JPS6348284A - 新抗生物質ｙｐ−０２９０８ｌ−ａおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、化合物ＹＰ−０２９０８Ｌ　７　Ａおよび発
酵法による該化合物の製造法に関する。

（発明が解決しようとする問題点、解決するための手段
） 本発明の化合物ＹＰ　−０２９０８Ｌ　−Ａはつぎの化
学構造式並びに理化学的性状によって特定される化合物
である。

理化学的性状： １）紫外線吸収スペクトル：メタノール中に於て特徴あ
る吸収を示さない。

２）赤外線吸収スペクトル：臭化カリウム錠剤法による
赤外線吸収スペクトルを第１図に示す。

３）水素核磁気共鳴スペクトル二重クロロホルム中での
５００ＭＨｚの１Ｈ核磁気共鳴スペクトルを第２図に示
す。メチレンクロライドより得られた結晶を使用した。

４）炭素核磁気共鳴スペクトル二重クロロホルム中での
１００ＭＨｚの１３ｃ核磁気共鳴スペクトルに於て第３
図に示すように２４個のシグナルが検出される。

δ（ｐｐｍ）　：１９１．４１．１７１．６７、１７０
．８２．１４１．７２゜１４０．８３．１３２．８３．
１２１．２８．８４．９７゜８３．７１．８２．３４．
５２．２９．４５．１７．４２．４０゜３７．７６、３
４．８］、　３３．９１．３２．４２．３０．３６゜２
７．４０．２５．９２．２３．７８．２３．６６、２０
．７０゜２３．３８ ５）質量分析：　ＦＡＢ−ＭＳに於て４］、７（ＭＨ”
）および４３９　（Ｍ＋Ｎａ”）が検出される。

６）分子量：４１６ ７）分子式Ｃ２４Ｈ３２ｏ６ ８）外　　観：白色粉末 ９）比旋光度：　［α］％、’＋３１°（Ｃ＝１．Ｍｅ
ＯＨ）、メチレンクロライドより得られた結晶を使用し
た。

１０）　　融　　点：１５９°Ｃで発泡融解、メチレン
クロライドより得られた結晶を使用した。

１１）塩基性・中性・酸性の区別：酸性物質１２）溶解
性：メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、
ジクロルメタンおよびクロロホルムに可溶 水およびｎ−ヘキサンに不溶 １３）　　薄層クロマトグラフィーのＲｆ値ニジリカゲ
ル６０Ｆ２．　（メルク社製）を使用、検出はＵＶ２５
゜ｍ １４）Ｘ線構造解析： メチレンクロライド溶液よりＸ線解析に適する結晶を得
た。結晶学的データを以下に示す。Ｃ２４Ｈ３２０１ｆ
ＣＨ２Ｃ１２５Ｍγ＝　５０１．４５．　単斜晶系、空
間群Ｃ２゜ａ＝２０．５０９（３）、　ｂ　＝　１０．
２１４（１）、　ｃ　＝　１２．３７２（１）Ａ。

β−９２，８４（２）−ｚ＝４．　ｄｍ＝　１．２８ｇ
／ｃｍ３．　ｄｃ＝　１．２８　ｇ／ｃｍ’。

線源としてＣｎＫα（λ−１，５４１８４Ｘ）線を用い
、理学電析 機製ＡＦＣ−５Ｒ型４軸自動回析計により９強度ゼロ。

の反射１２７個を含む２３５０個（２θ＜１３０°）反
射強度を測定した。構造は直接法とフーリエ合成法によ
って解き、精密化は対角近似最小二乗法により行った。

各原子の帰属は、電子密度分布図中のピークの高さ、温
度因子等に基づいて行った。水素原子は幾可学的計算に
より求めたが、精密化に含めなかった。溶媒分子（ＣＨ
２Ｃ１２）は２回軸のまわりで乱れており、電子密度を
特定することはできなかった。最終の信頼度因子は１Ｆ
ｏｌ）３σの２０４０個の反射について１０％であった
。ＹＰ−０２９０８Ｌ−Ａ分子の非水素原子の座標を表
２に示す。

表　　２ 表中Ｂの値は非゛等方性温度因子より計算された等価温
度因子である；　Ｂ＝８π２（ｕ、＋ｕ２＋ｕ３）／３
゜ここで”ＩＴ　ｕ２＋　”３は平均二乗偏位マトリッ
クスＵの主成分項である。〈〉内の値は異方度であり。

（Σ（Ｂ−８π２Ｕｉ　）”／３　）’で定義される。

また、（）内の値は標準偏差である。

（発明の効果） ＹＰ−０２９０８Ｌ　−Ａ　化合物は、各種１ｗＪ菌株
ニダラム陽性菌に対し抗菌作用を示すと共に、各種腫瘍
細胞に対し９強い細胞障害作用を有している。

つぎに、これらの作用を測定方法と共に示す。

（１）抗菌作用 実験方法： ＹＰ−０２９０８Ｌ　−Ａ物質に／ｌ’　夕／　−ルを
加え５００μｇ／ｍｌの溶液を作る。８ｍｍ径の抗菌活
性測定用の薄手のペーパーディスク（東洋製作新製）に
この溶液をしみ込ませ、余分な液を除いたのち。

各種被検菌にてペーパーディスク・アッセイを行った。

被検菌は３７℃で１６時間培養を行い、生じる生育阻止
円径（ｍｍ）を測定した。

結　果二表３に示す通りである。

ＡＧミー−ラー・ヒントン寒天培地（栄研製）Ｂニハー
ド・インツー−ジョン寒天培地（栄研製）（２）：腫瘍
細胞を用いる試験管内細胞障害作用試験方法： Ｉ　Ｘ　１０’　ｃｅｌｌｓ／ｍ７に調整したＬ１２１
０”　（ｅｓｔａ−ｂｌｉｓｈｅｄ　ｃｅｌｌ　１ｉｎ
ｅ）、Ｐ２Ｓ５”　（ｐｒｉｍａｒｙ　ｃｕｌｔｕｒｅ
ｄ　ｃｅｌｌ）の各細胞液１　ｍｌにエタノールで溶解
した各濃度のＹＰ　−０２９０８Ｌ　−Ａ化合物４μｔ
を加え。

３７℃の炭酸ガス培養器中で３日間培養した後、トリパ
ンブルー染色法により生残細胞を計数した。細胞障害活
性は、薬剤無添加の細胞数を対照として各濃度での細胞
増殖抑制率を算出し、グラフ上にプロットして求めた。

使用したｍｅｄｉｕｍ　： ＷＲＰＭＩ　−１６４０＋　１０％新生子牛血清＊＊Ｒ
ＰＭＩ−１６４０　＋　５％牛脂児血清＋５μＭ２−ヒ
ドロキシエチル　ジスルフィド結果：　表４に示す通り
である。

（Ｍ進法） ＹＰ　−０２９０８Ｌ　−Ａ化合物は、ストレプトミセ
ス属に属するＹＰ　−０２９０８Ｌ　−Ａ化合物生産菌
を培養し、培養物からＹＰ　−０２９０８Ｌ　−Ａ化合
物を採取することにより製造することができる。

この製造法で使用するＹＰ　−０２９０８Ｌ　−Ａ化合
物生産菌の一例としては９本発明者が沖縄県坐間味島の
土壌より分離したストレプトミセスエスピー（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ、　）　ＹＰ　−０２９０８Ｌ
株（微工研菌寄第８６１０号）を挙げることができる。

この菌株の菌学的性状を以下に記す。

（１）形態 本菌株は各種合成及び天然培地において生育し、イース
ト麦芽寒天、チロシン寒天及びベネノト寒天培地で気菌
糸を良好に着生し、胞子を豊富に形成する。気菌糸の分
枝は単純分枝で。

その先端は開℃・たらせん状（０ｐｅｎ　５ｐｉｒａｌ
　）を示す。

気菌糸の形状はセクションスビラレス（Ｓ）又はレティ
ナキュリアペルティ（ＲＡ　）である。

輪生糸、胞子のう及び菌核形成は認められた℃・。電子
顕微鐘での観察で胞子鎖は１０個以上の連鎖を認め、胞
子の大きさは０５〜０．７　Ｘ　１．０〜１．４μｍで
あり、その表面構造はとげ状から毛状である。

（２）各秤寒天培地上の性状 各種寒天培地上の性状は下表５に示すとおりである。

特に記載しなし・限り、２８°Ｃで２１日間培養し。

常法に従って観察したものである。色調の記載にすし・
ては１色の標準（日本色彩研究所）によった。

表５ （注）　Ｇ：生育及び集落表面の菌叢色Ｒ；裏面の色相 Ｓ；可溶性色素 （注）生育温度は各温度（５，１０，１５，２０，２５
，２８，３０゜３３．３７，４０，４５．５０°Ｃ）で
７〜２１日までの観察結果。ミルクに対する作用は３７
℃で３〜２１日までの観察結果。それ以外は特に指摘の
ない限り２８°Ｃで２週間後の観察結果を示す。

（４）炭素源の資化性（プリドハム・ゴドリーブ寒天培
地。

２８℃培養） 表７ （注）＋；生育する　　　　士；生育が疑わしい一；生
育しない （５）　　ジアミノピメリン酸（ＤＰＡ）の分析ＬＥＣ
ＨＥＶＡＬＩＥＲらの方法（ＬＥＣＩ（ＥＶＡＬＩＥＲ
，Ｍ、Ｐ、ｅｔ　ａｌ　；ＰＰ　２２７−２２８　ｉｎ
　Ｄｉｅｔｚ、　Ａ、ｅｔ　ａｌ　ｅｄ、、　Ａｃｔｉ
ｎｏｍｙｃｅｔｅＴａｘｏｎｏｍｙ、Ｓ　Ｉ　Ｍ　５ｐ
ｅｃｉａｌ　ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　４６．１９８０
年）に従℃・９本菌株の菌体の酸加水分解物の分析を行
った結果ＬＬ’−ＤＡＰが検出された。

以上の性状を要約すると、　　ＹＰ−０２９０８Ｌ株は
気菌糸が単純分枝で、その形状はセクションスビラレス
（Ｓ）又はレティナキュリアペルティ（ＲＡ　）であり
９色相は生育が灰白〜うす黄茶、気菌糸が灰白〜明るい
灰を呈す。可溶性色素、メラニン様色素の生成は認めら
れなし・。また菌体の酸加水分解物の分析より、　　Ｌ
Ｌ−ジアミノピメリン酸が検出された。

上記諸性質より２本菌株はストレプトミセス＝−ア７９
．オブ、デ、ミネヶイブ、７．クヶリオ゛ξ。

ロジー（Ｂｅｒｇｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔ
ｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　）
第８版、　　１９７４年」、［インターナショナル・ジ
ャーナル・オプ・システマティック・バクテリオロジー
（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉ−ｏｌｏｇｙ
　）第１８巻、２号、　６９−１８９頁、４号、２７９
−３９２頁（１９６８）　、第１９巻、４号、　３９１
−５１２頁（１９６９）、第２２巻、４号、　　２６５
−２９４頁（１９７２）　Ｊより検索した。その結果、
ストレプトミセスルビギノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓ　ｒｕｂｉｇｉｎｏｓｕｓ　）及びストレフトミセ
ス　グリセオフラプス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒ
ｉｓｅｏｆｌａｖｕｓ　）が類似菌種としてあげられる
。しかし、ストレプトミセス　ルビギノサスはオートミ
ール寒天培地で赤色の可溶性色素を産生ずルコト及ヒシ
ュクロース、Ｄ−マンニトールを生育に利用できる点で
、　ＹＰ−０２９０８Ｌ株とは異なっている。一方スト
レプトミセス　グリセオフラプスとＹＰ−０２９０８Ｌ
株との菌学的性状を比較すると次表８の通りである。

以上のようにＹＰ−０２９０８Ｌ株は、気菌糸の形態及
び色調、胞子表面構造、各種生理的性質などに関してス
トレプトミセス　グリセオフラプスと一致する点がある
が、生育温度範囲、スターチの加水分解力、硝酸塩の還
元力及び糖の利用性などの点では異っている。以上のこ
とからＹＰ−０２９０８Ｌ株はストレプトミセス　グリ
セオフラプスに近縁ではあるが必ずしも一致せず。

又他の既知菌株の中にも本菌株と一致する菌株は見い出
せなかった。従って本菌株を新種と判断し、とりあえず
ストレプトミセス・ニス・ピー　（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ　ｓｐ、　）　ＹＰ　　０２９０８　Ｌと命名し
た。

本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に。

受託番号微工研菌寄第８６１０号として寄託されている
。

本発明に用いられる菌株は、他の放線菌にも見られるご
と＜９．人工的にまた自然に変異をおこしやす℃・が９
本発明のいつＹＰ−０２９０８Ｌ株は天然から分離され
た放線菌、あるいはこれを紫外線、Ｘ線、化学薬剤など
で人工的に変異させた菌株及びそれらの自然変異株をも
包含するものである。

本発明の新菌種に属する微生物は天然の土壌より分離し
て取得したものであるが、前記微生物工業技術研究所に
寄託した菌株の凍結乾燥品を復元することによって容易
に取得することができる。本発明におし・て、ストレプ
トミセス属に属するＹＰ−０２９０８Ｌ　−Ａ化合物生
産菌の培養は一般微生物の培養方法に準じておこなわれ
るが通常は液体培地による深部培養法が有利である。培
養に用いられる培地としては、該生産菌が利用する栄養
源を含有する培地であればよい。

すなわち合成培地、半合成培地あるいは天然培地が用℃
・られ、培地の組成は、たとえば炭素源としては　Ｄ−
キシロース、グルコース、Ｄ−７ラクトース、Ｌ−ラム
ノース、マンニトール。

グリセリン、デキストリン、殿粉、植物油などが、窒素
源としては肉エキス、ペプトン、グルテンミール、綿実
粕、大豆粉、落花生粉、魚粉。

コーンスチープリカー、乾燥酵母、酵母エキス。

硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素その他の有
機または無機の窒素源が用℃・られる。

また金属塩としてはＮａ、　Ｋ、　Ｍｇ、　Ｃａ、　Ｚ
ｎ、　Ｆｅなどの硫酸塩、硝酸塩、塩化物、炭酸塩、燐
酸塩などが必要に応じて添加される。さらに必要に応じ
て、メチオニ石システィン、シスチン、　オレイン酸メ
チル、ラード油、シリコン油、界面活性剤などの抗生物
儒生成促進物質又は消泡剤が適宜使用される。

培養条件と１〜ては好気的条件下に培養するのが一般的
に有利で、培養温度は約１８〜３５℃の範囲が望ましく
、好ましくは約３０°Ｃ附近が用℃・られ、培地のｐＨ
は約５〜１０．好ましくは約６〜８の範囲に保持すると
好結果が得られる。

培養期間は培地の組成、温度などによって変動するが、
一般に１〜５日程度でよく、培養終了時に目的物質が選
択的に蓄積される。

培養物より本発明の目的物を単離採取するには通常の微
生物の培養物より抗生物質を単離する方法が適用される
。Ｙｐ−ｏ２ｃ＋ｏｓ　Ｌ　−Ａ化合物は培養液中に含
有されるので、遠心分離またはｒ過により菌体を除去し
た後、濾過液から有効物質の抽出をおとなう。すなわち
適当な溶剤に対する溶解性および溶解度の差、溶液から
の析出性および析出速度の差２種々の吸着剤に対する吸
着親和性の差、２種の液相間における分配の差などを利
用する一般の抗生物質の製造に用いられる手段によって
２分離、採取、精製される。この方法は必要に応じて単
独に用いられ。

あるいは任意の順序に組合せ、また反覆して適用できる
。

次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。

実施例　１゜ 白色デキストリン２０％、グルコース０．５％、ポリペ
プトン０．５％、酵母エキス０．５％、コーンステイー
プ・リカー０５％、肉エキス０．３％、プレイン・ハー
ト・インツー−ジョン０．５２％及び炭酸カルシウム０
２％を含む培地（ｐＨ８，０）を作製し、これを５００
ｍ１三角フラスコに各６０　ｍｌずつ分注し、１２０°
Ｃで２０分間滅菌したものにベネノト寒天培地上に生育
させたストレプトミセス・エスピーＹＰ　−０２９０８
Ｌ株の菌糸をかき取って接種し、２７℃で７２時間振盪
培養を行なし・種培養液とする。つぎに白色デキストリ
ン３．０％、クルコース３０％、ニスサンΦミート１５
％、ファーマ・メディア１．５％、　リン酸水素二カリ
ウム０．０６％、リン酸水素−カリウム００２５％及び
塩化コバルト・６水塩０．０００４％を含む培地（ｐｒ
（７，０）を３１作製し、これを５００　ｍｌ三角フラ
スコに各６０　ｍｌずつ分注し、１２０℃で２０分間滅
菌したものに種培養液を３０％の割合で植菌した。２７
°Ｃで９６時間振盪培養を続けるとバチルス・サブチリ
スＡＴＣＣ６６３３株に対する抗菌活性は最大となる。

このようにして得られた培養液にラジオライト＃６００
（昭和化学工業製）を加えて攪拌の後、１過するとｆ液
２．５乙が得られる。とのＰ液に０．１規定の塩酸を加
えてｐＨ７，０に調整した後、２５ｔの酢酸エチル層を
分離して、これに無水硫酸ナトリウムを加えて脱水する
。つぎに脱水された酢酸エチル層を減圧濃縮すると淡黄
色オイル状物質が３３０　ｒｆ１ｇ得られる。

得られた淡黄色オイル状物質３３０　ｍｇを少量のクロ
ロホルムに溶解し、ワコー・ゲル　Ｃ−２００（和光紬
薬製）８ｇをクロロホルムにて充填したカラムに乗せ、
クロロホルム：メタノール（４０：１）を展開溶剤とす
るカラム・クロマトグラフィーを行ないバチルス・サブ
チリスＡＴＣＣ６６３３株に抗菌活性を示す画分を集め
て減圧濃縮すると微黄色粉末が１８７　ｒｌ１ｇ得られ
る。

得られた微黄色粉末１８７　ｍｇを少量のメタノールに
溶解させた後、メルク社製シリカゲル６０Ｆ２５４薄層
プレートに帯状に塗布して、クロロホルム：メタノール
（９：１）を展開溶剤とする薄層クロマトグラフィーを
行なし・、　Ｒｆ値０．４を示し、かつバチルス・サブ
チリスＡＴＣＣ６６３３株に抗菌活性を示す部分をかき
取り、かき取ったシリカゲル粉末をカラムにつめ、クロ
ロホルム：メタノール（９：ｌ）で抗菌活性物質を溶離
させた後、減圧濃縮すると白色粉末として純粋な新抗生
物’］　ＹＰ　−０２９０８Ｌ−Ａ物質が４０１Ｔ１ｇ
得られた。

なお９本実施例で得られた純粋なＹＰ　−０２９０８Ｌ
　　４−Ａ物質４’Ｏｒ［１ｇをメチレンクロライド２
　ｍｌに溶解させた後、室温に放置すると結晶が析出す
る。この結晶をＰ取して乾燥するとＹＰ−０２９０８Ｌ
　−Ａ物質の無色結晶が３５ｍｇ得られた。

ＹＰ−０２９０８Ｌ　−Ａ物質の理化学的性状は、前述
の通りである。これらの理化学的性状から、ＹＰ−０２
９０８Ｌ　−Ａ物質の化学構造式はつぎの通り決定され
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、　ＹＰ−０２９０８Ｌ　−Ａ物質の赤外線吸
収スペクトルを示す。 第２図は、　ＹＰ−０２９０８Ｌ　−Ａ物質の水素核磁
気共鳴スペクトルを示す。 第３図は、　ＹＰ−０２９０８Ｌ　−Ａ物質の１３Ｃ核
磁気共鳴スペクトルを示す。 手続補正書 昭和６１年１０月１日 昭和６１年特許願第１９２２４４号 ２、発明の名称 新抗生物質ＹＰ−〇２９０８Ｌ−Ａおよびその製造法３
、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 住　所　　　東京都中央区日本橋本町２丁目５番地１名
称（Ｌ４７）山之内製薬株式会社 代表者森岡茂夫 ４、代理人 住　所　　　東京都板橋区小豆沢１丁目１番８号７、補
正の内容 （１）明細書第３頁下から１行ｒ２３．３８Ｊをｒ２０
．３８Ｊに訂正する。 （２）同第５頁第６行のｒｄｍ＝１．２８ｇ／ｃｍ”、
　ｄｃ＝１．２８ｇ／ｃｍ３」を「Ｄｍ＝１．２８ｇ／
ｃｍ３．　Ｄｃ＝１．２８ｇ／ａｍ”」に、第７行「Ｃ
ｎＫα」を’ＣｕＫα」にそれぞれ訂正する。 （３）同第９頁表４のｒＰ３３８に対して」をｒＰ３８
８に対して」に訂正する。 （４）同第１３頁表６「硝酸還元作用」を「硝酸塩の還
元作用」に訂正する。 （５）同第１４頁表７「ラムノース」を「Ｌ−ラムノー
ス」に訂正する。 （６）同第１９頁最終行「１８〜３５℃」を「１５〜３
０℃」に訂正する。 （７）同第２０頁第１行「約３ｏ℃」を「約２７℃」に
訂正する。 （８）同第２２頁第７〜８行’ｐＨ７，○に調整した後
、２．５１の酢酸エチル層を分離して・・・」を’ｐＨ
７，０に調整した後、２．５１の酢酸エチルを加えてよ
く撹拌する。 酢酸エチル層を分離して・・・」に訂正する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下式で示されるＹＰ−０２９０８Ｌ−Ａ化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼ ２、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属
   に属するＹＰ−０２９０８Ｌ−Ａ化合物生産菌を培養し
   、培養物からＹＰ−０２９０８Ｌ−Ａ化合物を採取する
   ことを特徴とするＹＰ−０２９０８Ｌ−Ａ化合物の製造
   法。 ３、ＹＰ−０２９０８Ｌ−Ａ化合物生産菌がストレプト
   ミセスエスピー（Ｓｔｏｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．
   ）ＹＰ−０２９０８Ｌ（微工研菌寄第８６１０号）であ
   る特許請求の範囲第２項記載の製造法。