン封入体５０ｇ
（肉蛋白含量：８．６ｇ）に１０ｍＭ ）リス塩酸（１
，２ｇ）、 ６Ｍ塩酸グアニジン（５７３ｇ）、ｐＨ８
，０溶液、７．２１量）を加え２３°Ｃ１２日間、攪拌
した。この溶液を遠心分離後、水で平衡化したＦＰ−Ｏ
Ｔ １３樹脂（三菱化成）、４．３１にｒ−ｔＧＨ濃度
を２０００ ｐｐｍとして添加し、２３℃、１晩、攪拌
した。ＦＰ−ＯＴ １３をｐＨ７゜０または０．１Ｍ硝
酸銀溶液でクロライドイオンか検出されなくなるまで水
で洗浄し塩を除去した。吸着した組み換え成長ホルモン
は３０％イソプロパツール溶液、４．３ｉ’で溶出させ
凍結乾燥した。収量は５５５ｍｇであった。
この凍結乾燥物は、０．１％トリフロロ酢酸に溶解後１
．ｃｚＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ Ｃｌ８（１９，ＯＸ
１５０ｍｍ、 ５ μｍ）逆相高速液体クロマトグラ
フィーに付した。溶出溶媒系としてアセトニトリル−〇
、１％ＴＦＡを用いた。
．ｃｚＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ Ｃｌ８（１９，ＯＸ
１５０ｍｍ、 ５ μｍ）逆相高速液体クロマトグラ
フィーに付した。溶出溶媒系としてアセトニトリル−〇
、１％ＴＦＡを用いた。
溶出条件はアセトニトリル濃度３５％か、ら６５％への
リニアグラジェントとし、流速を１７ｒＩｔｌ／ｍｉｎ
、カラム温度は４０°Ｃとした。溶出結果を第２図に示
す。
リニアグラジェントとし、流速を１７ｒＩｔｌ／ｍｉｎ
、カラム温度は４０°Ｃとした。溶出結果を第２図に示
す。
この結果、高純度の組み換え成長ホルモン、７５ｍｇを
得た。
得た。
実施例３ 大腸菌で産生じたマグロ成長ホルモンの性質
実施例１および２と同様に精製、再生した組み換え成長
ホルモンを５ＤＳ−ゲル電気泳動およびゲル濾過で分子
量を算定した結果、２２．０００であった。
ホルモンを５ＤＳ−ゲル電気泳動およびゲル濾過で分子
量を算定した結果、２２．０００であった。
等電点は７．１であった。
本発明により、微生物を用いて産生させた及び／又は抽
出した魚類の成長ホルモンポリペプチドを効率よく、大
量に活性型の分子にすることができる。
出した魚類の成長ホルモンポリペプチドを効率よく、大
量に活性型の分子にすることができる。
第１図は大腸菌で産生させたマグロ成長ホルモンポリペ
プチドのアミノ酸配列を示す図である。 第２図は凍結乾燥物の０．１％トリフロロ酢酸に溶解後
、アセトニトリル濃度３５％から６５％の勾配を用いて
、μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ Ｃｌ８（１９，０Ｘ １
５０ｍｍ、５μｍ）逆相高速液体クロマトグラフィーに
付した図である。 流速は１分間に１７−、カラム温度は４０°Ｃ１吸光度
は２１５ｎｍでおこなった。
プチドのアミノ酸配列を示す図である。 第２図は凍結乾燥物の０．１％トリフロロ酢酸に溶解後
、アセトニトリル濃度３５％から６５％の勾配を用いて
、μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ Ｃｌ８（１９，０Ｘ １
５０ｍｍ、５μｍ）逆相高速液体クロマトグラフィーに
付した図である。 流速は１分間に１７−、カラム温度は４０°Ｃ１吸光度
は２１５ｎｍでおこなった。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、第１図に示したペプチド配列を有する魚類の成長ホ
ルモンポリペプチドをコードするＤＮＡを組込んだ組み
換え体ＤＮＡを含む微生物を栄養培地に培養し、該培養
物中に魚類の成長ホルモンポリペプチドを蓄積せしめた
後、該培養物から塩酸グアニジンを用いて該ポリペプチ
ドを採取することを特徴とする魚類の成長ホルモンポリ
ペプチドの精製、再生法。 ２、微生物がエシュリヒア属に属する微生物である請求
項１記載の方法。 ３、魚類がスズキ魚群である請求項１又は２記載の方法
。 ４、スズキ魚群がマグロである請求項１、２又は３記載
の方法。 ５、魚類の成長ホルモンポリペプチド自体及び／又はそ
の製造、精製工程中に、塩酸グアニジン処理および疎水
性基を固定した担体処理を行うことを特徴とする魚類の
成長ホルモンポリペプチドの精製、再生法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23281790A JPH04112900A (ja) | 1990-09-03 | 1990-09-03 | 魚類の成長ホルモンポリペプチドの精製、再生法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23281790A JPH04112900A (ja) | 1990-09-03 | 1990-09-03 | 魚類の成長ホルモンポリペプチドの精製、再生法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04112900A true JPH04112900A (ja) | 1992-04-14 |
Family
ID=16945243
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23281790A Pending JPH04112900A (ja) | 1990-09-03 | 1990-09-03 | 魚類の成長ホルモンポリペプチドの精製、再生法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04112900A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0915101A4 (en) * | 1997-03-24 | 2002-09-18 | Hih Bioct Inc | NEW SYNTHETIC POLYPEPTIDE |
| KR100390529B1 (ko) * | 2000-04-25 | 2003-07-04 | 동원산업 주식회사 | 참치정소로부터 핵산복합물질을 추출하는 방법 및 이방법에 의해 얻어진 핵산복합물질 |
-
1990
- 1990-09-03 JP JP23281790A patent/JPH04112900A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0915101A4 (en) * | 1997-03-24 | 2002-09-18 | Hih Bioct Inc | NEW SYNTHETIC POLYPEPTIDE |
| KR100390529B1 (ko) * | 2000-04-25 | 2003-07-04 | 동원산업 주식회사 | 참치정소로부터 핵산복합물질을 추출하는 방법 및 이방법에 의해 얻어진 핵산복합물질 |
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