JPH04128654A - 酵素免疫染色法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は生体組成媒体の酵素免疫染色法に関し、特に有
機溶媒に難溶の染色色素を生成する酵素免疫染色法に関
する。

〔発明の背景〕

臨床学的解析を確実かつ簡便に行う必要から生体成分な
どの特定成分を検出する各種の分析法が開発されて来て
いる。それらの方法のうち、最も精度の高い方法として
、該特定成分とこれに対して特異的に結合しうる物質（
以後特異結合物質と称する）、例えば抗原と抗体、ある
種の糖鎖とレクチン、ビオチンとアビジン、プロティン
ＡとＩｇＧ１ホルモンとレセプタ、酵素と基質等の間の
特異的結合反応を用いる方法が知られている。

一般的には何らかの標ｍ（ラベル）を付した特異結合物
質（以後標識体と称する）を用い、対象とする特定成分
に応じて変化した該標識のシグナルを検出することによ
り特定成分の測定が行なわれる。

特に支持体に直接的にまたは間接的に担持させた特定成
分を標識体と反応させ、両者の複合体として標識体を固
定し、実質的に特定成分に応じた標識からのシグナルを
検出する方法が適宜用いられる。

例えば電気泳動した蛋白質生体成分（特定成分）をゲル
からニトロセルロース膜上に転写して担持し、これを標
識体たとえば抗体標識体と反応させシグナルを検出する
方法、ＴＬＣプレート上に展開した脂質等の特定成分に
標識体を反応させたシグナルを検出する方法、膜上でＤ
ＮＡと該ＤＮＡに対する標識した相補的ＤＮＡとを反応
させシグナルを検出する方法或は免疫組織染色法などで
ある。

また免疫組織染色法に於いては、組織上の目的とする特
定成分の存在場所、状態等の情報かえられる。

従来から特異結合物質の標識としては、放射性同位元素
、蛍光物質、発光物質、酵素等が用いられている。

しかしながら、これらのうち放射性同位元素を用いた場
合は放射活性の減衰や廃棄、被曝或は設備費に巨費を要
し更に長い時間と煩雑な操作を要するという欠点かある
。

また、蛍光物質もしくは発光物質を用いる場合は特殊な
装置、設備か必要になる。

一方、酵素を用いた場合、操作も比較的簡単で生成色素
はたやすく可視化でき、特定成分の定量も可能である。

従来、このような標識酵素としては、ペルオキシダーゼ
、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等
が用いられてきた。

酵素免疫染色法、特に生体組織、細胞上の抗原物質を検
出、測定する免疫組織染色法は、診断上有益な方法であ
る。

免疫組織染色法において常用される方法としては、ペル
オキシダーゼ（ＰＯＤ）の酸化触媒作用によって色原体
を酸化し色素を生成して染色した後、試料保存のために
、エタノール、キシレンで試料を洗浄し、脱水後封入剤
に浸漬し、封入が施される。

色原体としてはジアミノベンジジン（ＤＡＢ）　、アミ
ノエチルカルバゾール（ＡＢＣ）か常用される。

前記ＤＡＢを用いると染色色素はポリマー化し有機溶媒
に不溶であり封入には好都合であるが、発癌性物質であ
り、また色調は黄〜褐色であり、検出、診断に困難があ
る。

またＡＢＣを用いる場合には、染色色素は赤色であり色
調的には好都合であるが、エタノール、キシレン等の有
機溶媒に可溶であり、洗浄、脱水、封入操作が著しく困
難であり、特殊試薬を用い煩雑な操作が強いられる。

また一般的な酵素免疫染色法については、色原体として
芳香族アミン化合物に組合せてフェノール化合物（特開
昭６３−６４６２号）或は活性メチレン化合物（特開昭
６３−７１６５４号）を用いることが有用であることが
開示されているが、これらの染色色素も有機溶媒に可溶
であり、封入、保存に支障がある。

〔発明の目的〕

前記実情に基き、本発明の目的は： （１）発癌性その他の危険性のない色原体を用いた、（
２）有機溶媒に少くとも難溶性の染色色素を生成し、簡
便な封入操作が可能で、更に （３）鮮明で診断、検出の容易な色素を与える酵素免疫
染色法を提供することにある。

〔発明の構成〕

前記本発明の目的は 金属塩を形成しうる官能基を有する色原体から酵素の存
在の下に形成された色素を担持したマトリックス媒体に
、更に金属イオンを作用させて、前記色素の有機溶媒に
対する溶解性を低減させることを特徴とする酵素免疫染
色法によって達成される。

更に本発明の態様においては、前記色原体が芳香族第１
級アミン化合物の酸化体とカップリングする活性基を有
する発色性カプラーであり、かつ前記酵素がペルオキシ
ダーゼであることが好ましい。

本発明において色原体の有する金属塩を形成しうる官能
基はスルホ基及び／又はカルボオキシル基であり、色原
体はスルホン酸及び／又はカルボン酸或はそれらの金属
塩である。金属塩としはＮａＫ等の塩が好ましい。

これら色原体としては、芳香族第１級アミン化合物の酸
化体とカップリングする活性基を有しており、活性メチ
レン化合物、活性メチン化合物か例として挙げられ、写
真工業界で使用される発色性カプラーも使用可能である
。色調からはマゼンタ発色カプラーか好ましい。

染色色素を担持したマトリックス媒体に作用させる金属
イオンとしては多価金属イオンであり、好ましくはＦｅ
　（ｍ’）　”、　Ｃｏ　（Ｎ）　”イオンであり、錯
イオンとなっていてもよい。

酵素としては一般に酵素抗体法の標識酵素が用いられる
が、好ましくはペルオキシダーゼである。

本発明において、対象となる特定成分は、その特定成分
に特異的に結合する特異結合物質が得られる物質または
物質群である。

たとえば蛋白質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、糖
脂質、多糖類、酵素、ビタミン、抗原、抗体等が挙げら
れる。

また本発明に使用し得る特異結合物質は、特定成分又は
他の特異結合物質と特異的に結合できる物質であり、測
定対象とする特定成分に応じて適当に選ぶ事ができる。

たとえば、蛋白質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、
糖脂質、多糖類、酵素、ビタミン、抗原、抗体、レクチ
ン、プロティンＡ１アビジン、ビオチン、レセプター、
補酵素、酵素の基質、毒素、補体及びこれらの複合体等
が挙げられる。

本発明に使用し得るマトリックス媒体としては、セルロ
ースアセテート、ニトロセルロース等の膜：ポリアクリ
ルアミド等のゲル状支持体、ＴＬＣプレート等のシリカ
ゲル担体、デキストラン、アガロース等の多糖類及びそ
の誘導体；プレート状、ビーズ状のプラスチック、ガラ
ス、金属、繊維、活性炭、ヒドロキシアパタイト等が挙
げられる。

また免疫組織染色法においては、組織そのものがマトリ
ックス媒体として使用される。

本発明において使用し得る芳香族第１級アミン化合物と
しては、〇−又はｐ−アミノフェノール系化合物及び〇
−又はｐ−フェニレジアミン系化合物及びそれらの塩が
挙げられる。

好ましくはｐ−フエイレジアミン系化合物であり、下記
一般式［Ｉ）で示されるものである。

Ｈ２ 式中、Ａ及びＢは水素原子またはアルキル基を表し、Ａ
とＢは窒素原子と共に複素環を形成してもよ＜、Ｄ、Ｅ
、Ｇ及びＪは水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、
アミノ基、アルコキシ基、アシルアミド基、アリールス
ルホンアミド基、アルキルスルホンアミド基またはアル
キル基を表す。

Ａ及びＢで表されるアルキル基としては、炭素原子数１
乃至６のものか好ましく、特にＩ乃至４のものが好まし
い。例えばメチル基、エチル基、ブチル基を挙げること
ができる。これらのアルキル基は置換基を有していても
よく、その場合の置換基としては、例えばヒドロキシル
基、ウレイド基、テトラヒドロフリル基、カルボキシル
基、メタンスルホンアミド基、スルホ基、メトキシ基、
エトキシ基、メトキシエトキシ基、メトキシエトキシエ
トキン基、メトキシテトラエトキシ基か挙げられる。更
に好ましくは、ヒドロキシル基、メタンスルホンアミド
基である。

Ｄ、Ｇ及びＪとしては水素原子、アルコキン基及びアル
キルスルホンアミド基、アリールスルホンアミド基が好
ましく、さらに好ましくは水素原子である。Ｅとしては
水素原子、アルキル基、アシルアミド基が好ましく、よ
り好ましくは炭素原子数１〜３のアルキル基、特にメチ
ル基である。

また一般式ｒＩ）で示される化合物の塩としてはｐ−ト
リエンスルホン酸、スルホン酸、スルフィン酸、硫酸エ
ステル、スルファミン酸、チオ硫酸Ｓ−エステル、カル
ボン酸、燐酸エステル、アミド燐酸、帽り亜燐酸エステ
ル、有機硼素化合物、塩酸及び硫酸等の有機酸又は無機
酸の塩を挙げることができ、特にｐ−）リエンスルホン
酸塩、塩酸塩及び硫酸塩が好ましい。

以下に本発明に係る芳香族第１級アミン化合物の代表的
具体例を示すが、本発明にはこれに限定されるものでは
ない。

例示化合物 （１−１）Ｎ、Ｎ−ジエチル−３−メチル−４−アミノ
アニリン （１−２）Ｎ、Ｎ−ジエチル−４−アミノアニリン（１
−３）Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−メチル−４−アミノ
アニリン （１−４）Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−テトラヒドロフ
ルフリル−３−メチル−４−アミノアニリン （１−５）Ｎ−エチル−Ｎ−カルボキンメチル−３メチ
ル−４−アミノアニリン １−６）Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ＝エチル−３メチル
−４−アミノアニリン （１−７）Ｎ−エチル−Ｎ−テトラヒドロフルフリル３
−メチル−４〜アミノフエノール （１−８）３−アセチルアミノ−４−アミンジメチルア
ニリン （１−９）　Ｎ−エチル−Ｎ−β−メタンスルホンアミ
ドエチル−４−アミノアニリン （１−１０）Ｎ−エチル−Ｎ−β−メタンスルホンアミ
（，１−１１） ドエチルー３−メチルー４−アミノアニリン Ｎ−メチル−Ｎ−β−スルホエチル−ｐフェニレンジア
ミン Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−３メチル−４−ア
ミンアニリン （１−１３）Ｎ−エチル−Ｎ−［２−（２−メトキシエ
トキシ）エチルツー３−メチル−４−アミノアニリン Ｎ−エチル−Ｎ−ｉ　２−［２−（２−メトキシエトキ
シ）エトキシ］エチル）−３−メチル−４−アミノアニ
リン Ｎ−エチル−Ｎ−［２−＋２−［２−［２−（２−メト
キシエトキシ）エトキシコエトキシコエ トキシ）エチルロー３−メチル−４−アミノアニリン １６）　Ｎ、Ｎ−ジエチル−３−メタンスルホンアミド
エチル−４−アミノアニリン。

一般式ＣＩ）で示される化合物の塩は、一般に水溶性で
あり、水もしくは緩衝液中に容易に溶解する事ができる
。

本発明において使用し得る活性メチレン化合物又は活性
メチン化合物は、芳香族第１級アミン化金物の酸化体と
カップリングして色素を生成する化合物であり、該生成
色素の水に対する溶解性を減するため、適当な置換基を
置換した活性メチレン化合物又は活性メチン化合物であ
り、ハロゲン化銀カラー写真において、シアンカプラー
、イエローカプラー、マゼンタカプラーとしてよく知ら
れている化合物である。また活性メチレンの２つの水素
原子のうち】つか、又は活性メチンの水素原子が芳香族
第１級アミン化合物の酸化体とのカップリング反応によ
って脱離する基によって置換されている場合も含まれる
。これらの化合物については、たとえば、Ｔ、　Ｈ，ジ
エムス（Ｔ、　Ｈ，Ｊａｍｅｓ）著「ザ・セオリ・オブ
・ザ・フォトグラフィック０プロセスＪ　（Ｔｈｅ　ｔ
ｈｅｏｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｉｃ
Ｐｒｏｃｅｓｓ）　（第３版）第１７章及び（第４版）
第１２章に記載されている。

シアンカプラーとしては、フェノール誘導体、ナフトー
ル誘導体か好ましい例としてあげられる。

マゼンタカプラーとしては、５−ピラゾロン誘導体、ピ
ラゾロ［２，３−ａ］ベンツイミダゾール誘導体、ピラ
ゾロ−（３，２−ｃ）−５−）リアゾール誘導体、シア
ノアセチル置換複素環式化合物（シアノアセチル、クロ
マン、−チオフェン、−キノリン誘導体）、インダシロ
ン誘導体が好ましい例としていあげられる。

イエローカプラーとしては、アシルアセトニトリル誘導
体、アシルアセトアミド誘導体、１．３−ジケトン誘導
体があげられる。

これら色原体は２種以上を用いる事もできる。

以下に本発明の色原体の代表的具体例を示すか、本発明
に用いられる化合物はこれに限定されるものではない。

例示化合物 Ｈ Ｈ ＯＯＨ ＳＯ，Ｈ 一１２ Ｉ Ｉ ｒ　ρ ＯＯＨ マトリックス媒体に担持された特定成分とパーオキシダ
ーゼ標識体との複合結合上に色素を生成沈着せしめるた
めには、発色液中に支持体を浸漬させれば良い。発色液
は、適当なｐｌの緩衝液中に過酸化水素、芳香族第１級
アミン化合物、色原体を溶解して調製される。色原体は
、少量の親水性の有機溶剤たとえばメタノール、エタノ
ール、ＤＭＦ等に溶解して加えても良い。芳香族第１級
アミン化合物と色原体とのモル比は１対１００から１０
０対１であることが適当であり、とくに１対１０から１
０対１であることが好ましい。

酵素反応によりマトリックス媒体上に色素か充分生成沈
着した後、未反応物質を洗い流し、反応を停止する。

次に、たとえば金属イオン含有水溶液中に浸漬する事に
より、金属イオンを作用させ、色素の有機溶媒に対する
溶解性を低減させる。免疫組織染色の場合は次いでアル
コール、キシレンによる脱水、透徹操作が可能となる。

生成した染色色素についての情報は、目視にてもしくは
技術的に公知な方法たとえば分光光度計を用いて読み取
ることができる。

〔実施例〕

次に実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例１ メタノールによりウエツテイング操作をしたＰＶＤＦ膜
（ミリポア社）にプロッティング装置（バイオ・ラッド
社）を用い、ペルオキシダーゼＯ１ｍυをドツトプロッ
トした。

例示化合物（２−６）１５■をメタノールに５−に溶解
し、これに例示化合物（１−１０）　（３／２硫酸１水
塩）５■を溶解した５０ｍＭ　トリス塩酸バッファ（２
００ｍＭＮａＣ１含有、ｐＨ７，４；以下ＴＢＳと称す
）２５ｄを加え、さらに３％過酸化水素水１００μ！を
加え発色液■を調製した。

ペルオキシダーゼをプロットしたＰＶＤＰ膜を発色液■
に浸漬し、室温にて反応させた。１５分後に膜を発色液
から取出し、純水にて３回洗浄した。次いで以下の３通
りの処理を行った。

処理（１）純水中３０分間静置（比較例）処理（２）５
％（Ｗ／Ｖ）塩化第２鉄水溶液中３０分間静置 処理（３）５％（Ｗ／Ｖ）塩化へキサミンコバルト水溶
液中３０分間静置 各処理後、純水にて３回洗浄後、順次６０％エタノール
、純エタノール、キシレンに浸漬し、色素の溶解耐性を
判定した。結果を表１に示す。

表　　１ 本発明の金属イオンの作用による染色色素の対有機溶媒
溶解性の減少が明らかである。

実施例２ 表２に示した例示化合物を用い、実施例１と同表 本メタノール５−の代わりにＤＭＦ２−用いた。

５０ｎｇのヒトＩｇＧをプロットしたＰＶＤＦ膜を１％
牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと称す）　ＰＢＳ溶液に
より室温にて２時間ブロッキングした後、ペルオキシダ
ーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（カッペル社製＋１％Ｂ
ＳＡ／ＰＢＳｉ：　テ２０００倍希釈）　トＮ’！−１
：　で１　時間反応させた。ＰＢＳにて５回洗浄後、発
色液■〜■に浸漬し室温に反応させた。１５分後に膜を
発色液に取出し純水にて３回洗浄後５％（Ｗ／Ｖ）塩化
第２鉄水溶液中３０分間静置した。次いで３回の水洗後
、順次６０％エタノール、純エタノール、キシレンに浸
漬し染色色素の溶解耐性を検討した。

結果を表 ３に示した。

表 色原体が金属イオンと塩を形成し得る官能基を有する場
合に金属イオンとの接触による対有機溶媒溶解性の減少
は有効である。

実施例３ 免疫組織染色法によるＣＢＡ　Ｃ癌胎児性抗原）の検出 常法にて作成した人大腸癌のパラフィン切片をサンプル
とし、これを脱パラフイン後ＰＢＳで洗浄した。０．３
％過酸化水素水中３０分間浸漬し内因性のベルオキンダ
ーゼ活性を除去した後、ＰＢＳで３回洗浄後５％ヤギ血
清にて１０分間ブロッキング処理を行った。ＰＢＳで１
回軽く洗浄後、ウサギ抗Ｃｆｌ＾抗体（コスモ・バイオ
社製、ＰＢＳにて２００倍希釈）と室温にて３０分間反
応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、ペルオキシダーゼ標識
ヤギＩｇＧＰａｂ抗ウサギイムノグロブリン抗体（カッ
ペル社製、ＰＢＳにて２００倍希釈）と室温にて３０分
間反応させた。ＰＢＳにて３回洗浄後、２通りの発色液
■■にて発色反応を行なった。本発明に係る発色液■は
実施例１の発色液■と同様に調製した。従来の３−アミ
ノエチル−９−カルバゾールを使用した発色液■はジメ
チルホルムアミド１−に溶解した１０■の３−アミノエ
チル−９−カルバゾールに０．０１％過酸化水素含育Ｔ
ＢＳ２０−を加え調製した。

１０分間の反応後、ＰＢＳにて３回洗浄、純水にて洗浄
後、発色液■にて発色したサンプルは５％（Ｗ／■）塩
化第２鉄水溶液にて３０分間浸漬３回の純水洗浄後処理
を行なった。発色液■、発色液■によるサンプルは両者
とも顕微鏡下、赤色色素のＣＥＡ陽性像を示した。

次いで２つのサンプルは１％メチルグリーン液（０１Ｍ
酢酸ベロナールバッファ、ｐＨ４，０）にて核染色を行
ない。さらに封入のために、以下の様にエタノール脱水
、キシレン透徹の操作を行なった。

７０％エタノール２槽、９５％エタノール２槽、純エタ
ノールで２槽次いでキシレン２槽に順次浸漬させた。

従来の色原体として３−アミノエチル−９−カルバゾー
ルを用いた発色法によるサンプルはこの操作中に生成し
た染色色素が溶解してしまい、ＣＥＡ陽性像が消失した
。一方、本発明の金属塩を形成し得る官能基を有する色
原体を用い、さらに色素生成後に金属イオンを含む溶液
に接触させる方法によれば、上記操作にも生成色素は溶
解すること無く鮮やかな染色像か得られた。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）金属塩を形成しうる官能基を有する色原体から酵
   素の存在の下に形成された色素を担持したマトリックス
   媒体に、更に金属イオンを作用させて、前記色素の有機
   溶媒に対する溶解性を低減させることを特徴とする酵素
   免疫染色法。
2. （２）前記色原体が芳香族第１級アミン化合物の酸化体
   とカップリングする活性基を有する発色性カプラーであ
   り、かつ前記酵素がペルオキシダーゼである請求項１に
   記載の酵素免疫染色法。
3. （３）前記色原体が活性メチレン化合物及び／又は活性
   メチン化合物である請求項１又は２に記載の酵素免疫染
   色法。
4. （４）前記金属塩を形成しうる官能基がスルホ基及び／
   又はカルボキシル基である請求項１〜３のいづれかに記
   載の酵素免疫染色法。
5. （５）前記金属イオンがＦｅ（III）＾３＾＋及び／又
   はＣＯ（III）＾３＾＋である請求項１〜４のいづれか
   に記載の酵素免疫染色法。