JPH04175657A - 免疫学的凝集反応試薬の製造方法及び免疫学的凝集反応粒子溶解用液 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、保存安定性に富む免疫学的凝集反応試薬、並
びに長期保存安定性を目的とした免疫学的凝集反応粒子
の溶解方法及びそれに用いる免疫学的凝集反応粒子溶解
液に関する。

〔従来の技術及びその問題点〕

臨床検査の分野では、近年種々の疾患を血清学的に診断
することが重要視されている。そして、この診断のため
には、抗原あるいは抗体を正確迅速かつ簡便に定量する
ことが極めて重要な課題となっている。そこて、抗原あ
るいは抗体を不溶性担体に感作して抗体あるいは抗原を
検出する凝集反応が、操作が簡単であることに加え、反
応が肉眼的に観察しやすいことから臨床検査や研究分野
で広く用いられる。

かかる凝集反応は原理的には一種類であるか、不溶性担
体の種類によって分類される。即ち、不溶性担体として
は、ラテックス、カオリン、炊米、有機無機複合粒子な
どの非生物学的粒子、動物赤血球、細菌菌体なとの生物
学的粒子、などが用いられる。

生物学的粒子は、それぞれの大きさか一定であるという
利点はあるものの生物の種類によって粒子の大きさは決
まっており、目的に応じた任意の大きさの粒子を得るこ
とはできない。たとえば動物赤血球は、大きさの一定し
た担体であるが赤血球表面に固有の抗原を有しており、
非特異的反応を起こして目的とする凝集反応に誤まりを
与える可能が大きい。

したがって、最近では化学的に安定て、それ自身抗原活
性を有しないなとの利点のある非生物学的粒子を使用す
る傾向にあるが、抗原あるいは抗体か、密に吸着されに
くいという欠点かある。例えば、保存のために抗原ある
いは抗体を感作した非生物学的粒子を凍結乾燥し、長期
保存した後、該粒子を分散溶液状態に復元すると、抗原
あるいは抗体か粒子から遊離しやすくなり、復元溶液状
態で長期間保存することが困難であった。

〔問題を解決するための手段〕

本発明者等は、不溶性担体上へ抗原あるいは抗体を感作
した免疫学的凝集反応粒子（以下、凝集反応粒子という
）を分散溶液中で性能を維持しながら、長期的に保存す
ることを目的として鋭意研究を重ねた結果、タンニン酸
の存在により、該凝集反応粒子の性能が長期的に維持さ
れることを見い出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、免疫学的凝集粒子、蛋白質、タンニン
酸及び水を含有してなることを特徴とする保存安定性に
優れた免疫学的凝集反応試薬である。

また、本発明は、乾燥した免疫学的凝集反応粒子を水及
び蛋白質を主成分とする溶解液を用いて溶解するに際し
て、溶解時にタンニン酸を添加することを特徴とする免
疫学的凝集反応粒子の溶解方法である。

さらに、本発明は、水、蛋白質、及びタンニン酸を含有
してなることを特徴とする免疫学的凝集反応粒子溶解液
である。

本発明において、溶解とは乾燥した免疫学的凝集反応粒
子を分散し、溶液状態に復元することを言い、溶解液と
はこの復元に用いる分散液のことを言う。

本発明において用いられる凝集反応粒子とは、不溶性担
体に抗原あるいは抗体を感作して調製したものである。

不溶性担体は特に限定されず、例えば、ラテックス、カ
オリン、炊米、有機無機複合粒子、ゼラチン粒子などの
非生物学的粒子、あるいは動物赤血球、細菌菌体などの
生物学的粒子が挙げられる。しかし、生物学的粒子は、
該表面に固有の抗原を有するものもあり゛、抗体との間
で非特異的反応を起こしやすく、さらに、動物の個体間
でばらついてしまって常に一定品質の血球を入手するこ
とが困難である。したがって、化学的に安定で、それ自
身抗原活性を有しないなとの利点のある非生物学的粒子
を使用する方が好ましい。

特に有機無機複合粒子は人工担体である為、該担体表面
を目的に応じて化学的処理でき、また極めて非特異的反
応が起こりにくいので好適に用いられる。

かかる不溶性担体に感作する物質としては免疫学的凝集
反応を起こすものてあれば良く、該物質として抗原及び
抗体か挙げられる。

抗原は、抗体を産生させて、体液性免疫や細胞性免疫を
誘発する物質であれば特に制限されず例えば、蛋白、糖
蛋白、脂質蛋白、脂質、核酸等が挙げられる。

抗体は、抗原と特異的に結合する活性をもつものであれ
ば特に制限されずＩｇＧ、ｒｇＭ、［ｇＡ、ＩｇＤ、　
ＩｇＥ等が挙げられる。

抗原又は抗体を不溶性担体上へ感作して得る凝集反応粒
子の製造方法は何んら制限されないが、一般に、リン酸
緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、生理食塩水な
どの緩衝液中に、前記不溶性担体と、担体１ｇ当たり０
．０１ｍｇ〜５０ｍｇの抗原あるいは担体を混合して感
作する。通常、感作は室温で約１時間放置すればよいが
、抗原を感作する場合は、４〜５６°Ｃの広い温度範囲
で感作が可能である。

上記方法て製造された凝集反応粒子を溶液状態で保存す
る場合は、蛋白質、タンニン酸とともに水媒体中に分散
して保存する。これら全成分を含有した分散液を、免疫
学的凝集反応試薬（以下、凝集反応試薬ともいう）と言
い、診断に供される。

凝集反応試薬中の凝集反応粒子の濃度は、通常０．３〜
１重量％である。下限値より小さいと、凝集像が不鮮明
となり判定できない。上限値より大きいと感度が悪くな
る。

タンニン酸は、凝集反応粒子を液体中で長期にわたり性
能安定性よく保存する効果を有する。該タンニン酸とし
ては、植物中に分布する多数のフェノール性水酸基をも
つ芳香族化合物であれば特に制限はされない。通常、縮
合性タンニン酸と加水分解型タンニン酸とに分類される
が加水分解型タンニン酸の使用がより好ましい。凝集反
応試薬中に含有されるタンニン酸の濃度は抗原あるいは
抗体によって異なるが、担体１ｇに対し１〜１０００ｍ
ｇのタンニン酸を存在させることが好ましい。

１ｍｇ以下であれば、タンニン酸を存在させた効果がな
く　１１０００ｒｎ以上だと非特異的反応となってしま
う。

蛋白質は凝集反応を起こすために必要な成分であり、抗
原、抗体反応を阻害しないものであれば特に制限されな
い。該タンパク質として、例えば、牛血アルブミン、牛
脂児血清、ヤギ血清、ウサギ血清、ゼラチン、スキムミ
ルク、等が挙げられる。

蛋白質の使用量は、通常、担体１ｇ当り１−１０００ｍ
ｇである。

水としては、超純水あるいは蒸留水を使用することが好
ましく、更には、例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、
グリシン緩衝液、生理食塩水などのｐＨ４〜９の緩衝液
を用いるほうが、抗原、抗体反応が速やかに進行するの
でより好ましい。散水は担体１ｇ当たり１００〜５００
ｇ用いる。

凝集反応粒子を、より長期にわたって保存するためには
乾燥状態で保存する。乾燥方法としては何んら制限され
ないが凍結乾燥方法が好適である。

かかる乾燥した凝集反応粒子は、臨床検査に用いる前に
、水および蛋白質を主成分とした溶解液を用いて分散状
態に、復元される。この溶解時にタンニン酸を添加する
ことか必要であり、タンニン酸の存在により、復元され
た凝集反応粒子を分散、含有する凝集反応試薬は溶液状
態でさらに安定に長期保存可能となる。

乾燥した凝集反応粒子の復元時にタンニン酸を添加する
方法はいかなる手段を採用しても良いが、溶解とほぼ同
時に添加しなければ、本発明の効果か得られない。従っ
て、溶解液中にあらかじめタンニン酸を溶かしておく態
様がその効果及び操作の簡便さの点で好ましい。

あらかじめタンニン酸を溶解液中に溶解させておくにし
ろ復元時に添加するにしろ、その使用量は前述の通り最
終凝集反応試薬中の不溶性担体Ｉｇ当たり１〜ｌＯＱＯ
ｍｇになるように用いる。

又、復元に用いる溶解液中の水、及び蛋白質の含有量も
、前述の通り、それぞれ不溶性担体１ｇ当たりｌ　〜１
０００ｍｇ、及び１００〜５００ｇとなるように構成さ
れておればよい。

本発明の凝集反応試薬、あるいは溶解液中には、更に無
機塩及び必要に応じてアミノ酸塩を含有しても良い。

無機塩を添加することにより、抗原、抗体反応が速やか
に起こる傾向が認められる。該無機塩としては、塩化ナ
トリウム、アジ化ナトリウム、塩化カリウム、塩化リチ
ウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどが挙げら
れる。通常、これらの無機塩は、凝集反応試薬、又は溶
解液中に０．Ｏ１〜１．５モル／Ｉ！の範囲で用いられ
る。０．Ｏ１モル／ｌより少ないと、添加した効果はな
く、１．５モル／ｌ．より多いと抗原抗体反応を阻害す
る傾向かある。

被検体によっては、抗原抗体反応は起こるが、凝集像が
崩れてしまう場合がある。この凝集像の崩れを防止する
ために、アミノ酸塩を添加することができる。該アミノ
酸塩としては例えば、Ｌ−挙げられる。通常、これらの
アミノ酸塩は、凝集反応試薬、又は溶解液中に０．５〜
１０重量％の範囲で用いられる。上限値を超えると凝集
反応が行こらない。

〔作用及び効果〕

タンニン酸を、あらかじめ凝集反応試薬中に、あるいは
乾燥保存した凝集反応粒子の溶解、復元時に存在させる
ことにより、凝集反応粒子を長期間水媒体中て、その性
能を低下させることなく保存可能となった。

凝集反応粒子の保存安定性か向上した理由は明確ではな
いが、タンニン酸には蛋白質を収れんする作用があるの
で、担体に感作された抗原あるいは抗体か、水媒体中で
収れんされて担体からはずれにくくなっているものと推
測される。

（実施例） 本発明を以下に示す実施例により具体的に説明するが、
本発明はその実施例により何ら限定されるものではない
。

実施例 凝集反応試薬として免疫学的梅毒診断薬を作成するため
に、まず梅毒の病原菌であるトレボネーマ・バリダムｌ
Ｘｌ０’個を１ｍｐの生理食塩水に分散させた。次いで
、このトレボネーマ・パリダムが分散した生理食塩水を
超音波破砕器により２００Ｗて３０分間破砕した。この
破砕されたトレボーマ・パリダムを含んだ生理食塩水に
、０．（１２）Ｍリン酸緩衝液に有機無機複合粒子（徳
山曹達株式会社製、商品名：イムノティクルス■ＨＤＰ
）２．５重量％を分散させた液を等量加えて１時間室温
で放置し、次いで０．（１２）Ｍ　ＩＪン酸緩衝液で２
回洗浄し凍結乾燥して、トレボネーマ・パリダム由来の
抗原が感作された有機無機複合粒子からなる凝集反応粒
子を調製した。その後６カ月間、４°Ｃで放置した。牛
血アルブミンを５％含んでなる０、　（１２）Ｍリン酸
緩衝液に、凝集反応粒子１ｇ当たり５０ｍｇ量になるよ
うにタンニン酸（和光純薬製）を加えて粒子溶解液を調
製した。この粒子溶解液に、上記期間保存した凝集反応
粒子を凝集反応試薬基準で５重量％濃度となるように溶
解して凝集反応試薬を調合した。

次に、この免疫学的梅毒診断薬の保存性を以下に示すよ
うに測定した。

被検液として梅毒患者血清を用い、該血清の１０倍希釈
液を原液として、倍数希釈法に従ってリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，２）を用いて希釈を行い、各希釈液をマイクロタ
イタープレートのウェル中に２５μβずつ加えた。次い
で前記調合した凝集反応試薬を該ウェル中に２５μβず
つ加えて行き、３分間の攪拌の後室温下で放置した。３
０分後、粒子の凝集状態を観察し、被検液で粒子リング
が明らかに大きく、且つリング内に凝集粒子が一様に広
がっているのが認められるウェルにおける希釈液の最高
希釈倍数を求め鋭敏性を評価した。

前記調合した凝集反応試薬を室温下で７日間及び３０日
間放置した後、同様の操作を行い、鋭敏性を評価した。

第１表にこれらの結果を示した。

第　　１　　表 比較例１ 実施例】でタンニン酸を加えないこと以外はすべて同様
に行った。第２表にこれらの結果を示した。

第２表 実施例２ 抗原をＢ型肝炎ウィルス由来の“ものに変え、凝集反応
粒子１ｇに対して０．（１２）ｇ量になるようにタンニ
ン酸を加えた粒子溶解液を用い、更に被検液としてＢ型
肝炎患者血清を用い且つ該血清を原液として用いたこと
以外はすべて実施例１と同様に行った。第３表にこれら
の結果を示した。。

第　　３　　表 比較例２ タンニン酸を加えないこと以外はすべて実施例２と同様
に行った。第４表にこれらの結果を示した。

第　　４　　表 実施例３ 免疫学的凝集反応試薬として免疫学的成人Ｔ細胞白血病
診断薬を作成する為に成人Ｔ細胞白血病ウィルス由来の
抗原を０．１重量％のドデシル硫酸ナトリウムを含む生
理食塩水１ｍ４７当たり１００μｇ溶解した。該溶解液
に０．（１２）Ｍリン酸緩衝液に対して有機無機複合粒
子（徳山曹達株式会社製、商品名：イムノティクルス＠
ＨＤＰ）２．５を量％を分散させた液を等量加えて１時
間室温で放置し次いで０．（１２）Ｍリン酸緩衝液で２
回洗浄して成人細胞白血病ウィルス由来の抗原が感作さ
れた有機無機複合粒子を調製した。次いで、上清を取り
除いた後、抗原感作粒子１ｇに対して０．０８　ｇ量に
なるようにタンニン酸を加えた０、５％ウサギ血清を含
んでなる０、　（１２）Ｍ　ＩＪン酸緩衝液を用いて、
該抗原感作粒子濃度が０．５重量％となるように調製し
、凝集反応試薬とした。

被検液として、成人Ｔ細胞白血病患者血清を用い、該血
清を原液として倍数希釈法に従って０．（１２）Ｍリン
酸緩衝液を用いた希釈を行い、各希釈液をマイクロタイ
タープレートのウェル中に２５μｌずつ加え、次いて前
記調製した凝集反応試薬を該ウェル中に２５μβずつ加
えて、３分間の攪拌の後室温下で放置した。

３０分後粒子の凝集状態を観察し、被検液で粒子リング
が明らかに大きくリング内に凝集粒子が一様に広かって
いるのが認められるウェルにおける希釈液の最高希釈倍
数を求め鋭敏性を評価した。

前記調合した凝集反応試薬を室温下で７日間及び３０日
間放置した後、同様の操作を行い、鋭敏性を評価した。

第５表 比較例３ タンニン酸を加えないこと以外はすべて実施例３と同様
に行った。第６表にこれらの結果を示す。

第６表 比較例４ タンニン酸の代わりに第７表に示す蛋白質架橋剤を用い
たこと以外は実施例１と同様の方法で行った。第７表中
、凍結乾燥状態にある凝集反応粒子を粒子溶解液で溶液
状態に復元し、３日間診断薬としての性能を維持したも
のをＯ１性能を維持しなかったものを×とした。

第７表

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）免疫学的凝集反応粒子、蛋白質、タンニン酸及び
   水を含有してなることを特徴とする保存安定性に優れた
   免疫学的凝集反応試薬。 （２）０．０１〜１．５モル／ｌの無機塩を含有する請
   求項第（１）項記載の免疫学的凝集反応試薬。 （３）無機塩が、塩化ナトリウム、アジ化ナトリウム、
   塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム及び
   塩化リチウムよりなる群から選ばれた少なくとも一種で
   ある請求項第（２）項記載の免疫学的凝集反応試薬。 （４）０．５〜１０重量％のアミノ酸塩を含有する請求
   項第（２）項記載の免疫学的凝集反応試薬。 （５）アミノ酸塩が、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、Ｌ
   −リジン塩酸塩、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩、Ｌ−アルギニ
   ン塩酸塩、及びＬ−ア スパラギン酸ナトリウムからなる群から選ばれた少なく
   とも一種である請求項第（４）項記載の免疫学的凝集反
   応試薬。 （６）免疫学的凝集反応粒子が、不溶性担体に抗原を感
   作した抗原感作粒子である請求項第（１）項〜第（５）
   項記載の免疫学的凝集反応試薬。 （７）不溶性担体が、非生物学的担体粒子である請求項
   第（６）項記載の免疫学的凝集反応試薬。 （８）タンニン酸が、縮合型タンニン酸、又は加水分解
   タンニン酸である請求項第（７）項記載の免疫学的凝集
   反応試薬。 （９）タンニン酸が、不溶性担体１ｇに対して１〜１０
   ００ｍｇ量である請求項第（８）項記載の免疫学的凝集
   反応試薬。 （１０）蛋白質が、牛血アルブミン、牛脂児血清、ヤギ
   血清、及びウサギ血清からなる群から選ばれた少なくと
   も一種の動物血清である請求項第（９）項記載の免疫学
   的凝集反応試薬。 （１１）水が、ｐＨ４〜９の緩衝液である請求項第（１
   ０）項記載の免疫学的凝集反応試薬。 （１２）乾燥した免疫学的凝集反応粒子を、水及び蛋白
   質を主成分とする溶解液を用いて溶解するに際して、溶
   解時にタンニン酸を添加することを特徴とする免疫学的
   凝集反応粒子の溶解方法。 （１３）溶解液が０．０１〜１．５モル／ｌの無機塩を
   含有する請求項第（１２）項記載の免疫学的凝集反応粒
   子の溶解方法。 （１４）無機塩が、塩化ナトリウム、アジ化ナトリウム
   、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム及
   び塩化リチウムよりなる群から選ばれた少なくとも一種
   である請求項第（１３）項記載の免疫学的凝集反応粒子
   の溶解方法。 （１５）溶解液が０．５〜１０重量％のアミノ酸塩を含
   有する請求項第（１３）項記載の免疫学的凝集反応粒子
   の溶解方法。 （１６）アミノ酸塩が、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、
   Ｌ−リジン塩酸塩、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩、Ｌ−アルギ
   ニン塩酸塩及びＬ−アスパラギン酸ナトリウムよりなる
   群から選ばれた少なくとも一種である請求項第（１５）
   項記載の免疫学的凝集反応粒子の溶解方法。（１７）免
   疫学的凝集反応粒子が、不溶性担体に抗原を感作した抗
   原感作粒子である請求項第（１２）の項〜第（１６）項
   記載の免疫学的凝集反応粒子の溶解方法。 （１８）不溶性担体が、非生物学的粒子である請求項第
   （１７）項記載の免疫学的凝集反応粒子の溶解方法。 （１９）タンニン酸が、縮合型タンニン酸又は加水分解
   タンニン酸である請求項第（１８）項記載の免疫学的凝
   集反応粒子の溶解方法。 （２０）タンニン酸が、不溶性担体１ｇに対して１〜１
   ０００ｍｇ量である請求項第（１９）項記載の免疫学的
   凝集反応粒子の溶解方法。 （２１）蛋白質が、牛血アルブミン、牛脂児血清、ヤギ
   血清及びウサギ血清よりなる群から選ばれた少なくとも
   一種の動物血清である請求項第（２０）項記載の免疫学
   的凝集反応粒子の溶解方法。 （２２）水がｐＨ４〜９の緩衝液である請求項第（２１
   ）項記載の免疫学的凝集反応粒子の溶解方法。 （２３）水、蛋白質及びタンニン酸を含有してなること
   を特徴とする免疫学的凝集反応粒子溶解液。 （２４）０．０１〜１．５モル／ｌの無機塩を含有する
   請求項第（２３）項記載の免疫学的凝集反応粒子溶解液
   。 （２５）無機塩が、塩化ナトリウム、アジ化ナトリウム
   、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム及
   び塩化リチウムよりなる群から選ばれた少なくとも一種
   である請求項第（２４）項記載の免疫学的凝集反応粒子
   溶解液。 （２６）０．５〜１０重量％のアミノ酸塩を含有する請
   求項第（２４）項記載の免疫学的凝集反応粒子溶解液。 （２７）アミノ酸塩が、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、
   Ｌ−リジン塩酸塩、Ｌ−ヒスチジン塩酸塩、Ｌ−アルギ
   ニン塩酸塩及びＬ−アスパラギン酸ナトリウムよりなる
   群から選ばれた少なくとも一種である請求項第（２６）
   項記載の免疫学的凝集反応粒子溶解液。 （２８）タンニン酸が、縮合型タンニン酸又は加水分解
   タンニン酸である請求項第（２３）項〜第（２７）項記
   載の免疫学的凝集反応粒子溶解液。 （２９）蛋白質が、牛血アルブミン、牛脂児血清、ヤギ
   血清及びウサギ血清よりなる群から選ばれた少なくとも
   一種の動物血清である請求項第（２８）項記載の免疫学
   的凝集反応粒子溶解液。 （３０）水が、ｐＨ４〜９の緩衝液である請求項第（２
   ９）項記載の免疫学的凝集反応粒子溶解液。