JPH05264536A - 結合状態測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】陰電荷表面と高分子キニノーゲン又はハーゲマ
ン因子の被検物質存在下における結合状態を測定する方
法を提供する。 【構成】高分子キニノーゲン又はハーゲマン因子中に存
在し、且つ陰電荷表面と結合活性を有するフラグメント
を構成成分として含有する物質の非ラベル化体及びラベ
ル化体を用いることを特徴とする。 【効果】高分子キニノーゲン又はハーゲマン因子と陰電
荷表面との結合を阻害する作用を有する物質、即ちキニ
ンの産生を抑制する物質、例えば抗炎症物質、鎮痛物
質、抗アレルギー物質等をスクリーニングするための測
定法等として非常に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、陰電荷表面と高分子キ
ニノーゲン又は陰電荷表面とハーゲマン因子の被検物質
存在下における結合状態を測定する際に、高分子キニノ
ーゲン又はハーゲマン因子中に存在し、且つ陰電荷表面
と結合活性を有するフラグメントを構成成分として含有
する物質の非ラベル化体及びラベル化体を用いることを
特徴とする方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】カリクレイン−キニン系は、種々の生理
活性を有するキニン類を生成させる一連の生体内反応系
である。このカリクレイン−キニン系は生体内におい
て、他の様々な酵素反応系、例えばレニン−アンジオテ
ンシン系、血液凝固系、線溶系、補体系やプロスタグラ
ンジン、ロイコトリエン、トロンボキサンを中心とする
アラキドン酸カスケード並びにカテコールアミン等と密
接な関連性をもって生体の機能調節に重要な意義を有し
ている。従って、カリクレイン−キニン系は、他の酵素
系と関連することにより血圧調節作用、血液凝固−線溶
−補体系を通じての作用、或いはアラキドン酸カスケー
ドにより生成する種々の生体内活性物質による生体調整
作用や末梢循環改善作用等に深く関わっているものであ
る。

【０００３】カリクレイン−キニン系の生成産物である
ブラジキニン等のキニン類は、末梢血管拡張に伴う降
圧、血管透過性の亢進、平滑筋の収縮或いは弛緩、発
痛、白血球の遊走、副腎皮質からのカテコールアミンの
遊離作用など種々の生理活性を示すほか、アレルギー反
応を含めた炎症反応のメディエーターとしても知られて
おり、生体内における存在意義は大きい。従って、キニ
ン類の作用を抑制或いはその生成を阻害する物質は、抗
炎症剤、鎮痛剤、抗アレルギー剤等の医薬品として有用
であると考えられている。

【０００４】尚、カリクレイン−キニン系につき詳述す
ると、当該酵素系は以下のような一連の酵素反応の上に
成立するものである。即ち、この酵素系ではハーゲマン
因子（血液凝固第ＸII因子）が重要な役割を果してお
り、血漿中のハーゲマン因子はガラス、カオリン、エラ
ジン酸等の異種物質、若しくは尿酸塩、コラーゲン、ホ
モシスチン、硫酸化糖脂質、血小板膜等の細胞膜等の生
体内に存在する物質、即ち陰電荷表面を有する物質と接
触することにより、或いは生体組織に対する発痛侵害刺
激等により活性化される。活性化されたハーゲマン因子
は同じく血漿中に存在するプレカリクレインに作用し
て、これをカリクレインへと変換し、このカリクレイン
が血漿中の高分子キニノーゲンに作用してノナペプチド
であるブラジキニンを遊離させるという一連の反応を引
き起こすことになる。その結果、ブラジキニン等の遊離
されたキニン類は、前述の如く直接的には炎症、痛みや
アラキドン酸カスケードに対する作用を引き起こす等、
生体に様々な影響を及ぼす。

【０００５】即ち、ハーゲマン因子が陰電化表面上で活
性型ハーゲマン因子となることにより、カリクレイン−
キニン系という一連の反応が開始する。多くの研究者に
よるこれまでの研究より、高分子キニノーゲンは血流中
でプレカリクレインと複合体を形成していることが知ら
れており、また高分子キニノーゲン及びハーゲマン因子
が陰電荷表面上に集合し、これら４因子の複合体形成
が、ハーゲマン因子活性化、即ちカリクレイン−キニン
系の反応亢進の必須条件であることが明らかになりつつ
ある。本発明者は、生体内で生ずるこのようなカリクレ
イン−キニン系に関連する一連の酵素反応を踏まえ、特
にカリクレイン−キニン系の開始段階であるハーゲマン
因子の活性化に注目し、陰電荷表面並びに高分子キニノ
ーゲン及びハーゲマン因子の複合体形成機構について研
究を続けてきた。その結果、高分子キニノーゲン又はハ
ーゲマン因子と相互作用を有し、これら蛋白質と陰電荷
表面の結合を阻害するような物質の結合阻害能をインビ
トロで調べることが可能な測定法を見出した。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、高分
子キニノーゲン又はハーゲマン因子中に存在し、且つ陰
電荷表面と結合活性を有するフラグメントを構成成分と
して含有する物質の非ラベル化体及びラベル化体を用い
ることを特徴とする被検物質存在下における陰電荷表面
と高分子キニノーゲン又はハーゲマン因子の結合状態を
測定する方法、並びに高分子キニノーゲン又はハーゲマ
ン因子と相互作用を有し、これら蛋白質と陰電荷表面の
結合を阻害するような物質（被検物質）の結合阻害能を
測定できるような方法を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明測定法において、
高分子キニノーゲン又はハーゲマン因子中に存在し、且
つ陰電荷表面と結合活性を有するフラグメントを構成成
分として含有する物質（以下、本発明結合物質と略す
る）としては、高分子キニノーゲン、キニン遊離後の開
裂型高分子キニノーゲン、高分子キニノーゲンのＬ鎖、
高分子キニノーゲンのＬ鎖中の結合活性を有するフラグ
メント又はそのフラグメントを構成成分として含有する
ペプチド若くはペプチド誘導体、或いはハーゲマン因子
（活性型も含む）、ハーゲマン因子のＨ鎖、ハーゲマン
因子のＨ鎖中の結合活性を有するフラグメント又はその
フラグメントを構成成分として含有するペプチド若くは
ペプチド誘導体等が挙げられる。上記本発明結合物質の
ラベル化体としては、ラジオアイソトープ、蛍光標識物
質、発色標識物質、酵素・抗体標識物質等でラベル化し
たものが挙げられる。尚、ラベル化の方法は、当該分野
で通常用いられている方法で行うことができる。

【０００８】陰電荷表面を有する物質としては、カオリ
ン、ガラス、セライト、コラーゲン繊維、ホモシスチ
ン、尿酸ナトリウム等の尿酸塩、血小板・細胞等の膜、
デキストラン硫酸、アミローズ硫酸、カラゲニン等の多
糖硫酸エステル、スルファチド等の硫酸化糖脂質、コン
ドロイチン硫酸等のムコ多糖、ヘパリン等のムコ蛋白
質、ステアリン酸ナトリウム、エラジン酸、クエルセチ
ン、ルチン等が挙げられる。またハーゲマン因子活性化
作用を有するような物質であったら、これ以外の物質で
も勿論利用できる。前記の陰電荷表面を有する物質のう
ち、固体で非水溶性のものはそのまま本発明測定法にお
いて利用できるが、例えば水溶性のスルファチド等の硫
酸化糖脂質の場合は、上述した蛋白質、ペプチド類等と
の結合状態は蛍光偏光法等により解析するか、又は非水
溶性の担体と架橋結合させたものを用いることができ
る。

【０００９】本発明測定法は、カリクレイン−キニン系
の開始段階である陰電荷表面と高分子キニノーゲン又は
ハーゲマン因子の結合状態を測定する方法、特に高分子
キニノーゲン又はハーゲマン因子と相互作用を有し、こ
れら蛋白質と陰電荷表面の結合を阻害するような物質の
結合阻害能を測定する方法であり、例えば以下のように
行うことができる。

【００１０】先ず、被検物質の存在下にて本発明結合物
質のラベル化体と陰電荷表面との結合実験を行う。被検
物質が高分子キニノーゲン又はハーゲマン因子と陰電荷
表面の結合を阻害するような物質である場合、該被検物
質の添加量を増加するにつれて、陰電荷表面に結合する
ラベル化本発明結合物質の量は減少し、プラトーに達す
る。陰電荷表面に結合したラベル化本発明結合物質の量
を測定するためには、陰電荷表面を有する物質を遠心分
離、濾過等の方法で上清や濾液等と分離して、沈殿物質
に結合した或いは上清又は濾液等に残存するラベル化本
発明結合物質を定量するなど通常の方法が利用できる。
上記の予備的な結合実験を行っておくと、本発明測定法
の試験系に添加すべき被検物質の量を好ましく設定する
ことができる。即ち、上記予備実験において陰電荷表面
に結合するラベル化本発明結合物質の量がある程度低下
する部分からプラトーに達する前後の範囲における添加
量で被検物質を適用すると、その後行う本発明測定法に
おいて用いる非ラベル化本発明結合物質量が少なくて済
み経済的で好ましい。

【００１１】本発明測定法の基本的な方法としては、ラ
ベル化本発明結合物質及び被検物質をある一定量に設定
し、これに非ラベル化本発明結合物質を量を増加しつつ
添加してゆく方法が挙げられる。被検物質が高分子キニ
ノーゲン又はハーゲマン因子と相互作用を有し、これら
蛋白質と陰電荷表面の結合を阻害するような物質であれ
ば、非ラベル化本発明結合物質の添加量が増加するにつ
れ、ラベル化体及び非ラベル化体の量比により陰電荷表
面に結合するラベル化本発明結合物質の量が増加してゆ
く結果が得られる。これに対して、陰電荷表面と相互作
用を有するような物質であれば、非ラベル化本発明結合
物質の添加量の増加に従って、陰電荷表面に結合するラ
ベル化本発明結合物質の量は減少する。従って、本発明
測定法を用いることによって、特に高分子キニノーゲン
又はハーゲマン因子と相互作用を有し、これら蛋白質と
陰電荷表面の結合を阻害するような物質の結合阻害能を
特異的に測定することが可能となる。

【００１２】

【実施例】

実施例１．１ｍｇのカオリン又は尿酸ナトリウム、適当
量の ¹²⁵Ｉラベル化高分子キニノーゲン、及び種々の量
の非ラベル化高分子キニノーゲンを、０．１４％ウシ血
清アルブミン、０．１１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１
％トリトンＸ−１００を含む２５ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）中で、被検物質（商品名：ノイロトロピ
ン）の存在下、室温で１０分間インキュベートした。遠
心分離によりカオリン又は尿酸ナトリウムを沈殿させ、
これらに結合したラベル化高分子キニノーゲンの量をγ
−カウンターにて測定した。

【００１３】結果の一例を表１及び表２に示す。

【表１】

【００１４】

【表２】

【００１５】実施例２．¹²⁵Ｉラベル化ハーゲマン因
子、同ラベル化活性型ハーゲマン因子並びにそれらの非
ラベル化体を用いて、実施例１と同様の方法で測定を行
った。結果の一例を表３及び表４に示す。

【表３】

【００１６】

【表４】

【００１７】

【発明の効果】表１乃至表４において、非ラベル化本発
明結合物質の添加量を増加させるにつれ、陰電荷表面に
結合するラベル化本発明結合物質の量が増加してゆくこ
とが明らかに示されている。これら測定結果より、上記
被検物質は高分子キニノーゲン又はハーゲマン因子と相
互作用を有し、これら蛋白質と陰電荷表面の結合を阻害
するような作用を有する物質であると考えられる。この
ように、本発明方法は陰電荷表面と高分子キニノーゲン
又はハーゲマン因子の被検物質存在下における結合状態
を測定することができ、特に高分子キニノーゲン又はハ
ーゲマン因子と相互作用を有し、これら蛋白質と陰電荷
表面の結合を阻害するような物質の結合阻害能を測定可
能にするものである。

【００１８】高分子キニノーゲン又はハーゲマン因子と
相互作用を有し、これら蛋白質と陰電荷表面の結合を阻
害するような物質は、ハーゲマン因子活性化、即ちカリ
クレイン−キニン系の開始段階を阻害し、最終的にはカ
リクレイン−キニン系の生成産物であるキニンの産生を
抑制する薬剤として有用であると考えられている。カリ
クレイン−キニン系の生成産物であるブラジキニン等の
キニン類は、末梢血管拡張に伴う降圧、血管透過性の亢
進、平滑筋の収縮或いは弛緩、発痛、白血球の遊走、副
腎皮質からのカテコールアミンの遊離作用など種々の生
理活性を示すほか、アレルギー反応を含めた炎症反応の
メディエーターとしても知られており、これらキニン類
の作用を抑制或いはその生成を阻害する物質は、抗炎症
剤、鎮痛剤、抗アレルギー剤等の医薬品としての有用性
が示唆されている。従って、本発明測定法は、高分子キ
ニノーゲン又はハーゲマン因子と陰電荷表面との結合を
阻害する作用を有する物質、即ちキニンの産生を抑制す
る物質、例えば抗炎症物質、鎮痛物質、抗アレルギー物
質等をスクリーニングするための測定法等として非常に
有用なものである。

Claims (1)

【整理番号】 ＰＣ−２０８ 【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 高分子キニノーゲン又はハーゲマン因子
   中に存在し、且つ陰電荷表面と結合活性を有するフラグ
   メントを構成成分として含有する物質の非ラベル化体及
   びラベル化体を用いることを特徴とする被検物質存在下
   における陰電荷表面と高分子キニノーゲン又はハーゲマ
   ン因子の結合状態を測定する方法。