JPH03157400A - ヒトインターフェロン―β２／インターロイキン―６受容体 - Google Patents
ヒトインターフェロン―β２／インターロイキン―６受容体Info
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- JPH03157400A JPH03157400A JP2144235A JP14423590A JPH03157400A JP H03157400 A JPH03157400 A JP H03157400A JP 2144235 A JP2144235 A JP 2144235A JP 14423590 A JP14423590 A JP 14423590A JP H03157400 A JPH03157400 A JP H03157400A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明の分野
本発明は、ヒトインターフェロン−β２／インターロイ
キン−６受容体（以下、ＩＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６−Ｒ
という）、その可溶性細胞外フラグメント、その塩、官
能性誘導体、前駆体、および活性分画に関する。本発明
はまた、ヒト天然ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒおよびそ
の可溶性細胞外フラグメントの精製方法、その可溶性細
胞外フラグメントのクローニングおよびその組換えＤＮ
Ａ技術による産生、ならびにそれに対するポリクローナ
ルおよびモノクローナル抗体に関する。
キン−６受容体（以下、ＩＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６−Ｒ
という）、その可溶性細胞外フラグメント、その塩、官
能性誘導体、前駆体、および活性分画に関する。本発明
はまた、ヒト天然ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒおよびそ
の可溶性細胞外フラグメントの精製方法、その可溶性細
胞外フラグメントのクローニングおよびその組換えＤＮ
Ａ技術による産生、ならびにそれに対するポリクローナ
ルおよびモノクローナル抗体に関する。
本発明はさらに、ヒト天然ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ
もしくはその可溶性細胞外フラグメント、またはそれら
の塩、官能性誘導体、前駆体および活性分画を含有する
医薬組成物に関する。
もしくはその可溶性細胞外フラグメント、またはそれら
の塩、官能性誘導体、前駆体および活性分画を含有する
医薬組成物に関する。
発明の背景
現在ではインターロイキン−６と命名されているインタ
ーフェロン−β２（以下、ＩＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６と
いう）は、各種の細胞および組織の成長および分化を調
節し、またウィルスおよび細菌感染やショックに対する
反応の重要なメデイエータ−と考えられている多機能性
サイトカインである。ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６が関連す
る生物学的作用には、成熟Ｂリンパ球による免疫グロブ
リン分泌の刺激（ＢＳＦ−２活性）、形質細胞腫および
ハイブリドーマの成長刺激（ＨＧＦ活性）、Ｔ細胞活性
化、肝急性相蛋白質合成の刺激（ｔ（ＳＦ活性）、造血
機能の刺激、細胞分化（ＤＩＦ活性）、腫瘍細胞成長の
阻害（ＡＰ活性）ならびに他のＩＮＦ様作用が包含され
る。代表的なサイト力インとして、ＩＦＮ−β２／ＩＬ
−６は多（の細胞種によって分泌され、他のインターロ
イキンおよびインターフェロンと多様に組合わさって作
用する。抗腫瘍活性の可能性が考えられる活性には、癌
細胞の成長およびコロニー形成の阻害、悪性細胞のより
正常な表現型への分化、正常造血機能の刺激、Ｔ ＩＪ
ンパ球球性性化刺激、Ｂ細胞による抗体分泌の刺激、補
体合成の刺激、ならびにアンチプロテアーゼ合成の刺激
がある。
ーフェロン−β２（以下、ＩＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６と
いう）は、各種の細胞および組織の成長および分化を調
節し、またウィルスおよび細菌感染やショックに対する
反応の重要なメデイエータ−と考えられている多機能性
サイトカインである。ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６が関連す
る生物学的作用には、成熟Ｂリンパ球による免疫グロブ
リン分泌の刺激（ＢＳＦ−２活性）、形質細胞腫および
ハイブリドーマの成長刺激（ＨＧＦ活性）、Ｔ細胞活性
化、肝急性相蛋白質合成の刺激（ｔ（ＳＦ活性）、造血
機能の刺激、細胞分化（ＤＩＦ活性）、腫瘍細胞成長の
阻害（ＡＰ活性）ならびに他のＩＮＦ様作用が包含され
る。代表的なサイト力インとして、ＩＦＮ−β２／ＩＬ
−６は多（の細胞種によって分泌され、他のインターロ
イキンおよびインターフェロンと多様に組合わさって作
用する。抗腫瘍活性の可能性が考えられる活性には、癌
細胞の成長およびコロニー形成の阻害、悪性細胞のより
正常な表現型への分化、正常造血機能の刺激、Ｔ ＩＪ
ンパ球球性性化刺激、Ｂ細胞による抗体分泌の刺激、補
体合成の刺激、ならびにアンチプロテアーゼ合成の刺激
がある。
ヒトＩＦＮ−β２／ＩＬ−６受容体クローニングはすで
に報告されている（Ｙｘｍａ ｓ ｓ ｋ ｉ ら５ｃ
ｉｅｎｃｅ、 ２４１巻、８２５〜８２８頁）。しかし
ながら、天然ヒトＩＦＮ−β２／、ＩＬ−６受容体およ
びその可溶性細胞外フラグメントはまだ単離されておら
ず、文献に記載はない。
に報告されている（Ｙｘｍａ ｓ ｓ ｋ ｉ ら５ｃ
ｉｅｎｃｅ、 ２４１巻、８２５〜８２８頁）。しかし
ながら、天然ヒトＩＦＮ−β２／、ＩＬ−６受容体およ
びその可溶性細胞外フラグメントはまだ単離されておら
ず、文献に記載はない。
発明の要約
ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒおよびその可溶性フラグメ
ントは、マウス形質細胞腫細胞に対するＩＦＮ−β２／
ＩＬ−６の刺激作用を強力に増強し、またヒト乳癌に対
するヒトＩＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６の成長阻害作用を著
しく増強すること、すなわちＩＦＮ−β２／ＩＬ−６の
生物活性の増強に使用できることが見出された。すなわ
ち、本発明は、ＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６に特異的に結合
してＩＦＮ−β２／ＩＬ−６の有益な生物学的作用の刺
激および増強が可能な、ヒト天然インターフェロン−β
２／インターロイキン−６受容体（本明細書ではＩＦＮ
−β２／ＩＬ−６−Ｒと略称する）、その可溶性細胞外
フラグメント、それらの塩、官能性誘導体、前駆体およ
び活性分画を提供する。本発明は、蛋白性の不純物を含
まない実質的に精製された形態の上記ヒト天然ＩＦＮ−
β２／ＩＬ−６−Ｒ，およびその単離方法を指図するも
のである。
ントは、マウス形質細胞腫細胞に対するＩＦＮ−β２／
ＩＬ−６の刺激作用を強力に増強し、またヒト乳癌に対
するヒトＩＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６の成長阻害作用を著
しく増強すること、すなわちＩＦＮ−β２／ＩＬ−６の
生物活性の増強に使用できることが見出された。すなわ
ち、本発明は、ＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６に特異的に結合
してＩＦＮ−β２／ＩＬ−６の有益な生物学的作用の刺
激および増強が可能な、ヒト天然インターフェロン−β
２／インターロイキン−６受容体（本明細書ではＩＦＮ
−β２／ＩＬ−６−Ｒと略称する）、その可溶性細胞外
フラグメント、それらの塩、官能性誘導体、前駆体およ
び活性分画を提供する。本発明は、蛋白性の不純物を含
まない実質的に精製された形態の上記ヒト天然ＩＦＮ−
β２／ＩＬ−６−Ｒ，およびその単離方法を指図するも
のである。
本発明はまた、蛋白性の不純物を含まない実質的に精製
された形態の、逆相ＨＰＬＣで単一のピークとして移動
するヒトＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フラ
グメント、ならびにそのフラグメントのヒト体液たとえ
ば尿からの単離および精製方法に関する。
された形態の、逆相ＨＰＬＣで単一のピークとして移動
するヒトＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フラ
グメント、ならびにそのフラグメントのヒト体液たとえ
ば尿からの単離および精製方法に関する。
本発明はまた、ヒトＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒおよび
その可溶性細胞外フラグメントに対するポリクローナル
およびモノクローナル抗体を指図する。
その可溶性細胞外フラグメントに対するポリクローナル
およびモノクローナル抗体を指図する。
本発明はさらに、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細
胞外フラグメントまたはそれと実質的に相同の蛋白質を
コードするＤＮＡの製造、それを含有する発現ビヒクル
およびそれでトランスホームされた宿主細胞の構築、な
らびにこのトランスホーマント細胞を適当な培地中で培
養することによるＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細
胞外・フラグメントまたはそれと実質的に相同の蛋白質
を産生させろ過程を包含するＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−
Ｒ可溶性細胞外フラグメントの組換えＤＮＡ技術による
製造に関する。
胞外フラグメントまたはそれと実質的に相同の蛋白質を
コードするＤＮＡの製造、それを含有する発現ビヒクル
およびそれでトランスホームされた宿主細胞の構築、な
らびにこのトランスホーマント細胞を適当な培地中で培
養することによるＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細
胞外・フラグメントまたはそれと実質的に相同の蛋白質
を産生させろ過程を包含するＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−
Ｒ可溶性細胞外フラグメントの組換えＤＮＡ技術による
製造に関する。
本発明のヒト天然ＩＦＮ−β２／夏Ｌ−６−Ｒおよびそ
の可溶性細胞外フラグメント、およびそれらの塩、官能
性誘導体、前駆体、活性分画、ならびにこれらの任意の
混合物は、ＩＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６の有益な作用を増
強するため、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６と配合して医薬組
成物の活性成分として使用される。
の可溶性細胞外フラグメント、およびそれらの塩、官能
性誘導体、前駆体、活性分画、ならびにこれらの任意の
混合物は、ＩＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６の有益な作用を増
強するため、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６と配合して医薬組
成物の活性成分として使用される。
図面の簡単な説明
第１図は、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フ
ラグメント分画の、固定化ＩＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６カ
ラム上での部分精製後における、逆相ＨＰＬＣカラム溶
出パターンを示す。
ラグメント分画の、固定化ＩＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６カ
ラム上での部分精製後における、逆相ＨＰＬＣカラム溶
出パターンを示す。
第２図は、精製ＩＦＮ−β２／ｒ Ｌ−６−Ｒ可溶性細
胞外フラグメントの非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
１ついで銀染色（レーン１および２）または電気プロッ
ティング、 Ｉ−ｒｌＦＮ−β２／ＩＬ、−６結合
およびオートラジオグラフィーによる可視化（レーン３
および４）による分析結果を示す。
胞外フラグメントの非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
１ついで銀染色（レーン１および２）または電気プロッ
ティング、 Ｉ−ｒｌＦＮ−β２／ＩＬ、−６結合
およびオートラジオグラフィーによる可視化（レーン３
および４）による分析結果を示す。
第３図は、ヒト乳癌Ｔ４７Ｄ細胞に対するＩＦＮ−β２
／ＩＬ−６ＨＧＦ活性の、ＩＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６−
Ｒ可溶性細胞外フラグメントによる増強を示す。
／ＩＬ−６ＨＧＦ活性の、ＩＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６−
Ｒ可溶性細胞外フラグメントによる増強を示す。
発明の詳細な説明
各種ヒト細胞上のＩＦＮ−β２／ＩＬ−６の受容体は、
放射標識ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６での架橋実験によって
同定される。簡単に説明すれば、純粋なＩＦＮ−β２／
ＩＬ−６を既報の操作に従ってクロラミン−Ｔ法により
〔１２５Ｉ〕で標識し、その完全な生物学的活性は維
持させる。このような標識ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６を４
℃で各種ヒＩ・細胞と反応させ、得られたＩＦＮ−β２
／ＩＬ−６受容体複合体を共有結合で架橋し、ついでド
デシル硫酸ナトリウム（Ｓ Ｄ Ｓ）の存在下にポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）後オートラジオ
グラフィーによって解析する。同定後に、受容体を、受
容体をもつヒト細胞の可溶化により懸濁液を得、その上
澄液を固定化ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６または抗−ＩＦＮ
−β２／ＩＬ−６−Ｒモノクローナル抗体カラムに適用
し、結合した受容体蛋白質を様々なｐＨ条件で純度が高
められた状態で溶出することからなる方法によって単離
する。
放射標識ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６での架橋実験によって
同定される。簡単に説明すれば、純粋なＩＦＮ−β２／
ＩＬ−６を既報の操作に従ってクロラミン−Ｔ法により
〔１２５Ｉ〕で標識し、その完全な生物学的活性は維
持させる。このような標識ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６を４
℃で各種ヒＩ・細胞と反応させ、得られたＩＦＮ−β２
／ＩＬ−６受容体複合体を共有結合で架橋し、ついでド
デシル硫酸ナトリウム（Ｓ Ｄ Ｓ）の存在下にポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）後オートラジオ
グラフィーによって解析する。同定後に、受容体を、受
容体をもつヒト細胞の可溶化により懸濁液を得、その上
澄液を固定化ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６または抗−ＩＦＮ
−β２／ＩＬ−６−Ｒモノクローナル抗体カラムに適用
し、結合した受容体蛋白質を様々なｐＨ条件で純度が高
められた状態で溶出することからなる方法によって単離
する。
必要に応じて溶出分画をさらに精製してもよい。
本発明のＩＦＮ−β２７Ｉｔ、−６−Ｒの可溶性細胞外
フラグメントはヒト尿中に見出された。実質的に蛋白性
不純物を含まないその実質的に精製された形態では、非
還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析すると分子量約５０
（４０〜６０）Ｋを示し、逆相ＨＰＬＣで単一のピーク
として移動する。
フラグメントはヒト尿中に見出された。実質的に蛋白性
不純物を含まないその実質的に精製された形態では、非
還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析すると分子量約５０
（４０〜６０）Ｋを示し、逆相ＨＰＬＣで単一のピーク
として移動する。
この蛋白質はさらに、Ｎ−末端配列解析によって得られ
た以下の配列によって特徴づけられる。
た以下の配列によって特徴づけられる。
Ｌｅｅ−ＡＩｒＰｒｏ−＾ｐＨ−Ａ＋（−Ｃ７＋−Ｐｒ
ｏ−＾１ｒＧｌｎ−Ｇｌａ−１’ｚｌ−＾ＩＪ−Ａｒ！
−Ｇｌｙ−Ｖａ １−Ｌｅｕ−Ｔｈ ｒ−８ｅｔ−Ｌｅ
ｇ−Ｐｒｏ−Ｇ１７−＾＋ｐ−３ｅ＋Ｊｔｌ−Ｔｈ＋−
Ｌｅｅ−Ｔｈｒ−Ｃ７ｉ−Ｐｌｏ−ＧＩＴ本発明は、上
記配列からなるポリペプチド、ならびにＩＦＮ−β２／
Ｉ Ｌ−６−Ｒフラグメントの構造における１個もしく
は２個以上のアミノ酸の欠失もしくは他のアミノ酸によ
る置換または１個もしくは２個以上のアミノ酸の付加が
行われたポリペプチドでＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒに
特異的に結合する任意の他のポリペプチドを包含する。
ｏ−＾１ｒＧｌｎ−Ｇｌａ−１’ｚｌ−＾ＩＪ−Ａｒ！
−Ｇｌｙ−Ｖａ １−Ｌｅｕ−Ｔｈ ｒ−８ｅｔ−Ｌｅ
ｇ−Ｐｒｏ−Ｇ１７−＾＋ｐ−３ｅ＋Ｊｔｌ−Ｔｈ＋−
Ｌｅｅ−Ｔｈｒ−Ｃ７ｉ−Ｐｌｏ−ＧＩＴ本発明は、上
記配列からなるポリペプチド、ならびにＩＦＮ−β２／
Ｉ Ｌ−６−Ｒフラグメントの構造における１個もしく
は２個以上のアミノ酸の欠失もしくは他のアミノ酸によ
る置換または１個もしくは２個以上のアミノ酸の付加が
行われたポリペプチドでＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒに
特異的に結合する任意の他のポリペプチドを包含する。
本発明はまた、ヒト体液たとえば尿からのＩＦＮ−β２
／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメントの単離および
その精製方法に関する。その好ましい一態様においては
、本発明の実質的に精製された受容体フラグメントは、 （ａ）健常ドナーのヒト尿の透析濃縮物から粗蛋白分画
を回収し、 （ｂ）工程（りの粗蛋白分画を固定化ＩＦＮβ２／ＩＬ
−６カラム上アフィニティー精製に付し、 （ｃ）工程（ｂ３からのＩＦＮ−β２／ＩＬ−６結合蛋
白質の上記アフィニティー精製活性分画を逆相ＨＰＬＣ
に適用し、 （ｄ）３９％アセトニトリルで溶出し、非還元条件下Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量約５０ Ｋを有し、逆相Ｈ
ＰＬＣで単一のピークとして移動する実質的に精製され
たＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメン
トを含有する分画を回収する方法によって製造される。
／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメントの単離および
その精製方法に関する。その好ましい一態様においては
、本発明の実質的に精製された受容体フラグメントは、 （ａ）健常ドナーのヒト尿の透析濃縮物から粗蛋白分画
を回収し、 （ｂ）工程（りの粗蛋白分画を固定化ＩＦＮβ２／ＩＬ
−６カラム上アフィニティー精製に付し、 （ｃ）工程（ｂ３からのＩＦＮ−β２／ＩＬ−６結合蛋
白質の上記アフィニティー精製活性分画を逆相ＨＰＬＣ
に適用し、 （ｄ）３９％アセトニトリルで溶出し、非還元条件下Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量約５０ Ｋを有し、逆相Ｈ
ＰＬＣで単一のピークとして移動する実質的に精製され
たＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメン
トを含有する分画を回収する方法によって製造される。
好ましい態様においては、工程（ａ）の粗蛋白分画はま
ず、たとえばカルボキシメチル５ｅｐｈａ＋ｏ＋ｅ（ｃ
Ｍ−３ｃｐｈａｒｏｓｅまたはＣＭＳ）カラム上、イオ
ン交換クロマトグラフィーに付される。
ず、たとえばカルボキシメチル５ｅｐｈａ＋ｏ＋ｅ（ｃ
Ｍ−３ｃｐｈａｒｏｓｅまたはＣＭＳ）カラム上、イオ
ン交換クロマトグラフィーに付される。
他の好ましい態様においては、工程（ｂ）のアフィニテ
ィー精製は、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性フラグ
メントに対するモノクローナル抗体の固定化したカラム
上で行われる。本発明はさらに遺伝子工学技術によるＩ
ＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメントの
製造に関し、これらの技術に使用されるすべての手段を
包含する。
ィー精製は、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性フラグ
メントに対するモノクローナル抗体の固定化したカラム
上で行われる。本発明はさらに遺伝子工学技術によるＩ
ＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメントの
製造に関し、これらの技術に使用されるすべての手段を
包含する。
すなわち、本発明は、上述の受容体フラグメントまたは
それと実質的に相同の蛋白質をコードするヌクレオチド
配列からなるＤＮＡ分子に関する。
それと実質的に相同の蛋白質をコードするヌクレオチド
配列からなるＤＮＡ分子に関する。
これらのＤＮＡ分子はゲノムＤＮＡ、、ｃＤＮＡ。
合成りＮＡ、およびそれらの組合せである。
ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメント
のクローニングは様々な方法で実施できる。このフラグ
メントをコードするＤＮＡは合成されるか、それをコー
ドする遺伝子をＤＮＡライブラリーから単離されるか、
または全ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６受容体をコードする遺
伝子をまず得てついで公知の方法で切断する。ひとつの
方法では、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６受容体に対する特異
的抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）を製造
し、これを使用して免疫蛍光法またはウェスタンプロッ
ト法により受容体を産生ずる細胞を探索する。これらの
ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６受容体産生細胞からｍＲＮＡを
抽出し、ＣＤＮＡを形成させるのに適当な時間および条
件下に逆転写酵素と接触させてｃＤＮＡに変換させる。
のクローニングは様々な方法で実施できる。このフラグ
メントをコードするＤＮＡは合成されるか、それをコー
ドする遺伝子をＤＮＡライブラリーから単離されるか、
または全ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６受容体をコードする遺
伝子をまず得てついで公知の方法で切断する。ひとつの
方法では、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６受容体に対する特異
的抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）を製造
し、これを使用して免疫蛍光法またはウェスタンプロッ
ト法により受容体を産生ずる細胞を探索する。これらの
ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６受容体産生細胞からｍＲＮＡを
抽出し、ＣＤＮＡを形成させるのに適当な時間および条
件下に逆転写酵素と接触させてｃＤＮＡに変換させる。
ｃＤＮＡをラムダｇｔｌｌのような発現ベクター中にク
ローン化し、抗体の使用によってスクリーニングする。
ローン化し、抗体の使用によってスクリーニングする。
ラムダｇｔｌ１発現ベクターは、β−ガラクトシダーゼ
停止コドンの５３塩基上流にある唯一のＥｃｏＲ１部位
に７ｋｂまでの長さのＤＮＡを挿入するために使用でき
る。したがって、外来性ＤＮＡはこの部位に挿入し、適
当な条件下に融合蛋白質として発現させることができる
。ラムダｇｔ １１発現ベクターは、抗体プローブを用
いてスクリーニングされるｃＤＮＡライブラリーの構築
にとくに有用である（Ｈｕ７ｎｈ、 Ｔ、 Ｖ、 ら
： ＤａｖｉｄＧｌｏｖｅｒ編、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ、 ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆ
ｏｒｄ （１９８４）４９〜７８頁）。
停止コドンの５３塩基上流にある唯一のＥｃｏＲ１部位
に７ｋｂまでの長さのＤＮＡを挿入するために使用でき
る。したがって、外来性ＤＮＡはこの部位に挿入し、適
当な条件下に融合蛋白質として発現させることができる
。ラムダｇｔ １１発現ベクターは、抗体プローブを用
いてスクリーニングされるｃＤＮＡライブラリーの構築
にとくに有用である（Ｈｕ７ｎｈ、 Ｔ、 Ｖ、 ら
： ＤａｖｉｄＧｌｏｖｅｒ編、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ
Ａｐｐｒｏａｃｈ、 ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、０ｘｆ
ｏｒｄ （１９８４）４９〜７８頁）。
別の方法によれば、蛋白質のフラグメントのアミノ酸配
列、たとえばＮ−末端アミノ酸配列から誘導された配列
をもつ合成オリゴヌクレオチドまたは合成オリゴヌクレ
オチド混合物を製造し、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６受容体
またはその可溶性フラグメントをコードするｃＤＮＡま
たはそのゲノムＤＮＡをクローニングするためのプロー
ブとして使用する。適当なりＮＡプレバレージョン、た
とえばヒトゲノムＤＮＡは制限酵素によって酵素的に切
断するかまたはランダムに剪断し、フラグメントを適当
な組換えベクター中に挿入して遺伝子ライブラリーを生
成させる。このようなベクターをついで合成オリゴヌク
レオチドプローブでスクリーニングし、ＩＦＮ−β２／
Ｉ Ｌ−６受容体またはその可溶性フラグメントをコー
ドする配列を同定することができる。
列、たとえばＮ−末端アミノ酸配列から誘導された配列
をもつ合成オリゴヌクレオチドまたは合成オリゴヌクレ
オチド混合物を製造し、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６受容体
またはその可溶性フラグメントをコードするｃＤＮＡま
たはそのゲノムＤＮＡをクローニングするためのプロー
ブとして使用する。適当なりＮＡプレバレージョン、た
とえばヒトゲノムＤＮＡは制限酵素によって酵素的に切
断するかまたはランダムに剪断し、フラグメントを適当
な組換えベクター中に挿入して遺伝子ライブラリーを生
成させる。このようなベクターをついで合成オリゴヌク
レオチドプローブでスクリーニングし、ＩＦＮ−β２／
Ｉ Ｌ−６受容体またはその可溶性フラグメントをコー
ドする配列を同定することができる。
別法として、受容体を発現する細胞からｍＲＮＡを単離
し、精製後上述のようにしてｃＤＮＡに変換する。ｃＤ
ＮＡを公知方法によって二本鎖ｃＤＮＡに変換し、クロ
ーン化し、得られたクローンについて適当なプローブを
用い所望の配列をコードするｃＤＮＡをスクリーニング
する。所望のクローンが単離されたならば、ｃＤＮＡを
ゲノムＤＮＡの場合と実質的に同様に操作する。しかし
ながら、ｃＤＮＡにはイントロンまたは介在配列は存在
しない。
し、精製後上述のようにしてｃＤＮＡに変換する。ｃＤ
ＮＡを公知方法によって二本鎖ｃＤＮＡに変換し、クロ
ーン化し、得られたクローンについて適当なプローブを
用い所望の配列をコードするｃＤＮＡをスクリーニング
する。所望のクローンが単離されたならば、ｃＤＮＡを
ゲノムＤＮＡの場合と実質的に同様に操作する。しかし
ながら、ｃＤＮＡにはイントロンまたは介在配列は存在
しない。
本発明はまた、７ＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒまたはその
可溶性フラグメントをコードするＤＮＡにプローブとし
て使用される合成オリゴヌクレオチドに関する。これら
は、ＩＦＮ−β２／ＩＬ６−Ｒのフラグメントのアミノ
酸配列に基づいて、公知方法により合成される。この目
的では、完全なＩＦＮ−β２／ＩＩ、−６−Ｒまたはそ
の可溶性細胞外フラグメントの配列解析のいずれかを行
い、そのペプチドフラグメントを得、そのアミノ酸配列
を特性づけする。ペプチドフラグメントは、精製蛋白質
プレバレージョンを、たとえば本技術分野でよく知られ
たトリプシン、キモトリプシンまたはパパインのような
プロテアーゼの消化による断片化に付すことによって得
られる （Ｏｉｋｅ、Ｙ、 ら：Ｊ Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｃｍ、２５７ ： ９７５１−９７５８． １９８２）
。これらはついで逆相ＨＰＬＣで分離し、自動アミノ酸
配列決定法で配列を決定する。
可溶性フラグメントをコードするＤＮＡにプローブとし
て使用される合成オリゴヌクレオチドに関する。これら
は、ＩＦＮ−β２／ＩＬ６−Ｒのフラグメントのアミノ
酸配列に基づいて、公知方法により合成される。この目
的では、完全なＩＦＮ−β２／ＩＩ、−６−Ｒまたはそ
の可溶性細胞外フラグメントの配列解析のいずれかを行
い、そのペプチドフラグメントを得、そのアミノ酸配列
を特性づけする。ペプチドフラグメントは、精製蛋白質
プレバレージョンを、たとえば本技術分野でよく知られ
たトリプシン、キモトリプシンまたはパパインのような
プロテアーゼの消化による断片化に付すことによって得
られる （Ｏｉｋｅ、Ｙ、 ら：Ｊ Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｃｍ、２５７ ： ９７５１−９７５８． １９８２）
。これらはついで逆相ＨＰＬＣで分離し、自動アミノ酸
配列決定法で配列を決定する。
１個または２個以上の適当なペプチドフラグメントの配
列が決定されるかまたは蛋白質の部分配列が決定された
ならば、これらをコードできるＤＮＡ配列を検討する。
列が決定されるかまたは蛋白質の部分配列が決定された
ならば、これらをコードできるＤＮＡ配列を検討する。
遺伝子コードの縮重により、特定のアミノ酸をコードす
るためには２個以上のコドンを使用できるので、ＩＦＮ
−β２／ＩＬ−６−Ｒペプチドフラグメントをコードで
きるオリゴヌクレオチドは１個または２個以上作成でき
る（Ｗａｌｓｏｎ、 Ｊ、 Ｄ、 ： １ｌｌｏｌ！ｃ
ｕｌａ＋ Ｂｉｏｌ＋＋ｇｙ ｏｆ＋ｈｅ Ｇｅｎ！、
第３版、Ｗ、Ａ、 Ｂｃｎｊａｍｉｎ、 Ｉｎｃ、 Ｍ
ｅｎｌ。
るためには２個以上のコドンを使用できるので、ＩＦＮ
−β２／ＩＬ−６−Ｒペプチドフラグメントをコードで
きるオリゴヌクレオチドは１個または２個以上作成でき
る（Ｗａｌｓｏｎ、 Ｊ、 Ｄ、 ： １ｌｌｏｌ！ｃ
ｕｌａ＋ Ｂｉｏｌ＋＋ｇｙ ｏｆ＋ｈｅ Ｇｅｎ！、
第３版、Ｗ、Ａ、 Ｂｃｎｊａｍｉｎ、 Ｉｎｃ、 Ｍ
ｅｎｌ。
Ｐａｒｋ ＣＡ （１９７７） 、３５６〜３５７頁
）。しかしながら、このセット中のひとつのみが、遺伝
子のヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を含有
する。セット中にそれが存在し、それがセットの他のメ
ンバーの存在下でもＤＮＡにハイブリダイズできる能力
があれば、このオリゴヌクレオチドのセットを分画しな
いまま、ペプチドをコードする遺伝子をクローン化する
ために単一のオリゴヌクレオチドを使用しているのと全
く同様に使用することが可能である。ＩＦＮ−β２／Ｉ
Ｌ−６−Ｒ遺伝子フラグメントをコードできる理論的に
「最も高い可能性」をもつオリゴヌクレオチドまたはそ
れを含有するオリゴヌクレオチドのセットを用いること
により（Ｌａｔｈ、１１．ら（１９８５）１、Ｍｏ１ｅ
ｃ Ｂｉｏｌ、 １８３ ： １〜１２に開示されて
いる「コドン使用規則」に従って）、ＩＦＮ−β２／１
Ｌ−６−Ｒもしくは少なくともその部分をコードする「
最も高い可能性」をもつ配列またはその配列のセットに
ハイブリダイズできる相補的オリゴヌクレオチドまたは
オリゴヌクレオチドのセットの配列を同定することがで
きる。このような相補性配列を含むこのオリゴヌクレオ
チドを次に合成し、本発明のＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−
ＲをコードするＤＮＡ分子をＤＮＡライブラリーから同
定し単離するためのプローブとして使用する（Ｍａｎｉ
ａｊｉｓ、 Ｔ、ら： Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ ：ＡＬａｂｏｒａｆｕ７ ＭａｎＩＩａｌ、Ｃ
ｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ＋ｂｕ Ｐ＋ｅｓｓＣｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｌＩａ＋ｂｏ＋、ＮＹ、 １９８２
）。
）。しかしながら、このセット中のひとつのみが、遺伝
子のヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を含有
する。セット中にそれが存在し、それがセットの他のメ
ンバーの存在下でもＤＮＡにハイブリダイズできる能力
があれば、このオリゴヌクレオチドのセットを分画しな
いまま、ペプチドをコードする遺伝子をクローン化する
ために単一のオリゴヌクレオチドを使用しているのと全
く同様に使用することが可能である。ＩＦＮ−β２／Ｉ
Ｌ−６−Ｒ遺伝子フラグメントをコードできる理論的に
「最も高い可能性」をもつオリゴヌクレオチドまたはそ
れを含有するオリゴヌクレオチドのセットを用いること
により（Ｌａｔｈ、１１．ら（１９８５）１、Ｍｏ１ｅ
ｃ Ｂｉｏｌ、 １８３ ： １〜１２に開示されて
いる「コドン使用規則」に従って）、ＩＦＮ−β２／１
Ｌ−６−Ｒもしくは少なくともその部分をコードする「
最も高い可能性」をもつ配列またはその配列のセットに
ハイブリダイズできる相補的オリゴヌクレオチドまたは
オリゴヌクレオチドのセットの配列を同定することがで
きる。このような相補性配列を含むこのオリゴヌクレオ
チドを次に合成し、本発明のＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−
ＲをコードするＤＮＡ分子をＤＮＡライブラリーから同
定し単離するためのプローブとして使用する（Ｍａｎｉ
ａｊｉｓ、 Ｔ、ら： Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ ：ＡＬａｂｏｒａｆｕ７ ＭａｎＩＩａｌ、Ｃ
ｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ＋ｂｕ Ｐ＋ｅｓｓＣｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｌＩａ＋ｂｏ＋、ＮＹ、 １９８２
）。
本発明の一態様においては、ＩＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６
受容体の遺伝子の単離は、緊縮条件下でのコロニーハイ
ブリダイゼーション法によって行われる。核酸のハイブ
リダイゼーション操作は公知であり、たとえばＭａｎｉ
ａｌｉｓ、Ｔ、 ： Ｍｏｌ！ｃｕｌａ＋Ｃ１ｏｎｉＢ
： Ａ ＬａｂｏｒａｌｏＢ Ｍａｎｕａｌ、前出、お
よびＨａ７ｍｃｓ、 Ｂ、 Ｔ、ら： Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄ Ｈ７ｂｒｉｄｆａｌｉｏｎ＾Ｐ「ａｃｔｉ
ｃａｌ＾ｐｐ＋ｏａｃｈ、 ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、 Ｏ
ｘ篩「ｄＥｎｇｌａｎｄ （１９８５）に開示されて
いる。上述のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプ
ローブのセットとのハイブリダイゼーションにより、ｃ
ＤＮＡまたはゲノムライブラリー中にこのようなハイブ
リダイゼーションが可能なりＮＡ配列を同定することが
でき、ついでこれらを解析して、これらがＩＦＮ−β２
／ＩＬ−６−Ｒをコードする配列をどの程度含んでいる
かを決定する。本発明の受容体可溶性細胞外フラグメン
トをコードするＤＮＡはついで、全受容体の陽性クロー
ンのＤＮＡから公知操作によって得られ、本技術分野で
よく知られている技術により、適当に構築された発現ベ
クター中に挿入される（Ｍａｎｉａｌｉｓら・前出参照
）。二本鎖ｃＤＮＡは、ホモポリマーテーリング法によ
り、または合成りＮＡリンカ−の使用もしくはプラント
末端連結法を用いる制限結合法により、プラスミドベク
ターに連結される。
受容体の遺伝子の単離は、緊縮条件下でのコロニーハイ
ブリダイゼーション法によって行われる。核酸のハイブ
リダイゼーション操作は公知であり、たとえばＭａｎｉ
ａｌｉｓ、Ｔ、 ： Ｍｏｌ！ｃｕｌａ＋Ｃ１ｏｎｉＢ
： Ａ ＬａｂｏｒａｌｏＢ Ｍａｎｕａｌ、前出、お
よびＨａ７ｍｃｓ、 Ｂ、 Ｔ、ら： Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃ１ｄ Ｈ７ｂｒｉｄｆａｌｉｏｎ＾Ｐ「ａｃｔｉ
ｃａｌ＾ｐｐ＋ｏａｃｈ、 ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、 Ｏ
ｘ篩「ｄＥｎｇｌａｎｄ （１９８５）に開示されて
いる。上述のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプ
ローブのセットとのハイブリダイゼーションにより、ｃ
ＤＮＡまたはゲノムライブラリー中にこのようなハイブ
リダイゼーションが可能なりＮＡ配列を同定することが
でき、ついでこれらを解析して、これらがＩＦＮ−β２
／ＩＬ−６−Ｒをコードする配列をどの程度含んでいる
かを決定する。本発明の受容体可溶性細胞外フラグメン
トをコードするＤＮＡはついで、全受容体の陽性クロー
ンのＤＮＡから公知操作によって得られ、本技術分野で
よく知られている技術により、適当に構築された発現ベ
クター中に挿入される（Ｍａｎｉａｌｉｓら・前出参照
）。二本鎖ｃＤＮＡは、ホモポリマーテーリング法によ
り、または合成りＮＡリンカ−の使用もしくはプラント
末端連結法を用いる制限結合法により、プラスミドベク
ターに連結される。
ＤＮＡ分子の連結にはＤＮＡリガーゼが用いられ、望ま
しくない結合はアリカリホスファターゼ処理によって回
避する。
しくない結合はアリカリホスファターゼ処理によって回
避する。
所望の蛋白質の発現に際しては、発現ベクターは遺伝子
の発現と蛋白の産生を可能にするために、目的の蛋白を
コードするＤＮＡに結合した、転写および翻訳制御情報
を含む特異的なヌクレオチド配列を含有していなければ
ならない。まず第一に遺伝子が転写されるために、ポリ
メラーゼが結合しており従って転写過程を開始させる、
ＲＮＡポリメラーゼに認識されるプロモーターが先行し
ていなければならない。このようなプロモーターは種々
のものが使用されており、これらは異なる効率（強いプ
ロモーターと弱いプロモーター）で機能し、原核生物と
真核生物で異なる。シャインーダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ
−Ｄａ１ｇａ＋ｎｏ）配列（ＳＤ配列）のようなりボゾ
ーム結合部位を使用することにより、原核生物において
高レベルの遺伝子発現を達成することができる。真核生
物宿主細胞では、宿主細胞の性質により、異なる転写及
び翻訳制御配列を使用することができる。これらはウィ
ルス（例えばアデノウィルス、ウシパピローマウィルス
、シミアンウィルス（Ｓｉｍｉａｎ ｙｉｎ＋ｓ）など
）由来のこともあり、調節シグナルは、高レベルの発現
を有する特定の遺伝子に関連している。その例としては
ヘルペスウィルスのＴ Ｋプロモーター、ＳＶ４０アー
リープロモーター、酵母のｇａ１４遺伝子プロモーター
などがある。遺伝子の発現が調節できるように、抑制と
活性化ができる転写開始調節シグナルを選択することも
できる。
の発現と蛋白の産生を可能にするために、目的の蛋白を
コードするＤＮＡに結合した、転写および翻訳制御情報
を含む特異的なヌクレオチド配列を含有していなければ
ならない。まず第一に遺伝子が転写されるために、ポリ
メラーゼが結合しており従って転写過程を開始させる、
ＲＮＡポリメラーゼに認識されるプロモーターが先行し
ていなければならない。このようなプロモーターは種々
のものが使用されており、これらは異なる効率（強いプ
ロモーターと弱いプロモーター）で機能し、原核生物と
真核生物で異なる。シャインーダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ
−Ｄａ１ｇａ＋ｎｏ）配列（ＳＤ配列）のようなりボゾ
ーム結合部位を使用することにより、原核生物において
高レベルの遺伝子発現を達成することができる。真核生
物宿主細胞では、宿主細胞の性質により、異なる転写及
び翻訳制御配列を使用することができる。これらはウィ
ルス（例えばアデノウィルス、ウシパピローマウィルス
、シミアンウィルス（Ｓｉｍｉａｎ ｙｉｎ＋ｓ）など
）由来のこともあり、調節シグナルは、高レベルの発現
を有する特定の遺伝子に関連している。その例としては
ヘルペスウィルスのＴ Ｋプロモーター、ＳＶ４０アー
リープロモーター、酵母のｇａ１４遺伝子プロモーター
などがある。遺伝子の発現が調節できるように、抑制と
活性化ができる転写開始調節シグナルを選択することも
できる。
シグナルペプチドと機能的に結合している転写及び翻訳
調節シグナルのヌクレオチド配列が先行する、本発明の
ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメント
のアミノ酸配列を含む蛋白をコードするヌクレオチド配
列よりなるＤＮＡ分子を、目的の遺伝子配列を宿主細胞
染色体に取り込むことができるベクター中に挿入する。
調節シグナルのヌクレオチド配列が先行する、本発明の
ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメント
のアミノ酸配列を含む蛋白をコードするヌクレオチド配
列よりなるＤＮＡ分子を、目的の遺伝子配列を宿主細胞
染色体に取り込むことができるベクター中に挿入する。
発現ベクターを含有する宿主細胞の選択を可能にする１
つ又はそれ以上のマーカーを導入することによっても、
染色体中にＤＮＡを安定的に取り込んだ細胞を選択する
ことができる。
つ又はそれ以上のマーカーを導入することによっても、
染色体中にＤＮＡを安定的に取り込んだ細胞を選択する
ことができる。
好適な態様において、導入されたＤＮＡ配列は、受容宿
主細胞中で自己複製可能なプラスミツド又はウィルスベ
クターの中に取り込まれる。原核生物および真核生物プ
ラスミツドは文献中で公知である。特定のプラスミツド
やウィルスベクターの選択に重要な因子は、ベクターを
含まない受容細胞からベクターを含む受容細胞を認識し
選択することの容易性；特定の宿主細胞中での目的のベ
クターのコピー数；そして異なる種間でベクターを１シ
ヤトル」 （行き来）させることが好ましいか否かとい
うことである。
主細胞中で自己複製可能なプラスミツド又はウィルスベ
クターの中に取り込まれる。原核生物および真核生物プ
ラスミツドは文献中で公知である。特定のプラスミツド
やウィルスベクターの選択に重要な因子は、ベクターを
含まない受容細胞からベクターを含む受容細胞を認識し
選択することの容易性；特定の宿主細胞中での目的のベ
クターのコピー数；そして異なる種間でベクターを１シ
ヤトル」 （行き来）させることが好ましいか否かとい
うことである。
作成物（ｃｏｎｓｔｒ＋＋ｃｔ＜ｓ＞ｌを含有するベク
ター又はＤＮＡ配列が発現用に調製されたら、ＤＮＡ作
成物を任意の方法で適当な宿主細胞中に導入することが
できる：形質転換、トランスフェクション（ｌｒａｎｓ
ｌｃｃｌｉｏｎ）、結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）
、原形質融合、エレクトロポレーション（！１ｅｃｔｒ
ｏｐｏｒａｌｉｏｎ）、リン酸カルシウム沈澱、直接マ
イクロインジェクション（ｄｉｕｃｊ ｍｉｃ＋ｏｉｎ
ｊｅｃｔｉｏｎ）など。本発明で使用する宿主細胞は、
原核生物でも真核生物でもよい。好適な原核生物宿主細
胞としては、大腸菌、バシルス、放線菌、シュードモナ
ス、サルモネラ菌、セラチア菌などがある。最も好適な
原核生物宿主細胞は大腸菌である。このような条件では
、蛋白はグリコジル化されない。原核生物宿主細胞は発
現プラスミツド中のレプリコンや調節配列に対して融和
性がなければならない。蛋白分子に対する翻訳後の改変
（正しい折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ） と正しい部位で
のグリコジル化）を可能にするため、補乳動物細胞（た
とえばヒト、サル、マウス、チーズハムスター卵巣細胞
（ｃＨＯ） ）は、好適な真核生物宿主細胞である。酵
母細胞もグリコジル化などの翻訳後の改変が可能である
。
ター又はＤＮＡ配列が発現用に調製されたら、ＤＮＡ作
成物を任意の方法で適当な宿主細胞中に導入することが
できる：形質転換、トランスフェクション（ｌｒａｎｓ
ｌｃｃｌｉｏｎ）、結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）
、原形質融合、エレクトロポレーション（！１ｅｃｔｒ
ｏｐｏｒａｌｉｏｎ）、リン酸カルシウム沈澱、直接マ
イクロインジェクション（ｄｉｕｃｊ ｍｉｃ＋ｏｉｎ
ｊｅｃｔｉｏｎ）など。本発明で使用する宿主細胞は、
原核生物でも真核生物でもよい。好適な原核生物宿主細
胞としては、大腸菌、バシルス、放線菌、シュードモナ
ス、サルモネラ菌、セラチア菌などがある。最も好適な
原核生物宿主細胞は大腸菌である。このような条件では
、蛋白はグリコジル化されない。原核生物宿主細胞は発
現プラスミツド中のレプリコンや調節配列に対して融和
性がなければならない。蛋白分子に対する翻訳後の改変
（正しい折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ） と正しい部位で
のグリコジル化）を可能にするため、補乳動物細胞（た
とえばヒト、サル、マウス、チーズハムスター卵巣細胞
（ｃＨＯ） ）は、好適な真核生物宿主細胞である。酵
母細胞もグリコジル化などの翻訳後の改変が可能である
。
ベクターの導入後宿主細胞を選択培地で増殖させて、ベ
クター含有細胞の増殖を選択する。クローン化遺伝子配
列の発現により、所望のＩＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６−Ｒ
フラグメントが産生される。
クター含有細胞の増殖を選択する。クローン化遺伝子配
列の発現により、所望のＩＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６−Ｒ
フラグメントが産生される。
次に本明細書に記載の精製法又は他の従来法（例えば抽
出、沈澱、クロマトグラフィー、電気泳動など）により
、発現蛋白を単離し精製する。
出、沈澱、クロマトグラフィー、電気泳動など）により
、発現蛋白を単離し精製する。
本発明の蛋白に優先的に使用される精製法は、産生後カ
ラム内に含まれるゲルマトリックスに固定化された抗−
ＩＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６−Ｒモノクローナル抗体を使
用するアフィニティクロマトグラフィーである。組み換
え蛋白を含む不純物調製物をこのカラムに通す。特異的
抗体により蛋白はカラムに結合し、不純物は通過してい
く。洗滌後ｐ）Ｉ又はイオン強度を変えてゲルから蛋白
を溶出する。
ラム内に含まれるゲルマトリックスに固定化された抗−
ＩＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６−Ｒモノクローナル抗体を使
用するアフィニティクロマトグラフィーである。組み換
え蛋白を含む不純物調製物をこのカラムに通す。特異的
抗体により蛋白はカラムに結合し、不純物は通過してい
く。洗滌後ｐ）Ｉ又はイオン強度を変えてゲルから蛋白
を溶出する。
本明細書における「塩」という語は、当業者に公知の手
段で形成された蛋白分子のカルボキシル基の塩及びアミ
ノ基の酸付加塩を意味する。カルボキシル基の塩として
は、無機塩（例えばナトリウム、カルシウム）、及び有
機塩（例えばトリエタノールアミン、アルギニン、リジ
ン）との塩がある。酸付加塩としては例えば無機酸との
塩や有機酸との塩がある。
段で形成された蛋白分子のカルボキシル基の塩及びアミ
ノ基の酸付加塩を意味する。カルボキシル基の塩として
は、無機塩（例えばナトリウム、カルシウム）、及び有
機塩（例えばトリエタノールアミン、アルギニン、リジ
ン）との塩がある。酸付加塩としては例えば無機酸との
塩や有機酸との塩がある。
本明細書における「官能性誘導体」とは、当業者に公知
の方法で、残基の側鎖又はＮ末端又はＣ末端上に存在す
る官能基から調製される誘導体を意味し、薬剤として許
容される限り（即ち蛋白の活性を破壊せず、これを含有
する組成物に毒性を与えない限り）本発明に含まれる。
の方法で、残基の側鎖又はＮ末端又はＣ末端上に存在す
る官能基から調製される誘導体を意味し、薬剤として許
容される限り（即ち蛋白の活性を破壊せず、これを含有
する組成物に毒性を与えない限り）本発明に含まれる。
これらの誘導体としては、カルボキシル基の脂肪族エス
テル又はアミド、及びアシル分子（例えばアルカノイル
基又はカルボサイクリックアロイル基）と形成される遊
離アミノ基のＮ−アシル誘導体、又は遊離ヒドロキシ基
のＯ−アシル誘導体がある。
テル又はアミド、及びアシル分子（例えばアルカノイル
基又はカルボサイクリックアロイル基）と形成される遊
離アミノ基のＮ−アシル誘導体、又は遊離ヒドロキシ基
のＯ−アシル誘導体がある。
「前駆体」とは、動物またはヒト体内において、ＩＦＮ
−β２／ＩＬ−６−Ｒの前に形成され、それに変換され
る化合物である。実質的に精製された蛋白質の「活性分
画」として、本発明は、蛋白質分子のポリペプチド鎖の
任意のフラグメントまたはその前駆体の単独、ならびに
その分画が細胞に対するＴＮＦの細胞毒作用の阻害能お
よび／または長期にその有益な作用を維持する能力があ
る限り、それらと会合した分子または結合した残基、た
とえば糖もしくはリン酸残基を伴う蛋白質、または蛋白
質分子または糖残基の凝集体自体も包含する。
−β２／ＩＬ−６−Ｒの前に形成され、それに変換され
る化合物である。実質的に精製された蛋白質の「活性分
画」として、本発明は、蛋白質分子のポリペプチド鎖の
任意のフラグメントまたはその前駆体の単独、ならびに
その分画が細胞に対するＴＮＦの細胞毒作用の阻害能お
よび／または長期にその有益な作用を維持する能力があ
る限り、それらと会合した分子または結合した残基、た
とえば糖もしくはリン酸残基を伴う蛋白質、または蛋白
質分子または糖残基の凝集体自体も包含する。
本発明はさらに、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒおよびそ
の可溶性細胞外フラグメントに対する抗体、ならびにそ
のＦ（ａｂ）フラグメントに関する。本発明の抗体とＩ
ＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６−Ｒとの機能的相互作用は、あ
る種の疾患において生体内での細胞によるＩＦＮ−β２
／Ｉ Ｌ−６−Ｒの産生過剰または過少を免疫検定法た
とえば放射免疫検定法、ＥＬＩＳＡ等に基づいて検出す
る新しい診断手段を提供する。
の可溶性細胞外フラグメントに対する抗体、ならびにそ
のＦ（ａｂ）フラグメントに関する。本発明の抗体とＩ
ＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６−Ｒとの機能的相互作用は、あ
る種の疾患において生体内での細胞によるＩＦＮ−β２
／Ｉ Ｌ−６−Ｒの産生過剰または過少を免疫検定法た
とえば放射免疫検定法、ＥＬＩＳＡ等に基づいて検出す
る新しい診断手段を提供する。
抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でも
よう。またそれらはウサギ、マウス、又は他の動物、又
はそれらに由来する培養組繊細胞、又はヒトの細胞由来
の産生物でもよい。これらは天然の抗体と同じ形か又は
キメラ分子（ヒトの抗体と動物の抗体の組換えにより作
成される）の形、又は抗体を治療に最も適した形にし 抗体の発生レベルは、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６のハイブ
リドーマ成長因子（ＨＧＦ）活性の、動物血清による阻
害能で追跡する。
よう。またそれらはウサギ、マウス、又は他の動物、又
はそれらに由来する培養組繊細胞、又はヒトの細胞由来
の産生物でもよい。これらは天然の抗体と同じ形か又は
キメラ分子（ヒトの抗体と動物の抗体の組換えにより作
成される）の形、又は抗体を治療に最も適した形にし 抗体の発生レベルは、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６のハイブ
リドーマ成長因子（ＨＧＦ）活性の、動物血清による阻
害能で追跡する。
抗体の調製には、精製ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６受容体も
しくはその可溶性細胞外フラグメントまたは蛋白質の既
知の配列たとえばＮ−末端蛋白質配列と同一の１種もし
くは２種以上の合成ペプチドを使用して動物を免疫する
。他の可能性としては受容体のフラグメントをコードす
るヌクレオチド配列の１種をプロティン八をコードする
遺伝子に融合し、融合プロティンＡ−Ｉ ＦＮ−β２／
ＩＬ−６〜Ｒ遺伝子を大腸菌内で発現させ、融合蛋白質
をＩ ｇＧ ５ｅｐｈａ＋ｏｓｅカラム上アフィニテ
ィークロマトグラフィーで精製し、ついでこれを用いて
動物を免疫する方法がある。
しくはその可溶性細胞外フラグメントまたは蛋白質の既
知の配列たとえばＮ−末端蛋白質配列と同一の１種もし
くは２種以上の合成ペプチドを使用して動物を免疫する
。他の可能性としては受容体のフラグメントをコードす
るヌクレオチド配列の１種をプロティン八をコードする
遺伝子に融合し、融合プロティンＡ−Ｉ ＦＮ−β２／
ＩＬ−６〜Ｒ遺伝子を大腸菌内で発現させ、融合蛋白質
をＩ ｇＧ ５ｅｐｈａ＋ｏｓｅカラム上アフィニテ
ィークロマトグラフィーで精製し、ついでこれを用いて
動物を免疫する方法がある。
本発明のモノクローナル抗体は従来のハイブリドーマ技
術により調製される（コーラ−１１：ｏｈｌｅ＋）ら、
ネーチャ（Ｎａｔｕ「ｅ）、第２５６巻、４９５頁（１
９７５年）、コーラ−（にｏｈｌｃｒ）ら、ヨーロピア
ンジャーナルオブイミュノロジー（Ｅｕ＋、ＩＩｍｍｕ
ｎｏｌ、） 、第６巻、５１１頁、（１９７６年））。
術により調製される（コーラ−１１：ｏｈｌｅ＋）ら、
ネーチャ（Ｎａｔｕ「ｅ）、第２５６巻、４９５頁（１
９７５年）、コーラ−（にｏｈｌｃｒ）ら、ヨーロピア
ンジャーナルオブイミュノロジー（Ｅｕ＋、ＩＩｍｍｕ
ｎｏｌ、） 、第６巻、５１１頁、（１９７６年））。
免疫後牌臓細胞を単独で又は免疫動物のリンパ節細胞と
共に単離し、適当なミエロマー細胞株と融合させる。融
合後得られたハイブリドーマ細胞をＨＡ Ｔ培地中で選
択的に維持した後クローン化する。次にこの選択により
得られたハイブリドーマを検定して、ＩＦＮ−β２／Ｉ
Ｌ−６受容体またはその可溶性細胞外フラグメントに結
合可能な抗体を分泌するクローンを同定する。同定後、
所望のクローンを懸澗培養液中で、または適当な宿主マ
ウスの腹膜に注射して腹水中で、大量に壜殖させる。つ
いで、ハイブリドーマによって産生されるモノクローナ
ル抗体を単離し、精製する。
共に単離し、適当なミエロマー細胞株と融合させる。融
合後得られたハイブリドーマ細胞をＨＡ Ｔ培地中で選
択的に維持した後クローン化する。次にこの選択により
得られたハイブリドーマを検定して、ＩＦＮ−β２／Ｉ
Ｌ−６受容体またはその可溶性細胞外フラグメントに結
合可能な抗体を分泌するクローンを同定する。同定後、
所望のクローンを懸澗培養液中で、または適当な宿主マ
ウスの腹膜に注射して腹水中で、大量に壜殖させる。つ
いで、ハイブリドーマによって産生されるモノクローナ
ル抗体を単離し、精製する。
前述したように、モノクローナル抗体は固定化し、免疫
吸着カラムを使用するアフィニティー精製操作でのＩＦ
Ｎ−β２／ＩＬ−６受容体またはその可溶性細胞外フラ
グメントの精製に使用することもできる。
吸着カラムを使用するアフィニティー精製操作でのＩＦ
Ｎ−β２／ＩＬ−６受容体またはその可溶性細胞外フラ
グメントの精製に使用することもできる。
ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒおよその可溶性細胞外フラ
グメント、ならびにそれらの塩、官能性誘導体、前駆体
および活性分画、およびこれらの任意の混合物は、哺乳
動物におけるＩＦＮ−β２／［Ｌ−６の望ましい作用た
とえばＩＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６の抗増殖活性の刺激お
よび増強に使用できる。
グメント、ならびにそれらの塩、官能性誘導体、前駆体
および活性分画、およびこれらの任意の混合物は、哺乳
動物におけるＩＦＮ−β２／［Ｌ−６の望ましい作用た
とえばＩＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６の抗増殖活性の刺激お
よび増強に使用できる。
本発明はさらに、医薬的に許容される担体、と、１ＦＮ
−β２／ＩＬ−６ならびにＩＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６−
Ｒ，その可溶性細胞外フラグメント、またはそれらの塩
、官能性誘導体、前駆体もしくは活性分画およびそれら
の任意の混合物を活性成分として含有する医薬組成物に
関する。これらの組成物は、Ｉ Ｌ−６の活性の刺激を
所望の場合に使用できる。もちろん、ＩＦＮ−β２／Ｉ
Ｌ−６の投与量は、受容体の増強作用という点から低い
ものである。投与方法は類似の薬剤について一般に受は
入れられている任意の方法が使用でき、処置すべき状態
によって決定される。
−β２／ＩＬ−６ならびにＩＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６−
Ｒ，その可溶性細胞外フラグメント、またはそれらの塩
、官能性誘導体、前駆体もしくは活性分画およびそれら
の任意の混合物を活性成分として含有する医薬組成物に
関する。これらの組成物は、Ｉ Ｌ−６の活性の刺激を
所望の場合に使用できる。もちろん、ＩＦＮ−β２／Ｉ
Ｌ−６の投与量は、受容体の増強作用という点から低い
ものである。投与方法は類似の薬剤について一般に受は
入れられている任意の方法が使用でき、処置すべき状態
によって決定される。
本発明の医薬組成物は、活性成分を生理的に許容される
担体、安定剤および賦形剤と混合して投与用に調製され
、適当な射影たとえばバイアル中に加えた凍結乾燥物と
することができる。活性化合物の投与量は、投与経路、
処置する疾患および患者の状態によって変動する。
担体、安定剤および賦形剤と混合して投与用に調製され
、適当な射影たとえばバイアル中に加えた凍結乾燥物と
することができる。活性化合物の投与量は、投与経路、
処置する疾患および患者の状態によって変動する。
ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒおよびその可溶性細胞外フ
ラグメントならびにそれらの塩、官能性誘導体、前駆体
および活性分画、およびこれらの任意の混合物はまた、
単独で、細菌感染、火傷、外傷などのような状態に際し
て内因性に生成されるＩＦＮ−β２／ＩＬ−６の活性を
増強するために使用できる。
ラグメントならびにそれらの塩、官能性誘導体、前駆体
および活性分画、およびこれらの任意の混合物はまた、
単独で、細菌感染、火傷、外傷などのような状態に際し
て内因性に生成されるＩＦＮ−β２／ＩＬ−６の活性を
増強するために使用できる。
次に本発明を以下の実施例によって例示するが、これは
本発明を限定するものではない。
本発明を限定するものではない。
例１
１ＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６受容体のヒト胎盤から胎盤膜
はＲ１＾、 Ｈａｃｋ ＆ Ｍ、 Ｄ、 Ｈｏ１ｌｅｎ
ｅｂｅ＋ｇの方法（１，ｂｉｏｌ、ｃｂ！ｍ、、 ２
５５．１０７３１〜１０７３６．１９８０）に従い以下
のようにして調製する。
はＲ１＾、 Ｈａｃｋ ＆ Ｍ、 Ｄ、 Ｈｏ１ｌｅｎ
ｅｂｅ＋ｇの方法（１，ｂｉｏｌ、ｃｂ！ｍ、、 ２
５５．１０７３１〜１０７３６．１９８０）に従い以下
のようにして調製する。
胎盤片を２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７゜４．
０．２５Ｍスクロース、Ｏ，ＩＭ ＮａＣｌ。
０．２５Ｍスクロース、Ｏ，ＩＭ ＮａＣｌ。
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２．２ｍＭ ＥＧＴＡ、１ｍ
Ｍ ＰＭＳＦおよび２２Ｔｔｕ／ｍ＋アプロチニンか
らなる緩衝液中でホモジナイズし、ついでガーゼを通し
て濾過し、遠心分離する（１．０．ＯＯｔ）Ｘｇ、３０
分、４℃）。上澄液にＮａＣ１とＭｇＳＯ４を加え、終
濃度をそれぞれ０．１Ｍおよび０．２ｍＭとする。混合
物を遠心分離しく４８．ｏｏｏｘｇ、４０分、４℃）、
得られたペレットを１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ 、ｐＨ７
，４，１５０ｍＭ ＮａＣ１，１ｍＭ ＰＭＳＦお
よび２２Ｔｉｕ／ｍｌの緩衝液中に再懸濁する。ついで
、膜を可溶化緩衝液（終濃度： ｌ ＯｍＭ ｔｌｅ
ｐｅｓ 。
Ｍ ＰＭＳＦおよび２２Ｔｔｕ／ｍ＋アプロチニンか
らなる緩衝液中でホモジナイズし、ついでガーゼを通し
て濾過し、遠心分離する（１．０．ＯＯｔ）Ｘｇ、３０
分、４℃）。上澄液にＮａＣ１とＭｇＳＯ４を加え、終
濃度をそれぞれ０．１Ｍおよび０．２ｍＭとする。混合
物を遠心分離しく４８．ｏｏｏｘｇ、４０分、４℃）、
得られたペレットを１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ 、ｐＨ７
，４，１５０ｍＭ ＮａＣ１，１ｍＭ ＰＭＳＦお
よび２２Ｔｉｕ／ｍｌの緩衝液中に再懸濁する。ついで
、膜を可溶化緩衝液（終濃度： ｌ ＯｍＭ ｔｌｅ
ｐｅｓ 。
ｐＨ’７． ４．１〜２％Ｔｒｉｌｏｎ Ｘ −１００
，１ｍＭＰＭＳＦおよび２０単位／ｎ＋Ｉアプロチニン
）中に溶解する。この懸濁液を最初１０．０００Ｘｇで
１５分間、ついで１００．０００Ｘｇで６０分間遠心分
離する。上澄液を固定化ＩＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６カラ
ムに適用する（０．８ｍｌのＡｌｌｉｇｅｌｏあたり２
．５ｍｇ）。負荷は流速０．２〜０．５ｍｌ／分で行う
。次にカラムをＰＢＳ （５０ｍｌ）で洗浄し、結合し
た物質を２５ｍＭクエン酸溶液で溶出する。１ｍｌずつ
の分画を集め、直ちにＬＭ Ｈｅｐｅｓ 、 ｐＨ８
，５で中和する。各分画について、その１２５１−ＩＦ
Ｎ−β２／ＩＬ−６結合能と蛋白質含量を調べる。蛋白
質はフロレスカミ°ンで定量する。
，１ｍＭＰＭＳＦおよび２０単位／ｎ＋Ｉアプロチニン
）中に溶解する。この懸濁液を最初１０．０００Ｘｇで
１５分間、ついで１００．０００Ｘｇで６０分間遠心分
離する。上澄液を固定化ＩＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６カラ
ムに適用する（０．８ｍｌのＡｌｌｉｇｅｌｏあたり２
．５ｍｇ）。負荷は流速０．２〜０．５ｍｌ／分で行う
。次にカラムをＰＢＳ （５０ｍｌ）で洗浄し、結合し
た物質を２５ｍＭクエン酸溶液で溶出する。１ｍｌずつ
の分画を集め、直ちにＬＭ Ｈｅｐｅｓ 、 ｐＨ８
，５で中和する。各分画について、その１２５１−ＩＦ
Ｎ−β２／ＩＬ−６結合能と蛋白質含量を調べる。蛋白
質はフロレスカミ°ンで定量する。
例２
健康な更年期の婦人からの尿２００１のプールを、孔径
０．４５４ｍのＰｅ１ｌｉｃｏｎ膜上、精密濾過に付し
た。濾液を、分子量カットオフＩＯＫのＰｅ１ｌｉｃｏ
ｎ膜を用い、最終審ｆｆｉ５００ｍｌに限外濾過した。
０．４５４ｍのＰｅ１ｌｉｃｏｎ膜上、精密濾過に付し
た。濾液を、分子量カットオフＩＯＫのＰｅ１ｌｉｃｏ
ｎ膜を用い、最終審ｆｆｉ５００ｍｌに限外濾過した。
この濃縮液を、１ｍＭベンズアミジンおよび０． １％
ナトリウムアジドを含むリン酸緩衝食塩溶液に対して透
析した。
ナトリウムアジドを含むリン酸緩衝食塩溶液に対して透
析した。
２、 ２． ＣＭ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ上イオン交換
り０７トグラフイー ＣＭ−３ｅｐｈａ＋ｏｓｅ （Ｐｈａｒａｍｃｔａ、
Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）陽イオン交換カラム（
２，７Ｘ１０ｃｍ）を０．０２％Ｎ ａ Ｎ ３含有Ｌ
Ｍ ＮａＣ１゜１３ｍＭクエン酸ｐＨ５，０（緩衝液
Ｃ）で前洗浄し、０．０２％Ｎ ａ Ｎ ３含有１０ｍ
Ｍクエン酸ｐ＋＋５．０（緩衝液Ａ）で平衡化した。尿
蛋白質の濃縮液を緩衝液に対して透析し、ｓ、０００Ｘ
ｇで１５分間遠心分離した。上澄液を４℃において、流
速２ｍ１／分でカラムに適用した。カラムを１．５００
ｍ１の緩衝液Ａで洗浄し、２００ｍＭＮａＣｌ、ｌＱｍ
Ｍクエン酸（ｐＨ１５，０）および０．０２％Ｎ ａ
Ｎ ３を含む溶液（緩衝液Ｂ）２５０ｍｌで溶出した。
り０７トグラフイー ＣＭ−３ｅｐｈａ＋ｏｓｅ （Ｐｈａｒａｍｃｔａ、
Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）陽イオン交換カラム（
２，７Ｘ１０ｃｍ）を０．０２％Ｎ ａ Ｎ ３含有Ｌ
Ｍ ＮａＣ１゜１３ｍＭクエン酸ｐＨ５，０（緩衝液
Ｃ）で前洗浄し、０．０２％Ｎ ａ Ｎ ３含有１０ｍ
Ｍクエン酸ｐ＋＋５．０（緩衝液Ａ）で平衡化した。尿
蛋白質の濃縮液を緩衝液に対して透析し、ｓ、０００Ｘ
ｇで１５分間遠心分離した。上澄液を４℃において、流
速２ｍ１／分でカラムに適用した。カラムを１．５００
ｍ１の緩衝液Ａで洗浄し、２００ｍＭＮａＣｌ、ｌＱｍ
Ｍクエン酸（ｐＨ１５，０）および０．０２％Ｎ ａ
Ｎ ３を含む溶液（緩衝液Ｂ）２５０ｍｌで溶出した。
溶出の第二工程は１５０ｍ１の緩衝液Ｃで実施した。５
０ｍ１の分画を集め、１．ＦＮ−β２／ＩＬ−６結合能
（１２５１−ＩＦＮ−β２／ ＩＬ−６の結合）につ
いて試験し、蛋白質濃度を測定した。
０ｍ１の分画を集め、１．ＦＮ−β２／ＩＬ−６結合能
（１２５１−ＩＦＮ−β２／ ＩＬ−６の結合）につ
いて試験し、蛋白質濃度を測定した。
ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６を濃度５ ｍｇ／ ｍｌとし、
ついで０．００２％ナトリウムアジド含有ＰＢＳで平衡
化してＡｌｌｉｇｃｌ −１０にカップリングさせた（
０．８ｍｌのビーズに２．５ｍｇ）。工程２．１または
２，２の尿蛋白質の濃縮液をリン酸緩衝食塩溶液（Ｐ
Ｂ Ｓ）で平衡化し、４°Ｃにおいて流速０．２ｍｌ／
分でＩＦＮ−β２／ＩＬ−６＾１１ｉｇｅ１１０カラム
（０，８ｍｌの屓１ｉｂｅｌ −１０に２．５ｍｇの蛋
白質が結合）に適用した。非結合蛋白質をＰＢＳで洗浄
し、結合蛋白質をついでｐＨ２，５で２５ｍＭクエン酸
溶液を適用することにより溶出し、１ ｍｌずつの分画
を、ＬＭ Ｈｅｐｅｓ。
ついで０．００２％ナトリウムアジド含有ＰＢＳで平衡
化してＡｌｌｉｇｃｌ −１０にカップリングさせた（
０．８ｍｌのビーズに２．５ｍｇ）。工程２．１または
２，２の尿蛋白質の濃縮液をリン酸緩衝食塩溶液（Ｐ
Ｂ Ｓ）で平衡化し、４°Ｃにおいて流速０．２ｍｌ／
分でＩＦＮ−β２／ＩＬ−６＾１１ｉｇｅ１１０カラム
（０，８ｍｌの屓１ｉｂｅｌ −１０に２．５ｍｇの蛋
白質が結合）に適用した。非結合蛋白質をＰＢＳで洗浄
し、結合蛋白質をついでｐＨ２，５で２５ｍＭクエン酸
溶液を適用することにより溶出し、１ ｍｌずつの分画
を、ＬＭ Ｈｅｐｅｓ。
ｐＨ８，５を含む試験管に集めた。溶出した蛋白質は、
電気プロッティングによって蛋白質と １２５１−ＩＦ
Ｎ−β２／ＩＬ−６の結合についてモニタリングした。
電気プロッティングによって蛋白質と １２５１−ＩＦ
Ｎ−β２／ＩＬ−６の結合についてモニタリングした。
２．４．逆相高圧液体クロマトグラフィー逆相ＨＰＬＣ
カラムＡｑｕａｐｏ＋ｅ ＲＰ −３００４、６Ｘ ３
０ｍｍ（Ｂ＋ｏｗｎｌｅｅ Ｌａｂｓ）を、フロレスカ
ミン検出系によって安定な基線が得られるまで、０．３
％トリフルオロ酢酸（Ｔ Ｆ Ａ）水溶液（緩衝液Ｆ）
で前洗浄した。工程２．３のアフィニティーＩＦＮ−β
２／ＩＬ−６カラムから溶出された蛋白質をピーク分画
を集め、カラムにその１．８ｍｌを注入した。カラムに
緩衝液Ｆを蛍光計が蛋白質を検知しなくなるまで、流速
０．５ｍｌ／分で流した。溶出は、緩衝液Ｆ中アセトニ
トリルの直線勾配で（−−−，５分間０〜２０％、つい
で６０分間２０〜５０％、最後に５分間５０〜８０％）
、流速０．５ｍｌ／分において実施した。次にカラムを
８０％アセトニトリルで１５分間洗浄した。各０．５ｍ
ｌの分画を集め、蛋白質含量（＝）および電気プロッテ
ィングによる １２５１−ＩＩ？Ｎ−β２／ＩＬ−６の結合を試験した
。第１図に示すように、活性蛋白質はアセトニトリル約
３９％に相当する分画に１個の蛋白質ピークとして溶出
されることが明らかにされた。
カラムＡｑｕａｐｏ＋ｅ ＲＰ −３００４、６Ｘ ３
０ｍｍ（Ｂ＋ｏｗｎｌｅｅ Ｌａｂｓ）を、フロレスカ
ミン検出系によって安定な基線が得られるまで、０．３
％トリフルオロ酢酸（Ｔ Ｆ Ａ）水溶液（緩衝液Ｆ）
で前洗浄した。工程２．３のアフィニティーＩＦＮ−β
２／ＩＬ−６カラムから溶出された蛋白質をピーク分画
を集め、カラムにその１．８ｍｌを注入した。カラムに
緩衝液Ｆを蛍光計が蛋白質を検知しなくなるまで、流速
０．５ｍｌ／分で流した。溶出は、緩衝液Ｆ中アセトニ
トリルの直線勾配で（−−−，５分間０〜２０％、つい
で６０分間２０〜５０％、最後に５分間５０〜８０％）
、流速０．５ｍｌ／分において実施した。次にカラムを
８０％アセトニトリルで１５分間洗浄した。各０．５ｍ
ｌの分画を集め、蛋白質含量（＝）および電気プロッテ
ィングによる １２５１−ＩＩ？Ｎ−β２／ＩＬ−６の結合を試験した
。第１図に示すように、活性蛋白質はアセトニトリル約
３９％に相当する分画に１個の蛋白質ピークとして溶出
されることが明らかにされた。
精製の結果をモニタリングするため、ＬａｅｍｍＵ、
Ｋ、らの方法（Ｎａｔｕｒｅ ２２７＋６８０． １
９７０）の方法に従い、非還元条件下にドデシル硫酸ナ
トリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）を実施した。逆相）（Ｐ Ｉ−Ｃから溶出する
活性分画のサンプルを、ＳＤＳもβメルカプトエタノー
ルも含まない３×濃縮サンプル緩衝液と混合し、１２％
アクリルアミドゲル上に負荷した。第２図においては、
分子量指標として分子量マーカー混合物（α−ラクトア
ルブミン１４．４に、大豆トリプシンインヒビター２０
．１に、炭酸デヒドロターゼ３０に１オバルブミン４３
に１ウシ血清アルブミン６７に１およびホスホリラーゼ
ｂ ９４Ｋ）をレーン１に負荷した。ゲルは１５０
ボルトで流し、蛋白質バンドは銀染色（Ｏａｋｌｅｙ、
Ｂ、 Ｒ，ら： Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ１０５
：３６１）で可視化した。レーン２には、ＨＰＬＣ精製
ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６結合蛋白質が、見掛けの分子量
５０（４０〜６０）Ｋで単一のバンドとして移動するこ
とが認められる。
Ｋ、らの方法（Ｎａｔｕｒｅ ２２７＋６８０． １
９７０）の方法に従い、非還元条件下にドデシル硫酸ナ
トリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ）を実施した。逆相）（Ｐ Ｉ−Ｃから溶出する
活性分画のサンプルを、ＳＤＳもβメルカプトエタノー
ルも含まない３×濃縮サンプル緩衝液と混合し、１２％
アクリルアミドゲル上に負荷した。第２図においては、
分子量指標として分子量マーカー混合物（α−ラクトア
ルブミン１４．４に、大豆トリプシンインヒビター２０
．１に、炭酸デヒドロターゼ３０に１オバルブミン４３
に１ウシ血清アルブミン６７に１およびホスホリラーゼ
ｂ ９４Ｋ）をレーン１に負荷した。ゲルは１５０
ボルトで流し、蛋白質バンドは銀染色（Ｏａｋｌｅｙ、
Ｂ、 Ｒ，ら： Ａｎａｌ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ１０５
：３６１）で可視化した。レーン２には、ＨＰＬＣ精製
ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６結合蛋白質が、見掛けの分子量
５０（４０〜６０）Ｋで単一のバンドとして移動するこ
とが認められる。
” Ｉ −Ｉ Ｆ Ｎ−β２／ＩＬ−６（２，２Ｘ１０
７ｃｐｍ／ｐｇ、１．５ ｘ １０’ ｃ ｐｍ／ｍｌ
）の結合は非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより行い、
ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｔ ＆ ５ｃ
ｈｕｅｌＯ，４５ｊｍ）上への電気プロッティングはウ
ェスタンプロット法（Ｔｏｗｂｉｎ、 Ｈ，ら： Ｐｔ
ｏｃ、 Ｈｕｌｌ、＾ｃａｄＳｉｃ、ＵＳＡ、７６：４
３５０〜４３５４．１９７９）にほぼ従って実施した。
７ｃｐｍ／ｐｇ、１．５ ｘ １０’ ｃ ｐｍ／ｍｌ
）の結合は非還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより行い、
ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｔ ＆ ５ｃ
ｈｕｅｌＯ，４５ｊｍ）上への電気プロッティングはウ
ェスタンプロット法（Ｔｏｗｂｉｎ、 Ｈ，ら： Ｐｔ
ｏｃ、 Ｈｕｌｌ、＾ｃａｄＳｉｃ、ＵＳＡ、７６：４
３５０〜４３５４．１９７９）にほぼ従って実施した。
レーン３にみられるように、ＩＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６
アフイニテイーカラム溶出液からの部分精製蛋白質の５
０（４０〜６０）Ｋ蛋白質のみが１２５１−ＩＦＮ−β
２／ＩＬ−６と特異的に反応した。ＩＦＮ−γアフィニ
ティーカラム溶出液からの精製ＩＦＮ−γ結合蛋白質を
陰性対照として用いた（レーン４）。レーン３および４
はオートラジオグラフィーによって可視化した。
アフイニテイーカラム溶出液からの部分精製蛋白質の５
０（４０〜６０）Ｋ蛋白質のみが１２５１−ＩＦＮ−β
２／ＩＬ−６と特異的に反応した。ＩＦＮ−γアフィニ
ティーカラム溶出液からの精製ＩＦＮ−γ結合蛋白質を
陰性対照として用いた（レーン４）。レーン３および４
はオートラジオグラフィーによって可視化した。
２．６．Ｎ−末端配列解析
本発明の実質的に精製されたＩＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６
−Ｒ可溶性細胞外フラグメントのサンプル（各１〜５μ
ｇ１５０〜２００ ｐｍｏｌ）を、前処置したｂｉｏｂ
ｒｅｎ！コートガラス繊維ディスクに適用した。乾燥デ
ィスクを、自動パルス液気相蛋白質微量シクエンサ−（
４７５型）とオンラインＨＰＬＣＰＴＨ−アミノ酸分析
計（１２０型）、データ取得および処理ユニット９００
型（すべてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉａｓｙｓｌｅｍｔ Ｉ
ｎｃ、、Ｆｏｓｔｅ＋ Ｃ１ｔｙ、ＣＡ、 ｔｌｓＡ
）を用いてＥｄｍａｎ分解の反復サイクルに付した。コ
ンピューターで得られた配列を生データと比較し、必要
に応じて補正を行った。配列データの確認のために、す
べて２回の分析を別個に実施した。初期収率は４０％以
上で、プレバレージョン中の主要蛋白質（５０にバンド
）が得られた配列に適合することを示している。このＩ
ＦＮ−β２／ｒＬ−６−Ｒの可溶性細胞外フラグメント
のＮ−末端配列決定では以下のアミノ酸配列が得られた
。
−Ｒ可溶性細胞外フラグメントのサンプル（各１〜５μ
ｇ１５０〜２００ ｐｍｏｌ）を、前処置したｂｉｏｂ
ｒｅｎ！コートガラス繊維ディスクに適用した。乾燥デ
ィスクを、自動パルス液気相蛋白質微量シクエンサ−（
４７５型）とオンラインＨＰＬＣＰＴＨ−アミノ酸分析
計（１２０型）、データ取得および処理ユニット９００
型（すべてＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉａｓｙｓｌｅｍｔ Ｉ
ｎｃ、、Ｆｏｓｔｅ＋ Ｃ１ｔｙ、ＣＡ、 ｔｌｓＡ
）を用いてＥｄｍａｎ分解の反復サイクルに付した。コ
ンピューターで得られた配列を生データと比較し、必要
に応じて補正を行った。配列データの確認のために、す
べて２回の分析を別個に実施した。初期収率は４０％以
上で、プレバレージョン中の主要蛋白質（５０にバンド
）が得られた配列に適合することを示している。このＩ
ＦＮ−β２／ｒＬ−６−Ｒの可溶性細胞外フラグメント
のＮ−末端配列決定では以下のアミノ酸配列が得られた
。
ｔｅＩＩ−Ａｌｔ−Ｐ【ｏ−Ａｒ１−ＡｒＩ−Ｃ７ｔ−
Ｆ＋ｏ−＾Ｉｔ−Ｇｌｎ−ＧＩｎ−ｖ１−＾ＩＭ−＾＋
１−ＧＩＴ−Ｖｔｌ−Ｌｅｎ−Ｔｈ＋−５ｃｒ−Ｌｅｗ
−Ｐ＋ａ−Ｇ１７−＾＋ｐ−３ｅｒ−Ｖｔｌ−丁ｂｒ−
Ｌｅａ−丁ｈ＋−Ｃｙ＋−Ｐｒｏ−Ｇ１７例３ ＩＦＮ−β２／ＩＩ、−６−Ｒに対するポリクローナル
抗体の製造 ＩＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメン
トの純粋なプレバレージョン１０μｇを完全フロインド
アジュバント中に乳化してウサギの皮下に初期投与した
。３週後再びプレバレージョン１．０ｐｇを、不完全７
０インドアジユバント中、皮下注射した。さらにＰＢＳ
中溶液として３回の注射を１０日間隔で行った。最後の
免疫処置後１０日目にウサギから採血した。ＩＦＮ−β
２／ＩＬ−６のＨＧＦ （ハイブリドーマ成長因子）活
性のウサギ血清による阻害能を用いて、発生した抗レベ
ルを追跡した。ウサギ血清の免疫グロブリンを硫酸アン
モニウムの添加によって沈殿させ、遠心分離し、透析お
よびクロマトグラフィーによって精製した。
Ｆ＋ｏ−＾Ｉｔ−Ｇｌｎ−ＧＩｎ−ｖ１−＾ＩＭ−＾＋
１−ＧＩＴ−Ｖｔｌ−Ｌｅｎ−Ｔｈ＋−５ｃｒ−Ｌｅｗ
−Ｐ＋ａ−Ｇ１７−＾＋ｐ−３ｅｒ−Ｖｔｌ−丁ｂｒ−
Ｌｅａ−丁ｈ＋−Ｃｙ＋−Ｐｒｏ−Ｇ１７例３ ＩＦＮ−β２／ＩＩ、−６−Ｒに対するポリクローナル
抗体の製造 ＩＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメン
トの純粋なプレバレージョン１０μｇを完全フロインド
アジュバント中に乳化してウサギの皮下に初期投与した
。３週後再びプレバレージョン１．０ｐｇを、不完全７
０インドアジユバント中、皮下注射した。さらにＰＢＳ
中溶液として３回の注射を１０日間隔で行った。最後の
免疫処置後１０日目にウサギから採血した。ＩＦＮ−β
２／ＩＬ−６のＨＧＦ （ハイブリドーマ成長因子）活
性のウサギ血清による阻害能を用いて、発生した抗レベ
ルを追跡した。ウサギ血清の免疫グロブリンを硫酸アン
モニウムの添加によって沈殿させ、遠心分離し、透析お
よびクロマトグラフィーによって精製した。
例４
Ｂａｌｂ／Ｃ雌性マウス（３月齢）に最初、精製ＩＦＮ
−β２／ＩＬ−ｆ３−Ｒ可溶性細胞外フラグメント２．
５μｇを完全フロインドアジュバントに乳化して注射し
、３週後に不完全アジュバント中で皮下注射した。さら
にＰＢＳ中での注射を３回、１０日間隔で皮下に行った
。最終の増強は融合の３日前、倒立固相ｔＡで最高の結
合力価を示すマウスの腹腔内に実施した。融合は、融合
パートナ−としてその動物のいずれも肺臓およびリンパ
節から調製したリンパ球とＮＳＯ／１骨髄腫細胞とを用
いて行った。融合細胞は微小培養プレート中に分配し、
ＨＡＴおよび１５％ウマ血清補充ＤＭＥＭ中で選択した
。ＩＦＮ−β２／ＩＬ６−Ｒに対する抗体を産生ずるこ
とが明らかにされたハイブリドーマを限界希釈法でサブ
クローニングし、予め腹水の産生のためブリスタンで感
作したＢａ１ｂ／Ｃマウスに注射した。免疫グロブリン
を腹水から硫酸アンモニウム（５０％飽和）で沈殿させ
、遠心分離し、水に再溶解し、０．０２％アジド含有Ｐ
ＢＳに対して透析して単離した。抗体のアイソタイプは
市販のＥＬ Ｉ ＳＡキット（八ｍ！ｒｓｈａｍ、 Ｕ
、 ｋ、 ）を用いるか、または異なるアイソタイプに
対する市販の抗血清を用いる０ａｃｈｌｅｒｌｏＢ法で
同定した。
−β２／ＩＬ−ｆ３−Ｒ可溶性細胞外フラグメント２．
５μｇを完全フロインドアジュバントに乳化して注射し
、３週後に不完全アジュバント中で皮下注射した。さら
にＰＢＳ中での注射を３回、１０日間隔で皮下に行った
。最終の増強は融合の３日前、倒立固相ｔＡで最高の結
合力価を示すマウスの腹腔内に実施した。融合は、融合
パートナ−としてその動物のいずれも肺臓およびリンパ
節から調製したリンパ球とＮＳＯ／１骨髄腫細胞とを用
いて行った。融合細胞は微小培養プレート中に分配し、
ＨＡＴおよび１５％ウマ血清補充ＤＭＥＭ中で選択した
。ＩＦＮ−β２／ＩＬ６−Ｒに対する抗体を産生ずるこ
とが明らかにされたハイブリドーマを限界希釈法でサブ
クローニングし、予め腹水の産生のためブリスタンで感
作したＢａ１ｂ／Ｃマウスに注射した。免疫グロブリン
を腹水から硫酸アンモニウム（５０％飽和）で沈殿させ
、遠心分離し、水に再溶解し、０．０２％アジド含有Ｐ
ＢＳに対して透析して単離した。抗体のアイソタイプは
市販のＥＬ Ｉ ＳＡキット（八ｍ！ｒｓｈａｍ、 Ｕ
、 ｋ、 ）を用いるか、または異なるアイソタイプに
対する市販の抗血清を用いる０ａｃｈｌｅｒｌｏＢ法で
同定した。
抗−ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマのスクリーニングは以下のようにして
実施した。すなわち、ハイブリドーマ上澄液について、
倒立固相放射免疫検定法（ｉＲＩＡ）により抗−ＩＦＮ
−β２／ＩＩ、−６−Ｒ抗体の存在を調べた。ＰＶＣマ
イクロタイタープレー） （Ｄｙｎ［ｅｃｂ Ｌａｂａ
＋ａｌｏｒｉｃｓ、＾Ｉｅｘａｎｄｒｉａ■＾）をアフ
ィニティー精製ヤギ抗−マウス血清Ｆ（ａｂ）２抗体（
［１ｉｏｌＪａｋｏ＋） （１０ａｇ／ ｍｌ、８０Ｉ
Ｉｌ／ウエル）でコーティングした。−夜４℃でインキ
ュベートしたのち、プレートをＢＳＡ（０，５％）およ
びＴｖｅｅｎ２０ （０，０５％）含有ＰＢＳで２回洗
浄し、３７℃において少なくとも２時間、洗浄液中でブ
ロックした。ハイブリドーマ培養上澄液（５０μｍ／ウ
ェル）を加え、プレートを３７℃で４時間インキュベー
トした。次に］２５ プレートを洗浄溶液で３回洗浄し、 Ｉ−ＩＦＮ−
β２／ Ｉ Ｌ−６−Ｒ（５０１Ｉｌ、１．０”ｃｐｍ
）を加えて４℃でさらに１．６時間インキュベートした
。プレートを３回洗浄し、個々のウェルを１２ノリ離し
、ガンマカウンターで計数した。陰性対照値よりも少な
くとも５倍高いカウントを与えたサンプルを陽性とみな
した（第１−表）。３０回の陽性クローンが選択され、
さらに検討し特徴を調べるためにサブクローニングした
。
生ハイブリドーマのスクリーニングは以下のようにして
実施した。すなわち、ハイブリドーマ上澄液について、
倒立固相放射免疫検定法（ｉＲＩＡ）により抗−ＩＦＮ
−β２／ＩＩ、−６−Ｒ抗体の存在を調べた。ＰＶＣマ
イクロタイタープレー） （Ｄｙｎ［ｅｃｂ Ｌａｂａ
＋ａｌｏｒｉｃｓ、＾Ｉｅｘａｎｄｒｉａ■＾）をアフ
ィニティー精製ヤギ抗−マウス血清Ｆ（ａｂ）２抗体（
［１ｉｏｌＪａｋｏ＋） （１０ａｇ／ ｍｌ、８０Ｉ
Ｉｌ／ウエル）でコーティングした。−夜４℃でインキ
ュベートしたのち、プレートをＢＳＡ（０，５％）およ
びＴｖｅｅｎ２０ （０，０５％）含有ＰＢＳで２回洗
浄し、３７℃において少なくとも２時間、洗浄液中でブ
ロックした。ハイブリドーマ培養上澄液（５０μｍ／ウ
ェル）を加え、プレートを３７℃で４時間インキュベー
トした。次に］２５ プレートを洗浄溶液で３回洗浄し、 Ｉ−ＩＦＮ−
β２／ Ｉ Ｌ−６−Ｒ（５０１Ｉｌ、１．０”ｃｐｍ
）を加えて４℃でさらに１．６時間インキュベートした
。プレートを３回洗浄し、個々のウェルを１２ノリ離し
、ガンマカウンターで計数した。陰性対照値よりも少な
くとも５倍高いカウントを与えたサンプルを陽性とみな
した（第１−表）。３０回の陽性クローンが選択され、
さらに検討し特徴を調べるためにサブクローニングした
。
例５：
ウェスタンブロッティング
ウェスタンブロッティングは以下のように実施した。す
なわち、ヒト尿からの部分精製ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６
−Ｒ可溶性フラグメントのサンプルを還元条件下にＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで分析し、ニトロセルロースシート（ＢＡ
８５．５ｃｈｌｅｉｃｈｅ＋ ＆Ｓｈｕ！ｌｌ）に電気
プロットした。電気ブロッティング後、シートを一部ブ
ロック緩衝液（０，０５％Ｔｖ！ｅｎ２０および０．０
２％ナトリウムアジド含有ＰＢＳ中５％脱脂ミルク）と
インキュベートし、ついで室温で抗−ＩＦＮ−β２／Ｉ
Ｌ−６−Ｒモノクローナル抗体Ｎα３４−４と２時間イ
ンキュベートシた。ＰＢＳ中０．０５％Ｔｖｅｅｎ２０
で洗浄後、ニトロセルロースを室温で１２５■−ヤギ抗
−マウス血清（０，７Ｘ １０６ｃ ｐｍ／ｍｌブロッ
ク緩衝液）と４時間インキュベートした。ついでシート
を洗浄し、乾燥し、オートラジオグラフィーに付した。
なわち、ヒト尿からの部分精製ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６
−Ｒ可溶性フラグメントのサンプルを還元条件下にＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで分析し、ニトロセルロースシート（ＢＡ
８５．５ｃｈｌｅｉｃｈｅ＋ ＆Ｓｈｕ！ｌｌ）に電気
プロットした。電気ブロッティング後、シートを一部ブ
ロック緩衝液（０，０５％Ｔｖ！ｅｎ２０および０．０
２％ナトリウムアジド含有ＰＢＳ中５％脱脂ミルク）と
インキュベートし、ついで室温で抗−ＩＦＮ−β２／Ｉ
Ｌ−６−Ｒモノクローナル抗体Ｎα３４−４と２時間イ
ンキュベートシた。ＰＢＳ中０．０５％Ｔｖｅｅｎ２０
で洗浄後、ニトロセルロースを室温で１２５■−ヤギ抗
−マウス血清（０，７Ｘ １０６ｃ ｐｍ／ｍｌブロッ
ク緩衝液）と４時間インキュベートした。ついでシート
を洗浄し、乾燥し、オートラジオグラフィーに付した。
単離されたクローンおよびサブクローンの一部のアイソ
タイプ、倒立ＲＩＡおよびウェスタンブロッティングに
おけるＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒの結合結果を第１表
に示す。
タイプ、倒立ＲＩＡおよびウェスタンブロッティングに
おけるＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒの結合結果を第１表
に示す。
例６
グメン
ークロ
ＩＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６−Ｒに対する抗体を使用して
、可溶性フラグメントをアフィニティークロマトグラフ
ィーで精製した。モノクローナル抗体Ｔｈ３４−４は、
倒立固相放射免疫検定法（ｉＲＩＡ）で放射標識抗原に
対するその結合能をテストしたのち、本例のアフィニテ
ィークロマトグラフィーに使用した。ハイブリドーマＮ
α３４−４によって分泌されるモノクローナル抗体を含
む腹水を、５０％飽和硫酸アンモニウムで沈殿させたの
ち、ＰＢＳに対して徹底的に透析して精製した。Ｗｉｌ
ｃｔｕｃｋ ＆ Ｍｉｒｏｎ： Ｍｐｌｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｒ７ｍｏｌｏｇ７ ３４ ： ７２〜７９． １９
７９に特定されているように、免疫グロブリン約１０ｍ
ｇがポリアクリルヒドラジドアガロース１ｍｌに結合し
た。
、可溶性フラグメントをアフィニティークロマトグラフ
ィーで精製した。モノクローナル抗体Ｔｈ３４−４は、
倒立固相放射免疫検定法（ｉＲＩＡ）で放射標識抗原に
対するその結合能をテストしたのち、本例のアフィニテ
ィークロマトグラフィーに使用した。ハイブリドーマＮ
α３４−４によって分泌されるモノクローナル抗体を含
む腹水を、５０％飽和硫酸アンモニウムで沈殿させたの
ち、ＰＢＳに対して徹底的に透析して精製した。Ｗｉｌ
ｃｔｕｃｋ ＆ Ｍｉｒｏｎ： Ｍｐｌｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｒ７ｍｏｌｏｇ７ ３４ ： ７２〜７９． １９
７９に特定されているように、免疫グロブリン約１０ｍ
ｇがポリアクリルヒドラジドアガロース１ｍｌに結合し
た。
カルボキシメチルセファロース（ｃＭＳ）カラムで部分
精製したヒト尿２５０ｍ１（粗製の尿２５０１に相当）
を抗−ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ抗体カラム０．５ｍ
ｌに４℃、流速０．２５ｍ１／分で負荷した。カラムを
、洗液に蛋白質が検出されなくなるまでＰＢＳで洗浄し
た。ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性フラグメントは
２５ｍＭりみン酸緩衝液、９１（２，２で溶出しく８×
１力ラム容量分画）、直ちにＩＭｆｌｅｐｅｓ緩衝液、
ｐＨ８，５テ中和し、計８８％のＩＦＮ−β２／ＩＬ−
６−Ｒ可溶性フラグメントが回収された。溶出分画のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥの銀染色解析により、Ｍ、 Ｗ。
精製したヒト尿２５０ｍ１（粗製の尿２５０１に相当）
を抗−ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ抗体カラム０．５ｍ
ｌに４℃、流速０．２５ｍ１／分で負荷した。カラムを
、洗液に蛋白質が検出されなくなるまでＰＢＳで洗浄し
た。ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性フラグメントは
２５ｍＭりみン酸緩衝液、９１（２，２で溶出しく８×
１力ラム容量分画）、直ちにＩＭｆｌｅｐｅｓ緩衝液、
ｐＨ８，５テ中和し、計８８％のＩＦＮ−β２／ＩＬ−
６−Ｒ可溶性フラグメントが回収された。溶出分画のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥの銀染色解析により、Ｍ、 Ｗ。
５０．０００の主要バンドと他の主要バンド１５０．０
００（夾雑物）が認められた。このプレバレージョンを
さらにＲＰ−３００ＨＰＬＣで精製し、可溶性受容体フ
ラグメントは第１図と類似のパターンで３９％アセトニ
トリルで溶出した。
００（夾雑物）が認められた。このプレバレージョンを
さらにＲＰ−３００ＨＰＬＣで精製し、可溶性受容体フ
ラグメントは第１図と類似のパターンで３９％アセトニ
トリルで溶出した。
例７：
ＥＬＩＳＡ試験
マイクロタイタープレート（ＤｙｎａｔｅｃｈまたはＭ
ａｘｉｓｕｂ、 Ｎｕｎｏ）を、抗−ＩＦＮ−β２／Ｉ
Ｌ−６−Ｒモノクローナル抗体Ｎα３４−４ （免疫グ
ロブリン分画、１２ｆ）Ｉ＋、２０ａｇ／ｍｌＰ Ｂ
Ｓ）により４℃で一部コーティングした。プレートをＢ
ＳＡ（０，５％）およびＴｖｅｅｎ２０ （０，０５％
）含有ＰＢＳで洗浄し、同じ溶液を用いて３７℃で少な
くとも２時間ブロックした。試験サンプルはブロック溶
液で希釈し、ウェルに加え（１００μｍ／ウェル）、３
７℃に４時間放置した。ついでプレートをＴｖｅｅｎ２
０ （０，０５％）含有ＰＢＳで３回洗浄し、ついでウ
サギ抗−ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ血清（１：１．０
００．１００ｊｌ／ウエル）を加え、さらに３７℃で４
時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、ヤギ
ー抗−ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ接合体（ＨＲ
Ｐ。
ａｘｉｓｕｂ、 Ｎｕｎｏ）を、抗−ＩＦＮ−β２／Ｉ
Ｌ−６−Ｒモノクローナル抗体Ｎα３４−４ （免疫グ
ロブリン分画、１２ｆ）Ｉ＋、２０ａｇ／ｍｌＰ Ｂ
Ｓ）により４℃で一部コーティングした。プレートをＢ
ＳＡ（０，５％）およびＴｖｅｅｎ２０ （０，０５％
）含有ＰＢＳで洗浄し、同じ溶液を用いて３７℃で少な
くとも２時間ブロックした。試験サンプルはブロック溶
液で希釈し、ウェルに加え（１００μｍ／ウェル）、３
７℃に４時間放置した。ついでプレートをＴｖｅｅｎ２
０ （０，０５％）含有ＰＢＳで３回洗浄し、ついでウ
サギ抗−ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ血清（１：１．０
００．１００ｊｌ／ウエル）を加え、さらに３７℃で４
時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、ヤギ
ー抗−ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ接合体（ＨＲ
Ｐ。
ＢｉｏＭｇｋｏｒ、 １ ： ２０００．１００ａｌ
／ウエル）を加え、３７℃に２時間放置した。プレート
を４回洗浄し、ＡＢＴＳ （２，２’−アジツーブス（
３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）。
／ウエル）を加え、３７℃に２時間放置した。プレート
を４回洗浄し、ＡＢＴＳ （２，２’−アジツーブス（
３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）。
Ｓｉｇｍａ ）基質により発色させた。プレートを自動
ＥＬ Ｉ ＳＡリーダーで読み取った。別法として、Ｅ
Ｌ Ｉ ＳＡは、ウサギポリクローナル抗−ＩＦＮβ２
／Ｉ Ｌ−６−Ｒ抗体をモノクローナル抗体Ｎ（１２２
−１のＨＲＰ接合体またはビオチン化体で置換して実施
することも可能であった。
ＥＬ Ｉ ＳＡリーダーで読み取った。別法として、Ｅ
Ｌ Ｉ ＳＡは、ウサギポリクローナル抗−ＩＦＮβ２
／Ｉ Ｌ−６−Ｒ抗体をモノクローナル抗体Ｎ（１２２
−１のＨＲＰ接合体またはビオチン化体で置換して実施
することも可能であった。
例８
ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメント
の活性をＩＦＮ−β２／ＩＬ−６のハイブリドーマ／形
質細胞腫成長因子（ＨＧＦ）活性について試験した。マ
ウス形質細胞腫Ｔ ｉ １６５細胞を、大腸菌内で産生
させ、均一に精製した（２Ｘ１０’ ＨＧＦ単位／ｍｇ
）純粋なヒト組換えＩＦＮ−β２／ＩＬ−６の低濃度に
１６時間暴露した。平行して、同じＩＦＮ−β２／ＩＬ
−６サンプルを、様々な濃度のＩＦＮ−β２／’ＩＬ−
６−Ｒ可溶性細胞外フラグメントと３７℃で９０分間イ
ンキュベートし、ついで細胞に加えた。０２５％ｇ／ｍ
ｌのＩＦＮ−β２／ＩＬ−６単独ではパルスＴ１１６５
細胞への３Ｈチミジンの取り込みは刺激されなかったが
、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメン
トの添加により用量依存性の刺激を生じた（第■表）。
の活性をＩＦＮ−β２／ＩＬ−６のハイブリドーマ／形
質細胞腫成長因子（ＨＧＦ）活性について試験した。マ
ウス形質細胞腫Ｔ ｉ １６５細胞を、大腸菌内で産生
させ、均一に精製した（２Ｘ１０’ ＨＧＦ単位／ｍｇ
）純粋なヒト組換えＩＦＮ−β２／ＩＬ−６の低濃度に
１６時間暴露した。平行して、同じＩＦＮ−β２／ＩＬ
−６サンプルを、様々な濃度のＩＦＮ−β２／’ＩＬ−
６−Ｒ可溶性細胞外フラグメントと３７℃で９０分間イ
ンキュベートし、ついで細胞に加えた。０２５％ｇ／ｍ
ｌのＩＦＮ−β２／ＩＬ−６単独ではパルスＴ１１６５
細胞への３Ｈチミジンの取り込みは刺激されなかったが
、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメン
トの添加により用量依存性の刺激を生じた（第■表）。
５％ｇ／ｍｌのＩＦＮ−β２／ＩＬ−６ではＴ１１６５
細胞の成長刺激がみられ、ＩＦＮ−β２／目、＝６−Ｒ
可溶性細胞外フラグメントによりわずかな刺激のみが認
められた。対照としてのヒト尿から精製したＩＮＦ−γ
可溶性受容体は作用を示さなかった すなわち、閾値濃
度以下のＩ ＦＮ−β２／ＩＬ−６がＩＦＮ−β２／Ｉ
Ｌ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメントの添加によって特
異的に増強できる。細胞上に約５．０００個のＩＦＮβ
２／ＩＬ−６受容体を仮定すると・ＩＦＮβ２／ＩＬ−
６の０． ２５ ｎ ｇ／ｍｌは受容体あたり約１５０
分子のサイト力インに相当する。ＩＦＮ−β２／ＩＬ−
６−Ｒ可溶性細胞外フラグメントの刺激作用は、マウス
ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６受容体あたり５〜１０．０００
のｔＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメン
ト分子を添加すると、み、られ始める。ＩＦＮ−β２／
Ｉｎ、−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメントの部分は不活
性であっても、作用は化学量論的であるように思われる
。
細胞の成長刺激がみられ、ＩＦＮ−β２／目、＝６−Ｒ
可溶性細胞外フラグメントによりわずかな刺激のみが認
められた。対照としてのヒト尿から精製したＩＮＦ−γ
可溶性受容体は作用を示さなかった すなわち、閾値濃
度以下のＩ ＦＮ−β２／ＩＬ−６がＩＦＮ−β２／Ｉ
Ｌ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメントの添加によって特
異的に増強できる。細胞上に約５．０００個のＩＦＮβ
２／ＩＬ−６受容体を仮定すると・ＩＦＮβ２／ＩＬ−
６の０． ２５ ｎ ｇ／ｍｌは受容体あたり約１５０
分子のサイト力インに相当する。ＩＦＮ−β２／ＩＬ−
６−Ｒ可溶性細胞外フラグメントの刺激作用は、マウス
ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６受容体あたり５〜１０．０００
のｔＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメン
ト分子を添加すると、み、られ始める。ＩＦＮ−β２／
Ｉｎ、−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメントの部分は不活
性であっても、作用は化学量論的であるように思われる
。
Ｅｐｓｊｅｉｎ−Ｂａｒ＋ウィルス（ＥＢＶ）でトラン
スホームされたヒトＢ細胞のいくつかの系統は、ＩＦＮ
−β２／ＩＬ−６によって成長刺激を受ける。ＴＩ細胞
系では、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６Ｒ可溶性細胞外フラグ
メントは、マウスＴ１１６５形質細胞腫細胞にみられた
ようなＩＦＮ−β２／ＩＬ−５の作用の増強を示さなか
った。実際、ＴＩ細胞では、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−
Ｒ可溶性細胞外フラグメントはＩＦＮ−β２／ＩＬ−６
作用の阻害剤として、このサイト力インの低濃度におい
て挙動した。
スホームされたヒトＢ細胞のいくつかの系統は、ＩＦＮ
−β２／ＩＬ−６によって成長刺激を受ける。ＴＩ細胞
系では、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６Ｒ可溶性細胞外フラグ
メントは、マウスＴ１１６５形質細胞腫細胞にみられた
ようなＩＦＮ−β２／ＩＬ−５の作用の増強を示さなか
った。実際、ＴＩ細胞では、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−
Ｒ可溶性細胞外フラグメントはＩＦＮ−β２／ＩＬ−６
作用の阻害剤として、このサイト力インの低濃度におい
て挙動した。
ＨＧＦ活性の検定では、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６の生物
活性は、マウス形質細胞腫Ｔ１１６５細胞での３Ｈ−チ
ミジンの取り込みによって測定される（ｔｌｏｔｄｉｎ
、 Ｒ，Ｐ、 ＆ Ｐｏｔｔｅｒ、 Ｍ、 ５ｃｉｅ
ｎｃｅ （１９８６）２３３ ： ５６６−５６８）。
活性は、マウス形質細胞腫Ｔ１１６５細胞での３Ｈ−チ
ミジンの取り込みによって測定される（ｔｌｏｔｄｉｎ
、 Ｒ，Ｐ、 ＆ Ｐｏｔｔｅｒ、 Ｍ、 ５ｃｉｅ
ｎｃｅ （１９８６）２３３ ： ５６６−５６８）。
簡単に説明すれば試験サンプルの希釈系列（６０ｐｌ）
をＴ１１６５細胞（４０ｕｌ中１０４個）と９６−ウェ
ルマイクロタイタープレート中３７℃で一部インキユベ
ートした。 ３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウエル）のパ
ルスを３７℃で４時間与えた。細胞を自動ハーベスタ−
で収穫し、計数した。１単位のＩＦＮ−β、２／ＩＬ−
６は検定において最大効果の５０％を与える蛋白量と定
義した。
をＴ１１６５細胞（４０ｕｌ中１０４個）と９６−ウェ
ルマイクロタイタープレート中３７℃で一部インキユベ
ートした。 ３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウエル）のパ
ルスを３７℃で４時間与えた。細胞を自動ハーベスタ−
で収穫し、計数した。１単位のＩＦＮ−β、２／ＩＬ−
６は検定において最大効果の５０％を与える蛋白量と定
義した。
例９：
ヒト乳癌細胞に対する活性
ヒト乳房骨癌細胞Ｔ４７ＤはＩＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６
で増殖を阻止される。これらの細胞はＩＦＮ−β２／Ｉ
Ｌ−６受容体結合部位に富み、少なくともリンパ球およ
び骨髄腫細胞の場合に匹敵する。Ｔ４７Ｄ癌細胞培養の
一連のサブクローンを単離し、そのＩＦＮ−β２／ＩＬ
−６による増殖阻害を比較した。数種の試験で、まばら
に接種した細胞からのコロニー形成および半集密的単層
における３Ｈ−チミジンの取り込みは、一部のクローン
（たとえば０７）では、母体のＴ４７Ｄ培養体に比べて
感受性が高く、他のクローン（たとえば０１２）では感
受性が低か゛った。ＩＦＮβ２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細
胞外フラグメントの作用は、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６が
用量依存性の阻害を生じる３Ｈ−チミジン取り込み試験
で調べた（第７表）。
で増殖を阻止される。これらの細胞はＩＦＮ−β２／Ｉ
Ｌ−６受容体結合部位に富み、少なくともリンパ球およ
び骨髄腫細胞の場合に匹敵する。Ｔ４７Ｄ癌細胞培養の
一連のサブクローンを単離し、そのＩＦＮ−β２／ＩＬ
−６による増殖阻害を比較した。数種の試験で、まばら
に接種した細胞からのコロニー形成および半集密的単層
における３Ｈ−チミジンの取り込みは、一部のクローン
（たとえば０７）では、母体のＴ４７Ｄ培養体に比べて
感受性が高く、他のクローン（たとえば０１２）では感
受性が低か゛った。ＩＦＮβ２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細
胞外フラグメントの作用は、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６が
用量依存性の阻害を生じる３Ｈ−チミジン取り込み試験
で調べた（第７表）。
ｒＦＮ−β２／夏Ｌ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメント
単独では全く作用を示さなかったが、可溶性受容体はＩ
ＦＮ−β２／ＩＬ−６の抗成長作用を強力に増強した。
単独では全く作用を示さなかったが、可溶性受容体はＩ
ＦＮ−β２／ＩＬ−６の抗成長作用を強力に増強した。
ネズミ形質細胞腫にみたれたのと異なり、ＩＦＮ−β２
／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメントのヒト乳癌細
胞に対する作用は、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６の高濃度で
著しかった。５０％阻害に必要なＩＦＮ−β２／ＩＬ−
６の量の低下のみならず、作用の振幅は著しく増強され
た。ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメ
ントの存在下、３Ｈ−チミジン取り込みの阻害は９８％
に達し、一方、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞
外フラグメントの不存在下には、残留ＤＮＡ合成はＩＦ
Ｎ−β２／ＩＬ−６の高用量でも観察された。この結果
は、【ＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメ
ントが、０１２のような抵抗性の強いサブクローンにも
ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６の増殖阻害に完全に反応させる
ことを示唆している。実際、ＩＦＮβ２／ＩＬ−６−Ｒ
可溶性細胞外フラグメントの添加により０１２細胞の３
Ｈ−チミジン取り込みはほぼ完全に阻害され（第３図）
、この作用はこの場合もＩＦＮ−β２／ＩＬ−６の高濃
度において明瞭であった。
／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメントのヒト乳癌細
胞に対する作用は、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６の高濃度で
著しかった。５０％阻害に必要なＩＦＮ−β２／ＩＬ−
６の量の低下のみならず、作用の振幅は著しく増強され
た。ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメ
ントの存在下、３Ｈ−チミジン取り込みの阻害は９８％
に達し、一方、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞
外フラグメントの不存在下には、残留ＤＮＡ合成はＩＦ
Ｎ−β２／ＩＬ−６の高用量でも観察された。この結果
は、【ＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメ
ントが、０１２のような抵抗性の強いサブクローンにも
ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６の増殖阻害に完全に反応させる
ことを示唆している。実際、ＩＦＮβ２／ＩＬ−６−Ｒ
可溶性細胞外フラグメントの添加により０１２細胞の３
Ｈ−チミジン取り込みはほぼ完全に阻害され（第３図）
、この作用はこの場合もＩＦＮ−β２／ＩＬ−６の高濃
度において明瞭であった。
これらの結果は、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細
胞外フラグメントがヒト乳癌細胞に作用し、感度および
反応の振幅の両者を増大させることを示している。
胞外フラグメントがヒト乳癌細胞に作用し、感度および
反応の振幅の両者を増大させることを示している。
図面の簡単な説明
第１図は、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フ
ラグメント分画の固定化ｆＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６カラ
ム上での部分精製後における逆相ＨＰＬＣカラム溶出パ
ターンを示し、第２図は、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６可溶
性細胞外フラグメントの非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥの結果を示す写真であり、第３図はヒト乳癌Ｔ４７
Ｄ細胞に対するＩＦＮ−β２／１１．−６ ８ＧＦ活性
のＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメン
トによる増強効果を示す。
ラグメント分画の固定化ｆＦＮ−β２／Ｉ Ｌ−６カラ
ム上での部分精製後における逆相ＨＰＬＣカラム溶出パ
ターンを示し、第２図は、ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６可溶
性細胞外フラグメントの非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥの結果を示す写真であり、第３図はヒト乳癌Ｔ４７
Ｄ細胞に対するＩＦＮ−β２／１１．−６ ８ＧＦ活性
のＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメン
トによる増強効果を示す。
Claims (23)
- （１）ヒト天然インターフェロン−β２／インターロイ
キン−６受容体（以下ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒとい
う）、その可溶性細胞外フラグメントならびにその塩、
官能性誘導体、前駆体および活性分画、およびＩＦＮ−
β２／ＩＬ−６と特異的に結合できるこれらの任意の混
合物。 - （２）実質的に精製された形の請求項（１）記載のヒト
天然ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ。 - （３）実質的に精製された形の請求項（１）記載のヒト
ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメント
。 - （４）実質的に精製された蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに
より非還元条件下に分析すると分子量約５０Ｋを有する
請求項（３）記載のヒトＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可
溶性細胞外フラグメント。 - （５）逆相高速液体クロマトグラフィー （ＨＰＬＣ）で単一のピークとして移動する請求項（３
）または（４）のいずれかに記載のヒトＩＦＮ−β２／
ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメント。 - （６）以下のＮ−末端アミノ酸配列： ▲数式、化学式、表等があります▼ を含有する請求項（１）、（３）、（４）または（５）
のいずれかに記載のヒトＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可
溶性細胞外フラグメント。 - （７）請求項（１）または（２）記載のヒト天然ＩＦＮ
−β２／ＩＬ−６畳容体を単離するにあたり、その受容
体をもつヒト細胞、特に胎盤細胞を可溶化して懸濁液を
得、その懸濁液を遠心分離し、上澄液を固定化ＩＦＮ−
β２／ＩＬ−６カラムに適用し、結合した受容体蛋白質
を各種ｐＨ条件により純度を高めた状態で溶出させる方
法。 - （８）実質的に精製されたＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ
可溶性細胞外フラグメントを製造する方法において、 （ａ）ヒト尿の透析濃縮物から粗蛋白分画を回収し、 （ｂ）工程（ａ）の粗蛋白分画を固定化ＩＦＮ−β２／
ＩＬ−６カラム上アフィニティークロマトグラフィーに
付し、 （ｃ）工程（ｂ）からのＩＦＮ−β２／ＩＬ−６結合蛋
白質の精製活性分画を逆相高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）に適用し、 （ｄ）３９％アセトニトリルで溶出し、非還元条件下Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥにより分子量約５０Ｋを有し、逆相ＨＰ
ＬＣで単一のピークとして移動する実質的に精製された
ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメント
を含有する分画を回収する方法。 - （９）工程（ａ）の粗蛋白分画は工程（ｂ）のアフィニ
ティークロマトグラフィーに先立ってイオン交換クロマ
トグラフィーに付す請求項（８）記載の方法。 - （１０）工程（ｂ）のアフィニティークロマトグラフィ
ーは抗−ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒモノクローナル抗
体のカラム上で行う請求項（８）または（９）に記載の
方法。 - （１１）組換え蛋白質またはそれと実質的に相同の組換
え蛋白質である請求項（１）記載のＩＦＮ−β２／ＩＬ
−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメント。 - （１２）請求項（１）、（３）〜（６）もしくは（１１
）のいずれかに記載のＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶
性細胞外フラグメント、またはそれと実質的に相同の蛋
白質をコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡ分子
。 - （１３）請求項（１２）記載のＤＮＡ分子からなり、ト
ランスホーマント宿主細胞中で請求項（１）、（３）〜
（６）または（１１）のいずれかに記載のＩＦＮ−β２
／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フラグメントを発現できる
複製可能な発現ビヒクル。 - （１４）請求項（１３）記載の複製可能な発現ビヒクル
でトランスホームされた原核細胞および真核細胞から選
ばれる宿主細胞。 - （１５）ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶性細胞外フラ
グメントを製造する方法において、（ａ）請求項（１４
）記載のトランスホーマント宿主細胞を適当な培地中で
培養し、ついで（ｂ）ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒ可溶
性細胞外フラグメントを単離する方法。 - （１６）ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−Ｒおよび／またはそ
の可溶性細胞外フラグメントを特異的に認識するその受
容体および／またはフラグメントに対する抗体。 - （１７）ポリクローナル抗体である請求項（１６）記載
の抗体。 - （１８）モノクローナル抗体である請求項（１６）記載
の抗体。 - （１９）活性成分として、ヒト天然ＩＦＮ−β２／ＩＬ
−６−Ｒまたはその可溶性細胞外フラグメント、それら
の塩、官能性誘導体、前駆体もしくは活性分画、および
これらの任意の混合物と、医薬的に許容される担体とか
らなる医薬組成物。 - （２０）活性成分としてヒトＩＦＮ−β２／ＩＬ−６−
Ｒ可溶性細胞外フラグメントを含有する請求項（１９）
記載の医薬組成物。 - （２１）さらにヒトＩＦＮ−β２／ＩＬ−６を含有する
請求項（１９）または（２０）に記載の医薬組成物。 - （２２）乳癌の処置用の請求項（２１）記載の医薬組成
物。 - （２３）ＩＦＮ−β２／ＩＬ−６の有用な効果たとえば
その抗増殖活性の刺激および増強に使用するためのＩＦ
Ｎ−β２／ＩＬ−６−Ｒおよび／またはその可溶性細胞
外フラグメント、それらの塩、官能性誘導体、前駆体も
しくは活性分画、およびこれらの任意の混合物。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IL090488 | 1989-06-01 | ||
| IL9048889A IL90488A (en) | 1989-06-01 | 1989-06-01 | Ifn-beta2/il-6 receptor its preparation and pharmaceutical compositions containing it |
| IL92444A IL92444A0 (en) | 1989-11-26 | 1989-11-26 | Pharmaceutical compositions comprising a cytokine receptor |
| IL092444 | 1989-11-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03157400A true JPH03157400A (ja) | 1991-07-05 |
| JP3542127B2 JP3542127B2 (ja) | 2004-07-14 |
Family
ID=26321941
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP14423590A Expired - Lifetime JP3542127B2 (ja) | 1989-06-01 | 1990-06-01 | ヒトインターフェロン―β２／インターロイキン―６受容体 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5216128A (ja) |
| EP (1) | EP0413908B2 (ja) |
| JP (1) | JP3542127B2 (ja) |
| DE (1) | DE69028671T3 (ja) |
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