JPH0414000B2 - - Google Patents

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JPH0414000B2
JPH0414000B2 JP62225959A JP22595987A JPH0414000B2 JP H0414000 B2 JPH0414000 B2 JP H0414000B2 JP 62225959 A JP62225959 A JP 62225959A JP 22595987 A JP22595987 A JP 22595987A JP H0414000 B2 JPH0414000 B2 JP H0414000B2
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plasma
kallikrein
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animal
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Yoshio Toyomaki
Katsumi Nishikawa
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Nippon Zoki Pharmaceutical Co Ltd
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Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は生理活性物質の測定法に関する。更に
詳しくは、血漿カリクレインの生成過程に作用を
及ぼす生理活性物質の測定法に関する。
（従来の技術） カリクレインは種々の動物の血漿中並びに組織
に広汎に存在するタンパク分解酵素であり、カリ
クレイン・キニン系なる酵素系が知られている。
このカリクレイン・キニン系は生体内におい
て、他の様々な酵素反応系、例えばレニアン・ア
ンジオテンシン系、血液凝固系、線溶系、補体系
やプロスタグランジン、ロイコトリエン、トロン
ボキサンを中心とするアラキドン酸カスケード並
びにカテコールアミン等と密接な関連性をもつて
作用しており、生体内の機能調節に重要な意義を
有している。従つて、カリクレイン・キニン系
は、他の酵素系と関連することにより血圧調節作
用、血液凝固−線溶−補体系を通じての作用、或
いはアラキドン酸カスケードにより生成する種々
の生理活性物質による生体調整作用や未梢循環改
善作用等に深く関わつているものである。
カリクレイン・キニン系の生成産物であるキニ
ン類は、未梢血管拡張に伴う降圧、血管透過性の
亢進、平滑筋の収縮或いは弛緩、初痛、白血球の
遊走、副腎皮質からのカツコールアミンの遊離作
用など種々の生理活性を有するほか、アレルギー
反応を含めた急性炎症のメデイエーターとしても
知られており、生体内における存在意義は大き
い。
従つて、カリクレインの生成に作用する質、即
ちカリクレインの生成を抑制或いは促進する物質
の作用を簡便、且つ正確に測定する方法を確立す
ることは、上記のような生体機能の調整に役立つ
作用を知るうえで又かかる薬剤を開発する上で非
常に有用な手段となるものである。
尚、カリクレイン・キニン系自身は以下のよう
な一連の酵素反応の上に成立するものである。
即ち、この酵素系には血液凝固第XII因子（ハー
ゲマン因子、以下ＦXIIと略す）が重要な役割を果
しており、血漿中のＦXIIはガラス、カオリン、エ
ラジン酸等の負に荷電した物質、若しくはコラー
ゲン、ホモシスチン、血小板膜、硫酸化糖脂質等
の生体内に存在する物質と接触することにより、
或いは組織に対する侵害刺激等により活性化され
る。この活性化されたＦXII（ＦXIIａ）は同じく血
漿中に存在するプレカリクレインに作用して、こ
れをカリクレインへと変換し、このカリクレイン
が血漿中の高分子キニノーゲンに作用してノナペ
プチドであるブラジキニンを遊離させるという一
連の反応が引き起こされることになる。
さらに引き続いて、遊離されたキニン類は、前
述のような作用により直接的には炎症、痛みやア
ラキドン酸カスケードに対する作用を引き起こす
など種々の影響を及ぼすことになる。
本発明者らは、このようなカリクレイン・キニ
ン系に関連する一連の酵素反応系を踏まえ、これ
らの反応を試験管内にて再構成することにより、
本発明の反応系が作用物質の測定法として極めて
有用で且つ信頼性が高く、又、操作も簡便である
ことを見出し本発明を完成した。
（発明が解決しようとする問題点） 本発明の目的は、生理活性物質のカリクレイン
生成阻害能測定法並びにこの測定法の為の有用な
反応系を提供することにある。
（問題点を解決するための手段） 本発明は、血漿中のＦXIIを活性化することによ
り、被検物質の存在下で血漿中のプレカリクレイ
ンをカリクレインに変換し、生成したカリクレイ
ンを定量することを特徴とする被検物質のカリク
レイン生成阻害能測定法である。
さらに詳しくは、 動物血漿、 血液凝固第XII因子活性化剤、 電解質、 被検物質、 から成る溶液を混合反応させ、次いで該反応にお
けるカリクレインの生成を停止させるために、生
成したカリクレイン活性には実質的に無影響で活
性型血液凝固第XII因子活性のみを特異的に阻害す
る阻害剤をカリクレイン生成と反応時間の間に実
質的に直線的な関係が成立する時間内に加え、生
成したカリクレインを定量することを特徴とする
被検物質のカリクレイン生成阻害能測定法であ
る。
好ましい態様としては、 動物血漿、 血液凝固第XII因子活性化剤、 電解質、 被検物質、 から成る溶液を混合反応させた後、該反応におけ
るカリクレインの生成を停止させるために、生成
したカリクレイン活性には実質的に無影響で活性
型血液凝固第XII因子活性のみを特異的に阻害する
阻害剤をカリクレイン生成と反応時間の間に実質
的に直線的な関係が成立する時間内に加え、（以
下第一次反応という）、次いでこの第一次反応液
を、 カリクレインに対する基質、 緩衝液、 から成る第二次反応液と混合反応させ（以下第二
次反応という）、生成したカリクレインによる分
解産物を定量する方法が挙げられる。
本発明における反応系は、前期のように二段階
の反応により構成されるものであり、第一次反応
は血漿にカオリン等のＦXII活性化剤を添加して活
性型ＦXIIとすることにより、該血漿中のプリカリ
クレインからカリクレインを生成させる反応系で
ある。
引き続いて行われる第二次反応は、第一次反応
で生成したカリクレインを定量する反応系であ
り、例えば、カリクレインの活性（生成量）をカ
リクレインに対する特異的基質を用いて測定する
方法で行うことができる。
即ち、本発明の測定法は、カリクレインの生成
に影響を及ぼす生理活性物質を上記第一次反応系
に共存させ、生成したカリクレイン量を第二次反
応系において定量することを特徴とする。
本発明で用いる物質血漿は、血液凝固系並びに
カリクレイン・キニン系を有するものであればい
かなる動物でも用いることができ、例えばヒト、
サル、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ヤギ、サル、
イヌ、ネコ、ウサギ、モルモツト、ラツト又はマ
ウス等のものが挙げられ、ヒト、ラツト等が好ま
しい。
これらの血漿は通常の方法により調製したもの
を使用することができ、例えばクエン酸存在下に
採血した後、遠心分離して得たクエン酸加血漿等
を用いることができる。又、本発明の反応系には
常法によつて製造された凍結乾燥血漿を用いても
よい。
調製された血漿はそのままで若しくは必要に応
じて適宜希釈して用いるが、第一次反応において
血漿の希釈率とカリクレイン活性との間に直線的
な関係が成立する濃度を選ぶことが好ましい。
本発明において、ＦXIIの活性化剤としては、
種々の物質、例えばカオリン、コラーゲン、硫酸
デキストラン、エラジン酸、セライト等を用いる
ことができる。ＦXII活性化剤は、ＦXIIを活性化す
るためにその至適濃度に調整することが好まし
く、例えばヒト血漿を用いて、カオリン懸濁液に
よつて活性化する場合、最終濃度１乃至３mg／
ml、好ましくは1.25乃至２mg／mlに調整して用い
ることができる。
前項のＦXII活性化剤の作用をより完全なものと
するために加えられる電解質は、例えばナトリウ
ムイオン等の一価の正電荷イオンを含むものが用
いられ、塩化ナトリウム或いは酢酸ナトリウムな
どが好ましい。例えばヒト血漿を用いた場合に
は、第一次反応における塩化ナトリウムの最終濃
度は50乃至200ｍＭ、好ましくは75乃至150ｍＭに
調整することが好ましい。第一次反応は、前述の
ように血漿にＦXII活性化剤を添加してＦXIIを活性
型ＦXIIとすることにより、プレカリクレインから
カリクレインを生成させる反応系であるが、この
反応は温度が高い時には急激に進行するとともに
内因性のインヒビターが働き、カリクレイン活性
の測定に非常に影響を及ぼすため、内因性のイン
ヒビターが働かずに反応がゆつくり進行するよう
に、第一次反応は低温下、例えば０乃至４℃で行
うことが好ましい。
第一次反応液のPHは、第一次反応の最終産物で
あるカリクレインの生成に対しての至適PHである
ことが好ましく、例えばヒト或いはラツト血漿を
用いた場合には、PH7.0乃至9.0、好ましくはPH7.5
乃至8.5範囲で反応を行うことができる。
第一次反応の反応時間は、第一次反応液中に加
えた血漿の量、ＦXII活性化剤、被検薬の濃度或い
は反応液のPH等によつて変化するが、反応時間と
生成したカリクレイン量（カリクレイン活性）と
の間に直線的な関係が成立する時間内に設定する
ことが必要である。なぜならば、本発明測定法は
カリクレイン生成に影響を与える生理活性物質の
作用を、生成カリクレイン活性で定量する方法が
好ましいため、カリクレイン活性が飽和してしま
う時間前の直線部分で行わねばならないからであ
る。しかしながら、実際の測定操作上の観点より
15乃至30分の間に反応時間を制定することが実際
的で好ましい。
第一次反応の停止は、活性型ＦXIIのみを特異的
に阻害してさらに余分のカリクレインが生成しな
いようにし、且つ第二次反応においては測定する
カリクレイン活性には実際的に無影響な阻害剤を
第一次反応系に添加することで行うことができ
る。
このような阻害剤として、LBTI（Lima Bean
Trypsin Inhibitor：リマ豆由来のトリプシンイ
ンヒビター）或いはCHFI（Corn Hageman
Fragment Inhibitor：トウモロコシ由来のハー
ゲマンフラグメントインヒビター）等が挙げられ
る。
これらの阻害剤は、第一次反応において残存す
る活性型ＦXIIを完全に阻害し、更に第二次反応に
おいて測定するカリクレイン活性に実際的に影響
しない濃度範囲になるよう第一次反応停止時に加
えるのがよい。例えば、ヒト血漿を用いた場合、
LBTIはその最終濃度が４乃至15mg／mlとなるよ
うに加えることができる。
第二次反応は、前述のように第一次反応で生成
したカリクレインを定量する反応系であるが、生
成カリクレイン活性（生成量）をカリクレインに
対する特異的基質を用いて測定する方法が好まし
い。
カリクレインに対する特異的基質としては、
種々の物質を用いることができるが、例えば、血
漿中に存在する高分子キニノーゲン、或いは、合
成基質、例えばBenzoyl−Arg−OEt（Ｎ−ベンゾ
イル−Ｎ−アルギニンエチルエステル）、Tos−
Arg−OMe（Ｎ−トシル−Ｌ−アルギニンメチル
エステル）、Ｄ−Pro−Phe−Arg−pNA（Ｄ−プ
ロリルフエニルアラニルアルギニル−ｐ−ニトロ
アニリド）、Benzoyl−Pro−Phe−Arg−pNA
（ベンゾイル−プロリルフエニルアラニルアルギ
ニル−ｐ−ニトロアニリド）、Pro−Phe−Arg−
NA（プロリルフエニルアラニルアルギニル−ナ
フチルアミド）、Ｚ−Phe−Arg−MCA（ベンジ
ルオキシカルボニル−フエニルアラニルアルギニ
ル−４−メチルクマリンアミド）等を用いること
ができる。
高分子キニノーゲンを用いた場合には、生成す
るブラジキニンはバイオアツセイであるモルモツ
ト回腸若しくはラツト子宮筋等の平滑筋を用いた
マグヌス法、或いはラジオイムノアツセイ法
（RIA）等の通常の定量方法により定量すること
ができる。
カリクレインのエステラーゼを作用を用いて、
その活性を測定する場合には、Benzoyl−Arg−
OEt、Tos−Arg−OMe等の基質を用いることが
でき、測定法としては、例えば、加水分解に伴う
吸光度の変化を測定する方法、発色物質に誘導し
分光学的に定量する方法、例えば、ヒドロキサメ
ート法、クロモトロープ酸を用いる方法、
MBTH（３−メチル−２−ベンゾチアソロンヒド
ラジン）を用いる方法、螢光物質へ誘導する方
法、アルコールデヒドロゲナーゼを用いる方法或
いは放射性合成基質を用いて放射化学的に検出す
る方法などが挙げられる。
更に、発色或いは螢光合成ペプチド基質を用い
る場合には、例えばＤ−Pro−Phe−Arg−pNA、
Benzoyl−Pro−Phe−Arg−pNA、Ｚ−Phe−
Arg−MCA等を使用することができ、カリクレ
インの加水分解作用によつて生成した発色物質或
いは螢光物質、例えばpNA（ｐ−ニトロアニリ
ン）或いはAMC（７−アミノ−４−メチルクマリ
ン）の量を分光学的に測定し、カリクレイン活性
を定量することができる。
第二次反応系において、PHはカリクレインの至
適活性PH付近のPH7.0乃至9.0が好ましく、反応温
度は同様に至適条件としての室温、即ち20乃至40
℃の範囲に設定することが好ましい。反応時間
は、温度、PH、基質濃度等によつて変動する。従
つて、如何なる反応時間を設定することも可能で
あるが、測定操作上の観点より30分以内程度が適
当である。
（実施例） 実施例 １ 動物血漿として、ヒト血漿を用いた場合につい
ての実施例を以下に詳細に説明する。
(1) ヒトクエン酸加血漿の調整 健常な成人より常法に従い、ヒト血液：3.8
％クエン酸ナトリウム（９：１）となるように
採血した後遠心分離し、ヒトクエン酸加血漿
（以下単にヒト血漿という）を上清として得た。
(2) 第一次反応 ヒト血漿 0.1ml カオリン懸濁液 0.5ml 塩化ナトリウム水溶液 被検薬水溶液 蒸留水 0.4ml 但し、上記組成中、ヒト血漿は第二次反応にお
いて1.6乃至2.2ｍＵのカリクレイン活性を示す濃
度に生理食塩液で希釈したものを用いた。尚、カ
リクレイン活性は第二次反応において1μmole／
min／mlのｐ−ニトロアニリンを生成する量を
1U（1000ｍＵ）とした表した。
標準組成中、カオリン懸濁液の濃度は2.5mg／
ml〔50ｍＭトリス塩酸緩衝液（PH8.0）〕、0.4ml混
液の塩化ナトリウム濃度は0.25Mで行つた。
上記反応液を氷水浴中20分間反応させた後、
0.5mlのLBTI溶液〔45mg／ml・50ｍＭトリス塩酸
緩衝液（PH8.0）〕を加え反応を停止した。或い
は、0.2mlの反応液を採取して、0.1mlのLBTI溶
液に加えてもよい。（以下これを第一次反応液と
する） (3) 第二次反応 第一次反応液 0.1ml 合成基質 0.1ml 緩衝液 0.2ml 但し、上記組成中、合成基質はＤ−Pro−
Phe−Arg−pNAの４ｍＭ水溶液を、緩衝液は
100ｍＭトリス塩酸緩衝液（PH8.0）を用いた。
反応に際しては、上記反応液を30℃で20分間
反応させた後、１％クエン酸0.8mlを加え、必
要に応じて遠心分離して懸濁物を除去した後、
ｐ−ニトロアニリンの405nｍにおける吸高度
を測定した。
(4) 第一次反応の至適PH 各種PHに調整した50ｍＭのトリス塩酸緩衝液
を用いて第一次反応を用い、生成したカリクレ
イン活性を第二次反応にて測定した結果、第一
次反応におけるPHは7.0乃至9.0の範囲、好まし
くはPH7.5乃至8.5の範囲が至適であることが示
された。
(5) 第一次反応における至適塩化ナトリウム濃度 第一次反応において種々の温度の塩化ナトリ
ウム水溶液を用いて第一次反応を行い、その後
第二次反応により生成したカリクレイン活性を
測定した結果、第一次反応における塩化ナトリ
ウムの最終濃度は50乃至200ｍＭ、好ましくは
75乃至150ｍＭが至適であることが示された。
尚、上記塩化ナトリウムの最終濃度は血漿中
の塩化ナトリウム量を換算せず、添加したもの
のみから算出した。
(6) 第一次反応における至適カオリン濃度 50ｍＭトリス塩酸緩衝液（PH8.0）で種々の
濃度に調整したカオリン懸濁液を第一次反応に
用い、生成したカリクレイン活性を第二次反応
により測定した。その結果、第一次反応におい
てカオリン濃度は最終濃度１乃至３mg／ml、好
ましくは1.25乃至２mg／mlで行うことができ
る。
(7) 第一次反応の反応時間 第一次反応を種々の時間行つて生成するカリ
クレイン活性を第二次反応により測定した。第
一次反応は０乃至20分の間にて、反応時間とカ
リクレイン活性との間に直線的な関係が成立す
る。従つて、本実施例において、第一次反応は
20分以内とすることができる。
(8) 第一次反応におけるLBTI量 第一次反応を０℃で20分間行い、種々の濃度
のLBTI溶液を加えた後、該第一次反応液の0.1
mlを用いて第二次反応を行いカリクレイン活性
を測定した。
LBTIは最終濃度４mg／ml以上で活性型ＦXII
を完全に阻害した。又、第二次反応におけるカ
リクレイン活性へのLBTIの影響を調べたとこ
ろ、LBTIは第一次反応最終濃度15mg／mlにお
いても、カリクレイン活性を低下させるような
有意の影響は与えなかつた。
(9) 第一次反応液におけるヒト血漿の濃度 ヒト血漿を生理食塩液で適宜希釈して第一次
反応を行い生成したカリクレイン活性を第二次
反応により測定した。ヒト血漿を1/5乃至1/10
希釈の範囲で用いた次、希釈率とカリクレイン
活性との間に直線的な関係が成立した。
(10) 第二次反応における基質濃度 第二次反応において種々の濃度の合成基質Ｄ
−Pro−Phe−Arg−pNAを用い、前述のとお
り30℃で20分間反応させた結果、第二次反応に
おけるＫｍ値は0.34ｍＭであつた。
(11) 第二次反応の酵素量 第二次反応の酵素量（即ち第一次反応液の
量）を種々の量で用いた場合の、酵素量とカリ
クレイン活性との関係を調べた。第二次反応に
用いる第一次反応液の量が０乃至0.1mlまでの
範囲でカリクレイン活性との間に直接的な関係
が成立した。
(12) 第二次反応の反応時間 第二次反応を種々の時間で行い、反応時間と
カリクレイン活性との関係を調べた。第二次反
応においては０〜20分の間で、反応時間とカリ
クレイン活性との間に直線的な関係が成立し
た。従つて、本実施例において第二次反応は20
分以内とすることができる。
(13) 第二次反応の至適PH 種々のPHのトリス塩酸緩衝液（100ｍＭ）を
調整して第二次反応を行い、反応PHとカリクレ
イン活性との至適条件を調べた。第二次反応に
おいてはPH7.0乃至9.0、好ましくはPH7.5乃至
8.5の範囲で行うことができる。
実施例 ２ 動物血漿としてヒト血漿、活性型ＦXIIの特異的
阻害剤としてCHFI、カリクレインに対する特異
的基質としてＺ−Phe−Arg−MCAを用いた実
施例を以下に示す。
(1) 第一次反応 第一次反応系は実施例１と同じものを用い
た。
反応液を氷浴中20分間反応させた後、0.5ml
の３mg／mlCHFI溶液〔50ｍＭトリス塩酸緩衝
液（PH8.0、０℃）〕を加える。或いは、0.2ml
の反応液を採取して、0.1mlのCHFI溶液に加え
てもよい。（以下これを第一次反応液とする） (2) 第二次反応 第一次反応液 0.1ml 合成基質 0.12ml 緩衝液 0.18ml 但し、上記組成中、合成基質は螢光基質Ｚ−
Phe−Arg−MCAの10ｍＭジメチルスルホキ
シド溶液を用い、緩衝液は100ｍＭトリス塩酸
緩衝液（PH8.0）を用いた。
反応に際しては、上記反応液を30℃で20分間
反応させた後、0.1M酢酸２mlを加え、必要に
応じて遠心分離して懸濁物を除去した後、７−
アミノ−４−メチルクマリンアミドの螢光
（Ex380nｍ、Em460nｍ）を測定した。
(3) 実施例１と同様にして、第一次反応及び第二
次反応の条件を検討した。
その結果、第一次反応においては、反応停止
時のCHFI濃度は２mg／ml以上で活性型ＦXIIを
抑制できた。
本実施例の第一次反応は、反応の停止時に
CHFIを用いている部分のみが実施例１と異なつ
ているので、その他の条件は実施例１と同様であ
つた。
第二次反応においては、その反応PHはPH7.0乃
至9.0、好ましくはPH7.5乃至8.5の範囲であり、合
成螢光基質Ｚ−Phe−Arg−MCAに対するＫｍ
値は約１ｍＭであつた。
又、第二次反応時間とカリクレイン活性には０
乃至30分の間に直接的な関係がみられたので、反
応時間は30分以内に行うことができる。
実施例 ３ 動物血漿としてヒト凍結乾燥血漿を用いた実施
例を以下に示す。
(1) 第一次反応 ヒト凍結乾燥血漿 0.1ml カオリン懸濁液 0.5ml 塩化ナトリウイム水溶液 被検薬水溶液 蒸留水 0.4ml ヒト凍結乾燥血漿は蒸留水にて溶解した後、第
二次反応において1.6乃至2.2ｍＵのカリクレイン
活性を示す濃度に生理食塩液で希釈したものを用
いた。
カオリン懸濁液、塩化ナトリウム溶液、反応温
度、反応時間、反応停止操作などは実施例１と同
様に行つた。
(2) 第二次反応は実施例１と同様に行つた。
(3) 実施例１と同様にして第一次反応及び第二次
反応の条件を検討した結果、ヒト凍結乾燥血漿
を用いても、新鮮ヒト血漿の場合と同様の条件
で行えることがわかつた。
実施例 ４ 動物血漿として、ラツト血漿を用いた実施例を
以下に示す。
(1) ラツトクエン酸血漿の調整 エーテル麻酔下のラツト腹部大動脈より、
3.8％クエン酸ナトリウム：血液（１：９）と
なるように採血した後、遠心分離してラツト血
漿を上清として得た。
(2) 第一次反応 ラツト血漿 0.1ml カオリン懸濁液 0.5ml 塩化ナトリウム水溶液 被検薬水溶液 蒸留水 0.4ml 但し、上記組成中、ラツト血漿は生理食塩液で
３乃至５倍希釈液であり、カオリン懸濁液及び塩
化ナトリウム水溶液は実施例１と同様のものを用
いた。
上記反応液を０℃で15分間反応せさた後、0.5
mlの45mg／mlLBTI溶液〔50ｍＭトリス塩酸緩衝
液（PH8.0）〕を加えた。
(3) 第二次反応 実施例１と同様に行つたが、反応時間は30分
で行つた。
(4) 実施例１と同様にして、第一次反応及び第二
次反応の条件を検討した。
その結果、第一次反応においては、PHは7.0
乃至9.0、好ましくはPH7.0乃至8.5の範囲で、 塩化ナトリウム水溶液は、０乃至150ｍＭ、
好ましくは25乃至125ｍＭで、 カオリン懸濁液濃度は、１乃至3.5mg／ml、
好ましくは1.5乃至３mg／mlで行うことができ
る。
又、反応時間と生成するカリクレイン活性は
０乃至20分の間に直線的な関係が見出されたの
で、第一次反応は20分以内とすることが好まし
い。
第二次反応においては、その反応PHはPH７乃
至９の範囲で至適であり、合成基質Ｄ−Pro−
Phe−Arg−pNAに対するＫｍ値は0.29ｍＭで
あつた。
又、第２次反応時間とカリクレイン活性には
０乃至60分の間に直線的な関係がみられた。従
つて、第二次反応は60分以内に行うことがで
き、操作上は30分程度が好ましい。
実施例 ５ デキストラン硫酸（分子量約50万）をＦXII活性
化剤として用いた実施例を以下に示す。他の条件
は実施例１と同様に行つたが、動物血漿として
は、新鮮ヒト血漿及びヒト凍結乾燥血漿を用い
た。
(1) デキストラン硫酸濃度は最終濃度１乃至5μ
ｇ／ml、好ましくは1.5乃至3μ／mlで行うこと
ができる。
(2) 第一次反応における塩化ナトリウム濃度を
種々に変えて行つたところ、最終濃度50乃至85
ｍＭ、好ましくは70乃至80ｍＭが至適であるこ
とが示された。
(3) 第一次反応の反応時間に関しては、４乃至20
分の間にて反応時間とカリクレイン活性との間
に直線関係が成立した。
(4) 第一次反応の至適PHを検討した結果、PH7.8
乃至8.3で行うのが好ましいことが示された。
以上のように、ＦXII活性剤としてカオリン懸
濁液の代わりにデキストラン酸を用いても、本
発明測定法を実施できる。
実施例 ６ 〔ブラジキニン遊離抑制作用の検定〕 本発明反応系において、被検薬により発痛・起
炎物質ブラジキニンの産生が抑制されているかを
調べた。
ブラジキニンの分解を抑えるため、実施例１の
第一次反応系にキニナーゼ活性阻害剤ｏ−フエナ
ントロリンを共存させた。ブラジキニンはカオリ
ンに吸着する性質があり、従つて、第一次反応終
了後、ＦXII活性化剤として添加したカオリンに吸
着した分のブラジキニンを抽出するため、アセト
ンを最終濃度50％６になるように第一次反応液に
加えた。
ブラジキニン量はラジオイムノアツセイ法によ
り測定した。即ち、上記のように調整した抽出ブ
ラジキニンの試料200μとアツセイ用緩衝液
（0.1％ゼラチン−７ｍＭ塩化カルシウイム−0.01
％Tween20−0.02％アジ化ナトリウム含有トリス
−酢酸緩衝液PH8.5）200μ、125I−Try−ブラジ
キニン（約50000cpm／ml）200μ及び1/15000希
釈ウサギ抗ブラジキニン抗血清200μを加え、
４℃で48時間反応させた。
次いで、正常羊血清200μ及びデキストラン
硫酸被覆活性炭溶液500μを加え、４℃でさら
に30分間反応させ、遠心分離して上清を除去した
後、ガンマーカウンターにて放射線量を測定し、
試料の代わりにブラジキニン標準液を用いて同様
に得られた検量線から試料中のブラジキニン量を
求めた。
結果の一例を第２図に示す。
（作用） 実施例１の反応系を用いて、インドメタシン、
ケトプロフエン、モルヒネ、アミノピリン等の各
種鎭痛剤のカリクレイン生成阻害活性を測定し
た。尚、これらの被検薬は中性付近の水溶液に調
製して使用した。
結果の一例を第１図に示す。第１図より明らか
なように、鎭痛作用の一因がブラジキニンの遊離
抑制作用であるインドメタシンやケトプロフエン
は本発明測定法により顕著なカリクレイン生成阻
害作用が観察されたが、中枢神経系に作用する鎭
痛剤であるモルヒネやアミノピリンはカリクレイ
ン生成阻害作用をほとんど示さなかつた。
さらに、本発明測定系において、最終生成物で
ある発痛・起炎物質ブラジキニンの被検薬による
遊離抑制作用を等べた結果の一例を第２図に示
す。
第２図より明らかなように、第１図で顕著なカ
リクレイン生成阻害作用を示した薬剤は、同様に
優れたブラジキニン遊離抑制作用を有することが
示された。
以上のように、カリクレイン生成阻害（第１
図）とブラジキニン遊離抑制（第２図）とは良く
相関関係を示し、従つて、本発明測定法はカリク
レイン−キニン系に関与する生理活性物質の測定
法として信頼性が高いものである。
（効果） 前記の測定結果より、本発明の生理活性物質測
定法は、カリクレインの生成に影響を及ぼす物
質、例えばブラジキニン遊離抑制作用を有する物
質等の測定法として有用であることが明らかに示
される。
本発明の反応系は複雑な一連の酵素反応を利用
し、従つて、種々の酵素が必要とされるものであ
るが、酵素源として動物血漿或いはその凍結乾燥
血漿を用いることにより、必要とされる一連の酵
素の分離精製という、極めて煩雑で時間を要する
準備段階を不用とすることができるので、この点
において非常に有利なものである。又、本発明の
反応系は一連の酵素反応を利用しているものであ
るから、被検薬として用いる生理活性物質の作用
点が多数存在し、従つて、本発明の反応系を利用
することで、多観点からみた生理活性物質のスク
リーニングを同時に、且つ簡便に行うことができ
る。
前述のよおうにカリクレイン・キニン系は種々
の酵素系に密接な関連を有し、様々な生体制御機
能に関わつているので、例えば、アラキドン酸カ
スケードにより生成するプロスタグランジン、ロ
イコトリエン、トロンボキサン等による生理作用
の調整物質、レニン・アンジオテンシン系と関連
した血圧調節作用物質、血液凝固系、線溶系に対
する調整物質、さらには生成物であるブラデイキ
ニンの生理作用を調整する物質、例えば抗炎症物
質、鎭痛物椎、抗アレルギー物質等の測定法とし
て本発明の反応系は極めて有用なものである。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明測定法よつて種々の鎭痛剤のカ
リクレイン生成阻害活性を測定した結果を示した
グラフであり、第２図は本発明測定系におけるブ
ラジキニン遊離抑制作用を調べた結果を示したも
のである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 動物血漿、 血液凝固第XII因子活性化剤、 電解質、 被検物質、 から成る溶液を混合反応させ、次いで該反応にお
    けるカリクレインの生成を停止させるために、生
    成したカリクレイン活性には実質的に無影響で活
    性型血液凝固第XII因子活性のみを特異的に阻害す
    る阻害剤をカリクレイン生成と反応時間の間に実
    質的に直線的な関係が成立する時間内に加え、生
    成したカリクレインを定量することを特徴とする
    被検物質のカリクレイン生成阻害能測定法。 ２ カリクレインに対する合成基質を用いて生成
    したカリクレインを定量する特許請求の範囲第１
    項記載の測定法。 ３ 動物血漿がヒト血漿である特許請求の範囲第
    １項記載の測定法。 ４ ヒト血漿が加クエン酸血漿又は凍結乾燥品で
    ある特許請求の範囲第３項記載の測定法。 ５ 動物血漿が家畜又は実験用動物の血漿である
    特許請求の範囲第１項記載の測定法。 ６ 動物血漿がウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ヤ
    ギ、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモツト、ラ
    ツト又はマウスの血漿である特許請求の範囲第５
    項記載の測定法。 ７ 動物血漿を５乃至10倍希釈して用いる特許請
    求の範囲第１項記載の測定法。 ８ ０℃乃至４℃の反応温度下でカリクレイン生
    成反応を行う特許請求の範囲第１項記載の測定
    法。 ９ 血液凝固第XII因子活性化剤がカオリンである
    特許請求の範囲第１項記載の測定法。 １０ 電解質が一価の正電荷イオンを含む化合物
    である特許請求の範囲第１項記載の測定法。 １１ 一価の正電荷イオンがナトリウムイオンで
    ある特許請求の範囲第１０項記載の測定法。
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