JPH04117400A - 酸性糖タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の利用分野） 本発明は、エリスロポエチンで免疫した動物の肺臓細胞
とミエローマ細胞とを細胞融合させたハイブリドーマ細
胞より得られたモノクローナル抗体に結合可能な特定の
酸性糖タンパク質に関する。

エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、貧血患者、手術後患者
、腎摘出後の人工透析患者に広く適用可能な医薬である
。

（従来技術と問題点） エリスロポエチンは、赤血球生成促進因子とも呼ばれ、
骨髄に存在する赤血球系前駆細胞に働いて、赤血球系細
胞への分化を促進させる一種のホルモンであり　主とし
て腎で生成されると考えられている。ＥＰＯ生成を調節
するのは、酸素需要供給のバランスであり、酸素欠乏状
態Ｓこ陥ると生成が亢進し、逆に、酸素過剰状態になる
と生成が減少する。例えば、貧血患者では、ＥＰ○生成
が増加し、ＥＰＯは尿に排泄されるようになる。ＥＰＯ
は市販されており、分子量３〜４万の酸性糖タンパク質
であるが、化学構造は完全には解明されていない。

ＥＰＯは、貧血患者、手術後患者、腎摘出後の人工透析
患者に広く適用可能な医薬である。また、高度に純化さ
れたＥＰＯは標準試薬として使用される。

尿中にＥＰＯが含まれていることは、前記のとおりであ
るが、その含量は極めて低く、全犀タンパク質中約０．
０１〜０．０２重量％程度とみられる。

このため、尿からＥＰＯを有効に得ることは困難であり
、通常のクロマト吸着法では、ＥＰＯを効率よく高純度
で採取することはできない。

（発明の知見と目的） 本発明者らは、特異抗体を結合させた吸着カラム（抗体
吸着カラム）を使用して、貧血患者の尿等から免疫特異
的にＥＰＯを製造する方法について検討を行ってきた。

カラムに使用する抗体を得るべく、部分精製ＥＰＯで免
疫したマウスの肺臓細胞とマウスミエローマ細胞とを融
合させ、モノクローナル抗ＥＰＯ抗体を産生ずるハイフ
リトーマ細胞を得た。このハイブリドーマ細胞が産生じ
た抗ＥＰＯ抗体を結合させて抗体吸着カラムを作製し、
これに貧血患者の尿タンパク質を通したところ、目的の
ＥＰＯが特異的に吸着され、収率よく高純度ＥＰＯを取
得てきた。そして、かかるモノクローナル抗体がハイブ
リトーマ細胞から安定的に得られることを知見した。し
かし、前述の方法で得られたＥＰＯは、わずかながら不
純物質を含有していた。そこで、−層純粋にＥＰＯを取
得すべく、さらに検討した結果、抗体吸着カラムによる
処理の後に、ゲル１過による分子量分画操作を加えた結
果、極めて純粋にＥＰＯを取得し得ることを知見した。

本発明は、この知見に基づき完成されたもので、本発明
の目的は、エリスロポエチンで免疫した動物の肺臓細胞
とミエローマ細胞とを細胞融合させたハイブリトーマ細
胞より得られたモノクローナル抗体に結合可能な特定の
酸性糖タンパク質を提供しようとするものである。

（発明の構成と効果） 本発明は下記のとおりである。

（１）　　エリスロポエチンで免疫した動物のＢｆｔ［
細胞とミエローマ細胞とを細胞融合させたハイブリドー
マ細胞より得られたモノクロール抗体に結合可能であり
、少なくとも約８８，０００　（単位／ｍｇタンパク質
）埼玉のエリスロボエヂン比活性を有し、５ＤＳ（ソジ
ウム　ドデシルサルフェート）ポリアクリルアミド上の
電気泳動で単一のハントを与える、分子量約３０，００
０〜４０．０００の酸性糖タンパク質。

（２）下記■〜■ ■ＰＢＳ　（燐酸緩衝食塩水）■５ｍＭ）リス塩酸緩衝
液■２００ｍＭ塩化ナトリウム含有りｎ＋Ｍトリス塩酸
緩衝液■４Ｍ塩化す）　ＩＪウム含有１０ｍＭ燐酸ナト
リウム緩衝液■１０ｍＭ水酸化ナトリウム、２０重量％
エチレングリコール水溶液及び６Ｍ塩酸グアニジンの混
合液■５ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液■５ｍＭ塩化カルシ
ウム水溶液■２０ｍＭ酢酸カルシウム緩衝液■２重量％
ＳＤＳ　（ソジウム　ドデシル　サルフェート）含有ト
リス塩酸緩衝液 の各法に溶解し、かつ、ジエチルアミノ　エチル（ＤＥ
ＡＥ）−セルロース、フェニルセファロースＣＬ−４Ｂ
及びＳＰ−セファデツクスに吸着され、ヒドロキシルア
パタイトに吸着されない特許請求の範囲（１）の酸性糖
タンパク質。

上記酸性糖タンパク質は、以下の特徴により特定するこ
とができる。

■　ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動で単一のハンド
を与え、分子量３０．０００〜４０．０００の位置に泳
動される。

■　マウス胎児肝細胞を用いたインビトロ法の３Ｈチミ
ジン法又は５９Ｆｅ法によるＥＰＯ活性測定で８８，０
００　（単位／ｍｇタンパク質）以上の値を示し、飢餓
ランド法によるインビボ活性は８１，６００（単位／ｍ
ｇタンパク質）の値を示す。

■　ＰＢＳ、５ｍＭ）リス−ＨＣｆ　　（ｐＨ６，８）
　Ｗ衝液、２００ｍＭ　ＮａＣｌ２を含む５ｍＭ）リス
−Ｈｃ／２　（ｐＨ６，８）緩衝液、４ＭＮａＣｆを含
む１０ｍＭ燐酸ナトリウム（１）Ｈ６，８）　ＩＩ衝液
、１０ｍＭ　Ｎａ０ｔｌ　＋２０重量％エチレングリコ
ール＋６Ｍ塩酸グアニジンの混合物、５１！！Ｍ燐酸ナ
トリウム（ｐＨ６，９）緩衝液、５ｍＭ　ＣａＣ４２ｚ
（ｐＨ７，０）水溶液、２０ｍＭ酢酸カルシウム（ｐＨ
５，５）緩衝液及び２重量％ＳＤＳ含有トリスーＨ１（
ｐＨ６，８）　ｙ衝液に溶解Ｌ、ＤＥＡＥ−セルロース
、フェニルセファロースＣＬ−４Ｂ及びＳＰ−セファデ
ックスに吸着され、ヒドロキシルアパタイトに吸着され
ない。

（４）抗エリスロポエチン抗体に結合性を有す。

本発明のタンパク質を得るためには、ＥＰＯを特異的に
吸着させ、これを吸着画分として取得するアフィニティ
ークロマト法と、ゲル濾過による分子量分画法とをこの
順序に組み合わせた方法を適用する。この順序を逆にし
て、ゲル濾過の後にアフィニティークロマト法を行って
も、ＥＰＯを純粋に取得することはてきない。上記方法
によれば、使用吸着支持体に結合させた抗体がモノクロ
ーナル抗体であるから、抗体に同一の性質を持たせるこ
とができ、さらにＥＰＯを免疫特異的に吸着し、溶出す
るため、貧血患者尿等から高純度のＥＰＯを効率よく製
造することができる。

上記方法では、モノクローナル抗体の結合した吸着剤が
使用される。そして、このモノクローナル抗体は、ハイ
ブリドーマ細胞より産生される。

モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞は、
ＥＰＯｌ例えば貧血患者尿より精製したＥＰＯで免疫し
た実験動物の肺臓細胞とミエローマ（骨髄腫）細胞とを
細胞融合して作られる。この場合の実験動物は、例えば
、マウスやラット等であり、細胞融合は、同種の動物の
細胞間で行わせるのが好ましい。例えば、マウスの肺臓
細胞とマウスのミエローマ細胞との間で細胞融合させる
。

ミエローマ細胞は、悪性ｕ！Ｉｍの一種であって増殖性
に冨む細胞である。

マウスに対する免疫（抗原抗体反応）は、ＥＰＯｌ例え
ば貧血患者の尿より部分精製したＥＰＯ標品を抗原とし
て使用し、これをマうスに投与して行う。ここで抗原と
して使用されるＥＰＯ標品は次のようにして得られたも
のであってもよい。

すなわち、ハイブリドーマ細胞を作製し、それから得ら
れた抗体を結合してなる吸着カラムに貧血患者尿を通し
て逆相クロマトに付し未吸着画分としてＥＰＯを得る。

マウスへの抗原投与は、通常、腹腔内注射により行われ
、免疫を十分に進めるため、例えば２週間の間隔をあけ
て、数回注射をする。注射液は、前記の精製ＥＰ○タン
パク質を例えばＰＢＳと呼ばれる燐酸塩緩衝食塩水に溶
解し、これにフロイントのアジュバントを混合して、エ
マルジョンを形成させて調製する。

このようにして免疫したマウスから、免疫処理終了後、
約３日後に、肺臓を摘出し、このＩｌｌ臓細胞（主にＢ
細胞）と、別に調製したマウスのミエローマ細胞との間
で細胞融合を行わせる。マウスのミエローマ細胞として
は、Ｐ３　　Ｘ６３　　Ａｇ８Ｐ３−ＮＳＩ／　１−Ａ
ｇ４−１　、　Ｘ６３−八ｇ８６５３などを培養して増
殖させたものを使用する。

細胞融合は、公知の技法に従って行われる。通常、ペニ
シリン１００単位／　ｍｌ及びストレプトマイシン１０
０μｇ　／　ｍｌさらに２ｍＭ　　グルタミン、ｌｌＴ
ＩＭ　　ピルビン酸を添加したＲＰＭＩ　　１６４０合
成培養液（以下ＲＰＭＩ　　１６４０液と記す）と牛胎
児血清（Ｆｅ２）との混合液中で前記ｌｐ１臓組織組織
断し、単細胞化した後、ＲＰＭＩ　　１６４０液に分散
し、これに前記ミエローマ細胞を混合し、遠心後、上清
を除去した混合細胞に対し、細胞融合剤のポリエチレン
グリコール１５００の５０重量％溶液を添加して細胞融
合させる。

かくして作られた融合細胞の中から雑種の、いわゆるハ
イブリドーマ細胞を公知のＨＡＴ選択によって選び出す
。

ＨＡＴ選択は、マイクロタイタープレートを使用して行
うことができる。例えば、同種及び雑種の融合細胞を９
６穴マイクロタイタープレート上にまいて、ＨＡＴ　（
ヒボキサンチン−アミノプテリン−チミジン）培養液で
培養を行い、約２週間後、ハイブリドーマが死滅しない
で増殖している穴を確認し、ハイブリドーマを得る。

次に、かくして選ばれたハイブリドーマについて、ＥＰ
Ｏと特異的に結合する抗体を産生ずるか否かをソリッド
フェーズ法にて検定した後、さらに本ハイブリドーマを
マウス腹腔内に移植して腹水を発生させ、腹水から、公
知の方法、例えば硫安分画法及びイオン交換カラムクロ
マト法により、免疫グロブリン（ＴｇＧ）を得る。この
抗体を吸着剤に結合させ、得られた抗体結合吸着剤をカ
ラムに充填し、抗体吸着カラムを作製し、このカラムに
、ＥＰＯ標品を通し、ＥＰＯの吸着能を調べ、ハイブリ
トーマが抗ＥＰＯ抗体を産生ずるか否かを検定する。こ
の目的に使用される吸着剤としては、例えば、アフィゲ
ル（バイオラント社製）、セファデンクス（ファルマシ
ア社製）かある。このようにして得られた抗ＥＰＯ抗体
産生ハイブリドーマは、さらに公知の限界希釈法により
、モノクローン化を行う。抗ＥＰＯ抗体の産生能は、前
記のソリッドフェーズ法及び抗体吸着カラムへのＥＰＯ
の吸着能で検定を行う。この中から、安定してモノクロ
ーナル抗体を産生ずる細胞を選出する。この細胞は、凍
結保存が可能であるので、必要に応じて融解してマウス
の腹腔内に移植すればよく、この点、必要な抗体を永続
的かつ安定的に供給することができ好都合である。

以上のようにして選出した、モノクローナル抗ＥＰＯ抗
体産生ハイブリドーマ細胞により、前記と同様にして、
マウス腹腔内で生産させたモノクローナル抗ＥＰＯ抗体
を精製した後、吸着支持体に結合し、抗体結合吸着剤を
作製する。これを原料のＥＰＯ含有物、好ましくは、貧
血患者の尿又はその処理物と接触させ、ＥＰＯを吸着さ
せ、次いで溶出し、吸着画分としてＥＰＯを取得する。

本ＥＰＯ液を凝縮した後、ゲル濾過に付し、高分子の不
純物質を除去して純粋なＥＰＯを取得する。

原料であるＥＰＯ含有物としては、正常人尿、若しくは
、貧血患者尿、又は、その各処理物、或は、ＥＰＯ産生
細胞の培養上清液、又は、ＥＰＯ産生細胞移植動物の体
液、組織抽出液、若しくは、尿などが挙げられる。例え
ば、尿中のプロテアーゼを失活させるため、予め、フェ
ノール処理又は加熱処理を行ってもよい。また、好まし
くは、５ＤＳ（ソジウム　ドデシル　サルフェート）処
理を行う。

ＥＰＯは、アフィ′ニティークロマト法の通常の技法に
より取得することができる。吸着カラムを使用する場合
には、前記の尿処理液をカラムに通し、ＥＰＯを吸着し
、溶出液としてＥＰＯを取得する。以上のごとき抗体吸
着法では、モノクローナル抗ＥＰＯ抗体がＥＰＯを特異
的に吸着する結果、カラムを１回通すだけで、溶出液と
してＥＰＯを特異的に高純度で効率よく取得することが
できる。

この高純度ＥＰ○は、しかし、いくばくかの不純タンパ
ク質を含んでいるが、さらに木簡純度ＥＰＯ溶液をａ縮
した後、ゲル濾過に付すと、高分子の不純タンパク質を
取り除くことができ、−層純粋なＥＰＯを効率よく取得
することができる。

ＥＰＯの純度は、液中のタンパク質のＥＰ○活性（単位
）を測定することにより決めることができる。ＥＰ○活
性の測定法としては、マウス胎児肝細胞を用い赤血球系
コロニーを形態学的に観察するコロニー法、３Ｈ−チミ
ジンのＤＮＡへの取り込み率をインビトロで調べる３Ｈ
−チミジン法、Ｓ’１ｐｅ−ヘムへの取り込み率をイン
ヒドロで調べる５ｌｉｐｅ法、飢餓状態にしたラットに
おいて５９ｐｅのヘムへの取り込み率をインビボで調べ
る飢餓ラット法等が知られている。後記のＥＰＯ活性は
、５ＱＦｅ法、３Ｈ−チミジン法又は飢餓ラット法で測
定されたものである。ＥＰＯ測定の標準物質としてはフ
ェニルヒドラジン処理した貧血ヒツジの血漿から調製さ
れたＥＰＯ（カナダ、コンノート社製、エリスロポエチ
ンステップ３）を用いることができる。

ケル濾過を最終の工程で行うことにより、得られるＥＰ
Ｏの純度は格段に向上しており、この製品ＥＰ○は、医
薬品としてのみならす、臨床検査時の標準試薬としても
有用なものである。すなわち、本製品ＥＰＯは、骨髄細
胞のｐｎ床検査における赤血球系前駆細胞分析用標準試
薬として用いられ、このものは下記第１表に示すように
、比活性で表わした純度が従来の市販品に比し極めて高
い。

第　　　１　　　表 赤血球系前駆細胞の分析に従来の市販品をＥＰ○標品と
して用いた場合、不純物質による悪影響が現われ、結果
は良好なものではなかった。これに対し、本製品ＥＰＯ
は、高純度のゆえに標準試薬として好結果を与え、極め
て有効なものである。

また、血清等の体液や組織；こおけるＥＰ○レヘルの測
定は、ラジオイムノアッセイ又は赤血球凝集■止反応に
よりウサギで作製した抗ＥＰＯ抗体を用いて行われるが
、この抗体作製に従来の市販品を使用すると低純度のゆ
え己こ有効な抗ＥＰＯ抗体が得られず、したかって、良
好な測定結果：ま得られなかった。このような免疫学的
ＥＰ○レヘル測定に高純度の本製品ＥＰＯを使用すると
、良好な結果が得られる。

次に、本発明の酸性糖タンパク質を得る製造例を示す （Ａ）実験動物の　疫に使用するＥＰＯの調製貧血患者
の尿６００ｆｆを限外濾過装置に通し、分子量１０，０
００までの低分子物質を除去することにより濃縮を行い
、さらに水を加えて同様に濃縮することにより脱塩を行
った。得られた尿濃縮液２０！を凍結乾燥して全尿タン
パク質粉末３１．０ｇ（ＥＰＯ活性１，８００，０００
単位／３１．０ｇ）を得た。（なお、タンパク質量は、
以下の操作を含め、卵白アルブミンを標準タンパク質と
して、バイオラッド社製プロティンアッセイキットによ
り測定した。） （第１回クロマト］ この粉末を５ｍＭｈリスー）ＩＣｆｆｉ　（ｐＨ６，８
）　１１衝液に溶解し、予め５ｍＭトリス−ＨＣｆｆ　
（ｐ）１６．８　）緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セル
ロース充填カラムに通して尿タンパク質を吸着させた後
、２００ｍＭ　ＮａＣｌ２を含む５ｍＭ）リス−ＨＣｆ
ｆ１　（ｐＨ６，８）緩衝液で溶出し、ＥＰＯ活性画分
を得た。

このものに含まれるタンパク質は、１６．０　ｇであり
、ＥＰＯ比活性は、９９（単位／ｍｇタンパク質）であ
った。

〔第２回クロマト〕 得られた前記ＥＰＯ活性画分を水に対し透析し、透析物
を凍結乾燥して粉末を得た。この粉末を１０ｍ−燐酸ナ
トリウム（ｐ！（６，８）と４ＭＮａＣＱからなる緩衝
液に溶解し、予め１０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ６，８
）と４ＭＮａＣｊ２からなる緩衝液で平衡化したフェニ
ルセファロースＣＬ４Ｂ充填カラムに通して、タンパク
質を吸着させた後、１０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐ１１７
．１　）と０．５ＭＮａＣｊ２からなる緩衝液で洗浄し
、次いでｌＱｍＭＮａ叶、２０重量％エチレングリコー
ル及び６Ｍ塩酸グアニジンからなる混合液で溶出し、Ｅ
Ｐ○活性画分を得た。このものに含まれるタンパク質は
２．３ｇであり、ＥＰＯ比活性は、４２１（単位／ｍｇ
タンパク質）であった。

（第３回クロマト〕 得られた前記ＥＰＯ活性画分を水に対して透析し、透析
物を凍結乾燥させて粉末を得た。このものを５ｍＭ燐酸
ナトリウム（ｐＨ６，９）緩衝液に熔解し、同じ緩衝液
に対し透析した。予め５ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ６，
９）緩衝液で平衡化したヒドロキシルアパタイト充填カ
ラムに前記透析溶液を通し、非吸着画分を得た。このも
のに含まれるタンパク質は６７２ｍｇであり、ＥＰＯ比
活性は１　、２４０　（単位／ｍｇタンパク質）であっ
た。

〔第４回クロマト〕 得られた前記ＥＰ○活性画分（非吸着画分）を水に対し
透析じ、透析物を凍結乾燥して粉末を得た。このものを
１０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ６，９）と１５０ｍ門Ｎ
ａＣｆ２からなる緩衝液に溶解した。予め、前記と同し
緩衝液で平衡化したセファデックスＧ１００充填カラム
に、前記溶液を通し、分子量による分画を行い、ＥＰＯ
活性画分を得た。このものに含まれるタンパク質は８３
ｍｇであり、ＥＰＯ比活性は３，０００（単位／ｍｇタ
ンパク質）であった。

〔第５回クロマト〕 前記ＥＰＯ活性画分を水に対して透析した後、透析物を
凍結乾燥して粉末を得た。このものを５ｍＭ　ＣａＣｊ
２ｚ（ｐＨ７，０）水溶液に溶解した後、同じ水溶液に
対し透析し、次いで０．１ＮＨＣＪ２でｐＨ４，５に調
製した。予め５ｍＭ　ＣａＣｌ２（ｐＨ４，５）水溶液
で平衡化したＳＰ−セファデックス充填カラムに、前記
調製後の液を通し、タンパク質を吸着後、５ｍＭ酢酸カ
ルシウム（ｐＨ４，５）緩衝液で洗浄し、次いで、２０
ｍＭ酢酸カルシウム（ｐ＋＋５．５）緩衝液で溶出し、
ＥＰＯ活性画分を得た。

このものに含まれるタンパク質は１６にであり、ＥＰＯ
比活性は５，１００（単位／ｍｇタンパク質）であった
。

［第６回クロマト］ 前記ＥＰ○活性画分を、予めＰＢＳで平衡化したセファ
デックス０５０充填カラムに通した後、前記の緩衝液で
展開してＥＰＯ活性画分を得た。この液を後記の抗体結
合吸着カラムに通して逆相クロマトに付し、未吸着画分
を得た。

このものに含まれるタンパク質は４■であり、ＥＰＯ比
活性は、２５０００　Ｃ単位／ｍｇタンパク質）であっ
た。

前記カラムは次のようにして作った。すなわち、第５回
クロマト後のＥＰＯ標品で免疫したマウスを用いて本発
明方法の前半部分に準してハイブリドーマ細胞を作製し
、これより得られる抗体のうちから、ＳＤＳ電気泳動を
作ったとき、ＥＰ○活性に近接して低分子量側に見出さ
れる免疫力の高い主要タンパク質と結合するところの抗
体を選び出し、この抗体をアフィゲル１０（バイオラン
ト社製）に結合させて抗体結合吸着カラムを作った。

（ＳＤＳ電気泳動によるＥＰＯの精製］得られたＥＰ○
活性画分（未吸着画分）を水に対し透析し、透析物を凍
結乾燥して粉末を得た。このものを２重量％ＳＤＳを含
むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ６，ｓ＞に溶解し、常法に
より、１３％ポリアクリルアミドゲルＳＤＳ電気泳動を
行い、ＥＰＯ活性画分のゲルを切り出した。

ゲルに対し３倍量のＰＢＳを添加し１、ゲルを磨細しな
。このものに含まれるタンパク質は１．２■であり、Ｅ
ＰＯ比活性は５０，０００　（単位／ｍｇタンパク質）
であった。抽出液を水に対し透析した後、凍結乾燥して
粉末を得た。

（Ｂ）目的物エリスロポエチンの製造 〔マウスの免疫］ 前記のＳＤＳ電気泳動精製ＥＰＯの標品を抗原として使
用し、マウス（Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス）に対し
次のとおり３回の免疫を行った。

第１回　　ＰＢＳ（ＩＪン酸塩緩衝食塩水）中に精製Ｅ
ＰＯタンパク質を２００１Ｉｇ Ｚ戚で溶解し、これにフロイント完 全アジュバントを混合して得たエマ ルジョンをマウスに対し、０．５戚 （ＥＰＯタンパク質５０μｇ）を腹 腔的注射で投与した。

第２回−ＰＢＳ中に精製ＥＰＯタンパク質１００μｇ　
／　ｍＲで熔解し、これにフロイント完全アジュバント
を混合し て得たエマルジョンを２週間後にマ ウスに対し、０．５ｍｆ（ＥＰ○タンパク質２５μｇ）
を腹腔的注射で投与 した。

第３回−ＰＢＳ中に精製ＥＰＯタンパク質５０μｇ／ｒ
ｎｆｌで溶解した液をさらに２週間後にマウスに対し、
０．５ｍ１ （ＥＰＯタンパク質２５μｇ）を腹 腔的注射で投与した。

〔細胞融合〕

前記免疫処理終了から３日後に、免疫マウスの肺臓細胞
を無菌的に摘出し、合成培養液ＲＰＭｌ　　１６４０液
と１５％生胎児血清（Ｆｅ２）との混合液で洗浄後、該
混合液中で、牌Ｒ組織をハサミで細断して単細胞化を行
い、該混合液で２回洗浄した後、単細胞化した細胞をＲ
ＰＭＴ　　１６４０液に分散した。細胞数は、２．０×
１０ｅ個であった。

別に、マウスのミエローマ細胞（Ｎ３−ＮＳ１　／　１
−Ａｇ４−１　）を前記ＲＰＭＩ及びＦｅ２の混合液中
で培養し、増殖した細胞をＲＰＭ１１６４０液で洗浄し
た。細胞数は１．０Ｘ１０８個であった。

次に、前記で調製した免疫マウスＮ１ｔｉｉ＆細胞とマ
ウスミエローマ細１：をＲＰＭＴ　　１６４０液に分散
し、混合した後、遠心し、上清を除去した。混合細胞を
、ポリエチレングリコール１５００の５０重量％溶液中
で細胞融合させた後、融合細胞群をＨＴ培養液（ヒボキ
サンチン、チミジン及び１５重量％牛脂児血清を含むＲ
ＰＭｌ　　１６４０液）に混合し、混合液を３枚の９６
六マイクロタイタープレートにまいて、２日目以陳、Ｉ
（ＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミ
ジン及び１５重量％牛脂児血清を含むＲＰＭＩ　　１６
４０液）を添加して、各穴で２週間培養してＨＡＴ選択
を行った。増殖したハイブリトーマ細胞を２６４穴にお
いて確認した。

〔抗体産生細胞の選択］ 前記で得た２６４種類のハイブリドーマより、特定の細
胞、すなわち、精製ＥＰＯ標品と特異的に結合しうる抗
体を産生ずるハイブリトーマを選び出すために、ビオチ
ン−アビジンシステムを用いるソリッドフェーズ法によ
り、スクリニングを行った。その結果、目的に適合した
ものとして、１９種類の細胞が選出され、そのうち７種
類が安定的に抗体産生を行うことを認めた。

（ＥＰ○吸着能による抗ＥＰＯ抗体産生細胞の選択〕 前記７ｓ類の各細胞を用いて抗体吸着カラムを作製し、
ＥＰＯ活性の吸着能を検定し、抗ＥＰＯ抗体産生細胞の
選択を行った。

すなわち、それぞれの細胞について７匹のマウスに対し
、１つの種類の細胞をマウス１匹当り、５Ｘ１０６個腹
腔内に注射して抗体を産生させた後、マウスから腹水を
採取し、これを４５％飽和硫安水溶液で硫安分画に付し
た後、ＤＥ５２　（ＤＥＡＥ−セルロース）充填カラム
に通し、免疫グロブリン（Ｔ　ｇ　Ｇ）　２０〜３０ｍ
ｇを得た。前記で得られたＩｇＧ画分をアフィゲル１０
（バイオラッド社製）と結合し、抗体吸着カラムを作製
した。すなわち、アフィゲル１０をガラスフィルター上
で氷水冷却下イソプロパツールで洗浄し、さらに氷水で
３回洗浄し、ゲルを回収した。このゲルと、前記で得た
抗体を含む液（０，２Ｍ　ＮａＨＣＯ：＋　ｐＨ８，３
０，３Ｍ　ＮａＣｊ２）とを等容量で混合し、４　’Ｃ
で５時間撹拌しながら結合反応を行わせた。反応後、ゲ
ルを遠心回収した。このものを０．　Ｉ　Ｍ　Ｎａ）Ｉ
ｃＯ：＋　と０．１５　ＭＮａ（、ｅとの混合液で２回
洗浄した後、０．１Ｍエタノールアミン−塩酸塩（ｐＨ
８）と室温で１時間よく混合して、抗体結合ゲルを得た
。このゲルをカラムに充填して、抗体吸着カラムを作製
した（７種類のハイブリトーマにつき各１本、合計７本
）。ここで得た７本の抗体吸着カラムに対して、前記精
製ＥＰ○標品を用い、ＥＰＯ活性吸着能を検定した。

すなわち、ＥＰＯ標品をＰＢＳに溶解し、この液を、予
めＰＢＳで平衡化した前記吸着カラムに通した。溶出は
０．２Ｍ酢酸と０．１５Ｍ　Ｎａ（、ｆ２との混合液で
行い、未吸着画分及び溶出画分のＥＰ○活性を測定した
。ここで得た７種のカラムのうち３種類についてＥＰＯ
活性の吸着を認めた。

〔抗ＥＰＯ抗体産生細胞のクローニング〕前記３種類の
抗ＥＰ○抗体産生ハイブリトーマについて、常法に従い
、限界希釈法により、クローニングを行った。

すなわち、ハイブリドーマ細胞５０個と４週令ＢＡＬＢ
／ｃマウスの胸腺より常法により調製した胸腺細胞１０
ｅ個をＲＰＭＩ　　１６４０液と１５重量％ＦＣ３との
混合液１０ｍ１に分散し、９６穴マイクロタイタープレ
ートの各人に０、１　ｍｆｌずつまき、５日目及び１２
２日目ＲＰＭｌ　　１６４０液と１５重量％ＦＣ３の混
合液（培養液）を添加し、増殖したハイブリドーマ細胞
について前記と同様にしてソリシトフェーズ法による抗
ＥＰＯ抗体産生細胞のスクリーニングを行い、さらにＥ
ＰＯ吸着能による抗ＥＰＯ抗体産生細胞の選択を行いク
ローニングを行った。このようにして、前記３種類の抗
ＥＰＯ抗体産生ハイブリドーマよりそれぞれ細胞株Ｅ１
、Ｅ−２、Ｅ−３を樹立した。

（モノクローナル抗ＥＰＯ抗体の産生〕前記のクローニ
ングにより得た抗ＥＰＯ抗体産生細胞株（Ｅ−２）を用
いて、抗体産生を行った。すなわち、前記と同様に、マ
ウスの腹腔内で抗体を産生させ、４５重量％硫安分画に
付した後、ＤＥ５２（ワットマン社製、ＤＥＡＥセルロ
ース）充填カラムに通し、未吸着両分として精製免疫グ
ロブリン（ＩｇＧ）を得た。

マウス２５０匹を用い、７５０■の精製モノクローナル
抗体を得た。

（抗体吸着カラムの作成］ 前記と同様の操作でＩｇＧとアフィゲル１０との間で結
合を行わせ、２０ｍ１の抗体結合ゲルを得た。なお、本
ゲルにはＩｇＣ；７１０ｍｇか結合した。このゲルをカ
ラムに充填し、吸着カラム（３，２ａｍ　Ｘ　２．５　
ｃｍ　）を作製した。

［ＥＰＯの取得］ 原料液を調製するため、前記限外濾過装置を用いて７０
０１の貧血患者尿より、調製した全尿タンパク質粉末３
４　ｇ　（７９２，０００単位）をＰＢＳ　　７００１
ｄに溶解し、外液６０ｊ２のＰＢＳに対し、１夜透析を
行い、遠心後得られた上清液に、２重量％ＳＤＳとなる
ようにＳＤＳ粉末を添加した。１００°Ｃで３分間加熱
した後、４°Ｃに冷却した。そしてＯ″Ｃで１晩放置し
た後遠心目によりＳＤＳを除去し、上清液７００戚を得
た。次に、４°Ｃで以下のカラム操作を行った。

前記で作成した抗体吸着カラム（３，２ｃｍ　ｘ２、５
　ｃｍ床容量２０ｄ）　ＰＢＳ　２００ｍｆｔを７０緘
／ｈｒで流し、次いで、０．２Ｍ酢酸と０．１５　ＭＮ
ａＣｊ２との混合液５００　ｍｆｌを同し流速で洗浄し
た後、さらにＰ　Ｂ　Ｓ　２００　ｍａｌを同様に流し
、平衡化した。

このように前処理した吸着カラムに前記で調製した原料
液７００−を５０ｍ／ｈｒの流速で通した。次に、ＰＢ
Ｓ１０００戚、０．５　Ｍ　ＮａＣ１を含む１０ｍＭ燐
酸緩衝液（ｐＨ７，４）　５００ｍｌ、０、１５Ｍ　Ｎ
ａＣｌ２５００ｍ１ｔの順に６５ｒｎＩｌ／ｈｒでカラ
ムを洗浄した後、０．２Ｍ酢酸と０．１５Ｍ　ＮａＣｌ
２との混合液を２４−／ｈｒの流速で流し、溶出液とし
て１００ｍを得た。本溶出液中には、ＥＰＯタンパク質
が１０■（５９４，０００単位）が含有されており、Ｅ
ＰＯ比活性は、５９，４００　（単位／ｍｇタンパク質
）であった。

さらに、次のようにしてゲル濾過を行った。

前記溶出液に対し、３．４　Ｍ　）リス溶液４．７戚を
加え中和後水に対し透析した後、凍結乾燥を行った。次
に、本凍結乾燥粉末を０．１５　Ｍ　ＮａＣｆｆを含む
１０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，５）３戚に溶
解した。予め前記と同じ緩衝液で平衡化したセファデッ
クスＧ１００充填カラム（１，２ｃｎ＋Ｘ　ｌ　５　Ｑ
　Ｃｍ、床容積１７０ｍｆ）に６ｍ（１／ｈｒで前記溶
液を通し、分子量による分画を行い、高分子不純物を除
去し、ＥＰＯ活性画分を得た。

本溶液中にはＥＰ○タンパク質が５．６■（５００，０
００単位）含有されており、ＥＰＯ比活性は、８８，０
００　（単位／ｍｇタンパク質）であった。

以上の結果をまとめると、下記の第２表のとおりである
。

第２表における処理品（Ｂ）に関するＥＰＣ比活性の８
８，０００　（単位／ｍｇタンパク質）はマウス胎児肝
細胞を用いたインヒドロ法の３Ｈ−チミジン法又は５９
Ｆｅ法で測定した値であり、インビボ法の飢餓ラット法
では、８１．６００　（単位／ｍｇタンパク質）であっ
た。また、処理品（Ｂ）についてＳＤＳポリアクリルア
ミド電気泳動法により純度検定を行ったか、不純タンパ
ク質は認められなかった。

（ＥＰＯのＨＰＬＣ） 上記の精製ＥＰＯを２８０ｎｍの吸光度で測定し２４■
／戚の濃度の溶液を２４０μ！、逆相ＨＰＬＣに注入し
、クロマトパターンを求めた。

使用したカラムは、０４カラム（０，４６Ｘ２５ｃｍ、
バイダック社製）である。これを展開相としてアセトニ
トリル及び水（０，１重量％ＴＦＡ含有）を使用し溶出
した。２８０ｎｍの吸収をモニターした。得られたパタ
ーンを３周べたところ、単一ピークとなりタンパク質と
して純粋なＥＰＯが得られたことが確認できた。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）エリスロポエチンで免疫した動物の脾臓細胞とミ
   エローマ細胞とを細胞融合させたハイブリドーマ細胞よ
   り得られたモノクロール抗体に結合可能であり、少なく
   とも約８８，０００（単位／ｍｇタンパク質）以上のエ
   リスロポエチン比活性を有し、ＳＤＳ（ソジウムドデシ
   ルサルフェート）ポリアクリルアミド上の電気泳動で単
   一のバンドを与える、分子量約３０，０００〜４０，０
   ００の酸性糖タンパク質。
2. （２）下記［１］〜［９］ ［１］ＰＢＳ（燐酸緩衝食塩水）［２］５ｍＭトリス塩
   酸緩衝液［３］２００ｍＭ塩化ナトリウム含有５ｍＭト
   リス塩酸緩衝液［４］４Ｍ塩化ナトリウム含有１０ｍＭ
   燐酸ナトリウム緩衝液［５］１０ｍＭ水酸化ナトリウム
   、２０重量％エチレングリコール水溶液及び６Ｍ塩酸グ
   アニジンの混合液［６］５ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液［
   ７］５ｍＭ塩化カルシウム水溶液［８］２０ｍＭ酢酸カ
   ルシウム緩衝液［９］２重量％ＳＤＳ（ソジウムドデシ
   ルサルフェート）含有トリス塩酸緩衝液の各液に溶解し
   、かつ、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セルロー
   ス、フェニルセファロースＣＬ−４Ｂ及びＳＰ−セファ
   デックスに吸着され、ヒドロキシルアパタイトに吸着さ
   れない特許請求の範囲（１）の酸性糖タンパク質。