JPH052020A - 酵素免疫染色法及び免疫組織染色法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 発癌性等の危険性がなく、鮮明で、より高感
度に検出が出来、診断がより正確になる酵素免疫染色法
を提供することである。 【構成】 色原体として下記の一般式（Ｉ）又は（Ｉ
Ｉ）で表される化合物と芳香族第一級アミン化合物とが
用いられる酵素免疫染色法。 一般式（Ｉ） 【化１】 一般式（ＩＩ） 【化２】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、生体組織媒体の酵素免
疫染色法に関するものである。

【０００２】

【発明の背景】臨床学的解析を確実、かつ、簡便に行う
必要から、生体成分などの特定成分を検出する各種の分
析法が開発されて来ている。それらの方法のうち、最も
精度の高い方法として、例えば抗原と抗体、ある種の糖
鎖とレクチン、ビオチンとアビジン、プロテインＡとＩ
ｇＧ、ホルモンとレセプタ、酵素と基質等のように、特
定成分とこれに対して特異的に結合しうる物質（以下、
特異結合物質）との間の特異的結合反応を用いる方法が
知られている。

【０００３】一般的には、何らかの標識（ラベル）を付
した特異的結合物質（以下、標識体）を用い、対象とす
る特定成分に応じて変化した該標識体のシグナルを検出
することにより特定成分の測定が行われる。特に、支持
体に直接的または間接的に担持させた特定成分を標識体
と反応させ、両者の複合体として標識体を固定し、実質
的に特定成分に応じた標識からのシグナルを検出する方
法が適宜用いられる。例えば、電気泳動した蛋白質生体
成分（特定成分）をゲルからニトロセルロース膜上に転
写して担持し、これを標識体、例えば抗体標識体と反応
させてシグナルを検出する方法、ＴＬＣプレート上に展
開した脂質等の特定成分に標識体を反応させてシグナル
を検出する方法、膜上でＤＮＡと該ＤＮＡに対する標識
したｃＤＮＡとを反応させてシグナルを検出する方法、
或いは免疫組織染色法などである。

【０００４】特異的結合物質の標識物質としては、例え
ば放射性同位元素、蛍光物質、発光物質、酵素等が用い
られている。しかしながら、放射性同位元素は、放射活
性の減衰の問題、廃棄処理の問題、被曝の問題、設備費
用が嵩む問題などがあり、又、操作も煩雑な欠点があ
る。又、蛍光物質もしくは発光物質を用いる場合にも、
特殊な操作、設備が必要になる。

【０００５】これに対して、酵素を用いた場合、操作も
比較的簡単で、生成色素は容易に可視化でき、特定成分
の定量も可能である。尚、このような標識酵素として、
ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガ
ラクトシダーゼ等が用いられて来た。酵素免疫染色法、
特に生体組織、細胞上の抗原物質を検出、測定する免疫
組織染色法は、診断上有益な方法である。例えば、免疫
組織染色法においては、組織上の目的とする特定成分の
存在場所や状態等の情報も得られる。

【０００６】免疫組織染色法においては、例えばペルオ
キシダーゼ（ＰＯＤ）の酸化触媒作用によって色原体を
酸化し、色素を生成させて染色した後、試料保存の為、
エタノール、キシレンで試料を洗浄し、脱水後封入剤に
浸漬し、封入が施される。ところで、色原体としてはジ
アミノベンジジン（ＤＡＢ）、アミノエチルカルバゾー
ル（ＡＥＣ）が使用されている。

【０００７】しかしながら、ＤＡＢを用いると、染色体
はポリマー化し、有機溶媒に不溶で、封入には好都合で
あるが、発癌性物質であり、また色調は黄ないし褐色で
あり、検出、診断に困難が有る。又、ＡＥＣを用いる
と、染色色素は赤色であり、色調的には好都合である
が、エタノール、キシレン等の有機溶媒に可溶であり、
洗浄、脱水、封入操作が著しく困難であり、特殊試薬を
用いての煩雑な操作が強いられる。

【０００８】又、一般的な酵素免疫染色法については、
色原体として芳香族アミン化合物に組み合わせてフェノ
ール化合物（特開昭６３−６４６２号公報）或いは活性
メチレン化合物（特開昭６３−７１６５４号公報）を用
いることが有用であることが開示されているが、これら
の染色色素も有機溶媒に可溶であり、封入、保存に支障
がある。

【０００９】

【発明の開示】本発明の第１の目的は、発癌性等の危険
性がない酵素免疫染色法及び免疫組織染色法を提供する
ことである。本発明の第２の目的は、鮮明で、より高感
度に検出が出来、診断がより正確になる酵素免疫染色法
及び免疫組織染色法を提供することである。

【００１０】本発明の第３の目的は、有機溶媒に難溶性
の染色色素が生成され、簡便な封入操作が可能となる免
疫組織染色法を提供することである。上記本発明の目的
は、色原体として下記の一般式（Ｉ）で表されるナフト
サルタン誘導体と芳香族第一級アミン化合物とが用いら
れることを特徴とする酵素免疫染色法によって達成され
る。

【００１１】一般式（Ｉ）

【００１２】

【化５】

【００１３】（但し、式中、Ｘは、水素原子、離脱原
子、又は離脱基を表し、Ｒは置換基を表し、ｍは０から
５の整数を表す。）又、色原体として下記の一般式
（Ｉ）で表されるナフトサルタン誘導体と芳香族第一級
アミン化合物とが用いられた色素の生成後に、金属イオ
ンが作用させられることを特徴とする免疫組織染色法に
よって達成される。

【００１４】一般式（Ｉ）

【００１５】

【化６】

【００１６】（但し、式中、Ｘは、水素原子、離脱原
子、又は離脱基を表し、Ｒは置換基を表し、ｍは０から
５の整数を表す。）又、色原体として下記の一般式（Ｉ
Ｉ）で表される化合物と芳香族第一級アミン化合物とが
用いられることを特徴とする酵素免疫染色法によって達
成される。 一般式（ＩＩ）

【００１７】

【化７】

【００１８】（但し、式中、Ｘは、水素原子、離脱原
子、又は離脱基を表し、Ｒは置換基を表し、ｍは０から
５の整数を表す。）又、色原体として下記の一般式（Ｉ
Ｉ）で表される化合物と芳香族第一級アミン化合物とが
用いられた色素の生成後に、金属イオンが作用させられ
ることを特徴とする免疫組織染色法によって達成され
る。

【００１９】一般式（ＩＩ）

【００２０】

【化８】

【００２１】（但し、式中、Ｘは、水素原子、離脱原
子、又は離脱基を表し、Ｒは置換基を表し、ｍは０から
５の整数を表す。）本発明における酵素としては、一般
に酵素抗体法の標識酵素が挙げられるが、好ましくはペ
ルオキシダーゼである。本発明の酵素免疫染色法及び免
疫組織染色法において、測定対象となる特定成分は、そ
の特定成分に特異的に結合する特異的物質が得られる物
質または物質群である。例えば、蛋白質、核酸、ホルモ
ン、脂質、複合糖質、糖脂質、多糖類、酵素、ビタミ
ン、抗原、抗体等が挙げられる。

【００２２】本発明の酵素免疫染色法及び免疫組織染色
法に使用し得る特異結合物質は、特定成分又は他の特異
的結合物質と特異的に結合できる物質であり、測定対象
とする特定成分に応じて適当に選ぶことができる。例え
ば、蛋白質、核酸、ホルモン、脂質、複合糖質、糖脂
質、多糖類、酵素、ビタミン、抗原、抗体、レクチン、
プロテインＡ、アビジン、ビオチン、レセプタ、補酵
素、酵素の基質、毒素、補体及びこれらの複合体等が挙
げられる。

【００２３】本発明において生成色素を担持させる為に
使用し得るマトリックス媒体としては、セルロースアセ
テートやニトロセルロース等の膜、ポリアクリルアミド
等のゲル状支持体、ＴＬＣプレート等のシリカゲル担
体、デキストラン、アガロース等の多糖類及びその誘導
体、プレート状やビーズ状のプラスチック、ガラス、金
属、繊維、活性炭、ヒドロキシアパタイト等が挙げられ
る。尚、免疫組織染色法においては、組織そのものがマ
トリックス媒体として使用できる。

【００２４】本発明で用いられる上記の一般式（Ｉ）及
び一般式（ＩＩ）の化合物における離脱原子としては、
塩素原子や臭素原子のようなハロゲン原子が挙げられ、
又、離脱基としては−ＯＲ₁ 、−ＯＣＯＲ₁ 、−ＯＳＯ
₂ Ｒ₁ 、−ＳＲ₁ 、−ＯＣＯＮＨＲ₁ 、−ＯＳＯ₂ ＮＨ
Ｒ₁ 、−Ｎ（ＣＯＲ₁ ）Ｒ₂ 、−Ｎ（ＳＯ₂ Ｒ₁ ）
Ｒ ₂ 、−Ｎ（Ｒ₁ ）Ｒ₂ 、−ＳＣＮ、Ｎ原子で結合した
含窒素複素環などが挙げられる。尚、ここで、Ｒ₁ 、Ｒ
₂ は、水素原子、脂肪族炭化水素残基（飽和、不飽和、
直鎖、分岐いずれのタイプのものでも良く、好ましくは
メチル基、エチル基などのアルキル基、アリル基などの
アルケニル基など）、脂環式化合物残基（例えば５，６
員のもので、例えばシクロペンチル基やシクロヘキシル
基など）、アリール基（例えば、フェニル基やナフチル
基など）あるいはヘテロ環残基（例えば、ピリジル基、
ピペラジニル基、キノリル基、フリル基、チアゾリル
基、ベンズイミダゾリル基、ベンズチアゾリル基など）
である。尚、これらの基は、例えばハロゲン原子、ニト
ロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、ケト基、カルボキシル
基、スルホ基、アミノ基、アルキル基、アルケニル基、
アリール基、アルコキシ基などの置換基を有していても
良い。一般式（Ｉ）及び一般式（ＩＩ）におけるＲの表
す置換基としては、特別な制限はないが、代表的な例と
してはアルキル基、アリール基、アニリノ基、アシルア
ミノ基、スルホンアミド基、アルキルチオ基、アリール
チオ基、アルケニル基、シクロアルキル基などの各基が
挙げられる。その他にも、例えばハロゲン原子、シクロ
アルケニル基、アルキニル基、複素環、スルホニル基、
スルファニル基、ホスホニル基、アシル基、カルバモイ
ル基、スルファモイル基、シアノ基、アルコキシ基、ス
ルホニルオキシ基、アリールオキシ基、複素環オキシ
基、シロキシ基、アシルオキシ基、カルバモイルオキシ
基、アミノ基、アルキルアミノ基、イミド基、ウレイド
基、スルファモイルアミノ基、アルコキシカルボニルア
ミノ基、アリールオキシカルボニルアミノ基、アルコキ
シカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、複素環
チオ基、チオウレイド基、カルボキシル基、ヒドロキシ
基、メルカプト基、ニトロ基、スルホン酸基なども挙げ
られる。特に、２位に置換されたアルキルカルバモイル
基、アリールカルバモイル基、アシルアミノ基は好まし
いものである。

【００２５】以下に、一般式（Ｉ）で表されるナフトサ
ルタン誘導体の代表的な具体例を幾つか示す。

【００２６】

【化９】

【００２７】

【化１０】

【００２８】

【化１１】

【００２９】

【化１２】

【００３０】

【化１３】

【００３１】

【化１４】

【００３２】

【化１５】

【００３３】

【化１６】

【００３４】尚、これらの化合物のうち、例えば例示化
合物−１及び−６は、以下のようにして合成される。

【００３５】

【化１７】

【００３６】１，８−ナフトサルタム（例示化合物−
２、アルドリッチ社製）２０ｇを、ＤＭＦ１５０ｍｌに
溶解した。これに、氷冷下、Ｎ−クロロスクシンイミド
１４．５ｇを約１時間かけて添加し、さらに３時間攪拌
した。反応液を３００ｍｌの氷水中に注ぎ、析出した固
体をエタノールで再結晶することにより淡褐色結晶の例
示化合物−１が１３．６ｇ得られた。

【００３７】この例示化合物−１の１３．６ｇを酢酸４
０ｍｌに溶解後、硫酸４０ｍｌを加え、さらに、氷冷
下、比重１．３６の硝酸水溶液４．２ｍｌを約１時間か
けて滴下した。４時間攪拌後、反応液を４００ｍｌの氷
水中に注ぎ、析出した固体をエタノール／酢酸エチルの
混合溶媒で再結晶することにより中間体１が１４．１ｇ
得られた。

【００３８】この中間体１の１４．１ｇをメタノール３
００ｍｌに溶解し、さらにパラジウム・カーボン０．７
０ｇを添加した。これに水素ガスをその吸収がなくなる
まで導入した。パラジウム・カーボンを濾過後にメタノ
ールを減圧留去し、中間体２を１２．５ｇ得た。この中
間体２の１２．５ｇをピリジン１００ｍｌに溶解後、無
水酢酸５．２ｇを徐々に滴下した。さらに、１５℃で２
時間攪拌した後、５０℃で１時間攪拌し、そして濃塩酸
を加えて中和した。これに酢酸エチル２００ｍｌを加
え、水１００ｍｌで２回洗浄し、無水硫酸マグネシウム
で乾燥後、溶媒を減圧留去した。このようにして得られ
た固体をアセトニトリルで再結晶し、淡黄色の例示化合
物−６を８．２ｇ得た。

【００３９】又、以下に、一般式（ＩＩ）で表される化
合物の代表的な具体例を幾つか示す。

【００４０】

【化１８】

【００４１】

【化１９】

【００４２】

【化２０】

【００４３】

【化２１】

【００４４】

【化２２】

【００４５】

【化２３】

【００４６】

【化２４】

【００４７】

【化２５】

【００４８】本発明において使用し得る芳香族第一級ア
ミン化合物としては、ｏ−又はｐ−アミノフェノール系
化合物、ｏ−又はｐ−フェニレンジアミン系化合物及び
それらの塩が挙げられる。好ましくは、ｐ−フェニレン
ジアミン系化合物であり、下記一般式（ＩＩＩ）で示さ
れるものである。 一般式（ＩＩＩ）

【００４９】

【化２６】

【００５０】式（ＩＩＩ）中、Ａ及びＢは水素原子また
はアルキル基を表わし、ＡとＢは窒素原子と共に複素環
を形成してもよく、Ｄ，Ｅ，Ｇ及びＪは水素原子、ハロ
ゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基、アルコキシ基、ア
シルアミド基、アリールスルホンアミド基、アルキルス
ルホンアミド基またはアルキル基を表わす。Ａ及びＢで
表わされるアルキル基としては、炭素原子数１ないし６
のものが好ましく、特に１ないし４のものが好ましい。
例えば、メチル基、エチル基、ブチル基を挙げることが
できる。これらのアルキル基は置換基を有していてもよ
く、置換基としては、例えばヒドロキシル基、ウレイド
基、テトラヒドロフリル基、カルボキシル基、メタンス
ルホンアミド基、スルホ基、メトキシ基、エトキシ基、
メトキシエトキシ基、メトキシエトキシエトキシ基、メ
トキシテトラエトキシ基などが挙げられる。好ましくは
ヒドロキシル基、メタンスルホンアミド基である。

【００５１】Ｄ，Ｇ及びＪとしては水素原子、アルコキ
シ基及びアルキルスルホンアミド基、アリールスルホン
アミド基が好ましく、さらに好ましくは水素原子であ
る。Ｅとしては水素原子、アルキル基、アシルアミド基
が好ましく、より好ましくは炭素原子数１ないし３のア
ルキル基、特にメチル基である。一般式（ＩＩＩ）で示
される化合物の塩としては、ｐ−トリエンスルホン酸、
スルホン酸、スルフィン酸、硫酸エステル、スルファミ
ン酸、チオ硫酸Ｓ−エステル、カルボン酸、燐酸エステ
ル、アミド燐酸、燐酸、亜燐酸エステル、有機硼素化合
物、塩酸及び硫酸等の有機酸又は無機酸の塩を挙げるこ
とができ、特にｐ−トリエンスルホン酸塩、塩酸塩及び
硫酸塩が好ましい。

【００５２】以下に、芳香族第一級アミン化合物の代表
的な具体例を幾つか示す。 （３−１）Ｎ，Ｎ−ジエチル−３−メチル−４−アミノ
アニリン （３−２）Ｎ，Ｎ−ジエチル−４−アミノアニリン （３−３）Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−メチル−４−ア
ミノアニリン （３−４）Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−テトラヒドロフ
ルフリル−３−メチル−−４−アミノアニリン （３−５）Ｎ−エチル−Ｎ−カルボキシメチル−３−メ
チル−４−アミノアニリン （３−６）Ｎ−カルバミドメチル−Ｎ−エチル−３−メ
チル−４−アミノアニリン （３−７）Ｎ−エチル−Ｎ−テトラヒドロフルフリル−
３−メチル−４−アミノフェノール （３−８）３−アセチルアミノ−４−アミノジメチルア
ニリン （３−９）Ｎ−エチル−Ｎ−β−メタンスルホンアミド
エチル−４−アミノアニリン （３−１０）Ｎ−エチル−Ｎ−β−メタンスルホンアミ
ドエチル−３−メチル−４−アミノアニリン （３−１１）Ｎ−メチル−Ｎ−β−スルホエチル−ｐ−
フェニレンジアミン （３−１２）Ｎ−エチル−Ｎ−ヒドロキシエチル−３−
メチル−４−アミノアニリン （３−１３）Ｎ−エチル−Ｎ−［２−（２−メトキシエ
トキシ）エチル］−３−メチル−４−アミノアニリン （３−１４）Ｎ−エチル−Ｎ−｛２−［２−（２−メト
キシエトキシ）エトキシ］エチル｝−３−メチル−４−
アミノアニリン （３−１５）Ｎ−エチル−Ｎ−［２−｛２−［２−［２
−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］エトキシ］エト
キシ｝エチル］−３−メチル−４−アミノアニリン （３−１６）Ｎ，Ｎ−ジエチル−３−メタンスルホンア
ミドエチル−４−アミノアニリン 尚、上記の芳香族第一級アミン化合物の塩は、一般に水
溶性であり、水若しくは緩衝液中に容易に溶解すること
ができる。

【００５３】マトリックス媒体に担持された特定成分と
ペルオキシダーゼ標識体との複合結合体に色素を生成沈
着せしめる為には、発色液中に支持体を浸漬すれば良
い。発色液は、適当なｐＨの緩衝液中に過酸化水素、芳
香族第一級アミン化合物、色原体（前記一般式（Ｉ）及
び（ＩＩ）で表される化合物）を溶解して調製される。
色原体は、少量の親水性の有機溶剤、例えばメタノー
ル、エタノール、ＤＭＦ等に溶解して加えても良い。芳
香族第一級アミン化合物とナフトサルタン誘導体とのモ
ル比は１対１００から１００対１であることが適当であ
り、特に１対１０から１０対１であることが好ましい。

【００５４】酵素反応によりマトリックス媒体上に色素
が充分生成沈着した後、未反応物質を洗い流し、反応を
停止する。次に、金属イオン含有水溶液中に浸漬する事
により、金属イオンを作用させ、色素の有機溶媒に対す
る溶解性を低減させる。染色色素を担持したマトリック
ス媒体に作用させる金属としては多価金属イオンであ
り、好ましくはＦｅ（III)³⁺，Ｃｏ（III)³⁺イオンであ
り、錯イオンとなっていてもよい。

【００５５】免疫組織染色の場合は、次いでアルコー
ル、キシレンによる脱水、透徹操作を行う。そして、こ
のようにして生成した染色色素についての情報は、目視
にて、又は公知な方法、例えば分光光度計を用いて読み
取ることができる。

【００５６】

【実施例】

〔実施例１〕メタノールによりウェッティング操作を行
ったＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）にブロッティング装置
（バイオラッド社）を用い、量変化させたヒトＩｇＧを
ドットブロットした。

【００５７】これを１％ＢＳＡ−ＰＢＳにて３７℃で１
時間ブロッキングした後、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗
ヒトＩｇＧ抗体（カッペル社製、１％ＢＳＡ−ＰＢＳに
て２０００倍希釈）と４℃にて１時間反応させ、その後
ＰＢＳで充分洗浄した。上記の免疫反応後の膜を下記の
発色液Ａ，Ｃ，Ｄに浸漬し、室温にて発色反応を行なわ
せた。

【００５８】〔発色液Ａ〕一般式（Ｉ）で表されるナフ
トサルタン誘導体（例示化合物１）１５ｍｇをメタノー
ル５ｍｌに溶解し、これに芳香族第一級アミン化合物
（Ｎ−エチル−Ｎ−β−メタンスルホンアミドエチル−
３−メチル−４−アミノアニリン、３／２硫酸１水塩）
５ｍｇを溶解した５０ｍＭトリス塩酸バッファー（２０
０ｍＭのＮａＣｌ含有、ｐＨ７．４、以下ＴＢＳ）２５
ｍｌを加え、さらに３％過酸化水素水１００μｌを加
え、これを発色液Ａ（本発明）とした。

【００５９】〔発色液Ｃ〕発色液Ａにおいて、ナフトサ
ルタン誘導体（例示化合物１）の代わりに４−クロロ−
１−ナフトールを用いて同様に行い、これを発色液Ｃ
（比較例１）とした。 〔発色液Ｄ〕発色液Ｃにおいて、芳香族第一級アミン化
合物を用いないで同様に行い、これを発色液Ｄ（比較例
２）とした。

【００６０】発色反応１０分後に膜を発色液から取り出
し、純水にて洗浄後に風乾し、目視にて判定した。その
結果は、本発明の発色液を用いた場合には０．１ｎｇの
量のヒトＩｇＧの検出が可能であった。これに対して、
比較例１の発色液が用いられた場合には０．５ｎｇのヒ
トＩｇＧの検出が出来るに過ぎず、又、比較例２の発色
液が用いられた場合には５ｎｇのヒトＩｇＧの検出が出
来るに過ぎず、本発明のものに較べて検出感度は格段に
劣っている。

【００６１】〔実施例２〕常法にて作成したヒト大腸癌
のパラフィン切片をサンプルとし、これを脱パラフィン
後ＰＢＳで洗浄した。そして、１％過酸化水素−メタノ
ール液中に３０分間浸漬し、内因性のペルオキシダーゼ
活性を除去した後、ＰＢＳで洗浄し、その後５％ヤギ血
清−ＰＢＳにて１０分間ブロッキングした。

【００６２】ＰＢＳで洗浄後、ウサギ抗ＣＥＡ抗体（コ
スモバイオ社製、ＰＢＳにて２００倍希釈）と室温で３
０分間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、ペルオキシダ
ーゼ標識ヤギＩｇＧＦａｂ抗ウサギＩｇＧ抗体（カッペ
ル社製、ＰＢＳにて２００倍希釈）と室温で反応後、下
記の発色液Ｂ，Ｃ，Ｅ中にて発色反応を行った。 〔発色液Ｂ〕一般式（Ｉ）で表されるナフトサルタン誘
導体（例示化合物２）１５ｍｇをメタノール５ｍｌに溶
解し、これに芳香族第一級アミン化合物（Ｎ−エチル−
Ｎ−β−メタンスルホンアミドエチル−３−メチル−４
−アミノアニリン、３／２硫酸１水塩）５ｍｇを溶解し
た５０ｍＭトリス塩酸バッファー（２００ｍＭのＮａＣ
ｌ含有、ｐＨ７．４、以下ＴＢＳ）２５ｍｌを加え、さ
らに３％過酸化水素水１００μｌを加え、これを発色液
Ｂ（本発明）とした。

【００６３】〔発色液Ｃ〕発色液Ｂにおいて、ナフトサ
ルタン誘導体（例示化合物２）の代わりに４−クロロ−
１−ナフトールを用いて同様に行い、これを発色液Ｃ
（比較例）とした。 〔発色液Ｅ〕１０ｍｇの３−アミノエチル−９−カルバ
ゾールを溶解したＤＭＦ１ｍｌに０．０１％過酸化水素
を含有したＴＢＳ２０ｍｌを加え、これを発色液Ｅ（比
較例）とした。

【００６４】１０分間の反応後、ＰＢＳにて３回洗浄
後、純水にて洗浄し、その後次の操作を行った。 〔操作ａ〕 純水中に１０分間静置 〔操作ｂ〕 ３％（Ｗ／Ｖ）塩化第２鉄水溶液中１０分
間静置 〔操作ｃ〕 ３％（Ｗ／Ｖ）塩化ヘキサミンコバルト水
溶液中１０分間静置 各処理後、サンプルを純水にて洗浄した。その結果、発
色液Ｂによるサンプルはいずれも淡青色のＣＥＡ陽性像
を示した。尚、発色液Ｃ，Ｅのサンプルは赤色及び濃青
色のＣＥＡ陽性像を示した。

【００６５】前記操作ａ，ｂ又はｃの操作の後、各サン
プルに封入の為の脱水、透徹操作を行った。すなわち、
７０％エタノール２槽、９５％エタノール２槽、純エタ
ノール２槽、次いでキシレン２槽に順次浸漬させた。こ
の結果を表−１に示す。 表−１ 発色液（色原体） 操作 色素像 発色液Ｂ 操作ｂ 保持 本発明 発色液Ｂ 操作ｃ 保持 本発明 発色液Ｃ 操作ａ 消失 比較例 発色液Ｃ 操作ｂ 消失 比較例 発色液Ｃ 操作ｃ 消失 比較例 発色液Ｅ 操作ａ 消失 比較例 発色液Ｅ 操作ｂ 消失 比較例 発色液Ｅ 操作ｃ 消失 比較例 これによれば、本発明の色原体を用い、さらに金属塩で
処理することにより、耐有機溶剤性の色素像が形成で
き、有用な免疫組織染色法が提供出来ることが判る。

【００６６】〔実施例３〕メタノールによりウェッティ
ング操作を行ったＰＶＤＦ膜（ミリポア社製）にブロッ
ティング装置（バイオラッド社）を用い、量変化させた
ヒトＩｇＧをドットブロットした。これを１％ＢＳＡ−
ＰＢＳにて３７℃で１時間ブロッキングした後、ペルオ
キシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（カッペル社製、
１％ＢＳＡ−ＰＢＳにて２０００倍希釈）と４℃にて１
時間反応させ、その後ＰＢＳで充分洗浄した。

【００６７】上記の免疫反応後の膜を下記の発色液Ａ，
Ｃ，Ｄに浸漬し、室温にて発色反応を行なわせた。 〔発色液Ａ〕一般式（ＩＩ）で表される化合物（例示化
合物１）１５ｍｇをメタノール５ｍｌに溶解し、これに
芳香族第一級アミン化合物（Ｎ−エチル−Ｎ−β−メタ
ンスルホンアミドエチル−３−メチル−４−アミノアニ
リン、３／２硫酸１水塩）５ｍｇを溶解した５０ｍＭト
リス塩酸バッファー（２００ｍＭのＮａＣｌ含有、ｐＨ
７．４、以下ＴＢＳ）２５ｍｌを加え、さらに３％過酸
化水素水１００μｌを加え、これを発色液Ａ（本発明）
とした。

【００６８】〔発色液Ｃ〕発色液Ａにおいて、例示化合
物１の代わりに４−クロロ−１−ナフトールを用いて同
様に行い、これを発色液Ｃ（比較例１）とした。 〔発色液Ｄ〕発色液Ｃにおいて、芳香族第一級アミン化
合物を用いないで同様に行い、これを発色液Ｄ（比較例
２）とした。

【００６９】発色反応１０分後に膜を発色液から取り出
し、純水にて洗浄後に風乾し、目視にて判定した。その
結果は、本発明の発色液を用いた場合には０．１ｎｇの
量のヒトＩｇＧの検出が可能であった。これに対して、
比較例１の発色液が用いられた場合には０．５ｎｇのヒ
トＩｇＧの検出が出来るに過ぎず、又、比較例２の発色
液が用いられた場合には５ｎｇのヒトＩｇＧの検出が出
来るに過ぎず、本発明のものに較べて検出感度は格段に
劣っている。

【００７０】〔実施例４〕常法にて作成したヒト大腸癌
のパラフィン切片をサンプルとし、これを脱パラフィン
後ＰＢＳで洗浄した。そして、１％過酸化水素−メタノ
ール液中に３０分間浸漬し、内因性のペルオキシダーゼ
活性を除去した後、ＰＢＳで洗浄し、その後５％ヤギ血
清−ＰＢＳにて１０分間ブロッキングした。

【００７１】ＰＢＳで洗浄後、ウサギ抗ＣＥＡ抗体（コ
スモバイオ社製、ＰＢＳにて２００倍希釈）と室温で３
０分間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、ペルオキシダ
ーゼ標識ヤギＩｇＧＦａｂ抗ウサギＩｇＧ抗体（カッペ
ル社製、ＰＢＳにて２００倍希釈）と室温で反応後、下
記の発色液Ｂ，Ｃ，Ｅ中にて発色反応を行った。 〔発色液Ｂ〕一般式（ＩＩ）で表される化合物（例示化
合物２）１５ｍｇをメタノール５ｍｌに溶解し、これに
芳香族第一級アミン化合物（Ｎ−エチル−Ｎ−β−メタ
ンスルホンアミドエチル−３−メチル−４−アミノアニ
リン、３／２硫酸１水塩）５ｍｇを溶解した５０ｍＭト
リス塩酸バッファー（２００ｍＭのＮａＣｌ含有、ｐＨ
７．４、以下ＴＢＳ）２５ｍｌを加え、さらに３％過酸
化水素水１００μｌを加え、これを発色液Ｂ（本発明）
とした。

【００７２】〔発色液Ｃ〕発色液Ｂにおいて、例示化合
物２の代わりに４−クロロ−１−ナフトールを用いて同
様に行い、これを発色液Ｃ（比較例）とした。 〔発色液Ｅ〕１０ｍｇの３−アミノエチル−９−カルバ
ゾールを溶解したＤＭＦ１ｍｌに０．０１％過酸化水素
を含有したＴＢＳ２０ｍｌを加え、これを発色液Ｅ（比
較例）とした。

【００７３】１０分間の反応後、ＰＢＳにて３回洗浄
後、純水にて洗浄し、その後次の操作を行った。 〔操作ａ〕 純水中に１０分間静置 〔操作ｂ〕 ３％（Ｗ／Ｖ）塩化第２鉄水溶液中１０分
間静置 〔操作ｃ〕 ３％（Ｗ／Ｖ）塩化ヘキサミンコバルト水
溶液中１０分間静置 各処理後、サンプルを純水にて洗浄した。その結果、発
色液Ｂによるサンプルはいずれも淡青色のＣＥＡ陽性像
を示した。尚、発色液Ｃ，Ｅのサンプルは赤色及び濃青
色のＣＥＡ陽性像を示した。

【００７４】前記操作ａ，ｂ又はｃの操作の後、各サン
プルに封入の為の脱水、透徹操作を行った。すなわち、
７０％エタノール２槽、９５％エタノール２槽、純エタ
ノール２槽、次いでキシレン２槽に順次浸漬させた。こ
の結果を表−２に示す。 表−２ 発色液（色原体） 操作 色素像 発色液Ｂ 操作ｂ 保持 本発明 発色液Ｂ 操作ｃ 保持 本発明 発色液Ｃ 操作ａ 消失 比較例 発色液Ｃ 操作ｂ 消失 比較例 発色液Ｃ 操作ｃ 消失 比較例 発色液Ｅ 操作ａ 消失 比較例 発色液Ｅ 操作ｂ 消失 比較例 発色液Ｅ 操作ｃ 消失 比較例 これによれば、本発明の色原体を用い、さらに金属塩で
処理することにより、耐有機溶剤性の色素像が形成で
き、有用な免疫組織染色法が提供出来ることが判る。

【００７５】

【効果】本発明によれば、発癌性等の危険性がなく、か
つ、鮮明で、より高感度な検出が出来、診断がより正確
になる。又、有機溶媒に難溶性の染色色素が生成され、
封入操作が簡便になる。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 色原体として下記の一般式（Ｉ）で表さ
   れるナフトサルタン誘導体と芳香族第一級アミン化合物
   とが用いられることを特徴とする酵素免疫染色法。 一般式（Ｉ） 【化１】 （但し、式中、Ｘは、水素原子、離脱原子、又は離脱基
   を表し、Ｒは置換基を表し、ｍは０から５の整数を表
   す。）
2. 【請求項２】 色原体として下記の一般式（Ｉ）で表さ
   れるナフトサルタン誘導体と芳香族第一級アミン化合物
   とが用いられた色素の生成後に、金属イオンが作用させ
   られることを特徴とする免疫組織染色法。 一般式（Ｉ） 【化２】 （但し、式中、Ｘは、水素原子、離脱原子、又は離脱基
   を表し、Ｒは置換基を表し、ｍは０から５の整数を表
   す。）
3. 【請求項３】 色原体として下記の一般式（ＩＩ）で表
   される化合物と芳香族第一級アミン化合物とが用いられ
   ることを特徴とする酵素免疫染色法。 一般式（ＩＩ） 【化３】 （但し、式中、Ｘは、水素原子、離脱原子、又は離脱基
   を表し、Ｒは置換基を表し、ｍは０から５の整数を表
   す。）
4. 【請求項４】 色原体として下記の一般式（ＩＩ）で表
   される化合物と芳香族第一級アミン化合物とが用いられ
   た色素の生成後に、金属イオンが作用させられることを
   特徴とする免疫組織染色法。 一般式（ＩＩ） 【化４】 （但し、式中、Ｘは、水素原子、離脱原子、又は離脱基
   を表し、Ｒは置換基を表し、ｍは０から５の整数を表
   す。）