JPH04154794A - アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびそれを有効成分とするｈｉｖ活性阻害剤 - Google Patents

アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびそれを有効成分とするｈｉｖ活性阻害剤

Info

Publication number
JPH04154794A
JPH04154794A JP27723990A JP27723990A JPH04154794A JP H04154794 A JPH04154794 A JP H04154794A JP 27723990 A JP27723990 A JP 27723990A JP 27723990 A JP27723990 A JP 27723990A JP H04154794 A JPH04154794 A JP H04154794A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
atom
sequence
internucleotide
formula
double bond
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP27723990A
Other languages
English (en)
Inventor
Hiroshi Takaku
洋 高久
Yoshikazu Suzuki
義和 鈴木
Hideo Hosaka
英生 保坂
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
YODOGAWA SEIYAKU KK
Original Assignee
YODOGAWA SEIYAKU KK
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by YODOGAWA SEIYAKU KK filed Critical YODOGAWA SEIYAKU KK
Priority to JP27723990A priority Critical patent/JPH04154794A/ja
Publication of JPH04154794A publication Critical patent/JPH04154794A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドおよびそれを有効成分とする１１１■活性阻害剤に関
する。
さらに詳細には、ＩＩＩＶ活性阻害作用を有するＡＩＤ
Ｓ　　（ａｃｑｕｉｒｅｄ　　！ｍ５ｕｎｏｄｅｆｌｃ
ｌｅｎｃｙ　　５ｙｎｄｒｏ＋ａｃ。
後天性免疫不全症候群）の治療薬として有用なアンチセ
ンスオリゴデオキシリボヌクレオチドに関する。
［従来の技術・発明が解決しようとする課題３１９８５
年にＮ１１ｌ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ
ｅ　ｏｒＩｌｃａｌｔｈ。
米国国立衛生研究所）においてイン・ビトロてそのＩｉ
ｌＶ（ｈｕｍａｎ　１ｓｓｕｎｏｄｅｆｉｃｌｅｎｃｙ
　ｖｉｒｕｓ、ヒト免疫不全症ウィルス）増殖抑制作用
が証明され、ＡＩＤＳの治療薬として世界で唯−認めら
れたアジドチミジン（＾ＺＴ）の作用機序は、＾ＺＴが
１１１■の逆転写酵素と強力に競合し、かつＤＮＡ生合
成の際に誤って取り込まれて鎖長形成を停止させる点に
ある。しかしながら、＾ＺＴは重篤な骨髄障害や消化器
系および神経系症状を伴う。また日本で研究が進められ
ているレンチナン （Ｌｅｎｔｌｎａｎ）は、１１１　Ｖ感染に伴う、細胞
性免疫の機能低下の改善により治療効果を図るものであ
るが、ＡＩＤＳの免疫不全にはいまだ不明な点が多く、
さらに感染しているＴ細胞を免疫増強剤が刺激すること
によって、潜伏していたプロウィルスの発現を促進させ
る危険性がある。その他にも最初の感染経路であるとこ
ろのＩＩ　Ｉ　ＶがＣＤ４分子と結合するのを阻止する
ことを目的としてモノクローナル・抗イデイオタイプ抗
体が治療に応用されるべく研究が始められているなど旧
■のライフサイクルの様々な段階でのブロック試薬の開
発が行なわれている。
レトロウィルス科に属するＩＩＩＶは、その被感染体で
あるヒトの分子生物的サイクルと異なる逆転写現象を利
用して、すなわちＲＮＡを鋳型として自身のもつ逆転写
酵素を利用して自己増殖のためのＤＮＡを生合成して増
殖し、ＡＩＤＳ発症の経過をたどる。その逆転写現象を
町害すれば、ヒトの生理作用に何ら影響を及ぼさずに１
１１■だけが死滅することになる。近年、その逆転写現
象に注目し、化学合成したオリゴヌクレオチドによる転
写阻害効果が報告されている（ピー・シー・ザメクニク
、エム・エル・ステフエンソン、プロシーデインゲス・
オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス命オ
ブ・ザ拳ユナイテ・ソドΦステート拳オブ・アメリカ（
Ｐ、Ｃ。
ＺａｇｅｃｎｌｋＳＭル、　５ｔｅｐｈｅｎｓｏｎ　、
　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ。
Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、７５巻、１号、２８０頁（１９７８
）およびピー・シー・ザメクニク、ジェー・グツドチャ
イルド、ワイ・タグチ、ピー・ニス・サリン（Ｐ。
Ｃ，Ｚａｍｅｃｎｌｋ、　Ｊ、Ｇｏｏｄｃｈｌｌｄ　、
　Ｙ、Ｔａｇｕｃ旧、ｐ、ｓ。
５ａｒｌｎ）、プロシーデインゲス・オブ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテ
ッド・ステート・オブ・アメリカ、８３巻、６号、４１
４３頁（１９８Ｂ）参照）。そこで、本発明者らは、相
補的な化学合成オリゴデオキシヌクレオチドを投与して
、イン・ビトロでウィルス遺伝子であるＲＮＡとハイブ
リッド二重鎖を形成させて、その部位で逆転写酵素の読
み取りを中断させることにより、プロウィルスとなるＤ
ＮＡの生合成を阻止することを目的として鋭意研究を重
ねた結果、生体でのプロウィルス合成に際して複製時の
促成因子である転写トランス活性遺伝子ｔａｔ−１ｌ　
ｌ内で中央にスプライス受容部位を含むＲＮ＾シーケン
ス　５３４８−５３６７　’ｉ−９＝ゲツトシーケンス
とするアンチセンスデオキシリボヌクレオチドを見出し
、本発明を完成するにいたった。
［課題を解決するための手段］ 本発明は、塩基配列： ｄ−Ａｐ（ｓ）Ｃｐ（ｓ）Ａｐ（ｏ）Ｃｐ（ｏ）Ｃｐ（
ｏ）Ｃｐ（ｏ）Ａｐ（ｏ）−Ａｐ（ｏ）Ｔｐ（ｏ）Ｔｐ
（ｏ）Ｃｐ（ｏ）Ｔｐ（ｏ）Ｇｐ（ｏ）Ａｐ（ｏ）Ａｐ
（ｏ）−Ａｐ（ｏ）Ａｐ（ｏ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｇ
（配列中、ｐ（ｓ）はインターヌクレオチド部分のリン
原子に二重結合により結合した原子がイオウ原子である
ことを表わし、ｐ（ｏ）はインターヌクレオチド部分の
リン原子に二重結合により結合した原子が酸素原子であ
ることを表わす）で示されるアンチセンスオリゴデオキ
シリボヌクレオチドを提供する。
また、本発明は塩基配列： ｄ−Ａｐ（ｘ）Ｃｐ（ｃ）Ａｐ（ｘ）Ｃｐ（ｘ）Ｃｐ（
ｘ）Ｃｐ（ｘ）Ａｐ（ｘ）−Ａｐ（ｘ）Ｔｐ（ｘ）Ｔｐ
（ｘ）Ｃｐ（ｘ）Ｔｐ（ｘ）Ｃｐ（ｘ）Ａｐ（ｘ）Ａｐ
（ｘ）−Ａｐ（ｘ）Ａｐ（ｘ＞Ｔｐ（ｘ）Ｇｐ（ｘ）Ｇ
（配列中、ｐ（ｘ）は独立にｐ（ｓ）またはｐ（０）で
あり、ｐ（ｓ）はインターヌクレオチド部分のリン原子
に二重結合により結合した原子がイオウ原子であること
を表わし、ｐ（ｏ）はインターヌクレオチド部分のリン
原子に二重結合により結合した原子が酸素原子であるこ
とを表わす）で示されるアンチセンスオリゴデオキシリ
ボヌクレオチドを有効成分として含有する１（１■活性
阻害剤を提供する。
［実施例］ ・　本発明のアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオ
チドのターゲットシーケンスである遺伝子配列部位（第
１図参照）は、約１万の塩基からなる全１１１ＶＲＮ＾
配列において何回か繰り返されている配列であり、他の
遺伝子配列部位でも塩基対結合を形成してＩＩ　Ｉ　Ｖ
活性阻害効果がみられる可能性がある（エル・ラトナー
、ダブリュ・ハゼルチン、アール・バタルカ、ケー中ジ
エーφリバク、ビー争スターシヒ、ニスφエフ・ジョセ
フス、イー・アール・トラン、ジエー・ニーφラフアル
スキー、イー拳ニー拳ファイルホーン、ケー・バラマイ
スター、エル・イワノフ、ニス・アール・ペテウェイ会
ジュニア、エム・エル−ピアソン、ジエー・ニー中ロー
テンバーガー、ティーΦニス・ババス、ジエー中グライ
エブ、エフ・ティー・チャン、アール・シー・ガロ、エ
フ・ダブリュ・スタール、ネイチ＋　−（Ｌ、Ｒａｔｎ
ｅｒ　、Ｗ、Ｈａｓｅｌｔｌｎｅ　ＳＲ，Ｐａｔａｒｃ
ａ　。
Ｋ、Ｊ、ｌ、Ｉｖａｋ　、　Ｂ、５ｔａｒｃｉｃｈ、　
Ｓ、Ｆ、Ｊｏｓｅｐｈｓ　ＳＥ、Ｒ。
Ｄｏｒａｎ　％　ＬＡ、Ｒａｆａｌｓｋｌ、　Ｅ、＾Ｊ
ｈｌｌｅｈｏｒｎ　ｓ　Ｋ。
ｒ３ａｕｍｅｌｓｔｏｒ、　Ｌ、１ｖａｎｏ「ｆ　ＳＳ
、Ｒ，Ｐｅｔｔｅｗａｙ　Ｊｒ　。
Ｍ、Ｉ、、　Ｐｅａｒｓｏｎ、　Ｊ、＾、１．ａＵｔｅ
ｎｂｅｒｇｏｒ、Ｔ、Ｓ、Ｐａｐａｓ　。
Ｊ、　Ｇｈｒａｙｅｂ、　Ｎ、Ｔ、Ｃｈａｎｇ　、　Ｒ
，Ｃ，Ｇａ１ｌｏ　、　ＰＪ。
５Ｌａａｌ　、Ｎａｔｕｒｅ）　３１３巻、２４号、２
７７頁（１９８５）参照）。
また、本発明のアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレ
オチドは、アプローチにイオウ酸化によってインターヌ
クレオチド部分にホスホロチオエート結合が導入される
ことで、生体内の分解酵素の認識をのがれて生理的に安
定なオリゴマーとなり、ＩＩＩＶ活性阻害効果が持続的
である。
本発明の化合物の合成法はとくに限定されないが、たと
えばつぎのような方法で製造される。
以下にキャツピング剤として一般式（１）：（式中、Ｒ
’　！；ｉ　−Ｃ（ＣＸ　　）　　、−ＣＩｌ　（ＣＸ
３）　２または−Ｃ１１２ＣＸ３（式中、Ｘはハロゲン
原子を示す）を表わし、Ｒ２は炭素数１〜６のアルキル
基を示す）で表わされる新規なボスファイト化合物を用
いた、ホスファイト法による本発明の化合物の合成法を
示す。
なお、前記の化合物（１）は、たとえば以下のような方
法でえられる。
Ｒ０＋１＋　　Ｒ０ＰＣＩ　　→（ＲＯ）　　Ｉ’ＯＲ
２（ｍ　　　（ＩＩ＋）　　　　　　（１）■ （式中、ＲおよびＲ２は前記と同じ） すなわちアルコール類（１１）とアルキルホスホロジク
ロリダイト（ＩＩ＋）を反応させることにより前記化合
物（１）かえられる。アルコール類を化合物（ＩＩ＋）
に対して３〜４当量加え、トリエチルアミン、ピリジン
などの三級塩基３〜４当量の存在下、エーテル、テトラ
ヒドロフラン　（ＴＩＩＦ）　、アセトン、ジクロロメ
タンなどの反応化合物に対して不活性な溶媒中で室温（
１０〜３５℃）で２〜５時間反応を行なうことにより高
収率でホスファイト化合物（１）かえられる。
一般に市販されている架橋ポリスチレン、シリカゲル、
多孔質ガラスなどの担体に適当なヌクレオシドを固定し
た固相担体を反応カラムに入れ、トリクロロ酢酸、ジク
ロロ酢酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸の塩化メチレ
ン溶液で脱トリチル化反応後、塩化メチレン、アセトニ
トリルなどを用いてよく洗浄を行なう。そして固相担体
を減圧乾燥させたのち、ターゲットシーケンスに適う塩
基をもったあらかじめ調製されたヌクレオチドユニット
を、固定されているヌクレオシドの３〜５倍当量、好ま
しくは３倍当量反応管中にいれ、再度減圧乾燥する。そ
こに３０〜５０倍当量、好ましくは３０倍当量の活性化
剤をたとえばアセトニトリル、ＴＩＩＰ　、塩化メチレ
ンなどの溶媒とともにカラムに導入して縮合反応を行な
う。
ついでアセトニトリル、塩化メチレンなどの溶媒で洗浄
したのち、反応管中に、前記のキャツピング剤および第
３級アミンを加え、未反応の５−水酸基および固相坦体
のキャッピングを行なう。固定されているヌクレオシド
に対して、前記のキャツピング剤は５０〜ＩＨ倍当量、
好ましくは６０〜８０倍当量、活性化剤としての第３級
アミンは３〜６倍当量、好ましくは４〜５倍当量加えら
れる。用いられる第３級アミンとして、たとえばピリジ
ン、トリエチルアミン、ジメチルアミノピリジン、Ｎ−
メチルイミダゾールなどがあげられる。このキャッピン
グ操作で用いられる溶媒は反応化合物に対して不活性で
あればとくに限定されないが、たとえばジクロロメタン
、エーテル、ＴＩＩＦ　、アセトン、ジオキサン、アセ
トニトリルなどがあげられる。反応温度は５〜４０℃、
好ましくは３０〜３７℃である。反応時間は５〜２０分
間、好ましくは１０〜１５分間である。
再びアセトニトリル、塩化メチレンなどの溶媒で洗浄し
、続いてホスフェートとして生体において基本的かつ安
定な状態とするために酸化反応を行なう。酸化剤として
は、ヨウ素がもつとも一般的であり、０．０５〜０．１
Ｍの、好ましくは０．１Ｍの１　とＴＩＩＰ　、ピリジ
ン、１１２０などとの混合液を加えて１〜２分間、好ま
しくは１分間程度の処置を行なう。また、イオウによる
酸化をたとえばつぎのように行なって、インク−ヌクレ
オチド部分にホスホロチオエート結合を導入することも
可能である。
キャッピング操作終了後に反応管中にイオウを３〜１０
重量％、好ましくは、４〜５重量％含有する二硫化炭素
とピリジンなどの第３級アミンとの混合液を入れ、さら
に前記混合液に対して３〜１０容量％、好ましくは４〜
５容量％のトリエチルアミンを加えて１０〜３０分間、
好ましくは１５〜２０分間のイオウ酸化操作を行なう。
ただし雰囲気を整えてイオウ酸化が充分に進行し、かつ
また縮合反応に影響を及はさないためにイオウ酸化の前
後で二硫化炭素と前記第３級アミンとの混合液によって
充分な洗浄を行なって残留イオウを除去する。ついで、
えられた酸化物をアセトニトリル：ピリジン−１：　１
　（Ｖ／Ｖ）、アセトニトリル、塩化メチレンなどを用
いてよく洗浄を行なう。
前記の一連の操作を目的のオリゴヌクレオチドかえられ
るまで繰り返す。なお、前記の酸化反応は目的の塩基配
列のシーケンスを合成してから最後に行なってもよい。
そのときの反応時間は１時間程度で充分である。
ついで５°末端のジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）Ｍお
よび塩基部アミノ基の保護基の脱保護反応をたとえばつ
ぎのようにして行なう。濃アンモニア水で５５〜６０℃
、好ましくは５５℃で４〜ＩＯ時間、好ましくは６〜７
時間処理して、生成物を固相担体から脱離させ、かつ、
塩基部の脱保護を行なう。つぎにジメトキシトリチル基
の結合したものだけを分離するためにアセトニトリルヲ
２０〜５０％含むＴＥＡＡ　（トリエチルアンモニウム
アセテート）溶出溶媒により、逆相Ｃ１８オープンカラ
ム（たとえば、ウォーターズ社製）で精製し、ピークに
ＤＭＴｒ基の発色を確認した部分を分取する。つぎに、
このＤＭＴｒ基を含むオリゴマーを８０〜９０％、好ま
しくは８０％の酢酸水溶液で５〜３７℃、好ましくは２
０〜３７℃で５〜１５分間、好ましくは１０分間処理し
脱トリチル化を行ない、２０％アセトニトリルを含むギ
酸アンモニウム水溶液（ｐｌ＋６．８．０４８Ｍ　−１
，３８Ｍ　）からなるグラデイエンド溶媒を用いて、イ
オン交換ＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃで単離精製し、脱保護された
目的物であるオリゴヌクレオチドをうる。この一連の各
ステップの反応収率はいずれも９５％以上の高収率であ
る。
縮合反応で用いられるヌクレオチドユニットとして、た
とえば−服代（Ｖ）： （式中、Ｂは塩基を示す）で表わされるホスファイトユ
ニットなどがあげられ、このばあい活性化剤として、Ｎ
−メチルイミダゾール、ジメチルアミノピリジンなどの
第３級塩基が用いられる。
以下に実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが
、本発明はもとよりこれらに限定されるものではない。
実施例１ 塩基配列： ｄ−Ａｐ（ｏ）Ｃｐ（ｏ）Ａｐ（ｏ）Ｃｐ（ｏ）Ｃｐ（
ｏ）Ｃｐ（ｏ）Ａｐ（ｏ）−Ａｐ（ｏ）Ｔｐ（’ｏ）Ｔ
ｐ（ｏ）Ｃｐ（ｏ）Ｔｐ（ｏ）Ｇｐ（ｏ）Ａｐ（０）Ａ
ｐ（ｏ）−Ａｐ（ｏ）Ａｐ（ｏ）Ｔｐ（ｏ）Ｇｐ（ｏ）
Ｇ（配列中、ｐ　（ｏ）はインターヌクレオチド部分の
リン原子に二重結合により結合した原子が酸素原子であ
ることを表わす）で示されるオリゴデオキシリボヌクレ
オチド（以下、ＤＯ−２０という）の製造 （１）キャツピング剤（ビス（＋、１．１，３．８．３
−へキサフルオロ−２−プロピル）−２−プロピルポス
ファイト）の合成 窒素雰囲気下−２０’Ｃにおいて撹拌しなから三塩化リ
ン（８７１、ＩＭ）に２−プロパツール（７７１、ＩＭ
）を約１時間３０分かけて滴下した。滴下後、徐々に室
温にもどして２時間程度撹拌し、分液ロートに移して一
晩放置した。その後減圧蒸留して沸点４０〜４２℃／　
２２ｖｉ＋ｌ１ｇ　（４０”Ｃ／　２０ｍｍｌ１ｇ）留
分を分取し、イソプロビルホスポロジクロリダイ）　（
２０，１ｇ　、　０．１２５Ｍ、　１２．５　％）　カ
、ｔ　ラｈｔ：。
このイソプロビルホスホロジクロリダイト（２０，１ｇ
　、０．１２５Ｍ）を窒素雰囲気下で無水エーテル（１
００ｍｌ）に溶かし、−２０”Ｃにおいて撹拌しながら
無水エーテル（６０ｍｌ）に溶かした無水トリエチルア
ミン（０，３５Ｍ、４８．８５ｍ１）を滴下し、つぎに
無水エーテル（Ｂｏｗｌ）に溶がした１、１．１゜３．
３＋３−ヘキｆ７／ＩｚオＤ−２−フｏハ）−ル（０，
５Ｍ、５２．８ｍ１）を滴下した。徐々に室温にもどし
、１２時間程度撹拌した。その後、塩酸塩をろ別除去し
、ろ液を減圧濃縮し残渣を減圧蒸留すると沸点４６〜４
８℃／１８ｓ＊Ｉ１ｇで目的とするビス（１，１，１゜
３．３．３−へキサフルオロ−２−プロピル）−２−プ
ロピル＋　スフ　７　イト（４３，４ｇ　、　０．１０
２Ｍ、収率８２％）かえられた。
”Ｐ−ＮＯＲスヘク）　ル（ＣＤＣＩ２）　　：　１３
９．９ｆｔｐｐｍ（２）オリゴマ−２０量体の合成 ヌクレオシドが導入されたＣＰＧ（２８ｍｇ、　０．５
μＭ　、　１７．９μＭ／ｇ）を反応管にいれ、３％ト
リクロロ酢酸塩化メチレン溶液（１＋ｍ１Ｘ２）で脱ジ
メトキシトリチル化を行ない塩化メチレン（１■１×３
）で洗浄しさらにアセトニトリルで洗浄した。その後、
ＣＰＧを減圧乾燥させたのちアセトニトリルに溶解させ
たホスファイトニーニット（３００μｍ　、　０．５Ｍ
／　ｌ　）と活性化剤としてＮ−メチルイミダゾール（
６０μｍ、７５０μＭ）を反応管に入れ３００分間反応
行ったのちアセトニトリル（２ｓｌＸ５）で洗浄した。
つぎにＯ，１ＭＮ−メチルイミダゾール溶液（ＴＩＩＦ
／　１１２０　＝　３８／　２（ｖ／ｖ）中）で２分間
反応を行ない、アセトニトリル（２１×５）で洗浄した
。つぎにアセトニトリル（７５μｍ）とビス（１，１，
Ｉ、３，３．３−ヘキサフルオロ−２−プルピル−２−
プロピルホスファイト（３７，５μＨ１１１，４μｌ）
を入れ、活性化剤としてＮ−メチルイミダゾール（１８
７，５μＭＳ１５μｌ）を加え１５分間キャッピング反
応をしたのち、アセトニトリル（２ｍｌＸ５）で洗浄し
た。最後に０．１ＭＮ−メチルイミダゾール溶液（Ｔｒ
ｒＦ／　Ｉｔ２０−９８／　２（ｖ／ｖ））を加え、２
分間反応させたのち、アセトニトリル（２ｍｌｘ５）塩
化メチレン（２ｍｌｘ５）で洗浄を行ない脱ジメトキシ
トリチル化へもどる。
この一連の操作を１９回繰り返した。
マニュアル合成によりえられた２０量体に０．１Ｍヨウ
素のＴＩＩＰ／Ｐｙ／ＩＩ。０−４４／３／３（ｖ／ｖ
）溶液（２１）を加え、室温下１時間反応させ酸化を行
なった。その後、ピリジン／アセトニトリル−１／　１
　（ｖ／ｖ）　、アセトニトリルてよく洗浄し、インタ
ーヌクレオチド部分のリン原子に二重結合により結合し
た原子がすべて酸素原子であるオリゴマ−２０量体を合
成した。
（３）オリゴマ−２０量体の脱保護・精製・構造確認 ２８％アンモニア水（２１）を加え室温下１時間処理す
ることによりＣＰＧからの切り出しを行なった。その後
、メンブランフィルタ−でＣＰＧや不溶物をろ別除去し
ろ液を減圧濃縮した。これを逆相Ｉｔ　Ｐ　ＬＣにより
、精製を行なった。溶出液としてＯ，ＩＮ−ＴＥ＾＾バ
ッファー−アセトニトリル極性（１０〜５０％）リニア
グラジェントにより１−１的物を溶出させると５°−末
端にジメトキシトリチル基を有する２０量体かえられた
。これを濃縮後、８０％酢酸水溶液（２１）を加え脱ジ
メトキシトリチル化を室温下１５分間行なったのち、エ
ーテルで洗浄した。その後逆相ＩＩ　ｒ’　Ｌ　Ｃを用
いて、０、ＩＭ）リエチルアンモニウムアセテートバッ
ファ＝（５〜４０％アセトニトリル）を用いて溶出し目
的とする２０量体（ＤＯ−２０）をえた。精製後逆相Ｉ
Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃカラムで分析した（第２図参照）。また
構造は７Ｍ尿素を含む２０％ポリアクリルアミノゲル電
気泳動（第３図参照）およびスネークベノムホスホジエ
ステラーゼとアルカリンホスファターゼによる酵素分解
（第４図参照）により２０量体を確認した。第３図にお
いてレーン１は鎖長標準としての２０量体を表わし、レ
ーン２は実施例１でえられた２０量体を表わす。スネー
クベノムホスホジエステラーゼ（３７℃、２時間）、ア
ルカリンホスファターゼ（３２℃、１時間）処理後、失
活（９０℃、３０分）させて、逆相１１ＰＩ、Ｃ（Ｃ−
１８）テ０．ＩＮ）　ＩＪエチルアンモニウムアセテー
ト（０，８％アセトニトリル）を用いて分析し、解析し
て配列確認（５ｄＣ：　３ｄＧ：　４ｄＴ：　８ｄ＾−
４，８７コ３．００：４．２５＋　７．８１）を行なっ
た。
実施例２ 塩基配列： ｄ−Ａｐ（ｓ）Ｃｐ（ｓ）Ａｐ（ｏ）Ｏｐ（ｏ）Ｃｐ（
ｏ）Ｃｐ（ｏ）Ａｐ（ｏ）−Ａｐ（ｏ）Ｔｐ（ｏ）Ｔｐ
（ｏ）Ｃｐ（ｏ）Ｔｐ（ｏ）Ｇｐ（ｏ）Ａｐ（ｏ）Ａｐ
（ｏ）−Ａｐ（ｏ）Ａｐ（ｏ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｇ
（配列中、ｐ（ｓ）はインターヌクレオチド部分のリン
原子に二重結合により結合した原子がイオウ原子である
ことを表わし、ｐ　（ｏ）は前記と同し）で示されるオ
リゴデオキシリボヌクレオチド（以下、ＤＳＯ３−２０
という）の製造酸化反応を除いて実施例１と同様に操作
を行なった。酸化反応は以下のように行なった。
２量体、３量体、１９ｆｉ体および２０℃体の各キャッ
ピング操作終了後に反応管中にイオウを５重量％含有す
る二硫化炭素：ビリジン−１：　ｌ　（ｖ／Ｖ）を入れ
、さらに混合液に対して５容量％のトリエチルアミンを
加えて１５分間のイオウ酸化操作を行なった。なお、イ
オウ酸化の前（２１て２回）後（２１で４回）で二硫化
炭素：ピリジン−１：　ｌ　（ｖ／ｖ）によって充分な
洗浄を行なって残留イオウを除去した。それ以外のイン
ターヌクレオチドの部分は、０．１Ｈの　＋２−ＴＩＩ
Ｆ：ビリジン：１１２０−４４　：　３：３（ｖ／ｖ）
を加えて１分間の処理を行ないホスファイトをホスフェ
ートへと酸化した。
エラレタ目的トスル２ｏ量体（Ｄｓｏｓ−２０）ラフＭ
尿素を含む２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
り確認した（第５図参照）。第５図おいてレーン１は実
施例２でえられた２ｏ量体を表わし、レーン３は鎖長標
準としての２０量体を表わす。また、０．０２５Ｍ　Ｉ
□−ピリジン溶液により脱硫操作を施し、０ＤＳ−１１
ＰＬｃ　（０，ＩＮ　）　！Ｊ　−Ｔ−チＬ　７　ンモ
ニウムアセテート（１０〜３０％アセトニトリル）で精
製してノーマルな２ｏ量体をえた。実施例１と同様にス
ネークベノムポスポジェステラーゼとアルカリンホスフ
ァターゼによる酵素分解ののち、ＴＳＫゲルオリゴ−針
刃ラム上でＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃにより解析して配列確認（
５ｄＣ：　３ｄＧ：　４ｄＴ：　８ｄＡ−４，５２：　
２．１８　：　４．２１　：　７．５０）を行なった（
第６図参照）。
実施例３ 塩基配列： ｄ−Ａｐ（ｓ）Ｃｐ（ｓ）Ａｐ（ｓ）Ｃｐ（ｓ）Ｃｐ（
ｓ）Ｃｐ（ｓ）Ａｐ（ｓ）−Ａｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｔｐ
（ｓ）Ｃｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａｐ（ｓ）Ａｐ
（ｓ）−Ａｐ（ｓ）Ａｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｇ
（配列中、ｐ（ｓ）は前記と同じ）で示されるオリゴデ
オキシリボヌクレオチド（以下、ＤＳ−２０という）の
製造 酸化反応を除いて実施例１と同様に操作を行なった。酸
化反応は以下のように行なった。
各ステップのキャッピングののちにイオウを５重量％含
有する二硫化炭素：ピリジン（容量比１：１）を入れ、
さらに混合液に対して５容量％のトリエチルアミンを加
えて１５分間のイオウ酸化をおこなった。
えられた目的とする２ｏ量体（ＤＳ−２０）を実施例２
と同様にしてゲル電気泳動により確認した（第５図参照
）。第５図においてレーン２は実施例３でえられた２０
量体を表わし、レーン３は鎖長標準としての２０量体を
表わす。また、実施例２と同様にして配列確認Ｃ３ｄＣ
：　３ｄＧ：　４ｄＴ：８ｄ＾−５，４１：　２．０９
　：　５．０２　：　７．５９）を行なった（第７図参
照）。
試験例１ 抗１１１ｖ活性試験 えられた合成プローブについて、山口大学医学部教授山
本直樹氏および吉田修氏に依頼して抗１ｉ　１　Ｖ、活
性試験を行なった。ＭＴ−４細胞に１１１■（１０１−
０，０１）を感染（３７℃、１時間）させ調製（２０ｘ
　１０’　ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）　した。実施例１〜３で
えられたオリゴマーを、ｌＯ％ＦＢＳ　　（胎児ウシ血
清）添加ＲＰＭＩ−１６４０（ＲＯ３ＷＩＥＬＬ　ＰＡ
ＲＫ　ＭＥＭＯＲＩＡＩ。
ｌＮ５ＴＩＴＵＴｒＥ製、ジー・イー・ムーア（Ｇ、Ｅ
、Ｍｏｏｒｅ）ら、ｊ、＾１Ｍ、＾、肚、５９１　　（
１９５７））で溶解させ０．４５．フィルターで浄過滅
菌したのち、２倍段階希釈して各濃度に調製した。なお
、オリゴマー自身の細胞への影響をみるために非感染細
胞についても同様の操作を行ない、活性試験を行なった
。感染４日目に、トリバンブルー染色法、間接蛍光抗体
法によってその阻害効果をｎ１定した。実施例１．２お
よび３でえられたそれソｔ’ＬノアＦ’）ゴ７−　ＤＯ
−２０、ＤＳＯ８−２０およびＤＳ−２０についての結
果をそれぞれ第８図、第９図および第１０図に示す。第
８図〜第１Ｏ図の棒グラフにおいて、斜線を付したもの
は旧Ｖ感染細胞を、斜線を付していないものは１１１■
非感染細胞を表わす。
その結果により本発明のオリゴマー〇〇−２０およびＤ
ＳＯ８−２０は２５μＸ以上になると活性が見られるこ
とがわかった。さらに本発明のオリゴマー　ＤＳ−２０
は５μＨ以上で活性が見られ、とくにすぐれた活性を示
すことが明らかになった。
本発明のＩＩ　Ｉ　Ｖ活性阻害剤の投与方法としては、
経口、経腸または非経口的投与方法のいずれをも選ぶこ
とができる。具体的な製剤形態としては、たとえば錠剤
、カプセル剤、細粒剤、シロップ剤、坐薬、軟膏剤、注
射剤などをあげることができる。
本発明の旧Ｖ活性阻害剤の製剤の担体としては、経口、
経腸、その他非経口的に投与するために適した有機また
は無機の固体または液体の、通常は不活性な薬学的担体
材料が用いられる。
具体的には、たとえば結晶性セルロース、ゼラチン、乳
糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム。
タルク、植物性および動物性脂肪ならびに油、ガム、ポ
リアルキレングリコールとなどをあげることができる。
本発明の化合物は製剤中に０．２〜１００％含ませるこ
とができる。
本発明のＩｔ　ｌ　Ｖ活性阻害剤は、一般に所望の作用
が副作用を伴なうことなく達成される投与量で投与され
る。
［発明の効果］ 本発明の安定なアンチセンスオリゴデオキシリボヌクレ
オチドは、Ａ１０３発症の原因となる）Ｉ　Ｉ　Ｖの活
性を有効に阻害しうる。
【図面の簡単な説明】
ｍ１図はＩＩＩＶＲＮ＾のｔａｔ　ｇｅｎｅ部位（スプ
ライシング部位）を示す図面である。第２図は実施例１
でえられたＤＯ−２０の２５４ｎｓ＋における逆相ＩＩ
　Ｐ　Ｌ　Ｃによるクロマトグラムである。第３図は実
施例１でえられたＤｏ−２０の２０％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動による電気泳動パターンを示す図面であ
る。第４図は実施例１てえられたＤＯ−２０をスネーク
ベノムホスホジエステラーゼとアルカリンホスファター
ゼにより酵素分解したのちえられた生成物の２５４ｎｓ
におけるＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃによるクロマトグラムである
。第５図は実施例２でえられたＤＳＯ３−２０および実
施例３でえられたＯ３−２０の２０％ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動による電気泳動パターンを示す図面であ
る。第６図は実施例２でえられたＤＳＯ３−２０をスネ
ークベノムホスホジエステラーゼとアルカリンホスファ
ターゼにより酵素分解したのちえられた生成物の２５４
ｒｖにおけるＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃによるクロマトグラムで
ある。第７図は実施例３でえられたＯ８−２０をスネー
クベノムホスホジエステラーゼとアルカリンホスファタ
ーゼにより酵素分解したのちえられた生成物の２５４　
ｎ＋ｇ＋こおける旧）１、Ｃによるクロマトグラムであ
る。第８図〜第１０図はそれぞれＤＯ−２０、ＤＳＯ３
−２０、ＤＳ−２０について抗ＩＩ　Ｉ　Ｖ活性を示す
棒グラフである。 ２２図 時　　　間　　（分） 第３図 才４図 時間（分ン 才５図 ２６団 時間（分） オフ図 時　間　（分） オ８図 囲　Ｈ工Ｖ感染細胞 濃　　　　度　　　（ＬＩＭ） 牙９図 ロＨ工■感染細胞 濃　　　　度　　（ＪＪＭ） 才１ｏ図 ＺＨ工Ｖ感染細胞 濃　　　　度　　　（ＪＪＭ）

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １　塩基配列： ｄ−Ａｐ（ｓ）Ｃｐ（ｓ）Ａｐ（ｏ）Ｃｐ（ｏ）Ｃｐ（
    ｏ）Ｃｐ（ｏ）Ａｐ（ｏ）−Ａｐ（ｏ）Ｔｐ（ｏ）Ｔｐ
    （ｏ）Ｃｐ（ｏ）Ｔｐ（ｏ）Ｇｐ（ｏ）Ａｐ（ｏ）−Ａ
    ｐ（ｏ）Ａｐ（ｏ）Ａｐ（ｏ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｇ
    （配列中、ｐ（ｓ）はインターヌクレオチド部分のリン
    原子に二重結合により結合した原子がイオウ原子である
    ことを表わし、ｐ（ｏ）はインターヌクレオチド部分の
    リン原子に二重結合により結合した原子が酸素原子であ
    ることを表わす）で示されるアンチセンスオリゴデオキ
    シリボヌクレオチド。 ２　塩基配列： ｄ−Ａｐ（ｘ）Ｃｐ（ｘ）Ａｐ（ｘ）Ｃｐ（ｘ）Ｃｐ（
    ｘ）Ｃｐ（ｘ）Ａｐ（ｘ）−Ａｐ（ｘ）Ｔｐ（ｘ）Ｔｐ
    （ｘ）Ｃｐ（ｘ）Ｔｐ（ｘ）Ｃｐ（ｘ）Ａｐ（ｘ）−Ａ
    ｐ（ｘ）Ａｐ（ｘ）Ａｐ（ｘ）Ｔｐ（ｘ）Ｇｐ（ｘ）Ｇ
    （配列中、ｐ（ｘ）は独立にｐ（ｓ）またはｐ（ｏ）で
    あり、ｐ（ｓ）はインターヌクレオチド部分のリン原子
    に二重結合により結合した原子がイオウ原子であること
    を表わし、ｐ（ｏ）はインターヌクレオチド部分のリン
    原子に二重結合により結合した原子が酸素原子であるこ
    とを表わす）で示されるアンチセンスオリゴデオキシリ
    ボヌクレオチドを有効成分として含有するＨＩＶ活性阻
    害剤。 ３　アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドの塩
    基配列が ｄ−Ａｐ（ｏ）Ｃｐ（ｏ）Ａｐ（ｏ）Ｃｐ（ｏ）Ｃｐ（
    ｏ）Ｃｐ（ｏ）Ａｐ（ｏ）−Ａｐ（ｏ）Ｔｐ（ｏ）Ｔｐ
    （ｏ）Ｃｐ（ｏ）Ｔｐ（ｏ）Ｇｐ（ｏ）Ａｐ（ｏ）−Ａ
    ｐ（ｏ）Ａｐ（ｏ）Ａｐ（ｏ）Ｔｐ（ｏ）Ｇｐ（ｏ）Ｇ
    （配列中、ｐ（ｏ）は前記と同じ）で示される請求項２
    記載のＨＩＶ活性阻害剤。 ４　アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドの塩
    基配列が ｄ−Ａｐ（ｓ）Ｃｐ（ｓ）Ａｐ（ｏ）Ｃｐ（ｏ）Ｃｐ（
    ｏ）Ｃｐ（ｏ）Ａｐ（ｏ）−Ａｐ（ｏ）Ｔｐ（ｏ）Ｔｐ
    （ｏ）Ｃｐ（ｏ）Ｔｐ（ｏ）Ｇｐ（ｏ）Ａｐ（ｏ）−Ａ
    ｐ（ｏ）Ａｐ（ｏ）Ａｐ（ｏ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｇ
    （配列中、ｐ（ｓ）およびｐ（ｏ）は前記と同じ）で示
    される請求項２記載のＨＩＶ活性阻害剤。 ５　アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドの塩
    基配列が ｄ−Ａｐ（ｓ）Ｃｐ（ｓ）Ａｐ（ｓ）Ｃｐ（ｓ）Ｃｐ（
    ｓ）Ｃｐ（ｓ）Ａｐ（ｓ）−Ａｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｔｐ
    （ｓ）Ｃｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ａｐ（ｓ）−Ａ
    ｐ（ｓ）Ａｐ（ｓ）Ａｐ（ｓ）Ｔｐ（ｓ）Ｇｐ（ｓ）Ｇ
    （配列中、ｐ（ｓ）は前記と同じ）で示される請求項２
    記載のＨＩＶ活性阻害剤。
JP27723990A 1990-10-15 1990-10-15 アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびそれを有効成分とするｈｉｖ活性阻害剤 Pending JPH04154794A (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP27723990A JPH04154794A (ja) 1990-10-15 1990-10-15 アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびそれを有効成分とするｈｉｖ活性阻害剤

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP27723990A JPH04154794A (ja) 1990-10-15 1990-10-15 アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびそれを有効成分とするｈｉｖ活性阻害剤

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH04154794A true JPH04154794A (ja) 1992-05-27

Family

ID=17580760

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP27723990A Pending JPH04154794A (ja) 1990-10-15 1990-10-15 アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびそれを有効成分とするｈｉｖ活性阻害剤

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JPH04154794A (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994002499A1 (en) * 1992-07-27 1994-02-03 Hybridon, Inc. Oligonucleotide alkylphosphonothioates
EP0653439A3 (de) * 1993-11-12 1995-10-25 Hoechst Ag Stabilisierte Oligonucleotide und deren Verwendung.

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1994002499A1 (en) * 1992-07-27 1994-02-03 Hybridon, Inc. Oligonucleotide alkylphosphonothioates
EP0653439A3 (de) * 1993-11-12 1995-10-25 Hoechst Ag Stabilisierte Oligonucleotide und deren Verwendung.
EP1182206A3 (de) * 1993-11-12 2002-08-21 Hoechst Aktiengesellschaft Stabiliserte Oligonucleotide und deren Verwendung

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7818563B2 (ja) オリゴヌクレオチド組成物およびその方法
RU2132853C1 (ru) Способ идентификации продуктов из смеси, продукт, полученный при идентификации, способ получения смеси и способ совместного получения катализирующей нуклеиновой кислоты и продукта
Shibahara et al. Inhibition of human immunodeficiency virus (HIV-1) replication by synthetic oligo-RNA derivatives
Guzaev Solid‐phase supports for oligonucleotide synthesis
JPH09509663A (ja) 新規ホスホルアミデートおよびホスホロチオアミデートオリゴマー化合物
EP0414607B1 (fr) Séquence d'oligonucléotides anti-sens, anti-ARN messager du TNF alpha, procédé de préparation, application à titre de médicaments et compositions pharmaceutiques
JPH06505704A (ja) 改変ヌクレオシド間結合
CA3232070A1 (en) Oligonucleotide compositions and methods thereof
JPH03500530A (ja) 新規な両親媒性核酸接合体
EP0748331A1 (en) Modified oligonucleotide duplexes having anticancer activity
CA2033330A1 (en) Steroid modified oligonucleotides
EP0406309A1 (en) Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
JP3676388B2 (ja) 非ヌクレオチド基を有する３′−誘導されたオリゴヌクレオチド類似体、その製法および使用
Debart et al. Synthesis and base-pairing properties of the nuclease-resistant α-anomeric dodecaribonucleotide α-[r (UCUUAACCCACA)]
Conlon et al. Solid-phase synthesis and structural characterisation of phosphoroselenolate-modified DNA: a backbone analogue which does not impose conformational bias and facilitates SAD X-ray crystallography
JPS6219096A (ja) ポリヌクレオチドの製造方法
CA1319119C (en) Nucleic acid chelate conjugate as therapeutic and diagnostic agents
WO1995031434A1 (en) Complementary dna and toxins
EP0739899B1 (en) Novel oligoribonucleotide derivatives and application thereof to antiviral agents
JPH04154794A (ja) アンチセンスオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびそれを有効成分とするｈｉｖ活性阻害剤
JPH02503911A (ja) ポリ（デオキシリボヌクレオチド）、及びその医薬組成物、用途及び製造方法
Diaz et al. Synthesis of oligodeoxynucleotides containing 2-substituted guanine derivatives using 2-fluoro-2′-deoxyinosine as common nucleoside precursor
JPH0291088A (ja) ホスファイトおよびヌクレオシド‐３’‐ホスファイト誘導体およびこれを用いるオリゴヌクレオチドの合成法
IL87582A (en) Immunoproximi catalysts and the process for their preparation
US5688940A (en) Linker for immobilization, modification and subsequent release of oligomers with a terminal hydroxyl group