JPH052018A - 酵素免疫染色法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 安定性に優れ、鮮明で、診断や検出が容易で
あり、発癌性などの危険性がなく、封入操作が簡単な酵
素免疫染色法を提供することである。 【構成】 オルトフェニレンジアミン、パラフェニレン
ジアミン、１，２，４−トリアミノベンゼンの群の中か
ら選ばれる芳香族アミン化合物と縮合リン酸誘導体を用
いる酵素免疫染色法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生体組成媒体の酵素免
疫染色法に関し、特に有機溶媒などに難溶な色素を構成
する酵素免疫染色法に関するものである。

【０００２】

【発明の背景】臨床学的解析を確実、かつ、簡便に行う
必要から生体成分などの特定成分を検出する各種の分析
法が開発されて来ている。これらの方法のうち、最も精
度の高い方法として、特定成分とこれに対して特異的に
結合しうる物質（以後、特異結合物質）、例えば抗原と
抗体、ある種の糖鎖とレクチン、ビオチンとアビジン、
プロテインＡとＩｇＧ、ホルモンとレセプタ、酵素と基
質などの間の特異的結合反応を用いる方法が知られてい
る。

【０００３】一般的には、何らかの標識を付した特異結
合物質（以後、標識体）を用い、対象とする特定成分に
応じて変化した該標識体のシグナルを検出することによ
り特定成分の測定が行われる。特に、マトリックス媒体
に直接的または間接的に担持させた特定成分を標識体と
反応させ、両者の複合体として標識体を固定し、実質的
に特定成分に応じた標識からのシグナルを検出する方法
が適宜用いられる。

【０００４】例えば、電気泳動した蛋白質生体成分（特
定成分）をゲルからニトロセルロース膜上に転写して担
持し、これを標識体、例えば抗体標識体と反応させ、シ
グナルを検出する方法、ＴＬＣプレート上に展開した脂
質等の特定成分に標識体を反応させてシグナルを検出す
る方法、膜上でＤＮＡに対して標識した相補的ＤＮＡと
を反応させ、シグナルを検出する方法あるいは免疫組織
染色法などである。

【０００５】免疫組織染色法においては、組織上の目的
とする特定成分の存在場所、状態などの情報が得られ
る。特異結合物質の標識としては、従来、放射性同位元
素、螢光物質、発光物質、酵素などが用いられている。
これらのうち放射性同位元素を用いた場合は放射活性の
減衰や廃棄、被曝あるいは設備に巨費を要し、更に長い
時間と煩雑な操作を要するという欠点がある。又、螢光
物質もしくは発光物質を用いる場合は、特殊な装置や設
備が必要になる。一方、酵素を用いた場合、操作も比較
的簡単で、生成色素はたやすく可視化でき、特定成分の
定量も可能である。従来、このような標識酵素として、
ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガ
ラクトシダーゼ等が用いられてきた。特に、使用のし易
さ、安定性よりペルオキシダーゼが広く用いられてき
た。

【０００６】酵素免疫染色法、特に生成組織、細胞上の
抗原物質を検出、測定する免疫組織染色法は、診断上有
益な方法である。免疫組織染色法において常用される方
法としては、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の酸化触媒作
用によって色原体を酸化し、色素を生成して染色した
後、試料保存の為に、エタノール、キシレンで試料を洗
浄し、脱水後封入剤に浸漬し、封入が施される。

【０００７】色原体としてはジアミノベンジジン（ＤＡ
Ｂ）、アミノエチルカルバゾール（ＡＥＣ）が常用され
ている。前記のＤＡＢを用いると、染色色素はポリマー
化し、有機溶媒に不溶であり、封入には好都合である
が、これは発癌性物質であり、又、色調は黄ないしは褐
色であり、検出、診断に困難である。又、ＡＥＣを用い
る場合には、染色色素は赤色であり、色調的には好都合
であるが、エタノール、キシレン等の有機溶媒に可溶で
あり、洗浄、脱水、封入操作が著しく困難であり、特殊
試薬を用い、煩雑な操作が強いられている。

【０００８】尚、一般的なペルオキシダーゼ酵素免疫染
色法については、色原体として芳香族アミン化合物に組
み合わせてフェノール化合物（特開昭６３−６４６２号
公報）、あるいは活性メチレン化合物（特開昭６３−７
１６５４号公報）を用いることが有用であることが開示
されているが、これらの染色色素も有機溶媒に可溶であ
り、封入、保存に支障がある。

【０００９】

【発明の開示】本発明の第１の目的は、安定性に優れた
酵素免疫染色法を提供することである。本発明の第２の
目的は、鮮明で、診断や検出が容易な酵素免疫染色法を
提供することである。

【００１０】本発明の第３の目的は、発癌性などの危険
性がない酵素免疫染色法を提供することである。本発明
の第４の目的は、封入操作が簡単な酵素免疫染色法を提
供することである。上記本発明の目的は、オルトフェニ
レンジアミン、パラフェニレンジアミン、１，２，４−
トリアミノベンゼンの群の中から選ばれる芳香族アミン
化合物と縮合リン酸誘導体を用いることを特徴とする酵
素免疫染色法によって達成される。

【００１１】尚、オルトフェニレンジアミン、パラフェ
ニレンジアミン、１，２，４−トリアミノベンゼンは酸
化されることにより色素を生成する色原体であり、これ
らは例えば塩酸塩のような塩の形のものであっても良
い。そして、縮合リン酸誘導体におけるリンの酸化数が
５のリン酸誘導体であるものが、特にウルトラリン酸又
はウルトラリン酸塩の群の中から選ばれるもの、最も望
ましくはウルトラリン酸アルカリ金属（ナトリウム、カ
リウム、リチウム）塩であるものが好ましい。

【００１２】又、酵素（疑似酵素も含まれる）として
は、色原体（芳香族アミン化合物）を酸化し、解析手段
を与える反応を触媒するものであれば特に限定されない
が、過酸化酵素が好ましい。過酸化酵素又は過酸化疑似
酵素による酸化反応には過酸化物質が必要とされる。過
酸化物質としては、無機、有機いずれの過酸化物資、例
えば有機過酸化物質であっても良いが、過酸化水素が好
ましい。過酸化酵素としては、例えばホースラディッシ
ュペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミエロ
ペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、チ
トクロームＣペルオキシダーゼ等が使用可能であり、ま
た過酸化疑似酵素としては、例えばヘモグロビンや鉄、
金、銀等の金属及び金属化合物が使用される。

【００１３】発色試薬には、少なくとも酸化されること
により解析手段を与える色原体及びウルトラリン酸アル
カリ金属塩のような縮合リン酸誘導体が含まれていれば
良く、又、過酸化水素等の過酸化物質又は過酸化酵素が
含まれても良く、更に、必要に応じてその他の物質、例
えば安定化剤が含まれていていもよい。発色試薬として
は、固体状、粉末状、溶液状など種々の形態のものが含
まれ、これら固体状、粉末状、溶液状などの種々の形態
の発色試薬は適当な操作、例えば溶媒への溶解等によ
り、検出系に使用可能な溶液状の発色試薬液に調製が可
能である。 安定化の対象とする検出系は、前記酵素又
はその疑似酵素により前記色原体の酸化反応を行わせ、
その程度を例えば光学的手段により検出する系であり、
結果の解析により目的の情報、例えば酵素活性に対応し
た試料中の解析物質を得ることができる。一般に、その
酵素又は疑似酵素の酸化反応は色原体を溶解した溶液中
にて行われる。

【００１４】発色試薬液又は検出系に用いる溶媒として
は水系溶媒が好ましいが、酵素的酸化反応を極端に阻害
するものでなければ、有機溶媒又は有機溶媒と水系溶媒
の混合溶媒であってもよい。一般には水、場合によって
は有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、Ｎ，Ｎ−
ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メ
チルピロリドン、ジオキサンと水系溶媒の混合溶媒が用
いられる。溶媒は酵素反応に適当なｐＨ値にあることが
望ましく、通常用いられる緩衝剤により調製されること
が好ましい。過酸化酵素を用いる場合は、ｐＨ３ないし
ｐＨ９が好ましい。

【００１５】ウルトラリン酸アルカリ金属塩のような縮
合リン酸誘導体を発色試薬液に含有させるには、色原体
を溶解した溶媒に添加してもよく、溶媒に最初に溶解後
に色原体を添加してもよく、又、色原体と縮合リン酸誘
導体の混合物もしくは凍結乾燥物を同時に溶媒に添加、
溶解してもよい。又、色原体を含む溶液と縮合リン酸誘
導体を含む溶液を混合してもよい。

【００１６】発色試薬液又は検出系において含有される
縮合リン酸誘導体の濃度は、酵素反応における阻害の程
度と非酵素的酸化の抑制度を考慮して決定されるが、
０．０１ないし１０００ｍＭ、望ましくは０．１ないし
５００ｍＭ、より望ましくは１ないし１００ｍＭである
ことが好ましい。又、色原体の濃度は０．１ないし５０
０ｍＭが好ましい。

【００１７】例えば、０．１ないし５００ｍＭの濃度の
色原体及び０．０１ないし１０００ｍＭの濃度の縮合リ
ン酸誘導体を含有させたｐＨ３ないしｐＨ９の緩衝液を
調製し、発色試薬液を用意する。発色試薬液と試料とを
混合し、２ないし５０℃の温度で酵素反応を行わせ、一
定時間してから水洗等の処理により反応を停止させる。
試料中の過酸化酵素活性に応じて色原体が酸化され、そ
の結果生成した物質がマトリックス媒体上に決着し、こ
れを光学的に検出する。尚、生成色素は有機溶媒にも不
溶であり、免疫組織染色に適用可能である。

【００１８】本発明において、測定の対象となる特定成
分は、その特定成分に特異的に結合する特異結合物質が
得られる物質または物質群である。例えば、蛋白質、核
酸、ホルモン、脂質、複合糖質、糖脂質、多糖類、酵
素、ビタミン、抗原、抗体などが挙げられる。本発明に
使用し得る特異結合物質は、特定成分又は他の特異結合
物質と特異的に結合できる物質であり、測定対象とする
特定成分に応じて適当に選ぶ事ができる。例えば、蛋白
質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、糖脂質、多糖
類、酵素、ビタミン、抗原、抗体、レクチン、プロテイ
ンＡ、アビジン、ビオチン、レセプター、補酵素、酵素
の基質、毒素、補体及びこれらの複合体等が挙げられ
る。

【００１９】本発明の酵素免疫染色法を適用し得るもの
としては、セルロースアセテートやニトロセルロース等
の膜、ポリアクリルアミド等のゲル状支持体、ＴＬＣプ
レート等のシリカゲル担体、デキストラン、アガロース
等の多糖類及びその誘導体、プレート状、ビーズ状のプ
ラスチック、ガラス、金属、繊維、活性炭、ヒドロキシ
アパタイト等のマトリックス媒体が挙げられる。尚、マ
トリックス媒体としては化学的に活性な基（例えば、−
ＳＨ、−ＮＨ₂ 、−ＣＯＯＨ等の基）を有するものであ
ることが好ましい。又、免疫組織染色法においては組織
そのものに適用できる。

【００２０】

【実施例】

〔実施例１〕０．０２％の過酸化水素を含有する１００
ｍＭクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）と０．０２
％の過酸化水素を含有する１００ｍＭウルトラリン酸
（関東化学社製、Ｎ₂ Ｐ₄ Ｏ₁₁）緩衝液（ｐＨ５．０）
とを所望量混和し、次いで色原体を５ｍｇ／１０ｍｌと
なるように添加溶解し、下記の表１の発色液を調製し
た。

【００２１】そして、０．５μｇのペルオキシダーゼを
ブロットしたＰＶＤＦ（ミリポア社製のポリビニルジフ
ロライド）膜を各発色液中に浸漬し、１０分間反応後水
洗した。 表１ 発色液 色原体 クエン酸緩衝液／ウルトラリン酸緩衝液 Ａ−１ ｏ−フェニレンジアミン １／０ Ａ−２ 〃 ０．９８／０．０２ Ａ−３ 〃 ０．８／０．２ Ａ−４ 〃 ０／１ Ｂ−１ ｐ−フェニレンジアミン １／０ Ｂ−２ 〃 ０．９８／０．０２ Ｂ−３ 〃 ０．８／０．２ Ｂ−４ 〃 ０／１ Ｃ−１ １．２．４−トリアミノベンゼン １／０ Ｃ−２ 〃 ０．９８／０．０２ Ｃ−３ 〃 ０．８／０．２ Ｃ−４ 〃 ０／１ その結果、Ａ−１、Ｂ−１、Ｃ−１の発色液が用いられ
た場合には、生成色素は水に溶解したが、その他は溶解
することなく、色素スポットが出現した。

【００２２】〔実施例２〕段階希釈したペルオキシダー
ゼをブロットしたＰＶＤＦ膜を実施例１と同様のＡ−
３，Ｂ−３，Ｃ−３及び比較の発色液Ｄ中に浸漬し、１
０分間反応後水洗した。尚、比較の発色液Ｄは、３ｍｇ
の４−クロロ−１−ナフトールを１ｍｌのメタノールに
溶解し、さらに０．０２４％過酸化水素含有トリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７．４、２００ｍＭ塩化ナトリウム含有）
５ｍｌを加え、調整したものである。

【００２３】その結果は、Ａ−３及びＢ−３のもので
は、０．２ｎｇのペルオキシダーゼが、Ｃ−３のもので
は０．１ｎｇのペルオキシダーゼが検出可能であったの
に対して、比較の発色液Ｄでは、１ｎｇのペルオキシダ
ーゼが検出可能であるに過ぎなかった。又、得られたＰ
ＶＤＦ膜を７０％エタノール、純エタノールに順に浸漬
したところ、Ａ−３、Ｂ−３、Ｃ−３の発色液が用いら
れた色素スポットは保持されたが、比較の発色液Ｄが用
いられた色素スポットは溶解、消滅した。

【００２４】〔実施例３〕胃癌組織のパラフィン切片を
常法に従い１０％ヤギ血清／ＰＢＳ溶液にてブロッキン
グした後、抗ＣＥＡマウスモノクローナル抗体（コスモ
・バイオ社）と反応させた。１５分後にＰＢＳで洗浄
し、さらにペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスイムノグ
ロブリン抗体（カッペル社）と反応させた。

【００２５】１５分後にＰＢＳで洗浄した後、下記の発
色液中で１０分間反応させた。 発色液Ａ−５ ｏ−フェニレンジアミンを２ｍｇ／ｍｌ
になるように０．０２％過酸化水素含有の１００ｍＭウ
ルトラリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解 発色液Ｃ−５ １．２．４−トリアミノベンゼンを２ｍ
ｇ／ｍｌになるように０．０２％過酸化水素含有の１０
０ｍＭウルトラリン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解 比較発色液Ｅ ５ｍｇの３−アミノ−９−エチルカルバ
ゾールを１ｍｌのＤＭＦに溶解し、さらに０．０２％過
酸化水素含有のトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）９ｍｌ
を加えて調整 １０分間の反応後、水洗したところ、発色液Ａ−５及び
発色液Ｃ−５が用いられたものでは黒褐色のＣＥＡ陽性
像が、比較発色液Ｅが用いられたものでは赤色のＣＥＡ
陽性像が顕微鏡下に見られた。

【００２６】次いで、７０％エタノールに３回、純エタ
ノールに３回、キシレンに３回浸漬させ、脱水透徹操作
を行ったところ、Ａ−５及びＣ−５の発色液が用いられ
たものではＣＥＡ陽性像が見られたが、比較発色液Ｅが
用いられたものではＣＥＡ陽性像が消滅した。

【００２７】

【効果】本発明は、安定性に優れ、しかも鮮明で、診断
や検出が容易なものであり、かつ、発癌性などの危険性
がなく、そして封入操作が簡単な酵素免疫染色法であ
る。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 オルトフェニレンジアミン、パラフェニ
   レンジアミン、１，２，４−トリアミノベンゼンの群の
   中から選ばれる芳香族アミン化合物と縮合リン酸誘導体
   を用いることを特徴とする酵素免疫染色法。
2. 【請求項２】 縮合リン酸誘導体がウルトラリン酸又は
   ウルトラリン酸塩であることを特徴とする請求項１の酵
   素免疫染色法。