JPH04187632A - 新抗腫瘍性抗生物質レゾルチオマイシン及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はストレプトミセス属に属する微生物を培養して
、その培養物から得られる新規な抗腫瘍性抗生物質レゾ
ルチオマイシンに関するもの及び本発明はレゾルチオマ
イシンの製造法に関するものである。

（従来の技術と発明が解決しようとする課題）従来、微
生物が生産する種々の抗腫瘍性抗生物質が知られている
が、ヒトの癌を制圧する有効な化学療法剤として有用で
ある抗生物質は極めて少ない。本発明者らは、それ自身
抗腫瘍作用を示しつつ、現用されている抗腫瘍剤の効果
を促進する物質が放線菌の培養液中に産生されているこ
とを発見した。その抗腫瘍性抗生物質を単離してレゾル
チオマイシン（Ｒｅｓｏｒｔｈｉｏｍｙｃｉｎ）と命名
し、これを研究してレゾルシノールの誘導体であること
が判明したが、その構造が類似する抗生物質は未だ知ら
れていない。本発明の目的は、新規な抗腫瘍性抗生物質
レゾルチオマイシンならびにその製造法を提供すること
にある。

（課題を解決するための手段） 第一の本発明の要旨とするところは、次式Ｈ・ｃ　ｓ　
、ｃ、○ で表わされる新規な抗腫瘍性抗生物質レゾルチオマイシ
ンおよびその塩にある。

本発明にかかる新抗生物質レゾルチオマイシンの性状は
次に示す通しである。

レゾルチオマイシンは、無色〜淡黄色の油状物質であり
、メタノール、エタノール、酢酸エチル、クロロホルム
、及びジメチルスルホキサイドに易溶であるが、水、ヘ
キサンには不溶である。比旋光度〔α〕ｒ＝−４，３４
°（ｃ　＝１．１９．メタノール）。

元素分析値は、Ｃ５９，１５％、Ｈ７，０４％、０２２
．５４％、８１１．２７％を示しＣ工４Ｈ２ｏ０４Ｓの
理論値（Ｃ５７，６８％、Ｈ７，１０％、０２３．２３
％、３１０．７６％）によく一致し、この分子式はレゾ
ルチオマイシンのＥＩマイスペクトルによって証明され
た。

レゾルチオマイシンのクロロホルム中で測定した赤外部
吸収曲線は添付図面の第１図に示すごとくである。紫外
部及び可視部吸収曲線は第２図に示すごとく、中性及び
酸性メタノール中で２８５ｎｍに吸収極大を示し、０．
０ＩＮ水酸化ナトリウム含有メタノール中では３５０ｎ
ｍに吸収極大を示した。重クロロホルム中で測定した１
Ｈ核磁気共鳴スペクトルは第３図に示すごときシグナル
を示し、１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル（重クロロホルム
中）は第４図のごとくであった。

レゾルチオマイシンの構造は実施例２に示した方法で得
たサンプルを用い、上記核磁気共鳴及び他の物理化学的
測定により、Ｓ−メチル　２，４−ジヒドロキシ−３，
６−シメチルー５−（３−ヒドロキシブチル）チオベン
ゾエートと決定された。この物質は新規抗生物質である
ことが確認された。

レゾルチオマイシンは、栄養寒天培地中で黄色ブドー球
菌、枯草菌、その他のグラム陽性細菌。

大腸菌、サルモネラ菌その他のグラム陽性細菌、及び酵
母菌、カンジダなどのカビ類の増殖を１００μｇ／ｍＱ
で全く抑制しなかったが、後記の試験例で示す如く、マ
ウス白血病Ｌ５１７８Ｙ細胞の増殖を１５．５μｇ／ｍ
Ｑで５０％抑制した。また、４０μｇ／ｍΩのレゾルチ
オマイシンはチャイニーズハムスターＶ７９細胞に対す
るビンクリスチンやアクチノマイシンＤの作用を３倍増
強した。従って、レゾルチオマイシンは抗腫瘍剤および
併用による抗腫瘍剤の効果増強剤としての用途が考えら
れる。

本発明の第二の要旨とするところは、ストレプトミセス
属に属するレゾルチオマイシン生産菌を培養してレゾル
チオマイシンを蓄積せしめ、その培養物からレゾルチオ
マイシンを採取するレゾルチオマイシンの製造法にある
。

レゾルチオマイシン生産菌の一例は、昭和５９年神奈川
県伊勢原市において採取した土壌より分離された放線菌
で４５８−６の菌株番号が付された菌株がある。

この４５８−６の菌学的性状は下記の通りである。

１、形　態 ４５Ｈ−６株は、顕微鏡下で分枝した基生菌糸よりほぼ
まっすぐで先が小さな螺旋状の気菌糸を形成し、輪生波
は認められない。成熟した胞子は１０〜２０個ぐらい連
鎖し、先の方は小さな螺旋状を描いている。胞子の大き
さは０．５〜０．９　Ｘ　Ｏ，８〜１．０μｍぐらいの
円筒状であり、表面は平滑である。

２、各培地における生育状態（２７°Ｃで培養して２週
間後の観察） 気菌糸はほとんどの培地において灰色を呈したが、未成
熟な気菌糸は赤味もしくは黄味を呈する場合があった。

コロニーの裏面はうすい黄色〜黄茶色もしくは灰黄茶色
を呈した。

（１）シュクロース・硝酸塩寒天培地 発育は僅かである。明るい褐灰色の気菌糸を中程度に着
生し、溶解性色素は認められない。

（２）グルコース・アスパラギン寒天培地発育は中程度
である。淡褐色の気菌糸を良好に着生し、淡黄褐色の溶
解性色素を認める。

（３）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−培
地５） 発育は中程度である。褐灰色の気菌糸を中程度に着生し
、淡橙色の溶解性色素を認める。

（４）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ−培地４）発
育は良好である。褐灰色の気菌糸を豊富に着生し、淡褐
色の溶解性色素を認める。

（５）チロシン寒天培地（ＩＳＰ−培地７）発育は中程
度である。茶色の気菌糸を良好に着生し、溶解性色素は
認められない。

（６）栄養寒天培地 発育は僅かである。気菌糸も生ぜず、溶解性色素も認め
られない。

（７）イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ−培地２）発育
は良好である。褐灰色の気菌糸を豊富に着生し溶解性色
素は認められない。

（８）オートミール寒天培地（ｌ５Ｐ−培地３）発育は
良好である。褐灰色の気菌糸を良好に着生し、淡黄褐色
の溶解性色素を認める。

３、生理・生化学的性質 （１）ゼラチンの液化 グルコース・ペプトン・ゼラチン培地でゼラチンの液化
が認められる。

（２）スターチの加水分解 スターチ・無機塩寒天培地でスターチの加水分解が認め
られる。

（３）脱脂牛乳の凝固・ペプトン化 明らかな凝固は認められず、ペプトン化が認められる。

（４）メラニン様色素の生成 チロシン・イーストエキス培地、千ロジン寒天培地及び
ペプトン・イーストエキス・鉄寒天培地でメラニン様色
素の生成が認められる。

（５）炭素源の利用性 炭素源の資化性はプリドハム・ゴトリーブの基礎培地Ｎ
ａ　９を用いて２７℃で１４日間培養して判定した。Ｄ
−グルコース、叶キシロース、Ｌ〜アラビノース、し−
ラムノース、Ｄ−フルクトース、ラフィノース、Ｄ−マ
ンニトール、イノシトールを利用して良く発育したが、
シュクロースは利用しなかった。

なお、細胞壁成分は、全菌体を用いて分析したところ、
ＬＬ−ジアミノピメリン酸が検品された。

（６）生育温度 イースト・麦芽寒天培地及びオートミール寒天培地にお
いて２０〜４０℃の範囲で生育し、至適温度は前者で２
７〜３７℃、後者では２７〜３０℃であった。

以上、４５Ｈ−６株は、その形態学的特徴と細胞壁タイ
プよりストレプトミセス属に帰属する。さらに、形態、
培養性状、生理・生化学的性状などの特徴から、４５Ｈ
−６株はストレプトミセス・コリナスであることが判定
される。

なお、４５Ｈ−６株は、工業技術院微生物工業技術研究
所に平成元年５月３１日寄託申請し、受託番号は微工研
菌寄第１０７５３号である。

４５Ｈ−６株は、他の放線菌の多くの菌株の場合にみら
れるように、その性質が変化しやすく、例えば紫外線、
エックス線、放射線、薬品などを用いる人工的変異手段
で変異しうるものであるが、いずれの変異株であっても
抗生物質レゾルチオマイシン生産能を有するものはすべ
て本発明の方法に使用することができる。

本発明のレゾルチオマイシンの製造法を実施するに当た
っては、レゾルチオマイシン生産菌、例えばストレプト
ミセス・コリナス４５Ｈ−６株を栄養源含有培地に接種
して好気的に培養して発育させることによってレゾルチ
オマイシンを含む培養物を得る。用いる培地中の栄養源
としては、放線菌の栄養源として用いられる公知のもの
が使用できる。例えば、市販されているペプトン、肉エ
キス。

コーン・スチープ・リカー、綿実粉、落花生粉、大豆粉
、酵母エキス、ＮＺ−アミン、カゼインの氷解物、魚粉
、硝酸ソーダ、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウムな
どの窒素源、および市販されているグリセリン、蔗糖、
澱粉、グルコース、マルトース、糖蜜などの炭水化物、
あるいは脂肪などの炭素源を使用できる。また、食塩、
リン酸塩。

炭酸カルシウム、硫酸マグネシウムなどの無機塩を添加
できる。その他、必要に応じて微量の金属塩を添加する
こともできる。これらのものは生産菌が利用し、レゾル
チオマイシンの生産に役立つものであればよく、公知の
放線菌の培養材料はすべて用いることができる。

本発明によって得られる培養物から、例えば培養濾液か
らレゾルチオマイシンを採取するに当たっては、レゾル
チオマイシンの性状を利用した通常の分離手段、例えば
溶剤抽出法、イオン交換樹脂法、吸着または分配クロマ
ト法、沈澱法などの操作を単独又は適宜組合わせて抽出
精製することができる。また、遊離の形で得られたレゾ
ルチオマイシンの溶液を、塩基、例えば水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウムなどのアルカリ金属化合物、水酸化
カルシウム、水酸化マグネシウムなどのアルカリ土類金
属化合物、アンモニウム塩などの無機塩基、エタノール
アミンなどの有機塩基により処理すれば、レゾルチオマ
イシンはそれら用いた塩基の塩類の形で分離することが
できる。

以下に実施例を示すが、レゾルチオマイシンの性状と化
学構造が本発明によって明らかになったので、その性状
に基づきレゾルチオマイシンの製造法を種々考案するこ
とができる。従って、本発明は実施例に限定されるもの
ではなく、実施例の修飾手段は勿論、本発明によって明
らかにされたレゾルチオマイシンの性状に基づいて公知
の手段を施してレゾルチオマイシンを生産、濃縮、抽出
。

精製する方法をすへて包括する。

実施例１ オートミール寒天培地（１リツトルの培地中オートミー
ル２０ｇ、イーストエキス１ｇ、寒天１５ｇ）の寒天斜
面培地に培養したストレプトミセス４５Ｈ−６株（微工
研菌寄第１０７５３号）を、同し組成の液体培地１００
ｍＱを含む坂ロフラスコに接種し、２７℃、４日間振盪
培養を行なった。培養液４リツトルを遠心（毎分１万回
転、１５分）により上清と菌体とに分けたのち、上清に
ダイヤイオンＨＰ−２０樹脂（三菱化成社製）４００ｍ
１２を加え吸着させ、その後、樹脂を水洗し、メタノー
ル４リツトルで溶出、溶出した液を減圧濃縮後、水に溶
解させた。これをＩＮ塩酸でｐＨ３にし、酢酸エチル６
４０ｍＱで３回に分けて抽出、酢酸エチル層を減圧濃縮
乾固の後、クロロホルム層に溶解させ、シリカゲルカラ
ムクロマトグラフィを行なった。クロロホルム−メタノ
ール（２０（１：　ｌ）で溶出して得られた活性成分を
減圧濃縮乾固後、メタノールに溶解し、ＯＤＳ逆相高速
液体クロマトグラフィにかけたところ、保持時間２４分
に均一な活性のピークが現れた。活性画分を集めて減圧
下に濃縮乾固したところ、　２．５■のレゾルチオマイ
シンが得られた。〔α）６’　＝−４，３４°（Ｃ＝１
．１９．メタノール）。

実施例２ 大量のレゾルチオマイシンを得るために、ジャー培養器
２基にオートミール・イーストエキス培地をそれぞれ３
０リットル入れ、種培養液（坂ロフラスコによる培養）
　６００ｍＲずつ加え、さらに２７℃、１２０時間培養
した（毎分２００回転、通気量毎分１０リツトル）。培
養液６０リツトルはセライト（ジョンス・マンビル社製
）を加えて吸引濾過したのち、上清をｐＨ３に合わせ、
これを酢酸エチル１００リツトルで抽出した。その後は
、実施例１と同様にして分離精製を行ない、高速液体ク
ロマトグラフィによる分画により３９．１■のレゾルチ
オマイシンを得た。

次に、試験例によって、本発明によるレゾルチオマイシ
ンは、癌細胞の増殖を抑制する作用をもつこと（試験例
１）及び抗癌剤の効果を増強する作用をもつこと（試験
例２）を例証する。

試験例１ マウス白血病Ｌ５１７８Ｙ細胞をウシ胎児血清１０％を
含むＲＰＭ１１６４０培地で３７℃で３日間培養すると
、１５．０００個／ｍＱの細胞が９８万個／ｍＱに増え
た。このとき、レゾルチオマイシンを種々な濃度で培地
中に加えておくと、その濃度に応じて細胞の増殖は阻害
され、１５．５μｇ／ｖｎＱのレゾルチオマイシン濃度
で細胞の増殖の５０％阻害（ＩＣ５゜）が観察された。

試験例２ チャイニーズハムスターＶ７９細胞を、１０％コウシ血
清を含むイーグルＭＥＭ培地中に２００〜３００細胞／
プレートの細胞濃度でまき、２０時間後に抗腫瘍剤とし
て知られるビンクリスチンを培地に添加し３７℃で７〜
８日間培養した。その後、プレート上の細胞を１０％ホ
ルマリン溶液で固定、クリスタルバイオレットで染色し
、コロニーの数を数えたところ、ビンクリスチンのＩＣ
，、は１７．３ｎｇ／ｍΩであったが、ビンクリスチン
とともにレゾルチオマイシンを４０μｇ／ｎ＋Ｑ添加す
ると、ビンクリスチンのＩＣ５ｏは５．１ｎｇ／−Ｑと
なり、ビンクリスチンの抗癌効果を３．４倍増強した。

同様の実験で、レゾルチオマイシン４０μｇ／ｍＱはア
クチノマイシンＤの効果を３．３倍増強した。

【図面の簡単な説明】

添付図面の第１図はレゾルチオマイシンのクロロホルム
中で測定した赤外部吸収曲線を示す。第２図は中性・酸
性メタノール中および０．０１　Ｎ水酸化ナトリウム含
有メタノール中で測定したレゾルチオマイシンの紫外部
および可視部吸収曲線を示す。第３図は重クロロホルム
中で測定したレゾルチオマイシンの１Ｈ核磁気共鳴スペ
クトル（５００１’１Ｈｚ）であり、第４図はその１３
Ｃ核核気共鳴スペクトル（１００Ｍ七）である。 り明伺

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ で表わされる抗腫瘍性抗生物質レゾルチオマイシンおよ
   びその塩。 ２、ストレプトミセス属に属するレゾルチオマイシン生
   産菌を、栄養源を含有する培地中で培養し、その培養物
   からレゾルチオマイシンを採取することを特徴とするレ
   ゾルチオマイシンの製造法。