JPH04135494A - ２３―ヒドロキシプロタイロノライドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 り粟上■科朋分野 本発明は、ミクロモノスポラ属に属する微生物を培養し
て１６員環マクロライド系抗生物質の合成中間体として
有用な２３−ヒドロキシブロタイロノライドを製造する
方法に関する。

従Ｊ四ｌ支得 式（１） で示される２３−ヒドロキシプロタイロノライド（以下
２３−ＨＰＴと略記する）は、マクロライド系抗生物質
の代表的な１つであるタイロシンから５つの反応工程を
経て得られる２０−デオキシ−２３０−マイシノシルレ
ロノライドを希塩酸で加水分解する化学的変換（Ｃｈｅ
ｍ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、、　３０（１）　９７
〜１１０　（１９８２））及びストレプトミセスエスピ
ー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ、）　Ｋ　Ａ−４
６４株によるプロタイロノライドの微生物変換（Ｊ　、
Ａｎｔｉｂｏｔｉｃｓ創（７）　９２１〜９２２（１９
８３）　：ｌにより製造されることが知られている。

また、微工研条寄第１０７６号として寄託されたミクロ
モノスポラエスピー（１’ｌｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒ
ａ　ｓｐ、）Ｙ　Ｓ　−０２９３０Ｋ株は、ミクロモノ
スポラ属に属する放線菌であることを本発明者等が最初
につきとめたもので、マクロライド系抗生物質Ｙ　Ｓ　
−０２９３０ＫＤ、　−Ｅ及び−Ｈ生産能を有する微生
物である（特開昭６１−２６８１７６号公報）。

しよ゛と　る しかしながら、Ｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、
、　３０　（１）　９７〜１１０に記載された化学的変
換では、タイロシンから２３−ＨＰＴを製造するのに６
つの反応工程を要し、それに伴って各中間生成物の単離
精製に要する操作が煩わしいこともさることながら、こ
の化学的変換は主として１６員環ラクトンの化学構造と
抗菌活性との相関関係を研究するために、各中間生成物
を得るものであるから、２３−ＨＰＴの工業的製造法と
しては適当でない。また、Ｊ、　Ａｎｔｉｂ　１ｏｔｉ
ｃｓ、３６　（７）　９２１〜９２２に記載のストレプ
トミセス属微生物による微生物変換では、プロタイロノ
ライドをヒドロキシル化して１９−ヒドロキシプロタイ
ロノライドと共に２３−ＨＰＴを製造するもので、原料
のプロタイロノライドを発酵法あるいは化学的変換によ
って取得した後、さらに畜価な試薬セルレニンを用いて
の微生物変換によって取得する方法であり、やはり工業
的製造法としては適当でない。

一方、特開昭６１−２６８１７６号公報に記載の微生物
の使用方法においては、ミクロモノスポラ　エスピーＹ
　Ｓ　−０２９３０Ｋ株を培養し、得られる培養物から
抗生物質ＹＳ−０２９３０１１−Ｄ、　Ｅ及びＨ物質を
単離しているが、他の有用な物質については全く記載さ
れていない。

ｉ　　　°　るための 本発明者等は、ミクロモノスポラ属に属するミクロモノ
スポラ　エスピーＹ　Ｓ　−０２９３０Ｋ株の培養物中
に抗生物質ＹＳ−０２９３０に−Ｄ、−Ｅ及び−Ｈ以外
の有用な物質が含有されてないかどうか、その後更に分
析を試みた。そして、培養物から単離された物質の化学
構造を決定し、その有用性を検討した結果、ミクロモノ
スポラエスピーＹＳ０２９３ＯＫ株は合成中間体として
有用な２３−ＨＰＴ生産能をも有していることが判明し
た。

即ち、本発明は、ミクロモノスポラ属に属する微生物、
殊にミクロモノスポラエスピーＹ３０２９３０　Ｋ株を
培養し、培養物から２３−ＨＰＴを採取する２１ＨＰＴ
の製造方法にかかるものである。

以下に本発明の詳細な説明する。

光所勿盪威 本発明にかかる微生物の培養は、その微生物が利用する
栄養源を含有する培地を用いて行なわれる。培地は合成
、半合成、または天然の固体もしくは液体培地のいずれ
を用いてもよいが、目的とする培養物を大量かつ低床に
生産するためには、通常天然の栄養源を含む液体培地が
好適である。

培地に添加する栄養源のうち、炭素源としては、同化可
能な炭素化合物であればよく、例えばコーンスターチ、
アラビノース、シュクロース、グルコース、澱粉、デキ
ストリン、ヤシ油、大豆油α−メリビオース等が単独ま
たは組み合わせて用いられる。さらに、アルコール類、
有機酸なども用いる場合がある。窒素源としては、塩化
アンモン、硝酸ソーダ、硫酸アンモン、硝酸アンモンな
どの無機化合物、また、ペプトン、酵母エキス乾ｉ酵ｔ
　肉エキス、グルテンミール、コーンメチ−ブリカー。

大豆粉、ファーマメディア、魚粉。

落花生粉、綿実粕などの有機物質、尿素、カザミノ酸や
各種アミノ酸（例えばグルタミン酸、アスパラギン酸、
アラニン１　リジン等）などの有機化合物が単独又は組
み合わせて用いられる。また、培地には必要に応じナト
リウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、
鉄、コバルト、マンガンなどの金属の硫酸塩、硝酸塩、
塩化物、炭酸塩、リン酸塩、酢酸塩などを添加すること
ができる。

培養は好気的条件下に行なうのがよく、静置。

振盪１通気撹拌培養のいずれも可能であるが、振盪ある
いは通気撹拌培養が有利である。培養温度はおよそ２５
〜３３°Ｃの範囲内が好ましく、殊に約２７〜２９°Ｃ
が有利である。また、培地のｐＨは約５．５〜８．５の
中性付近に保持するのが好適である。培養期間は培地の
組成、温度等の培養条件によって異なるが、通常２日〜
２０日程度であり、４日〜１０日で培養を終了するのが
有利である。

このようにして培養された培養物中に蓄積された２３−
ＨＰＴを単離、精製するには、通常用いられる単離精製
手段を適用すればよい。例えば、培養物を濾過または遠
心分離して菌体及びその他の固型物を除去した後、得ら
れる濾液または遠心分離液から溶媒に対する溶解性及び
溶解度の差、溶液からの析出性及び析出速度の差、種々
の吸着剤に対する吸着親和性の差、２種の液相間に対す
る分配率の差などを適用して、２３−ＨＰＴが単離され
る。これらの単離方法は必要に応じて単独または任意の
順序に組合わせあるいは反覆して適用できる。

これらの単離方法の具体的な例を示すと、培養物を濾過
して得られる濾液をまず有機溶媒で抽出する。適当な有
機溶媒としては、クロロホルム四塩化炭素、トリクロロ
エチレン等の塩素化炭化水素類、酢酸エチル、酢酸ブチ
ル、プロピオン酸エチル等の脂肪酸エステル類、ベンゼ
ン５　トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類などが
用いられる。即ち、２３−　ＨＰ　Ｔを溶解する水不混
和性の有機溶媒であれば使用可能である。次いで、有機
溶媒を留去すると、２３−ＨＰＴ含有の粗精製物が得ら
れるので、この粗精製物をシリカゲルなどを用いたカラ
ムクロマトグラフィーや向流分配などにより分画する。

各分画について、例えば上記したような塩素化炭化水素
類、脂肪酸エステル類、芳香族炭化水素類の他に、メタ
ノール、エタノール等の液状アルコール類、アセトン、
メチルエチルケトン等のケトン類、アセトニトリルなど
を２種以上適宜の割合で組合わせた混合溶媒を展開溶媒
とするシリカゲル薄層クロマトグラフィーに付して、２
３−ＨＰＴを含有する分画を集め、濃縮乾固する。その
後、この濃縮物を有機溶媒に溶解して高速液体クロマト
グラフィーに付し、２３−ＨＰＴを純粋に含有する分画
を集めて濃縮すると、培養物から２３−ＨＰＴが無色の
粉末として単離精製される。更に精製しようとするなら
ば、濃縮物を上記した有機溶媒で抽出し、溶媒を留去す
る精製手段を反覆してもよい。

なお、本発明方法にかかる微生物は、通商産業省工業技
術院微生物工業研究所に微工研条寄第１０７６号として
寄託されたもの、あるいは、他の放線菌にみられる如く
、これを紫外線、Ｘ線、化学薬剤などで処理して得られ
る人工的菌株及びそれらの自然変異株であってもよい。

このようにして得られる２：３−ＨＰＴは下記の物理化
学的性質を有する化合物である。

（１）紫外線吸収スペクトル λご二：□１　（ε　）　　　：２８４　　（２０，０
００）（２）赤外線吸収スペクトル 第１図（臭化カリウム錠） （３）’Ｈ−核磁気共鳴スベクトル 第２図（重クロロボルム中、５００Ｍｌ−１ｚ）（４）
　”　Ｃ−核磁気共鳴スペクトル第３図（重クロロボル
ム中、１２５門１１２）（５）質量分析（ＰＡＢ−ＭＳ
　　Ｐｏｓ、）４１１　　（Ｍ十トＩ）　＋ （６）分子量　４１０ （７）分子式　ＣｚｙＨｓａＯｂ （８）比旋光度　［α１ｔ゛ １７．３°　（Ｃ＝０．５．メタノール）（９）外　観
　無色（白色）粉末 ００）溶解性　メタノール、アセトン、酢酸エチルクロ
ロボルム、ベンゼンに可？容 水及びヘキサンに不溶 （Ｉｆ）　　ｆｊｔＥ層クロマトグラフィーのＲｆ値（
メルク社製、シリカゲル６０Ｆ２Ｓ４、Ａｒｔ５７１５
）（ＵＶランプ２５４ｎｍで検出） 上記の物理化学的性質を有する本発明の２３−ＨＰＴは
１６員環マクロライド系抗生物質の合成中間体として有
用であり、２３−ＨＰＴを原料物質とする抗生物質の簡
単な合成工程を下記に示す。

例えば、２３−ＨＰＴにおける２３位の水酸基をトリア
ルキルシリル基、アシル基、トリチル基等の適当な保護
基で保護し、次いで、５位の水酸基をＤ−デソサミンと
グリコシド結合させ、その後、保護基を脱離することに
より、下記式（ｎ）で示され、抗菌活性の優れた５−０
−デソサミニル２３−ＨＰＴを合成することができる。

また、２３−　ＨＰ　Ｔにおける２３位の水酸基をマイ
シノースと反応させ、次いで、５位の水酸基をマイカミ
ノースと反応させることにより、抗菌活性の優れた下記
の式（Ｉ［ｌ）で示される２０−デオキシデマイ力ロシ
ルレロマイシンを合成することができる。

する。

災隻桝 白色デキストリン５．０％、大豆粉３．０％、酵母エキ
ス０．５％、リン酸水素二カリウム０．１％及び硫酸マ
グネシウム・７水塩０．１％を含む培地（ｐＨ８，０）
を作製し、この培地を５００ｍ１三角フラスコに各６Ｍ
ずつ分注して１２０°Ｃで２０分間滅菌したものにＹＳ
寒天培地上に育成させたミクロモノスポラエスピーＹ　
Ｓ　−０２９３０Ｋ株の菌糸をかき取って接種し、２８
°Ｃで３日間振盪培養を行ない種培養液とした。つぎに
、ファーマメディア（トレーダーズ・プロティン社製）
４．０％、コーン・スターチ２．５％、シュクロース７
．５％、炭酸カルシウム０．１％、Ｌ−リジン塩酸塩０
．１８％、゛硫酸マグネシウム・７水塩０．１％及び塩
化コバルト・６水塩０．００１％を含む培地（ｐ）１７
．１）を２０１！、作製し、この培地を５００成三角フ
ラスコに各６０ｄずつ分注し、１２０°Ｃで４０分間滅
菌したものに種培養液を３．０％の割合で植種した。毎
分２１０回転の振盪培養を２８°Ｃで７日間行なった。

このようにして得られた培養液に０．ＩＮ水酸化ナトリ
ウム水溶液を加えてｐＨ７，０に調整し、ラジオライ）
＃６００（昭和化学工業製）を加えて撹拌した後、濾過
した。得られた濾液１．１を同量の酢酸エチルで２回抽
出を行ない、目的物を含有する酢酸エチル層３４ｎを減
圧濃縮すると褐色のシロップ状粗精製物が４．０ｇ得ら
れた。

得られた粗精製物４．０ｇを少量のクロロホルムに溶解
させた。次いで、ワコーゲルＣ，２００（相光純薬製）
２００ｇをクロロホルム−メタノール（９７：　３　）
で充填したカラムにクロロホルムに溶解させた粗精製物
を乗せ、上記クロロホルム−メタノール（９７：３）を
展開溶媒とするカラムクロマトグラフィーを行ない、５
戚ずつ分画した。各分画についてクロロホルム−メタノ
ール（５：　１）を展開溶媒とするシリカゲル薄層クロ
マトグラフィー（メルク社製、　Ａｒｔ、　５７１５）
を行ない、Ｒｆ値０．６３を示す目的物を含む分画を集
めて濃縮乾固すると、淡黄色オイル状物質が３０ｍｇ得
られた。この淡黄色オイル状物質を少量のアセトニトリ
ルに溶解させ、分取高速液体クロマトグラフィー〔カラ
ム：　Ｉｎｅｒｔｓｉｌ　００５２０　ｉ、ｄ、Ｘ２５
０　ｍｍ　（ガスクロ工業製）、移動相：３０％アセト
ニトリル水溶液、検出：ＵＶ２ＢＯｒ＋ｎ＋、流速＝１
５ｍ！／ｍｉｎ、）により精製した。保持時間２７〜２
９分で単一ピークを示す分画を集めて濃縮後、酢酸エチ
ルで抽出した。得られた酢酸エチル層を濃縮乾固するこ
とにより、純粋な２３−ＨＰＴを無色粉末として１０ｎ
＋ｇ得た。

光貝塑劾来 本発明は、ミクロモノスポラ属に属する微生物、殊にミ
クロモノスポラエスピーＹ　Ｓ　−０２９３０Ｋ株の培
養物から直接２３−ＨＰＴを製造するものであるから、
１６員環マクロライド系抗生物質の各種合成中間体とし
て有用な２３−ＨＰＴを製造するに際し、煩わしい単離
精製操作を極力少なくして簡便かつ廉価に製造すること
ができる。しかも、本発明はまた、抗生物質生産能を有
するミクロモノスポラエスピーＹ　Ｓ　−０２９３０Ｋ
株の培養物中の従来廃棄されていた有用成分を回収する
ものであるから、上記菌株の有効利用の拡大が図られ、
上記菌株の利用が効率的となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の２３−ヒドロキシプロタイロノライド
の赤外線吸収スペクトル、第２図は同化合物のＩＨ−核
磁気共鳴スベクトル、第３図は同化合物のｌ３Ｃ−核磁
気共鳴スペクトルである。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）ミクロモノスポラ属に属する２３−ヒドロキシプ
   ロタイロノライド生産菌を培養し、培養物から２３−ヒ
   ドロキシプロタイロノライドを採取することを特徴とす
   る２３−ヒドロキシプロタイロノライドの製造方法。
2. （２）前記生産菌がミクロモノスポラエスピーＹＳ−０
   ２９３０Ｋ株である請求項（１）記載の２３−ヒドロキ
   シプロタイロノライドの製造方法。