JPH04178400A - 生理活性物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、生理活性物質、該生理活性物質の製造方法、
該生理活性物質を産生する細胞株の培養上清および該生
理活性物質を有効成分とする医薬組成物に関する。　本
発明の生理活性物質は、巨核球−血小板系に作用するの
で、特に医療の分野で有用である。

〈従来の技術〉 生体を循環している血液中には、赤血球、白血球、リン
パ球、血小板等の細胞が存在し、それぞれ固有の機能を
分担して、生体の恒常性の維持を司っている。　これら
の血液細胞か生体内でどのように分化し、成熟し、血液
中に出現するのかという問題の解明は、長年、血液学分
野での大きな研究テーマであったか、近年になって、各
種血液細胞が１種類の多機能性造血幹細胞より分化、成
熟すること、および、その分化、成熟過程に生体内液性
因子が関与していることが明らかとなった。　これら液
性因子は、血球系細胞の減少を伴なう疾患の治療剤とし
ての応用が期待されるが、現在までに、これらの液性因
子のうち、エリスロポイエチン、Ｇ−Ｃ３Ｆ、ＧＭ−Ｃ
ＳＦ、Ｍ−Ｃ３Ｆ、各種インターロイキン等の因子か！
＃離され、その−部は、赤血球系、白血球系、リンパ球
系に対する分化、成熟因子として、医薬品として応用さ
れ始めている。

ところで、巨核球−血小板系は、他の血球系に比べて研
究が遅れていたか、これについても、最近、ＩＬ−６が
血小板の前駆細胞である巨核球の成りハを促進すること
か報告された（Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ　ｌ５ｈｉｂａｓｈ
ｉ等、　Ｐｒｏｃ、　ＮａｔｌＡｃａｄ、　Ｓｃｉ、　
ＬＩＳＡ、Ｖｏｌ、８６　、ｐ、　ｐ、　　５９５３〜
５９５７．１９８９および丁ｏｓｈｉｙｕｋｉＩｓｈｉ
ｂａｓｈｉ　等、　　Ｂｌｏｏｄ、Ｖｏｌ、　　７４．
　ｐ、　　ｐ１２４１〜１２４４．１９８９）。　　し
かし、ＩＬ−６は、多岐に亘る作用を示し、その１つと
して、生体内での急性期反応蛋白質として、炎症の惹起
に深く関わっていることが知られているので、ＩＬ−６
を医薬品として使用した場合には、強力な副作用を伴な
うことが危惧される。　従って、上記ＩＬ−６以外の物
質であって、巨核球−血小板系に対して分化、成熟、増
殖を促進する生理活性物質の！＃離か望まれている。

〈発明が解決しようとする課題〉 本発明の目的は、巨核球−血小板系の分化、成熟および
／または増殖を促進する生理活性物質を提供することに
ある。

本発明の他の目的は、該生理活性物質の製造方法、およ
び、該生理活性物質を産生ずる細胞株ＫＨＭ−５Ｍの培
養上清を提供することにある。

本発明のざらに他の目的は、該生理活性物質を有効成分
として含有することを特徴とする医薬組成物を、巨核球
および／または血小板減少を伴なう疾患や、巨核球およ
び／または血小板機能異常を伴なう疾患の治療あるいは
予防剤として提イ共することにある。

〈課題を解決するための手段〉 本発明者等は、巨核球−血小板系に対し、その分化、成
熟、あるいは増殖を促進する生理活性物質を明らかにす
るべく、鋭意研究を重ねてきた。　その結果、本発明者
等は、ヒト由来細胞株ＫＨＭ−５Ｍの培養上清中に上記
活性が見出されることを知見したので、該培養上清中か
ら、巨核球−血小板系に対する活性を指標として目的の
生理活性物質を精製し、その性状を明らかにし、本発明
を完成させたものである。

すなわち、本発明の第一の態様は、巨核球系細胞に対し
、アセチルコリンエステラーゼ産生を促進する作用を有
することを特徴とする生理活性物質である。

該生理活性物質として、マウス巨核球系細胞株Ｌ８０５
７に対し、アセチルコリンエステラーゼ産生を促進する
作用を有するものが好ましい。

該生理活性物質として、非還元下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
で測定される分子量か約１９ｋＤ〜約３１ｋＤであるも
のが好ましい。

また、該生理活性物質として、下記ａ）〜ｄ）の性質の
うちの１つ以上を有するものが好ましい。

ａ）１％ＳＤＳによる３７℃、６０分間の処理で活性か
残存する。

ｂ）０．０５％トリフルオロ酢酸１５０％アセトニトリ
ルによる２５℃、６０分間の処理で活性が残存する。

ｃ）７Ｍ尿素による２５℃、１８０分間の処理で活性が
残存する。

ｄ）ｐＨ２〜１２における２５℃、２４０分間の処理で
活性か残存する。

さらに、該生理活性物質として、ＫＨＭ−５Ｍ細胞株培
養土清中にその存在か確認されるものが好ましい。

そして、本発明の生理活性物質は、巨核球−血小板系に
対して、その分化、成熟、増殖のうちのいずれか１つ以
上を促進する活性を有するものであることが好ましい。

また、本発明の生理活性物質は、ヒト由来であるのが好
ましく、ヒト由来細胞株ＫＨＭ−５Ｍにより産生きれる
ものであるのかさらに好ましい。

本発明の生理活性物質は、以下に示すアミノ酸配列を有
するものであるのが好ましく、該アミノ酸配列中のＸが
ＣｙｓまたはＳｅｒであるアミノ酸配列を有するもので
あるのがさらに好ましい。

Ｇｌｙｔｅｕ　　Ｇｌｕ　　　Ｘ　　　Ａｓｐ　　Ｇｌ
ｙ　　Ｌｙｓ　　ＶａｌＡｓｎ　　Ｉｌｅ　　　Ｘ　　
　Ｘ　　ｔｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ｇｌｎ　　ＰｈｅＰｈｅ
　　Ｖａｌ　　　Ｘ　　　Ｐｈｅ　　Ｌｙｓ　　Ａｓｐ
　　Ｉｌｅ　　Ｇｌｙ（Ｘは、アミノ酸が特定されない
ことを示す。　また、４箇所のＸは、互いに同じであっ
ても異なっていてもよい。） 本発明の第二の態様は、下記の工程のうちの少なくとも
１つを実施することを特徴とする、木、発明の第一の態
様の生埋活性物質の製造方法である。

ａ）ヒト由来細胞株ＫＨＭ−５Ｍを培養する。

ｂ）ヒト由来細胞株ＫＨＭ−５Ｍの培養上清を回収する
。

Ｃ）下記より選ばわる少なくとも１つの精製方法を行な
う。

■陰イオン交換クロマトグラフィー ■陽イオン交換りロマトグラフィー ■逆相クロマトグラフィー ■疎水性クロマトグラフィー 前記各クロマトグラフィーは、各々、下記の特徴を有す
るものを使用することか好ましい。

ａ）陰イオン交換クロマトグラフィーは、ジエチルアミ
ンエチル基が導入された担体を使用する。

ｂ）陽イオン交換クロマトグラフィーは、スルホプロピ
ル基か導入された担体を使用する。

ｃ）逆相クロマトグラフィーは、ブチル基か導入された
担体を使用するか、もしくはポリスチレンジビニルヘン
セン重合体を担体として使用する。

ｄ）疎水性クロマトグラフィーは、フェニル基が導入さ
れた担体を使用する。

本発明の第三の態様は、本発明第一の態様の生理活性物
質を含有することを特徴とするヒト由来細胞株ＫＨＭ−
５Ｍの培養上清である。

本発明の第四の態様は、本発明第一の態様の生理活性物
質を有効成分とすることを特徴とする医薬組成物である
。

以下に、本発明の内容を詳細に説明する。

本発明第一の態様の生理活性物質は、巨核球系細胞に対
し、アセチルコリンエステラーセ産生を促進する作用を
有することを特徴とする特許 株に対し、アセチルコリンエステラーセ産生を促進する
作用を有するものが好ましい。

アセチルコリンエステラーゼは、げつ歯頚の巨核球系細
胞が分化および／または成熟すると産生される酵素であ
るので、これは、本発明の生理活性物質が巨核球一血小
板系に対して作用することを示すものである。

また、本発明の生理活性物質として、非還元下でのＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥで測定される分子量が約１９ｋＤ〜約３１
ｋＤであるものが好ましい。

周知のように、生理活性物質の分子量は、ゲル濾過やＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ等の測定法の差異や測定に用いる担体や
分子量マーカーの種類、測定条件によって変動する。　
従って、本発明の生埋活性物質は、その分子量か限定さ
れてはいないが、非還元下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで、フ
ァルマシア　ＬＭＷ　　ｋｉｔ　　Ｅ（ファルマシア社
製フの１４．４ｋＤ、２０．１ｋＤ。

３０ｋＤ，４３ｋＤ、６７ｋＤおよび９４ｋＤの分子量
マーカーを使用して測定した場合に、分子量が約１９ｋ
Ｄ〜約３１ｋＤであるものか好ましい。

さらに、本発明の生理活性物質は、下記ａ）〜ｄ）の性
質のうちの１つ以上を有するものであるのが好ましい。

ａ）１％ＳＤＳによる３７℃、６０分間の処理で活性が
残存する。

ｂ）０．０５％トリフルオロ酢酸／５０％アセトニトリ
ルによる２５℃、６０分間の処理で活性が残存する。

ｃ）７Ｍ尿素による２５℃、１８０分間の処理で活性が
残存する。

ｄ）ｐＨ２〜１２における２５℃、２４０分間の処理で
活性が残存する。

ところで、本発明の生理活性物質は、生理活性物質一般
か存在すると予想される体液中や細胞の培養上清中に存
在すると考えられるが、物質をその存在場所でグループ
分けした場合には、特に、ＫＨＭ−ｓＭＭ！Ａ胞株培養
上清中に存在するというグループに分けられるものであ
るのかよい。

さらに、本発明の生理活性物質は、巨核球−血小板系に
対して、その分化、成熟、増殖のうちのいずれか１つ以
上を促進する活性を有するものであることが好ましい。

ここで、巨核球−血小板系に対する前記促進活性とは、
巨核球から血小板が産生されろ過程における前記活性の
みならず、巨核球もしく（士その前駆細胞に対する、分
化、成熟、増殖を促進する活性のうち、いずれか１つ以
上の活性をも包含する。

ところで、巨核球−血小板系の分化、成熱、増殖を測定
する場合には、骨髄細胞や巨核球系細胞か一般に使用さ
れている。　すなわち、被験物質をこれらの細胞に作用
させて、巨核球や血小板に特異的な蛋白質や酵素の出現
を測定する方法である。

このような用途に用いる骨髄細胞や巨核球系細胞として
は、ヒト由来細胞やマウス由来細胞か一般に知られてい
るが、マウス由来細胞を使用すれば、ヒトｒＬ−３やヒ
トＧＭ−Ｃ５Ｆなと、ヒト−マウス間て種特異性を示す
既知の液性因子の影響を排除することができる。　なか
でも、株化された、マウス巨核球系細胞株Ｌ８０５７は
有用である（日本血液学会雑誌、５１巻、３１０頁、演
題番号１８７．１９８８年）。　本細胞は、マウス巨核
球系細胞と同様に、その成熟に伴ない、アセチルコリン
エステラーセ（以後、ＡｃｈＥと略す）を産生ずるので
、細胞を染色してＡｃｈＥを産生ずる細胞数を測定する
か、もしくは産生されるＡｃｈＥ活性を分光光度計で測
定する（例えば、Ｔｏｓｈｉｒｏ　Ｎｇａｓａｗａ等、
日本血液学会雑誌、４９巻１６８Ｂ−１６９５頁、１９
８６年参照）ことにより、生理活性物質の巨核球−血小
板系に対する分化、成熟、増殖に対する効果を測定する
ことかできる。

なお、このマウス巨核球系細胞株Ｌ８０５７に関しては
、組換えヒトＩＬ−６、組換えヒトエリスロボイエチン
、マウスＩ　Ｌ−３、組換えマウスＩＬ−１に対して反
応しない旨の報告もなされている（　Ｅｘｐｅｒｉｍｅ
ｎｔａｌ　Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ。

Ｖｏｌ、１８．ｐ、５９４．演題番号１７４゜１９９０
年）。′ 本発明の生理活性物質は、その由来は限定されないが、
ヒト由来であるのが好ましい。　例えば、本発明の生理
活性物質を産生じつるヒト由来細胞の培養上清や、尿等
のヒト体液から得たもの、本発明の生理活性物質に対す
るヒト遺伝子を利用して産生させたもの等である。　な
かでも、ヒト由来細胞株ＫＨＭ−５Ｍ由来であるものか
よく、特に、ヒト由来細胞株ＫＨＭ−５Ｍの培養上清か
ら得られたものであるのがよい。

また、本発明の生理活性物質は、以下に示すアミノ酸配
列を有するものであるのかよく、特に、該アミノ酸配列
中のＸかＣｙｓまたはＳｅｒであるアミノ酸配列を有す
るものであるのがよい。

Ｇｌｙ　　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ｘ　　Ａｓｐ　　Ｇａ
ｙ　　Ｌｙｓ　　Ｖａｌ八ｓへ　　Ｉｌｅ　　　Ｘ　　
　　Ｘ　　　Ｌｙｓ　　Ｌｙｓ　　Ｇｉｎ　　ＰｈｅＰ
ｈｅ　Ｖａｌ　　、Ｘ　　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　　
ｒｌｅ　Ｇｌｙ（Ｘは、アミノ酸が特定されないことを
示す。　　また、４箇所のＸは、互いに同じであっても
異なっていてもよい。） 本発明の生理活性物質の製造方法は、特に限定されない
が、後記本発明第二の態様によって製造するのがよい。

次に、本発明第二の態様の製造方法について説明する。

本発明第二の態様は、下記の工程のうちの少なくとも１
つを実施することを特徴とする本発明第一の態様の生理
活性物質の製造方法である。

ａ）ヒト由来細胞株ＫＨＭ−５Ｍを培養する。

ｂ）ヒト由来細胞株ＫＨＭ−５Ｍの培養上清を回収する
。

Ｃ）下記より選ばれる少なくとも１つの精製方法を行な
う。

■陰イオン交換クロマトグラフィー ■陽イオン交換りロマトグラフィー ■逆相クロマトグラフィー ■疎水性クロマトグラフィー 本発明では、必ずしも上記工程全てを実施する必要はな
い。　上記工程のうちの少なくとも１つの工程に、必要
に応じて他の工程を加えた本発明の生理活性物質の製造
方法も、本発明の方法に包含される。

ここで、前記各工程について、順次述べる。

前記ａ）のヒト由来細胞株ＫＨＭ−５Ｍの培養工程は、
当該細胞が増殖しつる培養条件にて行なえばよい。

すなわち、ヒト由来細胞株ＫＨＭ−５Ｍを増殖させるの
に好適な濃度の血清や増殖因子、例えはウシ胎児血清や
インスリン等を含む培地にて、３７℃にて培養すればよ
い。　培地は、現在一般に使用されているＤ　Ｍ　Ｅ　
Ｍ　（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄ　　Ｅａ
ｇｌｅ’ｓ　　Ｍｅｄｉｕｍ）　、　　Ｉ　Ｍ　Ｄ　Ｍ
（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃ
ｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ　）、ＲＰＭＩ　１６４０等の
培地から適宜選択すればよい。

なお、好適方法の一例を述へると、当該細胞を増殖に好
適な条件で培養した後、当該細胞を本発明の生理活性物
質の回収に適切な条件、例えば、血清等を含まない完全
合成培地に移して培養するのがよい。

また、当該細胞を、動物個体を利用して培養することも
可能である。

即ち、動物個体内に当該細胞を移植するか、または動物
個体内あるいは個体外に取り付けた拡散チャンバー内に
て、動物の体液を利用して培養することができる。

さらに、動物個体を利用して培養した当該細胞を、動物
個体から取り出して分散し、適当な増殖培地にて培養す
ることも可能である。

当該細胞を動物個体を利用して培養する場合に使用する
動物は、当該細胞が増殖しつる動物であればいずれも使
用可能であるが、胸腺摘出あるいは抗胸腺抗体処理され
たマウス、ラット、ハムスターまたはヌードマウス、ヌ
ードラットを使用することが好ましい。

前記ｂ）のヒト由来細胞株ＫＨＭ−５Ｍの培養上清の回
収工程は、例えばａ）に記載のようにしてヒト由来細胞
株ＫＨＭ−５Ｍを培養した培地や体液等から、その培養
上清を回収する工程のことである。

即ち、ヒト由来細胞株ＫＨＭ−５Ｍを培養後、培養容器
から培地を取り出し、必要があれば、遠心分離法、濾過
法等の手段により、培地中の当該細胞と培養上清とを分
離し、培養上清を回収すればよい。

このようにして得た培養上清からの本発明の生理活性物
質の精製方法は、特に限定されず、塩析法、限外濾過法
、等電点沈澱法、ケル濾過法、イオン交換クロマトグラ
フィー、疎水性クロマトグラフィー、抗体アフィニティ
ークロマトグラフィー等の各種アフィニティークロマト
グラフィー、クロマトフオーカシング法、吸着クロマト
グラフィー、逆相クロマトグラフィー等、多くの文献や
蔵書、例えば「生化学実験講座１　タンパク買の化学」
　（日本生化学金縁、１９７６年、東京化学同人）に記
載された方法の中から、適当な方法を選択し、選択した
方法を適当な順序で行なえばよい。　　しかし、前記Ｃ
）の工程によれば、本発明の生理活性物質を容易に精製
することができる。

工程Ｃ）は、本発明の生理活性物質を含有する液体を、
陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマ
トグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性クロマ
トグラフィーから選ばれる少なくとも１つの精製方法に
供する工程である。

ここで、本発明の生理活性物質を含有する液体とは、例
えば、前記ヒト由来細胞株Ｋ）ｆＭ−５Ｍをはじめ、本
発明の生理活性物質を産生じつる組織や細胞の培養上清
、本発明の生理活性物質を発現しつる細胞や微生物を培
養した培地、本発明の生理活性物質を含有する体液等で
ある。

なお、工程Ｃ）において、陰イオン交換クロマトグラフ
ィーは、ジエチルアミノエチル基が導入された担体を使
用した陰イオン交換クロマトグラフィーが好ましく、陽
イオン交換クロマトグラフィーは、スルホプロピル基が
導入された担体を使用した陽イオン交換クロマトグラフ
ィーが好ましく、逆相クロマトグラフィーは、ブチル基
が導入された担体を使用した、もしくは、ポリスチレン
ジビニルベンゼン重合体を担体として使用した逆相クロ
マトグラフィーか好ましく、疎水性クロマトグラフィー
は、フェニル基が導入された担体を使用した疎水性クロ
マトグラフィーが好ましい。

続いて、本発明第三の態様の培養上清について説明する
。

本発明第三の態様の培養上清は、本発明第一の態様の生
理活性物質を含有することを特徴とするヒト由来細胞株
ＫＨＭ−５Ｍの培養上清である。

本発明の培養上清は、ＫＨＭ−５Ｍを培養した培養上清
であればよく、本発明第二の態様についての説明の項で
例示した完全合成培地であっても、血清等を含む培地で
あっても、あるいは動物の体液であってもよい。

なお、本発明者等は、ヒト由来細胞株ＫＨＭ−５Ｍを、
１９９０年８月９日付けで、工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託している（受託番号：徹工研菌寄第　１１
［ｉ’５４号（ＦＥＲＭＰ−１１６５４）　）。

次に、本発明第四の態様の医薬組成物について説明する
。

本発明の医薬組成物は、本発明第一の態様の生理活性物
質を有効成分として含有することを特徴とする。

本発明の医薬組成物は、本発明第一の態様に示した生理
活性物質を、凍結乾燥や除菌濾過等の製剤学的に必要な
工程で処理しただけのものであっても、充分その効果を
医療の分野に提供することができるものであるが、本発
明の生理活性物質に加え、製剤学的に許容されつる補助
成分をも含んでいてもよい。

この補助成分とは、基剤、安定剤、防腐剤、保存剤、乳
化剤、懸濁化剤、溶解剤、溶解補助剤、滑沢剤、矯味剤
、着色剤、芳香剤、無痛化剤、賦形剤、結合剤、粘稠剤
、緩衝剤等のことであり、具体的には、炭酸カルシウム
、乳糖、蔗糖、ソルビット、マンニトール、デンプン、
アミロペクチン、セルロース話導体、ゼラチン、カカオ
脂、注射用蒸留水、塩化ナトリウム水溶液、リンゲル溶
液、グルコース溶液、ヒト血清アルブミン（Ｈ５Ａ）等
が挙げられる。

本発明の医薬組成物の調製に際しては、例えば医薬品添
加物−覧表（財団法人東京医薬品工業協会薬事法規委員
会および大阪医薬品協会薬事法規研究委員会発行）を参
照して、用いる補助成分を適宜選択すればよい。　また
、補助成分の使用量は、製剤学的に許容されつる範囲よ
り、医薬組成物の薬剤形態等に応じて適宜選択すればよ
い。

本発明の医薬組成物の投与量は、治療を受ける患者の状
態、年齢、性別、体重等に応じて適宜選択され、また、
その投与方法は、患者の状態に応じ、経口投与、筋肉内
投与、腹腔内投与、皮肉投与、皮下投与、静脈内投与、
動脈内投与、直腸投与等の様々な投与方法から選択され
るが、特に、静脈内に投与する方法が好ましい。

当該医薬組成物は、巨核球および／または血小板の減少
を伴なう疾患や、巨核球および／または血小板の機能異
常を伴なう疾患の治療や予防、もしくは抗癌剤の副作用
の軽減や予防に、有効な手段を提供するであろう。

〈実施例〉 以下に、実施例をもって、本発明を一層具体的に説明す
るが、これらは実施の一例として示すものであり、本発
明はこれらにより回答限定されるものではない。　また
、以下の記載において用いる略号は、当該分野における
慣用略号に基づくものである。

（実施例１）ヒト由来細胞株ＫＨＭ−５Ｍの培養 （１）ヒト由来細胞株Ｋ）ｉＭ−５Ｍの継代培養ヒト由
来細胞株ＫＨＭ−５Ｍの継代培養を以下の方法で行なっ
た。

まず、５％非働化ウシ胎児血清（以下、ＦＢＳと略す、
セラーラボ社製）／ＲＰＭ１１６４０培地（ギブコ社製
）１００ｍＩｌに、ヒト由来細胞株Ｋ）ＩＭ−５Ｍを４
Ｘ１０’細胞／ｍｊ２の濃度になるよう植え込み、底面
積１７５平方センチメートルの培養フラスコ（ベクトン
ディキンソン社製）で、３７℃にて３日間培養した。

培養終了後、培地を取り除き、ＲＰＭ　１１６４０培地
で２回洗浄した後、ＥＤＴＡ含有ト含有トリプシン溶液
約１０奢ＩＬて細胞を剥離せしめ、ＲＰＭＩ　１６４０
培地４０ｍｌ１を加え、低速冷却遠心分離機（トミーＲ
Ｌ−１００、株式会社トミー精工製）にて。

１０００回転／分で１０分間遠心分離を行ない、培地を
取り除いた。　さらにこの操作を縁り返した後、５％Ｆ
ＢＳ／ＲＰＭＩ　１６４０培地を加え、細胞の濃度が４
Ｘ１０’細胞／　ｍ　１１になるように細胞浮遊液を調
製し、それを、培養フラスコで、３７℃にて培養した。

以後、同様に継代培養を行なった。

（２）ヒト由来細胞株ＫＨＭ−５Ｍの培養ヒト由来細胞
株ＫＨＭ−５Ｍの培養上清から本発明の生理活性物質を
回収する目的で、以下の方法にて、ヒト由来細胞株ＫＨ
Ｍ−５Ｍの培養を行なった。

まず、１０％ＢＳ（ウシ血清、アーパインサイエンティ
フィック社製）／ＲＰＭＩ１６４０培地！ｌを用い、ヒ
ト由来ａ胞株ＫＨＭ−５Ｍを、約２Ｘ１０’細胞／　ｍ
　ｊ２の濃度に調製し、それを５ｆｔのローラーボトル
（株式会社種橋器械店製）に植え込み、３０回回転時間
、３７℃にて３日間培養した。

培養終了後、培地を取り除き、ＲＰＭ１１６４０培地２
５０ｍｊ培地２５註 でＩ　ＭＤＭ培地（ギブコ社製）１ｆＬと交換し、更に
３日間、３０回回転時間、３７℃にて培養した。

（実施例２） 本発明の生理活性物質の精製（その１）実施例１（２）
に従って得た細胞浮遊液を、高速冷却遠心機（ベックマ
ンＪ２−２１、ベックマン株式会社製）にて、８０００
ｘｇ，４℃で２０分間遠心分離し、培養上清を得た。　
この培養上清を、以下の方法にて、濃縮、精製した。　
なお、以下の操作のうち、濃縮および透析は、特に記載
しない限り１０℃以下にて、また、クロマトグラフィー
は、特に記載しない限り約２５℃にて行なった。

（１）濃縮 上記培養上清２１ｊ２を、限外ろ過膜（スパイラルカー
トリッジ５ＩＹ３、アミコン社製）を用いて濃縮し、更
に、限外ろ過膜（ＹＭ５、アミコン社製）にて１８０ｍ
ｊ２にまで濃縮した。

得られた濃縮液３６ｍｌ１を、分画分子量３５００の透
析膜を使用し、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５
．５）に対して４℃にて一晩透析した。

（２）陽イオン交換クロマトグラフィー透析後のサンプ
ルについて、約９００００×ｇで、４℃にて、２０分間
遠心分離を行ない、上清を回収した。　回収した上清を
、以下の要領で陽イオン交換クロマトグラフィーに供し
た。

すなわち、この上清を、予め５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ５．５）で平衡化したｓｐ−トヨパール６５
０８カラム（２．２ｃｍφｘ２０ｃｍ、東ソー株式会社
製）に供し、同緩衝液でカラムを洗浄した。　洗浄後、
溶出画分の蛋白量を波長２８０ｍｍにおける吸光度を測
定することによりモニターしながら、０〜０．８Ｍ　　
ＮａＣｊ２７５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，
５）を使用して、直線濃度勾配法により、流速３ｍｆｌ
／分で溶出を行なった。

各画分より一部を採取し、終濃度０１％となるようにＢ
ＳＡ　（ウシ血清アルブミン、シグマ社製）を加えた後
、分画分子量６０ｏＯ〜８００Ｑの透析膜を使用し、Ｐ
ＢＳ−に対して一晩透析した。　透析後、無菌のマイレ
ックスＧＶフィルター（日本ミリボア工業株式会社製）
を使用して除菌ろ過を行ない、０．１％ＢＳＡ／ｒＭＤ
Ｍで希釈し、活性測定用のサンプルとした。

得られたサンプルの活性を、実施例５に記載の方法で測
定した。　その結果、ＮａＣｊ２濃度約００５Ｍ〜約０
．２５Ｍ付近の両分に活性か肥められた。

この活性画分を回収し、後記の実験に供した。

（３）ＳＤＳ〜ポリアクリルアミドケル動法 実施例２（２）で得た活性画分をサンプルとして、Ｌａ
ｅｍｍｌｉの方法（ネイチャー、２２７巻、６８０頁、
１９７０年）に準し、以下のように、ＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す）を
行なった。

まず、分画分子ｉ５０００の透析膜を使用し、上記サン
プルをＯ．ＩＭＩ−リス塩酸Ｍ衝液（ｐＨ６．８）に対
して４℃で１時間透析し、透析後のサンプルを、分画分
子量５０００の限外濾過膜（ウルトラフリーＣＬ、日本
ミリボア工業株式会社製）にて濃縮した。

濃縮されたサンプルより６０μｋを分取し、１０％ＳＤ
Ｓ２０Ａｔｕ、グリセリン１５μ℃、０　１％ＢＰＢ　
（ブロムフェノールブルー）５μ℃を添加し、３７℃に
て１時間反応させた。　反応後のサンプル３０μ℃に対
し、１６％Ｔゲル（縦６ｃｍｘ横８ｃｍ，厚さ１．５ｍ
ｍ、テフコ社製）を使用し゛、１５ｍＡにて、２、２時
間、電気泳動を行なった。

なお、分子量マーカーとして、ファルマシアＬＭＷ　　
Ｋｉｔ　　Ｅ（ファルマシア社製）の、１４、４ｋＤ，
２０．１ｋＤ，３０ｋＤ，４３ｋＤ、６７ｋＤおよび９
４ｋＤのマーカーを使用した。

泳動終了後、ゲルを泳動方向に対して垂直に、２ｍｍ幅
で切出し、それぞれのゲル片を、０、４ｍｊｌの０．２
％Ｂ　Ｓ　Ａ／Ｐ　Ｂ　Ｓ−に−晩浸漬し、抽出を行な
った。

抽出後、ゲル片を取り除き、ＩＭのＫＣＩＬ１０μＪ２
を添加し、１　００００Ｘｇで、４℃にて、１０分間の
遠心分離を行なった。　それぞれ上清を回収し、分画分
子量６０００〜８０００の透析膜を使用し、Ｉ　ＭＤＭ
培地に対し、４℃で一晩透析を行なった。

透析後、無菌のマイレックスＧＶフィルター（既出）を
使用して除菌ろ過を行ない、０、１％ＢＳＡ／ＩＭＤＭ
で希釈し、活性測定用サンプルとした。

実施例５に記載の方法で、各サンプルの活性を測定した
。　ただし、サンプル添加後のＬ８０５７細胞の培養は
、３７℃にて４日間行なった。　その結果、切り出した
ケル片より、活性物質が抽出されたことが確認された。

　このゲル片の位置より、該活性は、推定分子量約１９
ｋＤ〜約３１ｋＤの物質に由来すると考えられた。

（４）疎水性クロマトグラフィー 実施例２（２）により得られた活性画分を、以下の要領
で疎水性クロマトグラフィーに供した。

まず、上記活性画分をＹＭ５　（既出）にて濃縮後、分
画分子量５０００の透析膜を使用し、１、５Ｍ硫酸アン
モニウム／　１　０　ｍ　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（
ｐＨ７．０）に対して３時間透析した。　透析後、約９
００００×ｇて、４℃にて、２０分間遠心分離を行ない
、上清を回収した。

この上清を、予め１．５Ｍ硫酸アンモニウム／　１０　
ｍ　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）て平衡化
したフェニル−５ＰＷカラム（７，５ｍｍφＸ’７．５
ｃｍ、東ソー株式会社製）に供した。　カラムを同緩衝
液で洗浄後、溶出画分の蛋白量をモニターしながら、１
５Ｍ−０Ｍ硫酸アンモニウム７１０　ｍ　Ｍリン酸ナト
リウム＆！衝液（ｐＨ７，０）を使用し、直線濃度勾配
法にて、流速ｏ、　　５ｍｉ／分で溶出を行なった。

各画分より一部を採取し、終濃度０．１％となるように
ＢＳＡを加えた後、分画分子量６０００〜８０００の透
析膜を使用し、ＰＢＳ−に対して一晩透析した。　透析
後、無菌のマイレックスＧＶフィルター（既出）を使用
して除菌ろ過を行ない、０１％ＢＳＡ／Ｉ　ＭＤＭで希
釈し、活性測定用のサンプルとした。

得られたサンプルの活性を、実施例５に記載の方法て測
定したところ、硫酸アンモニウム？Ｒ度約０．６〜約０
．９Ｍ付近に活性が認められた。

（５）陰イオン交換クロマトグラフィー実施例２（２）
により得られた活性画分を、以下の要領で陰イオン交換
クロマトグラフィーに供した。

まず、上記活性画分をＹＭ５　（既出）にて濃縮し、得
られた濃Ｍ液を、分画分子量５０００の透析膜を使用し
、２５ｍＭトリス塩酸Ｍ衝液（ｐＨ８，０）に対して３
Ｉ３！間透析した。　透析後、約９０００ｏＸｇで、４
℃ニテ、２０分間遠心分離を行ない、上溝を回収した。

この上清を、予め２５ｍＭのトリス塩酸Ｍ街液（ｐＨ８
，０）で平衡化したＤＥＡＥ−５ｐｗカラム（７，５ｍ
ｍφＸ７５ｍｍ、東ソー株式会社製）に供し、同緩衝液
でカラムを洗浄した。　洗浄後、溶出画分の蛋白量をモ
ニターしながら、ＯＭ〜ＩＭ　ＮａＣｆ１／２５ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）を使用し、流速０．５ｍ
ρ／分で、直線濃度勾配法にて溶出を行なった。

各画分より一部を採取し、終濃度０．１％となるように
ＢＳＡを加えた後、分画分子量６０００〜８０００の透
析膜を使用し、ＰＢＳ−に対して一晩透析した。　透析
後、無菌のマイレックスＧＶフィルター（既出）を使用
して除菌ろ過を行ない、０．１％ＢＳＡ／Ｉ　ＭＤＭで
希釈し、活性測定用のサンプルとした。

得られたサンプルの活性を実施例５に記載の方法で測定
したところ、ＮａＣｕ濃度約０．０５Ｍ〜約０．３５Ｍ
付近の画分に、活性の２つのピークが認められた。

（６）逆相クロマトグラフィー 実施例２（５）により得られた活性画分のうち、後のピ
ークに相当する両分を、以下の要領で逆相クロマトグラ
フィーに供した。

まず、上記活性画分をＹＭ５（既出）にて濃縮し、得ら
れたｆ１４縮液を、分画分子量５０００の透析膜を使用
し、０，１％トリフルオロ酢酸に対して３時間透析した
。

透析後、約９００００ｘｇで、４℃にて、２０分間遠心
分離を行ない、上清を回収した。　　この上清を、予め
０．１％トリフルオロ酢酸にて平衡化したＹＭＣＡＰ８
０３　　Ｃ４カラム（４，６ｍｍφＸ２５０ｍｍ、山村
化学研究所製）に供し、０．１％トリフルオロ酢酸でカ
ラムを洗浄した。　洗浄後、蛋白量をモニターしながら
、０％〜９０％アセトニトリル１０．１％トリフルオロ
酢酸を使用し、直線濃度勾配法により、流速０．５ｍｌ
１．７分にて溶出を行なった。

各画分より一部を採取し、終濃度０１％となるようにＢ
ＳＡを加えた後、分画分子量６０００〜８０００の透析
膜を使用し、ＰＢＳ−に対して一晩透析した。　透析後
、無菌のマイレックスＧＶフィルター（既出）を使用し
て除菌ろ過を行ない、０１％ＢＳＡ／Ｉ　ＭＤＭで希釈
し、活性測定用のサンプルとした。

得られたサンプルの活性を、実施例５に記載の方法で測
定したところ、活性は、アセトニトリル濃度約６０％〜
約８０％付近に認められた。

（実施例３）　本発明の生理活性物質の精製（その２） 実施例２（１）に記載の方法に準じて得たヒト由来細胞
株ＫＨＭ−５Ｍの培養上清の濃縮液１０８ｍｊ２を、実
施例２（１）に記載の方法で透析して得たサンプルにつ
き、以下の方法で精製を行なった。

なお、以下の操作のうち、濃縮および透析は、特に記載
しない限り１０℃以下にて、また、クロマトグラフィー
は、特に記載しない限り約２５℃にて行った。

（１）陽イオン交換クロマトグラフィー透析後のサンプ
ルについて、約９００００Ｘｇ、４℃にて、２０分間の
遠心分離を行ない、上清を回収した。　回収した上清を
、以下の要領て陽イオン交換クロマトグラフィーに供し
た。

すなわち、この上清を、予め５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩
衝−液（ｐＨ５，０）にて平衡化したｓｐ−トヨバール
６５０Ｓカラム（２，２ｃｍφＸ２０ｃｍ、東ソー株式
会社製）に供し、同ＩＩ衝液でカラムを洗浄した。　洗
浄後、蛋白量をモニターしながら、ＯＭ〜１．ＯＭＮａ
Ｃｎ１５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ＰＨ５，０）を
使用し、直線濃度勾配法により、流速３ｆｆ＋１／分で
溶出を行なった。

各画分より一部を採取し、終濃度０．１％となるように
ＢＳＡを加えた後、分画分子量６０００〜８０００の透
析膜を使用し、ＰＢＳ−に対して一晩透析した。　透析
後、無菌のマイレックスＧＶフィルター（既出）を使用
して除菌ろ過を行ない、０．１％ＢＳＡ／Ｉ　ＭＤＭで
希釈し、活性測定用のサンプルとした。

得られたサンプルの活性を、実施例５に記載の方法で測
定したところ、活性は、ＮａＣＪ２濃度約０．１５Ｍ〜
約０．３５Ｍ付近の画分に認められた。

活性画分を回収し、陰イオン交換クロマトグラフィーに
て、以下の方法でさらに精製した。

（２）陰イオン交換クロマトグラフィー実施例３（１）
により得られた活性画分をＹＭ５（既出）にて濃縮し、
得られた濃縮液を、分画分子量５０００の透析膜を使用
し、２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ＰＨ８，０）に対して
３時間透析した。　透析後のサンプルについて、約９０
０００ｘｇ、４℃にて、２０分間の遠心分離を行ない、
上清を回収した。

この上清を、予め２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ＰＨ８，
０）にて平衡化したＤＥＡＥ−５ｐｗカラム（７，６ｍ
ｍφ×７５ｍｍ、東ソー株式会社製）に供し、同緩衝液
でカラムを洗浄した。　洗浄後、蛋白量をモニターしな
がら、ＯＭ〜１、ＯＭ　　ＮａＣＡ／２５ｍＭトリス塩
酸Ｈａ液（ｐＨ８，０）を使用し、直線濃度勾配法にて
、流速０．　５　　ｍ１１分で溶出を行なった。

各画分より一部を採取し、終濃度０．１％となるように
ＢＳＡを加えた後、分画分子量６０００〜８０００の透
析膜を使用し、ＰＢＳ−に対して一晩透析した。　透析
後、無菌のマイレックスＧＶフィルター（既出）を使用
して除菌ろ過を行ない、０．１％ＢＳＡ／Ｉ　ＭＤＭで
希釈し、活性測定用のサンプルとした。

得られたサンプルの活性を、実施例５に記載の方法で測
定したところ、ＮａＣＪＺ濃度約０．０５Ｍ〜約０．３
５Ｍ付近の画分に活性の２つのピークが認められた。

溶出パターンを第１図に示す。

（３）逆相クロマトグラフィー 実施例３（２）により得られた活性画分のうち、第１図
におけるビークＢに相当する両分を、以下の要領て逆相
クロマトグラフィーに供した。

まず、上記活性画分をＹＭ５（既出）にて濃縮し、得ら
れた濃縮液を、分画分子量８０００の透析膜を使用して
０．１％トリフルオロ酢酸／１０％アセトニトリルに対
して３時間透析した。

透析後、約９００００ｘｇで、４℃にて、２０分間遠心
分離を行ない、上清を回収した。　　この上清を、予め
０．１％トリフルオロ酢酸／１０％アセトニトリルにて
平衡化したＰＲＬＰ−Ｓカラム（４，６ｍｍΦＸ５０ｍ
ｍ、ポリマーラボラトリーズ社製）に供し、次いで、カ
ラムを０．１％トリフルオロ酢酸／１０％アセトニトリ
ルで洗浄した。　洗浄後、溶出画分の蛋白量をモニター
しなから、０．１％トリフルオロ酢酸／１０％〜９０％
アセトニトリルを使用し、直Ｍ　ａ度勾配法により、流
速０．５ｍρ／分にて溶出を行なった。

各画分より一部を採取し、終濃度０１％となるようにＢ
ＳＡを加えた後、分画分子量６０００〜８０００の透析
膜を使用し、ＰＢＳ−に対して一晩透析した。　透析後
、無菌のマイレックスＧＶフィルター（既出）を使用し
て除菌ろ過を行ない、０１％ＢＳＡ／Ｉ　ＭＤＭで希釈
し、活性測定用のサンプルとした。

得られたサンプルの活性を、実施例５に記載の方法に準
じて測定したところ、アセトニトリル濃度約３０％付近
の画分に活性が認められた。

（４）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ 実施例３（３）で最終的に得られた活性画分の一部を、
遠心濃縮器（スピードバックコンセントレータ−、サハ
ント社製）を使用して減圧乾固し、それを、以下の方法
でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。

まず、減圧乾固されたサンプルを、１％ＳＤＳ１０．　
　　００５　　％　　Ｂ　　　Ｐ　　　Ｂ　　／　　２
　　０　　　ｍ　　Ｍ　　　ト　　リ　　ス塩酸緩衝液
（ｐＨ８，０）に溶解し、１００℃にて２分間反応させ
た。　反応後のサンプルを、ファストシステム（ファル
マシア社製）に供し、電気泳動を行なった。　泳動後、
クマシーブルーにて染色を行なったところ、分子量約２
３〜約２７ｋＤの位置にのみ、濃厚なバンドが認められ
た。

なお、分子量マーカーとして、ファルマシアＬＭＷ　　
Ｋｉｔ　　Ｅ（既出）を使用した。

（実施例４）アミノ酸配列の決定 （１）ビークＢ由来の蛋白質のアミノ酸配列実施例３（
３）で得られた活性画分を、５０％酢酸に溶解してサン
プルとし、モデル４７７Ａプロテインシークエンシング
システム−１２０Ａ　　ＰＴＨアナライザー（アブライ
ドバイオシステムズ社製）を使用し、そのＮ末端アミノ
酸配列を決定した。　すなわち、ＰＴＨアミノ酸の検出
を２７０ｎｍの紫外部吸収にて行ない、予め同一の方法
で分離した標準ＰＴＨアミノ酸（アプライドバイオシス
テムズ社製）の保持時間を基準にしてアミノ酸を同定し
た。

この結果、本発明の生理活性物質は、以下のアミノ酸配
列を有していることが確認された。

Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　　Ｘ　　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌ
ｙｓ　Ｖａｌ＾ｓｎ　Ｉｌａ　　Ｘ　　Ｘ　　Ｌｙｓ　
Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　ＰｈｅＰｈｅνａｌ　　Ｘ　　Ｐｈｅ
　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　ＩＩｅＧｌｙ（Ｘは、アミノ酸が特
定されないことを示す。　また、４箇所のＸは、互いに
同してあっても異なっていてもよい。） なお、該アミノ酸配列中のＸは、今回の実験ではアミノ
酸を特定できなかった箇所を示すが、ここに示した方法
で、アミノ酸が特定できない場合、その箇所のアミノ酸
は、ＣｙｓまたはＳｅｔである可能性が高い。

（２）ピーク八由来の蛋白質のアミノ酸配列実施例３（
２）により得られた活性画分のうち、第１図におけるビ
ークＡに相当する画分を、実施例３（３）に記載の方法
で逆相クロマトグラフィーに供した。

その結果、アセトニトリル濃度約３０％付近の画分に活
性が認められた。

この活性画分を、スピードバックコンセントレータ−（
既出）にて減圧乾固し、それを、以下の方法でＳＤＳ−
ＰＡＧＥに供した。

すなわち、減圧乾固されたサンプルを、２０％グリセロ
ール１０．０１％ＢＰＢ／２％ＳＤＳ１０．０６２５Ｍ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ６，８）に溶解し、この全量を
、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。　なお、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅは、Ｌａｅｍｍｌｉの方法（既出）に準じて、１５％
Ｔゲル（縦１４ｃｍＸ横１４ｃｍ、厚さ１．０ｍｍ）を
用いて行なった。

次に、ポリアクリルアミドゲル内で分離された蛋白買を
、マッダイラらの方法 （Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ、　Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ
、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、。

Ｖｏｌ、　２６２　、　ｐＪ、１００３５−１００３８
．　１９８７　）に従い、ポリビニリデン−ジフルオロ
ライド（以後、ＰＶＤＦと略す）膜上にエレクトロプロ
ッティングした。

すなわち、泳動を終了したポリアクリルアミドゲルを蒸
留水で洗浄後、トランスファーハ・ノアｙ−（１０％メ
タノール／１０ｍＭ　　３　−［ｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌ
ａｍｉｎｏ　　］　　−１−ｐ「ａｐａｎｅｓｕｌｆｏ
ｔｎｉｃａｃｉｄ　（株式会社同仁化学研究所製）　　
（ｐＨ１１，０））に５分間浸漬して平衡化した。

ＰＶＤＦ膜は、１００％メタノールですすいた後、上述
のトランスファーバッファー中に浸漬した。　さらに、
濾紙をトランスファーバッファーに浸漬し、この濾紙と
前述のＰＶＤＦ膜との間に上述のポリアクリルアミドケ
ルをはさみ、プロッティング装置（バイオメトラ社製）
に装着して１ミリアンペア／平方センチメートルの定電
流で３時間ブロッティングした。

プロッティング後、ＰＶＤＦ膜を取り出し、蒸留水中で
５分間洗浄した後、５０％メタノールに溶解した０、１
％クマシープルーＲ２５０溶液中で５分間染色した。　
染色後、５０％メタノール、１０％酢酸溶液中で充分脱
染した。　さらに、この膜を蒸留水中で５分間洗浄し、
風乾させた。その結果、膜上で、２５ｋＤ付近にバンド
が認められたので、その部分を切り取って、シーケンサ
−のカートリッジブロック上に乗せ、カートリッジブロ
ックを組み立てた。

アミノ酸配列の分析は、モデル４７７Ａプロテインシー
クエンシングシステム−１２０ＡＰＴＨアナライザー（
既出）を使用して、実施例４（１）に記載の方法で行な
った。

この結果、本発明の生理活性物質は、以下のアミノ酸配
列を有していることが確認された。

Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　　Ｙ　　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌ
ｙｓ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　ｌ１ｅＹ　　Ｙ　　Ｙ　　Ｙ　
　Ｇｌｎ　Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ（Ｙは、アミノ酸が
特定されないことを示す。　また、５箇所のＹは、互い
に同じであっても異なっていてもよい。） （実施例５）本発明の生理活性物質の活性の測″定 本発明の新規生理活性物質の巨核球−血小板系に対する
分化、成熟および／または増殖促進活性を、以下の方法
で確認した。

（１）活性測定用細胞懸濁液の調製 まず、マウス巨核球系細胞株Ｌ８０５７を、１％Ｎｕｔ
ｒｉｄｏｍａ−５Ｐ　（ベーリンガー・マンハイム山之
内株式会社製）／Ｉ　ＭＤＭ培地を用い、３ｘ１０４細
胞／　ｍ　ｆｌに調製し、３７℃にて３日間培養した。

　培養終了後、低速冷却遠心分離機（既出）にて、１０
００回転／分で５分間遠心分離を行ない、細胞を回収し
た。　回収した細胞を、２％Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ−５Ｐ
／　０　、　１％ＢＳＡ／Ｉ　ＭＤＭ培地に、３Ｘ１０
’細胞／　ｍ　Ｉｔとなるように分散させ、活性測定用
細胞懸濁液とした。

（２）活性測定 実施例２または３で得た活性測定用サンプルを使用し、
以下の方法で活性を測定した。

まず、９６ウエルマルチプレート（ベクトンディキンソ
ン社製）を準備し、実験群には上記サンプルを、対照群
には０１％ＢＳＡ／Ｉ　ＭＤＭを、それぞｔ’Ｌ１００
μＩｔ／ウェルずつ添加した。

このマルチプレートの各ウェルに、上述の活性測定用細
胞懸濁液を１００μ℃ずつ添加し、３７℃にて３日間培
養した。

培養終了後、プレートごと、遠心分離機（Ｈ−１６１，
国産遠心器株式会社製）にて、１５００回転／分で５分
間の遠心分離を行ない、各ウェルより上清１５０μｋを
除去し、かわりに、ｐＨ７，２で調製したＰＢＳ−を１
５０μ２ずつ添加した。　次に、０．３１５％ＤＴＮＢ
／１％クエン酸ナトリウムを１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１
００で１０倍希釈し、これを、各ウェルに５０μにずつ
添加し、タイターチック　マルチスキャン（フローラボ
ラトリー社製、Ｔｉｔａｒｔｅｋ　Ｍａｌｔｉｓｋａｎ
　ＭＣＣ）にて、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定
した。

次に、７．５ｍＭヨウ化アセチルチオコリレ溶液を各ウ
ェル２０μｌずつ添加し、２５℃にて３０分間反応させ
た後、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定し、得られ
た２つの吸光度の差、すなわちΔＯＤ　４０８　（３０
ｍｉｎ　−０＋ｎ１ｎ）を求めた。

なお、ＤＴＮ　Ｂは５．５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ−（
２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ）の略称であ
る。　　また、吸光度測定の際のブランクにはＰＢＳ−
を用いた。

コントロールに対して有意な差が見られる場合を、巨核
球−血小板系に対する作用有りと判断した。

（実施例６）本発明の生理活性物質の安定性実施例１（
２）に従って得た細胞浮ｔｌ液を、８０００Ｘｇで、４
℃にて、２０分間遠心分離し、培養上清を得た。　この
培養上清をサンプルとして、以下の実験を行なった。

（１）１％ＳＤＳに対する安定性 ＳＤＳ　（ナカライテスク株式会社製）を２゜％に調製
し、該ＳＤＳ溶液５０μρをＩｍｆｌのサンプルに添加
し、３７℃にて１時間インキュベートした。　次いで、
１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ＰＨ７，５）１５０μ℃を
加え、１００００ｘｇで、４℃にて、５分間遠心分離し
、上清１ｍｊ２を得た。　得られた上清を、分画分子量
５０００の透析膜を使用し、以下のように透析した。

すなわち、４℃にて、５００ｍｊ２のＰＢＳ−に対して
３時間の透析を２回繰り返し、次に、４℃にて、５０ｍ
ＡのＩ　ＭＤＭに対して３時間の透析を行なった。　透
析後、１０％Ｂ５Ａ１０μｍを添加し、無菌のマイレッ
クスＧＶフィルター（既出）にて除菌ろ過を行ない、０
．１％ＢＳＡ／ＩＭＤＭで希釈して活性測定用サンプル
とし、実施例５に記載の方法で活性を測定した。　ただ
し、サンプル添加後のし８０５７細胞の培養は、３７℃
にて４日間行ない、７．５ｍＭヨウ化アセチルチオコリ
ン溶ン夜添加後の反応時間は６０分間とした。　結果を
表１に示す。

表　　　　　１ （２）トリフルオロ酢酸／アセトニトリルに対する安定
性 ０．１％トリフルオロ酢酸（ナヵライテスク株式会社製
）／アセトニトリル（ナヵライテスク株式会社製）溶液
を調製し、該溶液１ｍｌ１を同量のサンプルに添加し、
２５℃にて１時間インキュベートした。　次いて、遠心
濃縮器（スピードバック　コンセントレータ−５既出）
にて３０分間濃縮し、ＰＢＳ−ＬＴｌｍｆＬにメスアッ
プ後、以下の透析処理を行なった。

すなわち、４℃にて、５００ｍｊ２のＰＢＳ−に対して
３時間の透析を２回繰り返し、次に、４℃にて、５０ｍ
ｌ１のＩＭＤＭに対して３時間の透析を行なった。　透
析後、１０％Ｂ５Ａ１０μ℃を添加し、無菌のマイレッ
クスＧＶフィルター（既出）にて除菌ろ過を行ない、０
．１％ＢＳＡ／ＩＭＤＭで希釈して活性測定用サンプル
とし、実施例５に記載の方法で活性を測定した。　ただ
し、サンプル添加後のＬ８０５７細胞の培養は、３７℃
にて４日間行ない、７．５ｍＭヨウ化アセチルチオコリ
ンｍン夜添加後の反応時間は６０分間とした。　結果を
表２に示す。

表　　　　　　２ （３）７Ｍ尿素に対する安定性 尿素（ナカライテスク株式会社製）を ＰＢＳ−に溶解し、７Ｍ溶液を調製した。　分画分子量
５０００の透析膜を使用し、２５℃にて、サンプル１ｍ
ｊｌＬを上記の７Ｍ尿素溶液１００ｍｕに対して３時間
透析した。　更に、４℃にて、５００ｍｕのＰＢＳ−に
対して３時間の透析を２回繰り返し、次に、４℃にて、
５０ｍｌ２のＩ　ＭＤＭに対して３時間の透析を行なっ
た。　透析後、１０％Ｂ５Ａｌ０μρを添加し、無菌の
マイレックスＧＶフィルター（既出）にて除菌ろ過を行
ない、０．１％ＢＳＡ／Ｉ　ＭＤＭで希釈して活性測定
用サンプルとし、実施例５に記載の方法で活性を測定し
た。　ただし、サンプル添加後のＬ８０５７細胞の培養
は、３７℃にて４日間行ない、７．５ｍＭヨウ化アセチ
ルチオコリン溶液添加後の反応時間は６０分間とした。

　結果を表３に示す。

表　　　　　　３ （４）ｐＨの影響 まず、以下の溶液を調製した。

０．１Ｍ塩化カリウム・塩酸緩衝液（ｐＨ２，０） ０．１Ｍクエン酸・水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ４，
０およびｐＨ６，０） ０．１Ｍトリス・塩酸緩衝液（ＰＨ８，０）０．１Ｍグ
リシン・水酸化ナトリウム緩衝液（ｐ　Ｈｉ　Ｏ） ０．１Ｍ塩化カリウム・塩酸緩衝液（ｐＨ次に、分画分
子量５０００の透析膜を使用し、２５℃にて、サンプル
各１ｍｌを上記の各溶液１００ｍｊ２に対して４時間透
析した。　更に、４℃にて、２００ｍＪｌのＰＢＳ−に
対して２時間の透析を３回繰り返し、次に、４℃にて、
２００ｍＡのＩ　ＭＤＭに対して３時間の透析を行なっ
た。　透析後、１０％ＢＳＡ　１０μｍを添加し、無菌
のマイレックスＧＶフィルター（既出）にて除菌ろ過を
行ない、０．１％ＢＳＡ／ＩＭＤＭで希釈して活性測定
用サンプルとし、実施例５に記載の方法で活性を測定し
た。　ただし、７．５Ｍヨウ化アセチルチオコリン溶液
との反応は６０分間行なった。　結果を表４に示す。

表　　４ （参考例） ヒトおよびマウスの既知の生理活性物質およびＬＰＳ　
（リポポリサッカライド）を各種ｄＡ度に調製してサン
プルとし、マウスＬ８０５７細胞の分化、成熟および／
または増殖に対する活性を、実施例５に記載の方法に準
じた方法にて測定した。　結果を表５に示す。

なお、結果は、ΔＯＤ　４０５　（３０ｍｉｎ　−０ｍ
１ｎｌか対照群に比べて有意に高い場合を＋、有意な差
が認められない場合を−て示した。

表　　　　５ 〈発明の効果〉 本発明により、巨核球−血小板系の細胞の分化、成熟、
あるいは増殖を促進する生理活性物質、該生理活性物質
の製造方法および該生理活性物質を産生ずる細胞株ＫＨ
Ｍ−５Ｍの培養上清が提供される。

また、本発明により、該生理活性物質を有効成分として
含有する医薬組成物が提供される。

本発明の生理活性物質および医薬組成物は、巨核球およ
び／または血小板減少を伴なう疾患や、巨核球および／
または血小板機能異常を伴なう疾患の治療もしくは予防
を目的として使用

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例３（２）における活性の溶出パターン
を示す図である。 Ｄ２８０ ？ 活性　Ｃフ１！！タ１：りｆｔ６比）

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）巨核球系細胞に対し、アセチルコリンエステラー
   ゼ産生を促進する作用を有することを特徴とする生理活
   性物質。
2. （２）前記巨核球系細胞がマウス巨核球系細胞株Ｌ８０
   ５７である請求項１に記載の生理活性物質。
3. （３）非還元下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子
   量が約１９ｋＤ〜約３１ｋＤである請求項１または２に
   記載の生理活性物質。
4. （４）下記ａ）〜ｄ）の性質のうちの１つ以上を有する
   請求項１〜３のいずれかに記載の生理活性物質。 ａ）１％ＳＤＳによる３７℃、６０分間の処理で活性が
   残存する。 ｂ）０．０５％トリフルオロ酢酸／５０％アセトニトリ
   ルによる２５℃、６０分間の処理で活性が残存する。 ｃ）７Ｍ尿素による２５℃、１８０分間の処理で活性が
   残存する。 ｄ）ｐＨ２〜１２における２５℃、２４０分間の処理で
   活性が残存する。
5. （５）ＫＨＭ−５Ｍ細胞株培養上清中にその存在が確認
   される物質である請求項１〜４のいずれかに記載の生理
   活性物質。
6. （６）前記生理活性物質が巨核球−血小板系に対してそ
   の分化、成熟、増殖のうちのいずれか１つ以上を促進す
   る活性を有するものであ る請求項１〜５のいずれかに記載の生理活性物質。
7. （７）前記生理活性物質がヒト由来である請求項１〜６
   のいずれかに記載の生理活性物質。
8. （８）前記生理活性物質がヒト由来細胞株 ＫＨＭ−５Ｍにより産生される請求項１〜７のいずれか
   に記載の生理活性物質。
9. （９）前記生理活性物質が以下に示すアミノ酸配列を有
   するものである請求項１〜８のいずれかに記載の生理活
   性物質。 【遺伝子配列があります】 （Ｘは、アミノ酸が特定されないことを示す。また、４
   箇所のＸは、互いに同じであっても異なっていてもよい
   。）
10. （１０）前記アミノ酸配列のＸがＣｙｓまたは、Ｓｅｒ
    である請求項９に記載の生理活性物質。
11. （１１）下記の工程のうちの少なくとも１つを実施する
    ことを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の生
    理活性物質の製造方法。 ａ）ヒト由来細胞株ＫＨＭ−５Ｍを培養する。 ｂ）ヒト由来細胞株ＫＨＭ−５Ｍの培養上清を回収する
    。 ｃ）下記より選ばれる少なくとも１つの精製方法を行な
    う。 ［１］陰イオン交換クロマトグラフィー ［２］陽イオン交換クロマトグラフィー ［３］逆相クロマトグラフィー ［４］疎水性クロマトグラフィー
12. （１２）前記精製方法がそれぞれ下記の如く行なわれる
    請求項１１に記載の生理活性物質の製造方法。 ａ）ジエチルアミノエチル基が導入された担体を使用し
    て陰イオン交換クロマトグラフィーを行なう。 ｂ）スルホプロピル基が導入された担体を使用して陽イ
    オン交換クロマトグラフィーを行なう。 ｃ）ブチル基が導入された担体を使用して、もしくはポ
    リスチレンジビニルベンゼン重合体を担体として使用し
    て逆相クロマトグラフィーを行なう。 ｄ）フェニル基が導入された担体を使用して疎水性クロ
    マトグラフィーを行なう。
13. （１３）請求項１〜１０のいずれかに記載の生理活性物
    質を含有することを特徴とするヒト由来細胞株ＫＨＭ−
    ５Ｍの培養上清。
14. （１４）請求項１〜１０のいずれかに記載の生理活性物
    質を有効成分とすることを特徴とする医薬組成物。