JPH04148687A - Ｍ―ｃｓｆ活性ポリペプチドの安定的高発現組換えベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【産業上の利用分野】

本発明は、ヒトＭ−ＣＳＦ活性ポリペプチドを安定的、
且つ高効率に発現が可能な安定的高発現組換えベクター
、該組換えベクターを動物細胞に導入し形質転換せしめ
高メトトレキセート耐性株を選択することにより得られ
る安定的高発現形質転換動物細胞、および該形質転換細
胞を用いるＭＣＳＦ活性ポリペプチドの安定的高発現製
造法に関する。

【従来の技術】 Ｍ−ＣＳＦ活性ポリペプチドは、ヒト骨髄中の単球系前
駆細胞である単球コロニー形成細胞に作用して、単芽球
や前単球を経て、分化成熟せしめる因子である。従来、
Ｍ−ＣＳＦ活性ポリペプチドの発現に関連する遺伝子と
しては、遺伝子クローニングにより、２５６個のアミノ
６１（Ｎ末端に３２個のアミノ酸からなるシグナルペプ
チドを含む）に対応する遺伝子（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３
０．　ｐｐ、２９１−２９６　（１９８５））と、５５
４個のアミノ酸に対応する遺転子（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２
３５．１５０４−１５０８　（１９８７）　）の２つが
知られている。 このうち２５６個のアミノ酸に対応する遺伝子によって
生産される成熟型のＭ−ＣＳＦ活性ポリペプチド（以下
、Ｍｌ−ＣＳＦという）は、発現の初期の過程において
、３２個のアミノ酸からなるシグナルペプチドが切断さ
れ、ホモ２量体を形成し、ゴルジ体内を移動する。さら
に翻訳後切断によりそのＣ末端が削除され、成熟型とな
ると推測されている。この切断箇所については、Ｃ■１
細胞を宿主細胞として発現されたＭｌ−ＣＳＦにおいて
同定されており（Ｊ、ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ　。 ８　　、ｐｐ、４５−８８　（１９８Ｂ）　）　、それ
によれば成熟型であるＭｌ−ＣＳＦは、１５８個のアミ
ノ酸からなるポリペプチドであることがｌ（１）認され
ている。 また、もう一方の５５４個のアミノ酸に対応する遺伝子
から生産されるＭ−ＣＳＦ活性ポリペプチド（以下、Ｍ
２−ＣＳＦという）は、ヒト尿中より抽出精製し得るこ
とより、充分な量が確保されるため、研究や臨床的な薬
効評価に既に供されているが、Ｍｌ−ＣＳＦについては
、後述の通り、種々の生産方法が試されているが、研究
や臨床的な薬効評価に供することができるまでには、安
定的且つ高発現に適する生産方法はなく、また、その他
のＭ−ＣＳＦ活性を有するポリペプチドであってＭｌ−
ＣＳＦと類似しているＭｌ−ＣＳＦ類似ポリペプチドの
生産についても全く未検討であった・ 例えば、Ｍｌ−ＣＳＦの生産に関与する天然型の遺伝子
（以下、Ｍｌ−ＣＳＦ遺伝子と略記することがある）を
、ＳＶ４０初期遺伝子プロモーターを有する発現ベクタ
ーに挿入して得たプラスミドｐｃｃｓＦ１７を用い、宿
主細胞であるＣＶ−１細胞を形質転換せしめて得られた
形質転換細胞にてＭｌ−ＣＳＦを生産した（Ｊ、ｏｆ　
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ。 ｇｙ　、８　　、ｐｐ、４５−８８　（１９８Ｂ）　）
　、　Ｌかし、この方法においては、Ｍ−ＣＳＦ活性ポ
リペプチドの発現量を高めるため、ＳＶ４０ウィルスを
用いることがらＣＶ−１細胞が５〜６日後には死滅する
ことになり、しかもその生存期間におけるＭ−ＣＳＦ活
性ポリペプチドの発現濃度も１０，０ＯＯＬＩ／ｍ１程
度と低いものであった。逆にＳＶ４０ウィルスを用いな
いと極めて少量の発現しか認め得す、安定的且つ高発現
の生産は望めなかった。 また、その他の例として、Ｍｌ−ＣＳＦ遺伝子の種々の
位置に終止コドンを挿入して得た改変遺伝子を、Ｍｌ−
ＣＳＦ遺伝子の代わりに用いて、他の操作は前記の組替
えベクターｐｃｃｓＦ１７と同様の構築方法を行って調
製した組替えベクターを、ＣＯＳ細胞に導入し形質転換
せしめた（特表平１−５（１３）２８３号公報）。しか
し、この方法においては、形質転換細胞は１週間程度で
活性を発現しなくなり、さらにＭ−ＣＳＦ活性ポリペプ
チドの発現可能な期間における発現濃度も２００００Ｕ
／ｍ１程度であり、安定的且つ高発現の生産は望めなか
った。 また、Ｍｌ−ＣＳＦ遺伝子の特定部位を削除した改変遺
伝子を用い、ＳＶ４０後期遺伝子プロモーターを有する
発現ベクターに挿入して得たプラスミド１）ＳＶＬ−Ｍ
ｌ−ｄｅ　ｌを用い、宿主細胞であるＣＯ８細胞を形質
転換せしめた形質転換細胞にて生産した（第６回次世代
産業基盤技術シンポジウム予稿集ｐｐ、２５８−２５９
　（１９８８）　）　、　Ｌかし、この方法においても
、形質転換細胞は１週間程度で活性を発現しなくなり、
さらにＭ−ＣＳＦ活性ポリペプチドの発現可能な期間に
おける発現濃度も２，０ＯＯＵ／ｍ１程度と低く、同様
に安定的且つ高発現の生産は望めなかった。

【発明が解決しようとする課題】

前述の如く、Ｍ−ＣＳＦ活性ポリペプチドの生産法は、
従来より種々試みられており、例えばＭｌ−ＣＳＦ遺伝
子の改変遺伝子を使用する方法では、Ｍｌ−ＣＳＦ遺伝
子を使用する方法に比較して若干高い発現量を認めるこ
とができるものの、未だ充分な発現量とはいえず、特に
安定的にＭ−ＣＳＦ活性ポリペプチドを生産することは
できないものであった。したがって、今なお、Ｍ−ＣＳ
Ｆ活性ポリペプチドを安定的に、且つ高発現せしめる生
産法は全く確立されておらず、Ｍ−ＣＳＦ活性ポリペプ
チドの大量生産に適する製造法の確立が待たれていた。 ［！ＩＮを解決するための手段］ 本発明者らは、上記問題点を解決するために鋭意研究し
た結果、Ｍｌ−ＣＳＦのシグナルペプチドを含むポリペ
プチドのＮ末端から１８０番のアミノ酸を含むＣ末端側
のアミノ酸残基の一部または全部が欠損したポリペプチ
ドをコードするＤＮＡであるＭ−ＣＳＦ−ｄｅｌｅｔｅ
ＤＮＡをｄｈｆｒマーカーＤＮＡを有する発現ベクター
のｄｈｆｒマーカーＤＮＡ部位に置換して導入すると共
に、ｄｈｆｒ？−カーＤＮＡを有し、１亥Ｍ−ＣＳＦ−
ｄ　ｅ　ｌ　ｅ　ｔ　ｅＤＮＡと１亥ｄｈｆｒマーカー
ＤＮＡが少なくとも１．５ｋｂｐ離れているように構築
した組換えベクターを用いると、形質転換の工程と細胞
株選択の工程を行うことにより、簡単にＭ−ＣＳＦ活性
ポリペプチドを安定的、且つ高発現に生産することがで
きることを知り、本発明を完成するに至った。 即ち、本発明は、ｄｈｆｒマーカーＤＮＡを有する発現
ベクターにおいて、そのｄｈｆｒマーカーＤＮＡ部位に
置換して導入したＭ−ＣＳＦ−ｄｅｌｅｔｅＤＮＡ（但
し、Ｍ−ＣＳＦ−ｄｅｌｅｔｅＤＮＡは、Ｍｌ−ＣＳＦ
のシグナルペプチドを含むポリペプチドのＮ末端から１
８０番のアミノ酸を含むＣ末端側のアミノ酸残基の一部
または全部が欠損したポリペプチドをコードするＤＮＡ
を示す）と、ｄｈｆｒマーカーＤＮＡとを有し、且つ、
該Ｍ−ＣＳＦ−ｄ　ｅ　ｌ　ｅ　ｔ　ｅＤＮＡと該ｄｈ
ｆｒマーカーＤＮＡとが少なくとも１．５ｋｂｐＨれて
いることを特徴とするＭ−ＣＳＦ活性ポリペプチドの安
定的高発現組換えベクター、および該Ｍ−ＣＳＦ活性ポ
リペプチドの安定的高発現組換えベクターを導入し動物
細胞を形質転換せしめたＭ−ＣＳＦ活性ポリペプチドの
安定的高発現形質転換動物細胞である。 また本発明は、上記の如く形質転換せしめた形質転換動
物細胞をメトトレキセート含有培地にて培養して高メト
トレキセート耐性株を選択して得られるＭ−ＣＳＦ活性
ポリペプチドの安定的高発現形質転換動物細胞を、培地
にて培養することを特徴とするＭ−ＣＳＦ活性ポリペプ
チドの安定的高発現製造法である。 本発明において、Ｍ−ＣＳＦ−ｄ　ｅ　ｌ　ｅ　ｔ　ｅ
ＤＮＡとは、Ｍｌ−ＣＳＦのシグナルペプチドを含むポ
リペプチドのＮ末端から１８０番のアミノ酸を含むＣ末
端側のアミノ酸残基の一部または全部が欠損したポリペ
プチドをコードするＤＮＡを示す、Ｍｌ−ＣＳＦのシグ
ナルペプチドを含むポリペプチドのアミノ酸配列および
塩基配列については、既に解明されており、３２個のア
ミノ酸残基からなるシグナルペプチド部分と、２２４個
のアミノ酸残基が連なった２５６個のアミノ酸にコード
する遺伝子として解析されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２
３０、　ｐｐ、２９１−２９６　（１９８５））　、ア
ミノ酸残基の一部または全部が欠損とは、簡便には適当
な制限酵素を用いて、そのアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡの制限酵素サイトを切断するか、またはこの切断Ｄ
ＮＡに小断片の天然又は合成のオリゴヌクレオチドを連
結してもよく、また適当な位置にポイントミューチーシ
ラン法等により終止コドンを創設せしめる等の遺伝子操
作技術を用いて行えばよい。 Ｍ−ＣＳＦ−ｄ　ｅ　ｌ　ｅ　ｔ　ｅＤＮＡは、そのＣ
末端に好ましくは終始コドンを有する。このＭ−ＣＳＦ
−ｄ　ｅ　ｌ　ｅ　ｔ　ｅＤＮＡの代表的な例示として
は、Ｍｌ−ＣＳＦ遺伝子を制限酵素ＢａｍＨＩｔ１３よ
び３ｔｕｌで切断しクレノー酵素にて連結した改変遺伝
子（以下、Ｍｌ−ｄｅｌと表記することがある）が挙げ
られ、この遺伝子がコードするアミノ酸配列は第２図に
示されるものであり、具体的な塩基配列は第３図に示さ
れるものである。 また本発明において、ｄｈｆｒマーカーＤＮＡとは、葉
酸還元酵素遺伝子を意味し、簡便に°はマウス由来のｄ
ｈｆｒマーカーＤＮＡが使用される（Ｎａｔｕｒｅ　ｖ
ｏｌ、２７５．　ｐｐ６１７−６２４　（１９７８））
　、　ｄ　ｈ　ｆｒママ−−を有する細胞は、メトトレ
キセート（ＭＴＸと略称することがある）を含有する培
地においても増殖可能であり、薬剤耐性のマーカーとし
て形質転換細胞の選択に適している。 ｄｈｆｒマーカーＤＮＡを有する発現ベクターとは、ｄ
ｈｆｒマーカーＤＮＡを有するものであれば特に限定さ
れないが、遺伝子操作し昌い適当な制限酵素部位を有す
るものが好ましく、具体的には、ｐＳＶ２−ｄｈｆ　ｒ
が例示される。これらの発現ベクターは、それぞれ適宜
のプロモーターを有し、例えば、ＳＶ４０初期遺伝子プ
ロモーター、メタロチオネイン遺伝子プロモーター、チ
ミジンオキシナーゼ遺伝子プロモーター等のプロモータ
ーが例示され、特に好ましくはＳＶ４０初期遺伝子プロ
モーターが挙げられる。前記のＭ−ＣＳＦ−ｄｅｌｅｔ
ｅＤＮＡのｄｈｆｒマーカーＤＮＡとの置換工程におい
ては、これらプロモーターの下流域に存在する制限酵素
サイト、例えばＨｉ　ｎｄｎｌおよびＢｇ！ＩＩを利用
して組替えを行えばよい、また、ｄｈｆｒマーカーＤＮ
Ａの創設においては、ｄｈｆｒマーカーＤＮＡの上流域
に存在するこれらプロモーターを含むような制限酵素サ
イト、例えばＥＣ０ＲＩを利用して組替えを行えばよい
、このようにしてＭ−ＣＳＦ−ｄ　ｅ　ｌ　ｅｔｅＤＮ
ＡおよびｄｈｆｒマーカーＤＮＡは、別個のプロモータ
ーの下流域にそれぞれ存在せしめるとより好ましい。 本発明のＭ−ＣＳＦ活性ポリペプチドの安定的高発現組
換えベクターを構築する方法につき、具体的に、ｐＳＶ
２−ｄｈｆｒを例にとって説明すると以下の通りである
。また、その概要の説明図が第４図に示される。 即ち、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒベクターＤＮＡのｄｈｆｒマ
ーカーＤＮＡの両端を、適宜の制限酵素により切断し、
ｄｈｆｒマーカーＤＮＡを削除したベクターＤＮＡ断片
を分離精製する。ベクターＤＮＡ断片の末端は、制限酵
素の種類により平滑化することもできる。また好ましく
は末端をアルカリフォスファターゼ等により脱リン酸化
するとよい。 ｄｈｆｒマーカーＤＮＡの両端の切断に用いられる制限
酵素としては、好ましくはＨ４ｎｄｌ［ｌ、Ｂｇｌｎ等
が挙げられる。また、末端を平滑化するには、ｄＡＴＰ
、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰの存在下、フレノウ断
片酵素により切断点を平滑化する方法が挙げられる。 一方、Ｍｌ−ＣＳＦを生産する細胞（例えば、Ｍ　Ｉ　
Ａ　−Ｐ　ａ　Ｃａ細胞、ＴＲＣ−２９Ｒ細胞等）から
Ｍｌ−ＣＳＦの生産に関与するｃＤＮＡを採取し、必要
により公知の方法に従って、適宜のベクターに挿入し、
培養増幅して調製したＭｌ−ＣＳＦ遺伝子のうちのＭｌ
−ＣＳＦのシグナルペプチドを含むポリペプチドのＮ末
端から１８０番のアミノ酸を含むＣ末端側のアミノ酸残
基の一部または全部を欠損せしめる工程を行えばよく、
例えば、適宜の制限酵素を用いて切断を行う方法、これ
に小断片のオリゴヌクレオチドを連結する方法、または
終止コドンをポイントミューチージョン法により創製す
る方法等が挙げられ、さらにこれらを適宜に組み合わせ
て行ってもよい。ベクターにＭｌ−ＣＳＦ遺伝子を挿入
してこれらの工程を行った場合には、適宜の制限酵素に
よりＭ−ＣＳＦ−ｄｅｌｅｔｅＤＮＡ断片を切断して取
り出す。 Ｍ−ＣＳＦ−ｄｅｌｅｔｅＤＮＡ断片の末端は、制限酵
素の種類により平滑化することもできる。 また好ましくは末端をアルカリフォスファターゼ等によ
り脱リン酸化するとよい。 以上により調製されたｄｈｆｒマーカーＤＮＡを削除し
たベクターＤＮＡ断片と、Ｍ−ＣＳＦｄｅｌｅｔｅＤＮ
Ａ断片とをライゲーションし、宿主微生物に導入し形質
転換せしめ、目的のＭＣＳＦ−ｄｅｌｅｔｅＤＮＡを含
むベクターを保持した形質転換体を採取し培養増幅して
、ベクターＤＮＡを得る０次いで、このＭ−ＣＳＦ−ｄ
　ｅｌｅｔｅＤＮＡを含むベクターＤＮＡのＭ−ＣＳＦ
−ｄ　ｅ　ｌ　ｅ　ｔ　ｅＤＮＡ断片に作用しない適宜
の制限酵素にてベクターを断片となす。この工程におい
て用いられる制限酵素は、後記によって調製されるｄｈ
ｆｒマーカーＤＮＡ断片を挿入し、ｄｈｆｒマーカーＤ
ＮＡを創設する箇所であるので、ｄｈｆｒ７−カーＤＮ
Ａ断片を挿入したときに該ｄｈｆｒマーカーＤＮＡとＭ
−ＣＳＦ−ｄｅｌｅ　ｔ　ｅ　ＤＮＡとの距離が、少な
くとも１．５ｋｂｐ以上となるような制限酵素サイトを
選択すればよく、好ましくは制限酵素Ｅｃ　ｏＲ１サイ
トが例示される。このベクターＤＮＡの末端をアルカリ
フォスファターゼ等により脱リン酸化すると好ましい。 また別に、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒベクターＤＮＡのｄｈｆ
ｒマーカーＤＮＡの両端を、適宜の制限酵素により切断
し、ｄｈｆｒマーカーＤＮＡ断片を調製する。この場合
においては、ｄｈｆｒマーカーＤＮＡの発現に適当なブ
ライマ一部分を含むように充分に広く切断することが好
ましく、好ましくは制限酵素ＥｃｏＲＩにてｄｈｆｒマ
ーカーＤＮＡを含む断片を調製するとよい、この末端に
ついても、アルカリフォスファターゼ等により脱リン酸
化するとより好ましい。 以上にして調製されたＭ−ＣＳＦ　−ｄ　ｅ　ｌ　ｅ　
ｔｅＤＮＡを含むベクターＤＮＡ断片と、ｄｈｆｒマー
カーＤＮＡを含む断片とをライゲーションし、宿主微生
物、例えばＥ、ｃｏｌｉ等に導入し形質転換せしめ、本
発明のＭ−ＣＳＦ活性ポリペプチドの安定的高発現組換
えベクターが構築される。 以上の操作において用いられる制限酵素は、通常、切断
すべきＤＮＡの量に対し当量以上のユニット量を添加す
ればよく、好ましくはＤＮＡ１μｇに対し、１〜２Ｕ程
度使用すればよい、また、その他の酵素においては、反
応系により異なり適宜の量を使用すればよいが、通常１
０〜２０Ｕ程度用いればよい。 斯くして構築された本発明の安定的高発現組換えベクタ
ーは、該Ｍ−ＣＳＦ−ｄ　ｅ　ｌ　ｅ　ｔ　ｅＤＮＡと
該ｄｈｆｒマーカーＤＮＡが少なくとも１゜５ｋｂｐ離
れているように構築されている。 本発明において、特に好ましい組替えベクターは第１図
に示されるものであり、図中のＭ−ＣＳＦ−ｄｅｌｅｔ
ｅＤＮＡは、好ましくは第２図に表されたアミノ酸配列
をコードするＤＮＡが例示され、さらに具体的に、第３
図に表された塩基配列のＤＮＡが例示される。 本発明のＭ−ＣＳＦ活性ポリペプチドの安定的高発現組
換えベクターを動物細胞に導入して形質転換動物細胞を
得る方法は、リン酸カルシウム沈殿法、ＤＥＡＥ−デキ
ストラン法、電気パルス法等の手法により、該組換えベ
クターを動物細胞に導入すればよく、特に好ましくは電
気パルス法が挙げられる。 宿主細胞として用いられる動物細胞は、培養可能なもの
であれば特に限定されないが、ｄｈｆｒの物性を持つ細
胞が選択し易いことから好ましく、最も好ましい例とし
てはｄｈｆｒ−の性質を持つＣＨＯ細胞（ｄ　ｈ　ｆ　
ｒ　−ＣＨＯ；　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。 ＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　ｖｏｌ、７７、ｐｐ、４２
１６−４２２０　（１９８０）　）が挙げられる。しか
しながら、ｄｈｆｒ−の性質を有さないＴＲＣ−２９Ｒ
細胞（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２３７５）を使用することも
可能である。 次いで、このようにして得た形質転換動物細胞を、ＭＴ
Ｘ　（メトトレキセート）含有培地にて培養して高ＭＴ
Ｘ耐性株を選択することにより、ＭＣＳＦ活性ポリペプ
チドの安定的高発現形質転換動物細胞が得られる０通常
、ＭＴＸの含有量を段階的に増加せしめて培養すること
が好ましく、通常使用されるＭＴＸの含有量は、約０．
１〜１０μＭ程度の量が例示される。斯くして得られた
約１０μＭ以上のＭＴＸに耐性を示す高ＭＴＸ耐性株は
、好ましい安定的高発現形質転換動物細胞を与える。 この形質転換細胞の好適な例としては、第３図に示され
るＭｌ−ｄｅｌ遺伝子を含む安定的高発現組替えベクタ
ーをｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入し形質転換せしめＭＴ
Ｘにより選択したＭｌ−ｄｅ１１４−２［微工研菌寄第
１１７５６号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−１１７５６）Ｊが挙げ
られる。 本発明において安定的とは、継代培養を行ってもＭ−Ｃ
ＳＦ活性ポリペプチドの生産量が低下せず、また通常の
培養においても少なくとも２週間はＭ−ＣＳＦ活性ポリ
ペプチドの生産量が低下しないことを意味し、上記Ｍｌ
−ｄｅｌ　　１４−２においては、少なくとも約１月間
程度は約６００．０ＯＯＵ／ｍ１程度のＭ−ＣＳＦ活性
ポリペプチドを発現できるものであった。 該形質転換細胞を培養することにより、ＭＳ−ＣＳＦ活
性を生産するに際しては、通常の動物細胞の培養方法が
採用でき、例えば、ＣＨＯ細胞やＴＲＣ−２９Ｒ細胞の
組織培養の培地、例えば、ダルベツコ変法イーグルＭＥ
Ｍ培地＋１０％牛脂児血清を用い、培養器、簡単にはシ
ャーレやルー瓶に、形質転換動物細胞を１０４個／ｃｍ
”程度播種して、２〜６日間、３０〜３７℃にて培養し
た後、その培養上清を回収して目的とするＭ−ＣＳＦ活
性ポリペプチドを確認し、さらに適宜公知の蛋白質の回
収、精製手段を利用して、目的とするＭ−ＣＳＦ活性ポ
リペプチドを回収すればよい。 さらに大量培養が必要な場合には、マイクロキャリアー
に付着せしめ適宜の撹拌条件、ｐＨ条件や酸素供給条件
等にて培養すればよい。 このようにして得られたＭ−ＣＳＦ活性ポリペプチド含
有溶液は、例えば減圧濃縮、膜濃縮、硫安や硫酸ナトリ
ウム等を用いた塩析処理、メタノールやエタノール、ア
セトン等の親水性有機溶媒での分別沈殿等の手段を適宜
選択し、組み合わせて行い、沈殿せしめ、さらにこのＭ
−ＣＳＦ活性ポリペプチド含有沈殿物を、必要に応じて
精製すればよく、例えばこの沈殿物を水または緩衝液に
熔解し、透析膜にて透析して、より低分子量の不純物を
除去してもよく、またイオン交換樹脂、吸着側やゲル濾
過側等によるイオン交換クロマトグラフィー、吸着クロ
マトグラフィー、やゲル濾過により精製してもよく、精
製Ｍ−ＣＳＦ活性ポリペプチドは凍結乾燥して保存すれ
ばよい。

【発明の効果】

本発明によれば、安定的、且つ大量のＭＳ−ＣＳＦ活性
を発現する組換えベクターを提供でき、さらにそれを使
った形質転換細胞の調製により、ＭＳ−ＣＳＦ活性の工
業レベルの大量生産が可能となった。

【実施例】

次いで本発明の実施例を挙げて本発明を具体的に説明す
るが、本発明は何らこれにより限定されるものではない
。 （以下、余白） 〈実施例１〉 ポＩ　　Ａ　　’ＲＮＡの ヒト細胞ＴＲＣ−２９Ｒ株（ＦＥＲＭＢＰ−２３７５）
を５％牛脂児血清を含むＤ−ＭＥＭ培地（ジブコ社製）
で３７℃、　５％ＣＯ２インキユベーター内で４日間培
養した。　１０′１個のこの細胞を４０ｍ１の６Ｍグア
ニジンイソチオシアネート中でホモジナイズしたのち、
１８．５ゲージの太さの注射針を通して高分子ＤＮＡを
切断し粘度を下げた。 ホモジネートを３分の１容の５．７Ｍ塩化セシウム、０
、ＩＭ　ＥＤＴＡ　（ＰＨ７，５）の溶液上に重層し、
３５、ＯＯＯｒｐｍ、２５℃で１８時間遠心した。 遠心後、沈澱物を水３＋ａｌに溶解し、等量のフェノー
ル・クロロホルムで処理し、水層を別の試験管に取り、
　１ｏ分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２．５倍容
のエタノールを加えて遠心し、沈澱物を集め、減圧乾燥
し、粗ＲＮＡ５ｍＫを得た。 この沈澱物を１．５ｍｌの水に溶解後、　６５℃で５分
間保温し、急冷して１．５ｍｌの４０＋ｎＭ）リス−塩
酸（ｐ　Ｈ７，６）、１．０ＭＮａＣ１，１ｍＭＥＤＴ
Ａおよび０．１％ＳＤＳで平衡化した７５霞にのオリゴ
（ｄ　Ｔ）−セルロース（ファルマシア社製）カラムに
吸着させた。１０Ｉｌｌｌの同じ溶液で洗浄した後、　
５ｍｌの２０ｍＭ）リス−塩酸（ｐ　Ｈ７，６）、Ｏ，
１ＭＮａＣ１，１ｍＭＥＤＴＡおよび０．１％ＳＤＳ溶
液でポリ（Ａ）’ＲＮＡ以外のＲＮＡを溶出させた０次
に１０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，５）、　１ｍＭＥＤ
ＴＡ、０．０５％ＳＤＳの溶液でポリ（Ａ）’ＲＮＡを
溶出させ、始めに溶出してくる１ｍｌを分画した。これ
に１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２．５倍容
のエタノールを加え、−２０℃で一晩放置し、　ｌ　５
　ｔ　ＯＯＯｒ　ｐ　ｍ１３０分の遠心で沈澱を集め、
減圧乾燥した。この様にしてポリ（Ａ）”ＲＮＡ５０μ
ｇを得た。 〈実施例２〉 ｃＤＮＡ−ブー１　の 実施例１で得たポリ（Ａ）’ＲＮＡを１μｇ／μｍにな
るように水に溶解し、その５μｌをマイクロチューブに
移し、６５℃で５分間加熱し、急冷した後に、これに５
０ｍＭ）リス−塩１１　（ｐＨ８゜３）、　　１０ｍＭ
ＭｇＣ１２、１４０ａＭＫＣＩ、　　１０―Ｎジチオス
レイトールおよび２鳳ＮのｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧ
ＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの等量浪合物）、５μｇのオ
リゴ（ｄＴ）（ファルマシア社製）と１．５単位の逆転
写酵素（全酒造社製）を加え、全量を２０μｍとし、４
２℃で１時間反応させた。その反応液に８０ｍＭ）リス
−＠ｍ！（ｐＨ７，５）、２００ｍＭ　ＫＣＩ、１０ｄ
ＭｇＣ１２，２５μｇ／ｍｌ　　Ｂ、　　Ｓ、　　Ａ、
　　にＲＮａｓｅＨ（全酒造社製）６０単位およびＤＮ
Ａポリメラーゼ■（ベーリンガーマンハイム社製）５単
位を加えてａｔを１５′Ｏμｍにし、　１２℃で１時間
反応させたのち、２２℃で１時間反応させた。２０μｌ
の０．２５Ｍ　ＥＤＴＡとｌＯμｌの１０％ＳＤＳを加
えて反応を停止したのち、等量のフェノール・りｏロホ
ルムを加え、１０．ＯＯＯｒｐｍ、　５分間遠心し、水
層を分取した。それに等量の４Ｍ酢酸アンモニウムと２
倍のエタノールを加え、　１５，０００ｒｐｍ、１５分
間遠心し、沈澱物を集め減圧乾燥した。沈澱物に１００
ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ８，０）、　１０ｍＫＥＤＴＡ
、　８０ＭＭＳ−アデノシルメチオニン、　１００μｇ
／ｍｌ　　Ｂ、’　　Ｓ、Ａ、　　および２単位のＥｅ
ｏＲＩメチレース（プロメガバイオチック社製）を加え
、　１０μｌとし、３７℃で１時間反応させた。反応後
１反応液に４０μｌの水を加え１等量のフェノール・ク
ロロホルムで処理し、遠心により分取した水層に、等量
の４に酢酸アンモニウムと２倍のエタノールを加え、７
０℃で１５分間放置した。１５．ＯＯＯｒｐｍ、１５分
間遠心後の沈澱物に６７ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ８，８
）、６．７ｅＭＭｇＣ１２，１６，６ｍＭ硫酸アンモニ
ウム、１０ｍＭ２−メルカプトエタノール、　　６．７
　μＭ　　ＥＤＴＡ、　　０．１６７％Ｂ、　　Ｓ、　
　Ａ。 、各７５０μＭｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ。 ｄＴＴＰおよびＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（全酒造社製）
４単位加え、全量を１２μｌとし、３７℃で１時間反応
させた０等量のフェノール・クロロホルム液で処理し、
エタノール沈澱し、遠心によって沈澱物を口取し、減圧
乾燥した。　１μｇのＥｃｏＲＩリンカ−に５０ｍＭ）
リス−塩！ｌ［（ｐＨ７，６）、１０ｍＭＭｇＣ１２、
ＩＣ）＋Ｍジチオスレイトール、　０．１ｍＭ　スペル
ミジン、　０．１＋ｎＭＥＤＴＡ、１０にＡＴＰおよび
３単位のＴ４ポリヌクレオチドカイネース（全酒造社製
）を加え、全量を１０μｍとし、　３７℃で３０分間反
応させた。これをＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理後のサン
プルに全量加え、６０単位のＴ４リガーゼ（ファルマシ
ア社製）を加え、　１４℃で一晩反応させた。この反応
液に１００ｍＭＮａＣ１、５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ
７，５）、　１０ｅ＋？Ｉ　Ｍ　ｇ　Ｃ１２、７Ｉｌ１
Ｍ２−メルカプトエタノール、　１００μｇ／ｍｌＢ、
Ｓ。 Ａ、および２５０単位のＥｃｏＲＩを加え、全量４０μ
ｍにて、　３７℃で２時間反応させた。この反応液を１
％低融点アガロースゲルにて分画し、６００〜２．ＯＯ
Ｏべ−ＸのＤＮＡを含ｔ？ゲ）Ｌｒ　ヲ口取した。６５
℃で１０分間保温し、ゲルを融解した後、等量のフェノ
ールを加え、　１０分間水冷後、１５、ＯＯＯｒｐｍ、
４℃で１０分間遠心した。水層に等量のフェノールを加
え操作を繰り返し、水層をクロロホルムで２回処理し、
　１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２．５倍容
のエタノールを加え、　−７０℃に放置した。　　１５
．ＯＯＯｒｐｍ。 １５分間遠心した後、沈澱を７５％エタノールで２回洗
浄し、減圧乾燥した。それにラムダファージベクターλ
ｇｔｌｌ　　（ストラドジーン社１！ｌ）アームを１μ
ｇ加え、ライゲーションキット（全酒造社製）を用いて
、２６℃で１０分間反応させた。 反応後のサンプルはインビトロパンケージングキット（
ストラドジーン社Ｉｔ）を用いて反応させた。 得られたラムダファージをエシェリヒア・コリＬＥ３９
２　（ストラドジーン社製）に感染させ、総数を調べた
ところ、５　、ＯＸ　１０５ｐ　ｆ　ｕ　（ｐｌａｑｕ
ｅｆｏｍｉｎ（ｕｎｉｔ）よりなっていた。 〈実施例３〉 Ｍ−ＣＳＦ　　　　　　　　ローンのス　Ｖ−二ン−グ 作製したＴＲＣ−２９Ｒ株のｃＤＮＡライブラリー５．
ＯＸ　１０’ｐ　ｆ　ｕをエシェリヒア・コリＬＥ３９
２を指示菌として、　１．５％ＬＢ寒天培地（１１につ
き、バタトトリプトン１０　ｇｏ　　バクトイ−ストエ
キストラクト５ｇ、ＮａＮａＣ１１Ｏ上にひらき、プラ
ークハイブリダイゼーション法を用いて、Ｍ−ＣＳＦ遺
伝子のクローン選択を行った。又、公知のＭ−Ｃ８Ｆ遺
伝子のＤＮＡ配列［５ｉｃｅｎｃｅ、Ｖｏｌ、２３０．
ｐ２９３−２９６（１９８５）コに基づいて、２４塩基
の合成ヌクレオチド（５’　−ＧＡＧＧＡＧＧＴＧＴＣ
ＧＧＡＧＴＡＣＴＧＴＡＧＣ）を作製した。 ＬＢプレート上に溶菌したプラークをナイロン膜上ニ移
シテカラ、Ｉｌ［を０．５ＮＮａＯＨ１１，５Ｍ　Ｎａ
Ｃ１、で５分、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５）で５
分処理した後、８０℃減圧下で２時間乾燥した。欣にこ
の膜をビニール袋に入れ、　５濃度度ＳＳＣ（１倍：　
　１５０ｓＭＮａｃ１、１５＋ａＭクエン酸ナトリウム
）、５倍デンハルト液（１倍：０．０２％フィコール、
　０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％Ｂ、　
　Ｓ、　　Ａ、　　）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐ
Ｈ６，５）、０．１％ＳＤＳ　（ラウリル硫酸ナトリウ
ム）、２５０μｇ　／　ｍ　１サケ精子ＤＮＡ、　２０
％ホルムアミド　１０ｍ１中で、３７℃、４時間保温し
た。液を除いてから、５′端を１２ｐでラベルした上記
の合成オリゴヌクレオチドプローブ（１０”ｃ　ｐ　ｍ
／　ｐ　ｇ）を２０ｎｇ上液に加え、　３７℃で一晩ハ
イブリダイズさせた。 その後膜を２倍５ＳＣ１０，１％ＳＤＳで室温で３回、
３７℃で１０分洗浄し、通風乾燥して一晩オートラジオ
グラムを行った。シグナルの出た位置の培地をくり抜き
、ＳＭ液（０，ＩＭＮａＣｌ、８ｍＭＭｇ５Ｏａ、　５
０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，５）０．（１３）％ゼラ
チン）１ｍｌに懸濁し、希釈してＬＢプレートにひらき
直し、同じプローブでスクリーニングを繰り返し、プラ
ークを純化した結果、２株のクローンを得た。 〈実施例４〉 Ｍｌ−ＣＳＦ“−の 実施例３で得た組換え体ラムダファージ１×１０５ｐｆ
ｕを宿主菌ＬＥ３９２に感染させ、ＬＢ寒天培地プレー
）（１３ｃ団Ｘ９ｃｍ）２枚にひらｌ／）た。 １枚につき１５ｍ１のＳＭ液を加えて、ファージをＳＭ
に浸潤させ、試験管に上層寒天ととも番こ移し、８．Ｏ
ＯＯｒｐｍ、１０分間遠心した。上滑にＣ０単位のＤＮ
ａｓｅｌ（全酒造社製）および１１００ｐのＲＮａｓｅ
Ａ（シグマ社製）を加え、３７℃で３０分間保温した。 これに等量の２０％ポリエチレングリコール、　２．５
にＮａＣ１を加え。 １時間氷冷した後、１５．ＯＯＯｒｐｍ、　２０分間遠
心し、沈澱物を得た。この沈澱物を０．５ｍｌのＳＭ液
に懸濁し、等量のクロロホルムを加えて処理し、遠心後
の水層に密度が１．１５になるように塩化セシウムを加
えた８次いでそれを密度が１．６（２ｍｌ）、　１．５
（３ｍｌ）、１．４　（３ｍｌ）になるように塩化セシ
ウムを加えたＳＭの溶液上に重層し、３０．ＯＯＯｒｐ
ｍ、３時間遠心した。 遠心後、密度１．５と１．４の間に表れるファージを含
むバンドを分取し、　トリス−塩酸（ｐＨ７，５）に溶
解し、４０．ＯＯＯｒｐｍ、１時間遠心によって沈澱物
を得た。沈澱物を、　２０ａＮＥＤＴＡ、０．５％ＳＤ
Ｓ、５０μｇ／ｍｌプロテアーゼＫ（シグマ社１１）で
６５℃、１時間処理した。この反応液に等量のフェノー
ルを加え、遠心後の水層を等量のフェノール・クロロホ
ルムで処理し、再度遠心後の水層をクロロホルムで処理
し、水層に１゜分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウムと２．５
倍容のエタノールを加え一７０℃に１５分間放置した。 １５．０００ｒｐｍ、　１５分の遠心にて回収した沈澱
物を７５％エタノールで２回洗浄し、減圧乾燥した。 ５μｇ／ｍ１ＲＮａｓｅＡを含む水５０μｌに沈澱を溶
かし、　１０μｌをＨａ街液□ＩＨＨｉａｔｉｓら、Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、１０４．Ｃｏ１ｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ（１９８２））中におい
てＥｃｏＲＩ　（東洋紡績社製）で完全消化して挿入断
片を調べると、約１　、Ｏｋ　ｂ　ｐの最長の断片を有
する、Ｍ−Ｃ８Ｆクローンが得られた。ＥｃｏＲＩ消化
後に得られた約１．０　ｋ　ｂ　Ｐの挿入断片を低融点
アガロースゲル電気泳動により回収した。この約１．０
ｋｂｐの挿入断片について、各種制限酵素で消化した結
果、第１図に示す制限酵素地図であった（図中、ＢはＢ
ａｍＨＩ、ＥはＥｃｏＲＩ、ＳＣは５ｃａＩ、ＳｔはＳ
ｔｕ工の各制限酵素サイト告示す、） さらにベクターｐＵｃ１１８をＥｃｏＲＩで完全消化し
た後１．５（１３）１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ８，０）中
にバクテリアアルカリホスファターゼ（東洋紡績社製）
を０．５単位加え、　６５℃で１時間反応させた。反応
液をフェノール・クロロホルム液テ２回処理した後、水
層に１０分の１容の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２倍容の
エタノールを加え、遠心してベクターを回収した。ゲル
から回収した挿入断片とＥｃｏＲＩ消化したベクターｐ
Ｕｃ１１８を、ライゲーションキット（全酒造社製）を
用いて連結させ、　プラスミドｐＵｃ１１８−Ｍｌ−Ｃ
ＳＦと命名した。 〈実施例５〉 Ｍ−Ｃ８−ｄｅ　ｅｔｅの ｐＵｃｌｌＢ−Ｍｌ−ＣＳＦ　　５０　　μ　ｇ　を、
　　１００ｍＭＮａＣ１、５０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ
７，５）１０ｍＭＭｇＣ１２、７Ｉｌ１Ｍ２−メルカプ
トエタノールおよび１００単位の制限酵素ＥｃｏＲＩを
含む１００μｍの反応液で、　３７℃、２時間消化した
。この反応液に等量の水飽和フェノールを加えて攪拌後
、遠心して水層を分取した。水層に１０分の１容の３Ｍ
酢酸ナトリウム（ｐＨ５，５）と２．５倍量のエタノー
ルを加えて攪拌後、　−８０℃で１５分間放置した。１
５．ＯＯＯｒｐｍ、　　１５分間遠心し、白色のペレッ
トを取得した。このペレットを６７ｎＭ　ＫＰＯａ、　
　６．７ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ２−メルカプトエタ
ノールおよび３３μにのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ
、　　ｄＴＴＰを含む反応液１０μｌに溶解し、フレノ
ウ断片酵素（宝酒造社ｍ１）２０単位を加え、２２℃で
１時間反応した。 この反応液を１％低融点アガロースゲル（ＢＲＬ社製）
で電気泳動し、約７０ｏｂｐと約３．２ｋｂｐのＤＮＡ
断片を抽出、単離した。３．２ｋｂｐのＤＮＡＩＦｉ片
２０ｕｇを、制限酵素Ｓｔ、ｕＩで同様に消化し、３．
１ｋｂｐの断片を単離した。この３．１　ｋ　ｂ　ｐの
断片２μｇを５（１３）１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ８，０
）中にバクテリアアルカリホスファターゼ　０．５１１
位を加え、６５℃で１時間反応させた後、フェノール抽
出とエタノール沈澱を行い、ＤＮＡｌｌ１片を回収した
。この脱リン酸化した３、１ｋｂｐのＤＮＡ断片　１１
００ｎと先に得ている　７００ｂｐのＤＮＡｌｌｉ片　
３００ｎｇをライゲーションキット（全酒造社製）で連
結し、あらかじめ用意しであるコンピテント菌エシェリ
ヒア・３９５Ｍ１０９株（全酒造社製）に加えた。これ
を、アンピシリン５０μｇ　／　ｍ　ｌを含むＬＢ寒天
培地上にまき、３７℃で１８時間培養し、形質転換体を
得た。この形質転換体よりプラスミドを調製し、ＤＮＡ
配列を決定して、図２に示すＭ−Ｃ８Ｆ−ｄｅｌｅｔｅ
　　（Ｍｌ−ｄｅｌと略祢する）ＤＮＡ配列を確認し、
　ｐＵｃｌｌＢ−Ｍｌ−ｄｅｌプラスミドを取得した。 く実施例６〉 ベ　　　タ　− ｐＳＶ２−ｄｈｆ　ｒ　（ＢＲＬ社製）プラスミドＤＮ
Ａ　　１０μｇを各２０単位の制限酵素Ｈｉ　ｎ　ｄ■
とＢｇｌｌｌで３７℃、　２時間消化した。さらに４種
のｄＮＴＰ存在下で２０単位のフレノウ断片酵素を加え
、　２２℃、　１時間反応した０反応液を低融点アガロ
ースゲルで電気泳動し、そこから約３．６　ｋｂｐのＤ
ＮＡ断片を単離し、バクテリアアルカリホスファターゼ
処理したＤＮＡｌ１片５μｇをａｍした。別に、　ｐＵ
ｃｌｌＢ−Ｍｌ−ｄｅ１１０μｇを２０単位の制限酵素
ＥｃｏＲＩで３７℃、２時間消化し、その後４種のｄ　
ＮＴＰ存在下で２０単位のフレノウ断片酵素で２２℃、
　１時間反応した。反応液を低融点アガロースゲルで電
気泳動し、そこから約７００ｂｐのＤＮＡ断片を単離し
た。この断片　３００ｎｇと先に用意した３゜６　ｋ　
ｂ　ｐのＤＮＡ断片　１１００ｎをライゲーションキッ
トで連結し、エシェリヒア・コリＪＭＩ　Ｃ９を宿主菌
にした形質転換体を取り、これからｐＳＶ２−Ｍｌ−ｃ
（ｅｌプラスミドを取得した。 一方、　　ｐＳＶ２−ｄｈｆｒプラスミドＤＮＡ　　１
５μｇを３０単位の制限酵素ＰｖｕＩＩで消化し、リン
酸化ＥｃｏＲＩリンカ−（Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ　−Ｔ　
−Ｃ−Ｃ：　　全酒造社製）１μｇをライゲーションキ
ットで連結した０反応液を１００単位の制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで３７℃、２時間消化し、低融点アガロースゲルで
電気泳動し、約２．４ｋｂｐのＤＮＡＩＩ片を単離した
。この断片　ａｏｏｎｇと、先に構築したｐＳＶ２−Ｍ
ｌ−ｄｅｌプラスミド５μｇを１０単位の制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩで３７℃、２時間消化し、さらにバクテリアアル
カリホスファターゼ処理したＤＮＡ　　１１００ｎをラ
イゲーションキットで連結した。エシェリヒア・コリＪ
Ｍ１０９を宿主菌として形ｇ１１検体を取り、ｐＳＶ２
−ｄｈｆ　ｒ−Ｍｌ−ｄｅｌプラスミドを取得した。対
照試験に使用する発現ベクターの構築には、ｐＵｃ１１
８−Ｍｌ−Ｃ８Ｆ　　５０μｇを用いて、全く同様な操
作によって、　ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ　−Ｍｌ−ＣＳＦ　
　プラスミドを作製した。 〈実施例７〉 遺伝子移入は電気パルス穿孔法（ＨＩＧＨＶＯＬＴＡＧ
ＥＣＥＬＬ　ＰＲＯＣＥＳＳＯＲ：　ＢＩＯＬＥＣＴＲ
ＯＮＩＣ５社製）で行った。５％牛脂児血清含有ＨＡＭ
　　Ｆ１２培地を用いてプラスティックプレート上で培
養したＣＨＯｄｈｆｒ−細胞（東京大学応用微生物研究
所より分与）を剥離酵素（ナガーゼ；　長瀬産業）によ
り剥離し、ＰＢＳ（−）に懸濁、遠沈操作により細胞を
回収した。この細胞を１ｘ１０７個／ｍｌとなるように
ＰＢＳ　（−）で懸濁し、実施例６で作製したプラスミ
ドｐＳＶ２−ｄｈｆ　ｒ−Ｍｌ−ｄｅｌおよびＰ　Ｓ　
Ｖ　２−　ｄ　ｈ　ｆ　ｒ　−Ｍ　１−　Ｃ，Ｓ　Ｆを
各４０μｇ　／　ｍ　ｉとなるように添加した。攪伴後
、チャンバーに懸濁液を入れて高電圧パルスをかけた。 パルス条件は、電極間比１１３ｍｍ、電圧１２００ｖ、
パルス幅３０μｓ　ｅ　ｃ、　　パルス回数５回で行っ
た。パルス後、すみやかに細胞懸濁液を回収して水冷下
に保持し、あらかじめ培地（５％牛脂児血清含有ＨＡ’
Ｍ　　Ｆ１２）を加えておｐｚたプラスティックシャー
レに播種した。 ３７℃、５％ＣＯ２インキユベーター内で４８時間培養
後、培地を選択培地（５％牛脂児透析血清含゛有α−Ｍ
ＥＭ）に交換した。培地交換後、　１０〜１４日目に選
択培地中で増殖する細胞のコロニーが確認された。この
コロニーを口紙法務こよりクローニングし、培養上清中
のＭ−Ｃ８Ｆ活性を渓す定した。Ｍ−Ｃ８Ｆの活性測定
法はＭ　ｅ　ｔ　ｃ　ａ　１ｆによる方法［Ｊ、Ｂｉｏ
ｌ、Ｍａｄ、、４４，２８７−３００（１９８６）］に
従い、　１コロニーを１単位として活性を算定した。Ｍ
−Ｃ８Ｆ活性の確認されたトランスフォーマントはＭＴ
Ｘ含有培地（５％牛脂児透析血清、０．１〜１０μＭ　
ＭＴＸ含有　α−ＭＥＭ）で培養し、ＭＴＸＩＩ度を０
．１，０．５，２．１０　ｐＭまテ段階的に上昇させた
。その結果得られた、ＭＴＸ１度１０μに耐性株のＭ−
Ｃ８Ｆ活性を測定したところ、ネイティブ型Ｍｌ−ＣＳ
Ｆ遺伝子を用いた場合、７０，０００ユニット／ｍｌの
生産性を示した。また、Ｍ　１−　ｄ　ｅ　ｌ遺伝子を
使用した株では、６００　、ＯＯＯユニット／　ｍ　ｌ
の生産性を示し、膜結合部位を削除した遺伝子を移入す
ることにより約１０倍生産性の高いトランスフォーマン
トを得、Ｍｌ−ｄｅｌ　　１４−２と命名し、微工研菌
寄第１１７５６号として寄託した。　トランスフォーマ
ン）　（Ｍｌ−ｄｅｌ　　１４−２）は、５％牛脂児血
清含有α−ＭＥＭ培地で１力月間安定的に６００．００
０ユニツト／ｒｆｉｌの生産性を示した。 〈実施例８〉 ＴＲ−２９Ｒ ＣＳ 遺伝子移入は電気パルス穿孔法（ＨＩＧＨＶＯＬＴＡＧ
ＥＣＥＬＬ　ＰＲＯＣＥＳＳＯＲ；　ＢＩＯＬＥＣＴＲ
ＯＮＩＣ５社製）で行った。５％牛脂児血清含有ＲＰＭ
Ｉ　　１６４０培地を用いてプラスティックプレート上
で培養したＴＲＣ−，２９Ｒ細胞（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−
２３７５）を剥離酵素（ナガーゼ；　長瀬産業）によっ
て剥離し、ＰＢＳ　（−）に懸濁、遠沈操作により細胞
を回収した。この細胞を５Ｘ１０６個／　ｍ　１となる
ようにＰＢＳ（−）で懸濁し、実施例６で作製したプラ
スミドｐＳＶ２　　ｄｈｆｒ−Ｍｌ−ｄｅｌおよびｐＳ
Ｖ２−ｄｈｆｒ−Ｍｌ−Ｃ８Ｆを各４０μｇ／　ｍ　１
となるように添加した。攪伴後、チャンバーに懸濁液を
入れて高電圧パルスをかけた。パルス条件は、電極間ｙ
＠　９３　ｍ　ｍ、電圧８００Ｖ、パルス幅３０μｓｅ
ｃ、パルス回数３回で行った。 パルス後、すみやかに細胞懸濁液を回収して水冷下に保
持し、あらかじめ培地（５％牛脂児血清含有ＲＰＭＩ　
　１６４０）を加えておいたプラステイツクシャーレに
播種した。 ３７℃、５％Ｃ○２インキュベーター内で４８時間後、
培地を選択培地（５％牛脂児血清、０４１８２００μｇ
／ｍｌ含有ＲＰＭＩ　　１６４０）に交換した。培地交
換後、１０〜１４日目に選択培地中で増殖する細胞のコ
ロニーが確認された。このコロニーを口紙法によりクロ
ーニングし、培養上滑中のＭ−ＣＳＦ活性を測定した。 Ｍ−ＣＳＦの活性測定法はＭ　ｅ　ｔ　ｃ　ａ　１　ｆ
による方法［Ｊ、Ｂｉｏｌ、河ｅｄ、、４４，２８７−
３００（１９８６）］に従い、　１コロニーを１単位と
して活性を算定した。Ｍ−Ｃ８Ｆ活性の確認されたトラ
ンスフォーマントはＭＴＸ含有培地（５％牛脂児透析血
清、０．１〜１０μＮＭＴＸ含有　ＲＰＭＩ　　１６４
０）で培養し、ＭＴＸ１度を０．１，０．５，２，１０
μにまで段階的に上昇させた。その結果得られた１ＭＴ
Ｘ１度１０μＭｆｆｌ性株のＭ−Ｃ８Ｆ活性を測定した
ところ、ネイティブ型Ｍｌ−Ｃ８Ｆ遺伝子を用いた場合
、４．０００ユニツト／　ｍ　ｌの生産性を示した。ま
た、Ｍｌ−ｄｅｌ遺伝子を使用した株では、３５，００
０ユニツト／ｍｌの生産性を示し、膜結合部位を削除し
た遺伝子を移入することにより約１０倍生産性の高いト
ランスフォーマント（ｄｅｌＭ−１５と命名）を得るこ
とができた。さらにこのトランスフォーマント（ｄｅｌ
Ｍ−１５）は、５％牛脂児血清含有ＲＰＭＩ　　１６４
０培地で１ケ月間安定的に３５，０００ユニツト／　ｍ
　ｌの生産性を示した。 〈実施例９〉 ＣＨＯ細胞Ｍｌ−ｄａｌ　　１４−２を５％牛脂児血清
を含むＤ−ＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％Ｃ○２イ
ンキュベーター内で２週間培養した２（１３）１７）ル
の培養上清を限外濾過ＩＩＩ（ミリボア社）で２リフド
ルに濃縮後、終濃度が４ＭになるようＮａＣ１を添加し
、４Ｍ　ＮａＣ１を含むｐＨ７，０の１（１３）１阿リ
ン酸ナトリウム緩衝液で平衡化したＰｈｅｎｙｌ−３ｅ
ｐｈａｒｏｓｅ　　ＣＬ−４Ｂ　（ファルマシア社、　
５×５０ｃｍ）に吸着させた。これをｐＨ７，０の１０
冒にリン酸ナトリウム緩衝液（以下緩衝液Ａと略する）
に４Ｎ〜ＯＭのＮａＣ１濃度で作製したリニアグラジェ
ントで溶出させ、ＮａＣ１濃度１．５Ｍ　〜１．０Ｍ　
（７）間で溶出したＭ−Ｃ８Ｆ活性画分を得た。この活
性画分をＹＭ−１０膜（アミコン社）で１０ｍ１に濃縮
し、８０膜ＭのＮａｃｌを含む緩衝液Ａで平衡化した５
ｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ−２５（ファルマシア社、　９．
１　ｍ　ｌ　）で脱塩し、同緩衝液で平衡化したＤＥＡ
Ｅ−Ｃｅ　１１　ｕ　１　。 ｆｉｎｅ（生化学工業社、２．５ｘｌＯｃｍ）に吸着サ
セ、　０．１〜０．５Ｍ　のＮａＣ１ｍ度で作製したリ
ニアグラジェントで溶出させた。ＮａＣ１１度０．１２
〜０．１５Ｍの間で溶出した、Ｍ−ＣＳＦ活性画分をＹ
Ｍ−ｌ　ｏｇで６ｍｌに濃縮後、１１衝液Ａで平衡化し
た　Ｕｌ　ｔｒｏｇｅｌ　　ＡｃＡ３４　（ＩＢＦ　　
バイオチク＝ｙり社、　２．５×９２ｃｍ）でゲルｉ！
！過し、Ｍ−ＣＳＦ活性画分を得た。 この活性画分を７ｍｌに濃縮し、終濃度４Ｍになるよう
ＮａＣ１を添加し、４ＭのＮａＣ１を含む緩衝液Ａで平
衡化した　Ｐｈｅｎｙｌ−８ｕｐｅｒ。 ｓｅ（ファルマシア社、　１．ＯＸｌｏｃｍ）に吸着さ
せ、ＮａＣ１濃度４Ｍ〜ＯＭで作製したリニアグラジェ
ントで溶出した。ＮａＣ１濃度２　？Ｉ　−１？ｌで溶
出したＭ−ＣＳＦ活性画分を２００倍量のｗＩｗ液Ａに
対して透析し、最終精製標品とした。この精製標品につ
いて、緩衝液Ａで平衡化した　５ｕｐｅｒｏｓｅ　　１
２　（ファルマシア社、　１．ＯＸ３０ｃｍ）による分
子量測定を行ったところ、約７０．０００ダルトンであ
り、　　５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結
果　２８．０００±２．０００ダルトンのやや幅広なバ
ンドを示した。さらに、この精製標品の総量をＵＶ吸収
で測定した結果。 Ａ　２１１１１＝　０．２６であった。また、軟寒天コ
ロニ法におけるＭ−ＣＳＦ活性の測定の結果、１゜２×
１０　”ｕ　／　Ａ　２＠ｅであった。 〈実施例１０＞ 実施例９で得られた標品２５０μｇ　（９ｍｌ）を透析
チューブに入れ、　５ｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ−１００　
をまぶして約１ｍｌにまで濃縮した後、２００ｍ１の０
．ＩＭ　β−メルカプトエタノール、　１％　ＳＤＳ、
１０％グリセロールを含む６５■にトリス緩衝液ｐＨ６
，８に対して２４時間透析し、ＳＨ基の還元と蛋白の変
性を行った。この透析内液に終濃度１５０＋ａＭになる
ようモノヨード酢酸を加え、室温に３０分放置してＭｌ
−ＣＳＦを還元カルボキシメチル化した。これを０．０
（１３）％　ＰＥＧ　で平衡化したイオン交換樹脂　Ａ
Ｇ１１Ａ８（バイオ−ラッド社、　０．６×１０ｃｍ）
と　５ｅｐｈａｄｅｘ　　Ｇ−５０（ファルマシア社、
　１．０×９．０ｃｍ）をつないだカラムにより脱塩、
脱ＳＤＳを行った。ＥＬＩＳＡにより同定した還元カル
ボキシメチル化Ｍｌ−Ｃ８Ｆ両分を凍結乾燥後、１ｍｌ
の１０ｅＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＤＴＴ、０．１％ＳＤＳ
、１％Ｔｒｉｔｏｎ　　Ｘ−１００を含む１００ｍＮリ
ン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，０に溶解し、　ＩＵのＮ
−Ｇｌｙｃａｎａｓｅ　　（ジエンザイム社）を添加し
、３７℃で２４時間反応させＭｌ−Ｃ８Ｆの糖鎖を切断
した。この脱１１Ｍ　１−ＣＳＦをＴＭＣ−ＰＡＣＫ　
　ＡＰ−３０３３００ＡＯＤＳ　（山村化学社）に吸着
させ、０〜７０％のアセトニトリル濃度のリニアグラジ
ェントで溶出した。　６０％アセトニトリル濃度で溶出
された脱糖鎖Ｍｌ−ＣＳＦを凍結乾燥し、４ｏｏμｌの
１０ｍＭ　　リン酸ナトリウム！ｌ＠液ｐ　Ｈ７，０に
溶解し、５μｇのエンドプロテイナーゼ　Ｌｙｓ−Ｃ（
ベーリンガー・マンハイム社）を加えて３７℃で１７時
間反応を行った。この反応系を、２０ｍＭＣａＣｌ２を
含む５０口Ｍ＃酸緩衝液ｐ　Ｈ５，０で平衡化した５０
０μｌのアンヒドロトリプシンアガロース（宝酒造社）
に供し、素通り画分を分取した。この素通り画分に含ま
れるＣ末端ペプチドをＴＳＫＯＤＳ　　１２０Ｔ　（）
−ソー社）に吸着させ、　５〜６０％のアセトニトリル
濃度のリニアグラジェントで溶出し、アセトニトリル濃
度２５％で溶出されるＣ末端ペプチドを分取した。これ
をＰＳＧ−１自動アミノ酸シークエンサー（島津製作所
社）で解析した結果、−Ａｓｎ−Ｘ　−Ａｓｐ−＾５ｎ
−５ｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｘ　−５ｅｒ−３
ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−Ａｒｚ−Ｇｌ
ｎ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−であった。 対照として、ネイティブ型Ｍｌ−ＣＳＦ遺伝子を持つＣ
ＨＯ細胞Ｍｌ−ＣＳＦ高生産株から、上記実施例９およ
び実施例１０で示した方法によりＭｌ−ＣＳＦを精製し
、エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ切断で生じたＣ末端
ペプチドのアミノ酸配列を決定した結果、−＾ｓｎ−Ｘ
−＾５ｐ−Ａｓｎ−５ｅｒ−Ｐｈｅ−＾１ａ−Ｇｌｕ−
Ｘ　−５ｅｒ−５ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌ
ｕ−＾ｒｇ−Ｇｉｎ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−５ｅｒ
−であり、　Ｍｌ−ｄｅｌ１４−２細胞の生産するＭ−
ＣＳＦ活性を有するポリペプチドがネイティブ型Ｍｌ−
ＣＳＦと一敗するこ

【図面の簡単な説明】

第１図は本願のＭＳ−ＣＳＦ活性の安定的高発現組換え
ヘクターを示し、第２図はＭｌ−ｄｅｌに対応するアミ
ノ酸配列を示し、第３図はＭ１ｄｅ＋であるＤＮＡを示
し、第４図は手順説明図をそれぞれ示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ｄｈｆｒマーカーＤＮＡを有する発現ベクターに
   おいて、そのｄｈｆｒマーカーＤＮＡ部位に置換して導
   入したＭ−ＣＳＦ−ｄｅｌｅｔｅＤＮＡ（但し、Ｍ−Ｃ
   ＳＦ−ｄｅｌｅｔｅＤＮＡは、Ｍ１−ＣＳＦのシグナル
   ペプチドを含むポリペプチドのＮ末端から１８０番のア
   ミノ酸を含むＣ末端側のアミノ酸残基の一部または全部
   が欠損したポリペプチドをコードするＤＮＡを示す）と
   、ｄｈｆｒマーカーＤＮＡとを有し、且つ、該Ｍ−ＣＳ
   Ｆ−ｄｅｌｅｔｅＤＮＡと該ｄｈｆｒマーカーＤＮＡと
   が少なくとも１．５ｋｂｐ離れていることを特徴とする
   Ｍ−ＣＳＦ活性ポリペプチドの安定的高発現組換えベク
   ター。 （２）Ｍ−ＣＳＦ活性の安定的高発現組換えベクターが
   、第１図で示されるＭ−ＣＳＦ−ｄｅｌｅｔｅＤＮＡを
   含む組換えベクターである請求項（１）記載の組換えベ
   クター。 （３）Ｍ−ＣＳＦ−ｄｅｌｅｔｅＤＮＡが、第２図で示
   されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡである請求項（
   ２）記載の組換えベクター。 （４）Ｍ−ＣＳＦ−ｄｅｌｅｔｅＤＮＡが、第３図で示
   されるＤＮＡである請求項（２）記載の組換えベクター
   。 （５）ｄｈｆｒマーカーＤＮＡを有する発現ベクターに
   おいて、そのｄｈｆｒマーカーＤＮＡ部位に置換して導
   入したＭ−ＣＳＦ−ｄｅｌｅｔｅＤＮＡ（但し、Ｍ−Ｃ
   ＳＦ−ｄｅｌｅｔｅＤＮＡは、Ｍ１−ＣＳＦのシグナル
   ペプチドを含むポリペプチドのＮ末端から１８０番のア
   ミノ酸を含むＣ末端側のアミノ酸残基の一部または全部
   が欠損したポリペプチドをコードするＤＮＡを示す）と
   、ｄｈｆｒマーカーＤＮＡとを有し、且つ、該Ｍ−ＣＳ
   Ｆ−ｄｅｌｅｔｅＤＮＡと該ｄｈｆｒマーカーＤＮＡと
   が少なくとも１．５ｋｂｐ離れているＭ−ＣＳＦ活性ポ
   リペプチドの安定的高発現組換えベクターを導入し動物
   細胞を形質転換せしめたＭ−ＣＳＦ活性ポリペプチドの
   安定的高発現形質転換動物細胞。 （６）Ｍ−ＣＳＦ活性ポリペプチドの安定的高発現組換
   えベクターが、第１図で示されるＭ−ＣＳＦ−ｄｅｌｅ
   ｔｅＤＮＡを含む組換えベクターである請求項（５）記
   載の形質転換動物細胞。 （７）Ｍ−ＣＳＦ−ｄｅｌｅｔｅＤＮＡが、第２図で示
   されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡである請求項（
   ６）記載の形質転換動物細胞。 （８）Ｍ−ＣＳＦ−ｄｅｌｅｔｅＤＮＡが、第３図で示
   されるＤＮＡである請求項（６）記載の形質転換細胞。 （９）動物細胞が、ｄｈｆｒ＾−の特性を有する動物細
   胞である請求項（５）記載の形質転換動物細胞。 （１０）ｄｈｆｒ＾−の特性を有する動物細胞が、ＣＨ
   Ｏｄｈｆｒ＾−細胞である請求項（５）記載の形質転換
   動物細胞。 （１１）形質転換動物細胞が、Ｍ１−ｄｅｌ１４−２「
   微工研菌寄第１１７５６号（ＦＥＲＭＰ−１１７５６）
   」である請求項（５）記載の形質転換動物細胞。 （１２）動物細胞が、ＴＲＣ−２９Ｒ細胞である請求項
   （５）記載の形質転換動物細胞。（１３）ｄｈｆｒマー
   カーＤＮＡを有する発現ベクターにおいて、そのｄｈｆ
   ｒマーカーＤＮＡ部位に置換して導入したＭ−ＣＳＦ−
   ｄｅｌｅｔｅＤＮＡ（但し、Ｍ−ＣＳＦ−ｄｅｌｅｔｅ
   ＤＮＡは、Ｍ１−ＣＳＦのシグナルペプチドを含むポリ
   ペプチドのＮ末端から１８０番のアミノ酸を含むＣ末端
   側のアミノ酸残基の一部または全部が欠損したポリペプ
   チドをコードするＤＮＡを示す）と、ｄｈｆｒマーカー
   ＤＮＡとを有し、且つ、該Ｍ−ＣＳＦ−ｄｅｌｅｔｅＤ
   ＮＡと該ｄｈｆｒマーカーＤＮＡとが少なくとも１．５
   ｋｂｐ離れているＭ−ＣＳＦ活性ポリペプチドの安定的
   高発現組換えベクターを、動物細胞に導入して形質転換
   せしめ、メトトレキセート含有培地にて培養して高メト
   トレキセート耐性株を選択して得られるＭ−ＣＳＦ活性
   ポリペプチドの安定的高発現形質転換動物細胞を、培地
   にて培養することを特徴とするＭ−ＣＳＦ活性ポリペプ
   チドの安定的高発現製造法。 （１４）Ｍ−ＣＳＦ活性ポリペプチドの安定的高発現組
   換えベクターが、第１図で示されるＭ−ＣＳＦ−ｄｅｌ
   ｅｔｅＤＮＡを含む組換えベクターである請求項（１２
   ）記載の製造法。 （１５）Ｍ−ＣＳＦ−ｄｅｌｅｔｅＤＮＡが、第２図で
   示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡである請求項
   （１４）記載の製造法。 （１６）Ｍ−ＣＳＦ−ｄｅｌｅｔｅＤＮＡが、第３図で
   示されるＤＮＡである請求項（１４）記載の製造法。 （１７）動物細胞が、ｄｈｆｒ＾−の特性を有する動物
   細胞である請求項（１３）記載の製造法。 （１８）ｄｈｆｒ＾−の特性を有する動物細胞が、ＣＨ
   Ｏｄｈｆｒ＾−細胞である請求項（１３）記載の製造法
   。 （１９）形質転換動物細胞が、Ｍ１−ｄｅｌ１４−２「
   微工研菌寄第１１７５６号（ＦＥＲＭＰ−１１７５６）
   」である請求項（１３）記載の製造法。 （２０）動物細胞が、ＴＲＣ−２９Ｒ細胞である請求項
   （１３）記載の製造法。