JPH04183399A - Ｄ―プロリンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はＤ−プロリンの製造法に関する。

Ｄ−プロリンは医薬品および各種工業薬品の合成中間体
として重要な化合物である。

従来の技術 Ｄ−アミノ酸は、一般にを機合成化学的に製造されたＤ
Ｌ−アミノ酸を光学分割する方法および化学合成的に安
価に得られる光学不活性な前駆物置を酵素により光学活
性な化合物に転換させる方法などが知られている（’Ｉ
公昭４１−２２３８０号公報、特公昭５４−２２７４号
公報）。

Ｄ−プロリンの製造方法に関しては、プロテウス属に属
する微生物を用いてＬ−オルニチンよりＤ−ブＤ　リン
を製造する方法および光学活性酒石酸を用いるジアステ
レオアイソマー晶析法による光学活性プロリンの製法が
知られている（特公昭４６−２７３５４号公報、特開昭
５０−１０１３５５号公報）が、前者では反応収率が低
く、また後者では高価なり一（−）酒石酸が必要であり
、工業的な手法とは言い難い。

一方、従来キャンジダ属またはトリコスポロン属に属す
る微生物が有する、Ｌ−プロリンの分解活性を利用して
ＤＬ−プロリンからＤ−プロリンを製造する方法は知ら
れていない。

発明が解決しようとする課題 本発明は微生物が有するし一プロリンを立体選択的に分
解する作用を利用することにより、ＤＬ−プロリンから
光学純度の高いＤ−プロリンを工業的により効率よく安
価に製造する方法を提供することを目的としている。

課題を解決するための手段 本発明はキャンジダ嘱またはトリコスポロン属に属し、
Ｌ−プＯＩＪンの分解活性を有する微生物の培養物、菌
体またはそれらの処理物を水性媒体中でＤＬ−プロリン
に作用させＬ−プロリンを選択的に分解し、該水性媒体
よりＤ−プロリンを採取することを特徴とするＤ−プロ
リンの製造法を提供する。

本発明で用いる微生物としては、キャンジダ属またはト
リコスポロン属に属し、ＤＬ−プロリンからし一プロリ
ンを立体選択的に分解してＤ−プロリンを生成する能力
を有する微生物であればいずれでもよいが、例えばキャ
ンジダ・エスピー（Ｃａｎｄｉｄａ　ｓｐ、）　　ＰＲ
Ｄ−２３８（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−３１５９）およヒトリ
コスボロン・エスピー（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｓ
ｐ、）　　Ｐ　ＲＤ　−３１７（Ｆ　Ｅ　ＲＭＢＰ−３
１６０）があげられる。

ギアンジダ・エスピーＰＲＹ）−２３８およびトリコス
ポロン・エスピーＰＲＤ−３１７は、１界より新たに分
離された微生物である。

キャンジダ・エスピーＰＲＤ−２３８の菌学的性質を以
下に述べる。

（ａ）　　各培地における生育状態 ■　ＭＹ液体培地。

栄養細胞の大きさ、３〜４×５μｍ 形　状；楕円形 増殖の形式；多極出芽、真性菌糸あり ■　ＭＹ寒天培地： 栄養細胞の大きさ；４〜５Ｘ６〜７μｍ形　状；楕円形 増殖の形式；多極出芽、真性菌糸あり ■　バレイショ抽出液寒天培地によるスライド培養： 増殖の形式；真性菌糸あり （ｂ）　　子嚢胞子の形成 有無：なし くマツフレアリーズ酢酸寒天培地） （Ｃ）　　射出胞子の形成 有無：なし くＭＹ寒天培地） （ｄ）　　各生理的性質 ■　最適生育条件。

ｐＨ；５〜７ 温度；２３〜２８℃ ■　生育の範囲・ ｐ　Ｈ；　２．５〜９５ 温度；４〜３１℃ ■　硝酸塩の同化：なし ■　脂肪の分解：あり ■　尿素の分解：あり ■　ゼラチンの液化：あり ■　好浸透圧性または耐浸透圧性：あり塩化ナトリウム
の最適濃度；０〜３％ 塩化す）　ＩＪウムの最高濃度；１５％■　カロチノイ
ドの生成；なし ■　顕著な有機酸の生成；なし ■　デンプン様物質の生成；なし ０　ビタミンの要求性；あり （ｅ）　　各炭素源の同化性 ■　Ｌ−アラヒリース；なし ■　Ｄ−キシロース；なし ■　シュークロース；なし ■　Ｄ−グルコース；あり ■　マルトース；なし ■　Ｄ−ガラクトース；なし ■　セロビオース：なし ■　ラクトース：なし ■　トレハロース：なし ■　ラフィノース；なし ■　メレジトース；なし ０　α−メチル−Ｄ−グルコシド；なし■　アトニット
；なし ■　イノジット；なし ■　グリセリン；あり ■　２−ケトーＤ−グルコン酸塩、なし■　ズルシット
：なし Ｑ　カダベリン；なし ■　エリスリトール；あり （ｆ）　　各炭素源の発酵性 ■　Ｄ−グルコース；なし ■　シュークロース；なし ■　マルトース；なし ■　Ｄ−ガラクトース；なし ■　ラフィノース；なし ■　ラクトース；なし 以上の菌学的性質を有する微生物について、クレーガー
バン　リジ（Ｋｒｅｇｅｒ−ｖａｎ　Ｒｉｊ）　ｇによ
るザ・イースト・タキソノミック・スタデイ−（Ｔｈｅ
Ｙｅａｓｔ　ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　５ｔｕｄｙ）　Ｖａ
ｔ、　　３　（１９８４年）の記載と照合し検索した結
果、本菌株はキャンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する
酵母と同定し、本菌株をキャンジダ・エスピー（Ｃａｎ
ｄｉｄａ　ｓｐ、）　　ＰＲＤ　−２３８と命名した。

本菌株は平成２年１１月９日付で工業技術院微生物工業
技術研究所にＦＥＲＭ　　ＢＰ−３１５９として寄託さ
れている。

トリコスポロン・エスピー−ＰＲＤ−３１７の菌学的性
質を以下に述べる。

（ａ）　　各培地における生育状態 ■　ＭＹ液体培地： 栄養細胞の大きさ、５×８〜９μｍ 形　状；楕円形 増殖の形式１多極８芽、真性菌糸あり ■　ＭＹ寒天培地。

栄養細胞の大きさ１４Ｘ５〜６μｍ 形　状；楕円形 増殖の形式、多極出芽、分節型、真性菌糸あり■　バレ
イショ抽出液寒天培地によるスライド培養： 増殖の形式；真性菌糸あり ら）子嚢胞子の形成 を無；なし くマツフレアリーズ酢酸寒天培地） （Ｃ）　　射出胞子の形成 有無：なし くＭＹ寒天培地） （社）各生理的性質 ■　最適生育条件； ｐＨ；５〜６，５ 温度；２４〜３３℃ ■　生育の範囲： ｐＨ；３．０〜９．５ 温度；１１〜３６．５℃ ■　硝酸塩の同化：なし ■　脂肪の分解：あり ■　尿素の分解：あり ■　ゼラチンの液化：なし ■　好浸透圧性または耐浸透圧性：あり塩化す）　ＩＪ
ウムの最適濃度：０％ 塩化ナトリウムの最高濃度；１２％ ■　カロチノイドの生成；なし ■　顕著な有機酸の生成；なし ０　デンプン様物質の生成；なし ■　ビタミンの要求性；なし くｅ）　　各炭素源の同化性 ■　Ｌ−アラビノース；なし ■　Ｄ−キシロース；あり ■　シュークロース；あり ■　Ｄ−グルコース；あり ■　マルトース、あり ■　Ｄ−ガラクトース、あり ■　セロビオース：あり ■　ラクトース、あり ■　トレハロース、なし ■　ラフィノース、なし ■　メレジトース：あり ０　α−メチル−Ｄ−グルコシド：あり０　アトニット
、なし ■　イノンット；なし ■　グリセリン；なし ｃｉｉ）２−ケトーＤ−グルコン酸塩；あり０　クエン
酸；なし ■　エタノール；あり ■　エリスリトール；なし く０　各炭素源の発酵性 ■　Ｄ−グルコース：なし ■　シュークロース；なし ■　Ｄ−ガラクトース；なし ■　ラフィノース；なし ■　ラクトース；なし ■　マルトース；なし 以上の菌学的性質を有する微生物についてクレーガー　
パン　リン（Ｋｒｅｇｅｒ−ｖａｎ　Ｒｉｊ）ｍによる
ザ・イースト・タキンノミック・スタデイ−（Ｔｈｅ　
　Ｙｅａｓｔ　　ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　　５ｔｕｄｙ）
　　Ｖｏｌ、　　３　　　（１９８４年）の記載と照合
し検索した結果、本菌株はトリコスポロン（Ｔｒｉｃｈ
ｏｓｐｏｒｏｎ）属に属する酵母と同定し、本菌株をト
リコスポロン・エスピー（Ｔｒ　１ｃｈｏｓｐｏｒｏｎ
ｓｐ、）ＰＲＤ　−３１７と命名した。

本菌株は平成２年子１月９日付で工業技術院微生物工業
技術研究所にＦＥＲＭ　　ＢＰ−３１６０として寄託さ
れている。

本発明の微生物を培養する培地は、用いる微生物が資化
し得る炭素源、窒素源、無機物などを含有し、Ｌ−プロ
リンを分解する能力を有する微生物の培養を効率的に行
なえる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでも
良い。

炭素源としては、グルコース、フラクトース、シューク
ロースなどの炭水化物、およびこれらを含有する糖蜜、
デンプン加水分解物が用いられる。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム
などの各種無機およびｆ機アンモニウム塩類ならびにペ
プトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチーブ・リ
カー、カゼイン加水分解物、大豆粕加水分解物、各種発
酵菌体およびその消化物などの窒素含有有機物など種々
のものが用いられる。

無機物としては、リン酸−水素カリウム、リン酸二水素
カリウム、リン酸マグネンウム、硫酸マグネシウム、塩
化す）ＩＪウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅お
よび炭酸カルシウムなどが用いられる。

培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養などの好気的
条件下で行う。培養温度は１５〜３５℃、培養時間は通
常１２〜７２時間である。培養中ｐＨは５．０〜８．０
に保持する。ｐ）ｌの調整は塩酸、硫酸などの無機酸あ
るいは酢酸などのを機の酸、炭酸カルシウムなどの塩、
アンモニアなどのアルカリ溶液を用いて行う。

培養の際、高いＬ−プロリン分解活性を誘導させるため
に、Ｌ−プロリンを培地に添加することは効果的であり
、その添加量は培地に対して０．　］〜５．０％程度が
好ましい。

このようにして培養した培養物、菌体またはそれらの処
理物が本発明のし一プロリンの分解反応に用いられる。

培養物、菌体の処理物としては、乾燥物、界面活性剤処
理物、酵素処理物、超音波処理物、溶媒処理物、固定化
物などがあげられる。

水性媒体としては、水、リン酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ホ
ウ酸塩、クエン酸塩およびトリス塩酸などの緩衝液など
があげられる。

反応は通常１５〜３５℃でｐＨ５，０〜８．０で１２〜
７２時間通気攪拌しながら行う。

通気量は通常０．１〜３．０ＶＶＭ、好−１−Ｌ　＜　
ｌ；！０．５〜２．’ＯＶＶＭである。通気量が少なす
ぎるとＬ−プロリンの資化速度が遅くなる。反応液申の
培養物、菌体またはそれらの処理物の濃度は、Ｌ−プロ
リンの量および反応時間により適宜決定すれば良いが、
通常乾燥菌体として反応液当たり５ｇ／ｐ〜１００ｇ／
ｊ７である。

被分割物質であるＤ−およびＬ−プロリン混合物は、Ｄ
体およびＬ体が等量混合したものに限ろず、いずれか一
方の光学活性プロリンがその対掌体に対して等量以上含
まれているものでもよい。

反応に用いるＤＬ−プロリンの濃度は、反応液当たり１
０ｇ／β〜６００ｇ／β、好ましくは１０ｇ／Ｒ〜２０
０ｇ／βである。ＤＬ−プロリン濃度が低いと生産性が
低下し、逆に濃度が高いと反応が阻害される。

ＤＬ−プロリンは始めから培養液に全量添加してもよい
が、初濃度を１０ｇ／β〜５０ｇ／Ｊ！とじ、残りのＤ
Ｌ−プロリンを分割添加すると反応阻害が軽減され有効
である。

本発明に用いるＤＬ−プロリンは、ジャーナル・オブ・
オーガニック・ケミストリー〔Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｏ
ｒｇａｎ＋ｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　４８．８４３−
８４６（１９８３）　　’Ｊおよび特公昭５７−１２３
１５０号公報に記載の方法で合成することができる。ま
た、ＤＬ−プロリンは、市販（シグマ社）されていて容
易に人手することができる。

反応が終了した時点で反応液を加熱あるいはｐＨを低下
させるなどの常法により処理し速やかに反応を停止させ
た後、反応液から目的物質であるＤ−ブロリンを分離、
回収する。分離方法としては、イオン交換樹脂などを用
いるカラムクロマトクラフィーあるいは晶出法など通常
の分離方法が用いられる。

以下、実施例により本発明を説明する。

実施例において、生成したＤ−プロリンの分析は下記条
件下で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により
行なう。

カラムゴ５Ｋ−ＧＥＬ　ＥＲＣタイプ（東ソー社製）移
動層ニアセトニトリル：　０．５ｍＭ硫酸銅水溶液（１
：９）流速：０．７ａｆ／分 カラム温度＝４０℃ 検出ＵＶ：２５４ｎｍ 実施例１゜ ペプトン１０　ｇ　／β、イーストエキス５ｇ／ｉおよ
び塩化ナトリウム５ｇ／ｌを含む培地（ｐＨ７，２）４
０ｍ１．を２５０ｍ１容三角フラスコに分注し、１２０
℃、２０分間オートクレーブにかけて滅菌し種培養培地
とした。この培地にキャンジダ・エスピーＰＲＤ−２３
８を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間振盪培養し、種
培養液として用いた。

一方、グルコ−２ニ０ 肉エキス５ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム２ｇ／矛、硫
酸マグネンウム０．５ｇ／ｌ、硫酸第一鉄１■／ｌ，硫
酸マンガン１■／ｌおよびＬ−プロリン１０　ｇ　／　
１を含む培地（ｐＨ７．０＞１１を２１容量のミニジャ
ーファーメンタ−に分注し、１２０℃、３０分間オート
クレーブにかけて滅菌し主培養培地とした。この培地に
種培養液２０ｄを無菌的に接種し、３０℃で２４時間通
気攪拌培養（通気量１、　Ｏ　ＶＶＭ）　した。なお、
培養中、４規定アンモニア水により培地のｐＨを７．０
±０．１に調整した。この主培養液１１を遠心分離（１
０．０００ｒｐｍ．　１０分間）し、生菌体３９ｇ（乾
燥菌体重量８、６ｇ）を得た。

ＤＬ−プロリン（シグマ社製）４０ｇを含む２５４１１
ｊＪリン酸緩衝液（ｐＨ７．　０）　１　ｉ’を２１容
量のミニジャーファーメンタ−に分注し、１２０℃、１
５分間オートクレーブにかけて滅菌し、生菌体６．６ｇ
（乾燥菌体重量換算）を加え、３０℃で４８時間通気攪
拌（通気量１，　Ｏ　ＶＶＭ）　して反応を行った。な
お、反応中、４規定硫酸により反応液のｐＨを７．０±
０．１に調整した。

反応終了後、反応液を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ．
　１０分間）して得られた上澄液をイオン交換樹脂ダイ
ヤイオン５Ｋ−ＩＢ（Ｈ型）（三菱化成社製）５０〇−
に通塔し、Ｄ−プロリンを吸着させた。該樹脂を水洗後
、１規定アンモニア水でＤ−プロリンを溶出した。溶出
液を減圧濃縮し、乾固して、Ｄ−プロリンの粗結晶１４
ｇを得た。

得られた粗結晶１４ｇを蒸留水に溶解し、活性炭７ｇを
加え脱色を行ない濾過して脱色Ｐ液を得た。この脱色戸
液を濃縮後、冷却して析出した結晶を乾燥した結果、Ｄ
−プロＩＪン６ｇ（光学純度９　９、　５　ａｅ％以上
）を得た。

旋光度〔αｒ”０−＋８４．８°　（Ｃ・１０，水）口 実施例２。

粉末ブイヨン２０ｇ／Ｉ！、イーストエキス５ｇ／βお
よび塩化ナトリウム２．５ｇ／ｆを含む培地（ｐＨ７．
　２　）　　４　０−を２５０ｄ用三角フラスコに分注
し、１２０℃、２０分間オートクレーブにかけて滅菌し
て種培養培地とした。この培地にトリコスポロン・エス
ピーＰＲＤ−３１７を一白金耳植菌し、３０℃で２４時
間振盪培養し、種培養液として用いた。

主培養培地は実施例１と同じ培地を用い、この培地に、
種培養液２０ｗｄ！を無菌的に接種し、３０℃で２４時
間通気攪拌培養（通気量１．　Ｏ　ＶＶＭ）　した。

なお、培養中、４規定アンモニア水により培地のｐＨを
７．０±０．１に調整した。この主培養液１１を遠心分
離（１０．００Ｏｒｐｍ．　１０分間）し、生菌体３０
ｇ（乾燥菌体重量６．３ｇ）を得た。

ＤＬ−プロリン（シグマ社製）３０ｇを含む２５ｍＭＩ
Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）］βを２！容量のミニジャ
ーファーメンタ−に分注し、１２０℃、１５分間オート
クレーブにかけて滅菌し、生菌体６，３ｇ（乾燥菌体重
量換算）を加え、３０℃で２４時間通気攪拌（通気量１
．０シシＭ）して反応を行なった。

以下実施例１と同様の操作を行ない、Ｄ−プロリン３ｇ
（光学純度９９．５ｅｅ％以上）を得た。

旋光度〔αジ０＝＋８４．７°　（ｃ＝１０．水）実施
例３゜ ペプトンｌｏｇ／ｌ、イーストエキス５ｇ／Ａ、肉エキ
スＴｇ／１ＳＬ−プロリン１０ｇ／ｆおよび塩化す）　
ＩＪウム３ｇ／ｆを含む培地（ｐＨ７，０）４０−を２
５０−容三角フラスコに分注し、１２０℃、２０分間オ
ートクレーブにかけて滅菌し種培ｔＳ地とした。この培
地にキャンジダ・リポリティカを一白金耳植菌し、３０
℃で２４時間振盪培養し、種培養液として用いた。

一方、ペプトンｌＯｇ／Ｌイーストエキス５ｇ／ｌ、肉
エキス７ｇ／β、ＤＬ−プロリン２５ｇ　／　ｌおよび
塩化す）　ＩＪウム３ｇ／ｌを含む培地（ｐＨ７，０）
１４！を２ｐ容量のミニジャーファーメンタ−に分注し
、１２０℃、３０分間オートクレーブにかけて滅菌し主
培養培地とした。この培地に種培養液１２０ｍ１を無菌
的に接種し、３０℃で２４時間通気攪拌培養（通気量１
．０〜″い、１）シた。得られた培養液を遠心分離＜１
０．０００ｒｐｍ、　１０分間）し、上澄液を以下実施
例１と同様の分離、回収操作を行ないＤ−プＤ　ＩＪン
２．２ｇ（光学純度９９５ｅｅ％以上）を得た。

旋光度〔α〕２０＝半８４．５°　（ｃ＝１０．水）発
明の効果 本発明方法により、医薬品および各種工業薬品の合成中
間体として重要なアミノ酸であるＤ−プロリンを安価に
かつ効率よく製造することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）キャンジダ属またはトリコスポロン属に属し、Ｌ
   −プロリンの分解活性を有する微生物の培養物、菌体ま
   たはそれらの処理物を水性媒体中で、ＤＬ−プロリンに
   作用させ、Ｌ−プロリンを選択的に分解し、該水性媒体
   よりＤ−プロリンを採取することを特徴とするＤ−プロ
   リンの製造法。