JPH04190798A - モノクローナル抗体 - Google Patents
モノクローナル抗体Info
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- JPH04190798A JPH04190798A JP2324712A JP32471290A JPH04190798A JP H04190798 A JPH04190798 A JP H04190798A JP 2324712 A JP2324712 A JP 2324712A JP 32471290 A JP32471290 A JP 32471290A JP H04190798 A JPH04190798 A JP H04190798A
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- hybridoma
- monoclonal antibody
- mouse
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明はＮＨ，−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ−ＣＯ
Ｏ）ｌであるペプチドに特異的に反応するモノクローナ
ル抗体、Ｔａｔ−ｍタンパクに特異的に反応するモノク
ローナル抗体、及びモノクローナル抗体を産生ずるハイ
ブリドーマに関する。
Ｏ）ｌであるペプチドに特異的に反応するモノクローナ
ル抗体、Ｔａｔ−ｍタンパクに特異的に反応するモノク
ローナル抗体、及びモノクローナル抗体を産生ずるハイ
ブリドーマに関する。
（従来の技術）
Ｔａｔ−ｍタンパクは、特定のウィルス、例えばエイズ
ウィルスまたはその感染細胞が産生ずるタンパクである
。かかるタンパクは、トランス遺伝子転写制御因子であ
ると言われ、遺伝子発現調節やウィルス増殖に関与して
いる可能性が示唆されている。
ウィルスまたはその感染細胞が産生ずるタンパクである
。かかるタンパクは、トランス遺伝子転写制御因子であ
ると言われ、遺伝子発現調節やウィルス増殖に関与して
いる可能性が示唆されている。
しかし、該タンパクは、特定のウィルスが産生ずる微量
タンパクであり、その局在性及び寿命の制限から、入手
が困難であった。そのため、該タンパクのモノクローナ
ル抗体は得られていなかった。
タンパクであり、その局在性及び寿命の制限から、入手
が困難であった。そのため、該タンパクのモノクローナ
ル抗体は得られていなかった。
Ｔａｔ−ｍタンパクに特異的に反応するモノクローナル
抗体が得られれば、該タンパクの検出が可能になり該タ
ンパクを産生ずるウィルスの感染の有無の診断に応用で
きる他、該タンパクの同定、単離、精製等が可能になり
、これによって、該タンパクの解析、該タンパクを発現
する遺伝子を有するウィルスの遺伝子転写制御機構の解
析、ひいては感染メカニズムの解明も可能になることが
期待される。
抗体が得られれば、該タンパクの検出が可能になり該タ
ンパクを産生ずるウィルスの感染の有無の診断に応用で
きる他、該タンパクの同定、単離、精製等が可能になり
、これによって、該タンパクの解析、該タンパクを発現
する遺伝子を有するウィルスの遺伝子転写制御機構の解
析、ひいては感染メカニズムの解明も可能になることが
期待される。
（発明が解決しようとする課題）
従って、本発明はＴａｔ−ｍタンパクに特異的に反応す
るモノクローナル抗体を提供することを目的とするもの
である。さらに本発明は該モノクローナル抗体を産生ず
るハイブリドーマを提供することをも目的とするもので
ある。
るモノクローナル抗体を提供することを目的とするもの
である。さらに本発明は該モノクローナル抗体を産生ず
るハイブリドーマを提供することをも目的とするもので
ある。
（課題を解決するための手段）
本発明者は、↑ａｔ−ｍタンパクのアミノ酸配列の中か
らエピトープとなる可能性の高い部分ペプチドＮＨ２−
ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰ Ｐ Ｑ−ＧＯＯＲを選択し
、これを抗原として用いることにより、該抗原に対する
抗体産生細胞のハイブリドーマを得、これの産生ずるモ
ノクローナル抗体を得て本発明を完成した。
らエピトープとなる可能性の高い部分ペプチドＮＨ２−
ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰ Ｐ Ｑ−ＧＯＯＲを選択し
、これを抗原として用いることにより、該抗原に対する
抗体産生細胞のハイブリドーマを得、これの産生ずるモ
ノクローナル抗体を得て本発明を完成した。
すなわち本発明はＮＨ２−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰ
Ｐ Ｑ−ＣＯＯＨであるペプチドに特異的に反応するモ
ノクローナル抗体、Ｔａｔ−Ｉ［［タンパクに特異的に
反応するモノクローナル抗体、及び該モノクローナル抗
体を産生ずるハイブリドーマを提供するものである。
Ｐ Ｑ−ＣＯＯＨであるペプチドに特異的に反応するモ
ノクローナル抗体、Ｔａｔ−Ｉ［［タンパクに特異的に
反応するモノクローナル抗体、及び該モノクローナル抗
体を産生ずるハイブリドーマを提供するものである。
以下に本発明の詳細な説明する。
まず、本発明のモノクローナル抗体の製造に使用する抗
原を以下のようにして得ることができる。
原を以下のようにして得ることができる。
旧Ｖ（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ
Ｖｉｒｕｓ）のゲノム塩基配列からＴａｔ−ＩＩ［タ
ンパクのアミノ酸配列が同定されている。その−例を第
１図に示す（Ｃｅｌｌ。
Ｖｉｒｕｓ）のゲノム塩基配列からＴａｔ−ＩＩ［タ
ンパクのアミノ酸配列が同定されている。その−例を第
１図に示す（Ｃｅｌｌ。
４６．６３−７１．１９８６）、これについてＨｏｏｐ
＆ Ｗｏｏｄらの方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ。
＆ Ｗｏｏｄらの方法（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ
ｄ、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ。
７８．３８２４−３８２８．１９８１）を用いて上記Ｔ
ａｔ−ｍタンパクのアミノ酸配列における疎水性領域と
親水性領域を推定し、さらにＣｈｏｕ ＆ Ｆａｓｍａ
ｎらの方法（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ、土工。
ａｔ−ｍタンパクのアミノ酸配列における疎水性領域と
親水性領域を推定し、さらにＣｈｏｕ ＆ Ｆａｓｍａ
ｎらの方法（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ、土工。
４５−１４８．１９７８）を用し１て７ａｔ−［［タン
パクの二次構造を推定することにより、該タンパクのア
ミノ酸配列の中か：）ＮＨ２−Ｙ Ｇ ＲＫ Ｋ ＲＲ
Ｑ ＲＲＲＰ Ｐ Ｑ−ＣＤＤＨ（アミノ酸番号にして
４７〜６０まで）を抗原オリゴペプチドとして採用した
。
パクの二次構造を推定することにより、該タンパクのア
ミノ酸配列の中か：）ＮＨ２−Ｙ Ｇ ＲＫ Ｋ ＲＲ
Ｑ ＲＲＲＰ Ｐ Ｑ−ＣＤＤＨ（アミノ酸番号にして
４７〜６０まで）を抗原オリゴペプチドとして採用した
。
上記抗原オリコベブチドは、Ｈ１νの丁ａｔ−■タンパ
クかろ該ペプチドを切断後単離して用いることも、化学
的に合成して用いることもできる。ＨＩＶＴａｔ−ＩＩ
［遺伝子産物から該ペプチドを切断して単離する場合に
は、例えば、遺伝子組換の手法を用いて大腸菌にＴａｔ
−ＩＩＩ遺伝子を導入発現させ、遺伝子産物を精製した
後、タンパク分解酵素により部分分解をして該ペプチド
を得ることができる。また、化学的に合成する場合には
、ＡＢＩ社のペプチド合成機を用いて合成し該ペプチド
を得ることができる。
クかろ該ペプチドを切断後単離して用いることも、化学
的に合成して用いることもできる。ＨＩＶＴａｔ−ＩＩ
［遺伝子産物から該ペプチドを切断して単離する場合に
は、例えば、遺伝子組換の手法を用いて大腸菌にＴａｔ
−ＩＩＩ遺伝子を導入発現させ、遺伝子産物を精製した
後、タンパク分解酵素により部分分解をして該ペプチド
を得ることができる。また、化学的に合成する場合には
、ＡＢＩ社のペプチド合成機を用いて合成し該ペプチド
を得ることができる。
該ペプチドは不完全抗原であるため、キャリヤーを結合
することにより免疫原性が得ちれる。キャリヤーとして
は、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｙｍｐｅｔ Ｈａｅ＋
ｎｏｃｙａｎｉｎ）やＢ Ｓ Ａ （Ｂｏｒｉｎｅ Ｓ
ｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）等を挙げることかできる。
することにより免疫原性が得ちれる。キャリヤーとして
は、ＫＬＨ（Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｙｍｐｅｔ Ｈａｅ＋
ｎｏｃｙａｎｉｎ）やＢ Ｓ Ａ （Ｂｏｒｉｎｅ Ｓ
ｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）等を挙げることかできる。
例えば、キャリヤーとしてＫＬＨを用いる場合には、該
ペプチドＣ末端のＱ （Ｇｌｎ）のＣ０ＯＨ基に、スペ
ーサーとしてＣ（Ｃｙｓ）を結合させ、このＣの持つＳ
Ｈ基を利用してＫＬＨと結合する。
ペプチドＣ末端のＱ （Ｇｌｎ）のＣ０ＯＨ基に、スペ
ーサーとしてＣ（Ｃｙｓ）を結合させ、このＣの持つＳ
Ｈ基を利用してＫＬＨと結合する。
上記の様にして得られるペプチド−キャリヤー複合体を
抗原として使用してマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、
ウマ、ウシ等を免疫してもよいが、該ペプチド−キャリ
ヤー複合体をニトロセルロース製の微粒子に吸着させた
ものを抗原として使用することによりさらに効率よく免
疫動物を得ることができる。
抗原として使用してマウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、
ウマ、ウシ等を免疫してもよいが、該ペプチド−キャリ
ヤー複合体をニトロセルロース製の微粒子に吸着させた
ものを抗原として使用することによりさらに効率よく免
疫動物を得ることができる。
該微粒子としては上記のニトロセルロースの他、セルロ
ースアセテート製のものを使用することができ、該微粒
子の粒径は通常１０〜５００μｍである。該微粒子に上
記のペプチド−キャリヤー複合体を結合させるにはイン
キュベーション等の手段を用いることができ、通常は微
粒子の重量に対して等量程度のペプチド−キャリヤー複
合体を結合させればよい。その後に、上記の様にして得
られた微粒子結合ペプチド−キャリヤー複合体１〜１０
μｇ ／ ｍ ｌで生理食塩水に懸濁して抗原懸濁液と
することができる。
ースアセテート製のものを使用することができ、該微粒
子の粒径は通常１０〜５００μｍである。該微粒子に上
記のペプチド−キャリヤー複合体を結合させるにはイン
キュベーション等の手段を用いることができ、通常は微
粒子の重量に対して等量程度のペプチド−キャリヤー複
合体を結合させればよい。その後に、上記の様にして得
られた微粒子結合ペプチド−キャリヤー複合体１〜１０
μｇ ／ ｍ ｌで生理食塩水に懸濁して抗原懸濁液と
することができる。
上記の抗原懸濁液を被免疫動物に接種することにより、
該ペプチドを抗原として免疫された動物が得られる。例
えばマウスを免疫する場合には上記のペプチド−キャリ
ヤー複合体とニトロセルロースの懸濁液を初回免疫では
１００μ！で、追加免疫では５０μ！を２回〜４回、２
〜３週間隔で、例えば足底部皮下投与、腹腔内投与する
ことにより効率良くマウスを免疫することができる。
該ペプチドを抗原として免疫された動物が得られる。例
えばマウスを免疫する場合には上記のペプチド−キャリ
ヤー複合体とニトロセルロースの懸濁液を初回免疫では
１００μ！で、追加免疫では５０μ！を２回〜４回、２
〜３週間隔で、例えば足底部皮下投与、腹腔内投与する
ことにより効率良くマウスを免疫することができる。
上記の様にして得られた免疫動物からリンパ節細胞、肺
臓細胞、脚線細胞、末梢血細胞等の抗体産生細胞を分離
することにより抗体産生細胞を得ることができる。例え
ば肺臓細胞を抗体産生細胞として使用する場合には、肺
臓を摘出した後に、例えばダルベツコ変法イーグル培地
（日永製薬製）（以下ＤＭＥ培地という）で数回洗浄す
ることにより抗体産生細胞を得ることができる。
臓細胞、脚線細胞、末梢血細胞等の抗体産生細胞を分離
することにより抗体産生細胞を得ることができる。例え
ば肺臓細胞を抗体産生細胞として使用する場合には、肺
臓を摘出した後に、例えばダルベツコ変法イーグル培地
（日永製薬製）（以下ＤＭＥ培地という）で数回洗浄す
ることにより抗体産生細胞を得ることができる。
細胞融合に使用するミエローマ細胞としてはマウス、ラ
ット、ウサギ、ヒトなどの種々の動物の細胞株を使用す
ることができる。例えばヒポキサンチン・グアニン・ホ
スホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）を欠損
するミエローマを使用することができる。このようなミ
エローマは未融合の状態ではＨＧＰＲＴを欠くためにヒ
ポキサン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地で
核酸の合成ができずに死滅するが、肺臓細胞と融合しＨ
ＧＰＲＴ活性を回復したハイブリドーマはアミノプテリ
ンで核酸の生合成を阻害されてもヒボキサンチンを利用
して成育することができるのでハイブリドーマのみが成
育する。また、これらのミエローマ細胞は非分泌型の細
胞株であることが好ましい。この様なミエローマ細胞と
してはマウスミエローマＰ３／Ｘ６３−Ａｇ３−６５３
（ｘ６３・６・５・３）、Ｐ３／χ６３−Ａｇ８Ｕｌ
（Ｐ、Ｕ、）、Ｐ３／ＮＳＩ−ＮＳｌ−１−Ａ （ＮＳ
−１）、ＳＰ２１０−Ａｇ１４ （ＳＦ３）、ラフトミ
エローマ２１０・ＲＣＹ３・Ａｇｌ・２・３ （Ｙ３・
Ａｇｌ・２・３）、ヒトミエローマ Ｕ−２６６−、へ
Ｒ１、ＧＭ １ ５ ０ ０ ＴＧ −Ａ１２等
を挙げることができる。
ット、ウサギ、ヒトなどの種々の動物の細胞株を使用す
ることができる。例えばヒポキサンチン・グアニン・ホ
スホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）を欠損
するミエローマを使用することができる。このようなミ
エローマは未融合の状態ではＨＧＰＲＴを欠くためにヒ
ポキサン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地で
核酸の合成ができずに死滅するが、肺臓細胞と融合しＨ
ＧＰＲＴ活性を回復したハイブリドーマはアミノプテリ
ンで核酸の生合成を阻害されてもヒボキサンチンを利用
して成育することができるのでハイブリドーマのみが成
育する。また、これらのミエローマ細胞は非分泌型の細
胞株であることが好ましい。この様なミエローマ細胞と
してはマウスミエローマＰ３／Ｘ６３−Ａｇ３−６５３
（ｘ６３・６・５・３）、Ｐ３／χ６３−Ａｇ８Ｕｌ
（Ｐ、Ｕ、）、Ｐ３／ＮＳＩ−ＮＳｌ−１−Ａ （ＮＳ
−１）、ＳＰ２１０−Ａｇ１４ （ＳＦ３）、ラフトミ
エローマ２１０・ＲＣＹ３・Ａｇｌ・２・３ （Ｙ３・
Ａｇｌ・２・３）、ヒトミエローマ Ｕ−２６６−、へ
Ｒ１、ＧＭ １ ５ ０ ０ ＴＧ −Ａ１２等
を挙げることができる。
細胞融合はＲＰＭ１１６４０等の動物細胞培養培地中で
１０７〜１０８個のミエローマ細胞と上記の抗体産生細
胞を混合比１：１〜１：１０て混合して行う。細胞融合
促進物質としては平均分子量２０００〜６０００のポリ
エチレンクリコール（ＰＥＧ）やポリビニルアルコーノ
ベセンダイウイルス等が使用でき、通常２５℃で１〜３
分間、好ましく：ま２分間の融合を行えばよい。特にＰ
ＥＧを用′、）る二とが好まし゛、）ｅ 細胞融合処理後の細胞からノ飄イブリドーマを選別する
には選択培地における選択的増殖を行えばよい。例えば
、細胞をＤＭＥ培地等の培地で１０Ｓ個／ｍｊ２と一；
るように希釈した後に、マイクロタイタープレート上に
１０４細胞数／ウエルと一；る様に各ウェルに細胞を入
れ、各ウェルに例えばＨＡＴ培地等の選択培地を加えて
、以後適当な間隔、例えば７日間隔て選択培地を交換し
て培養すればよい。例えばミエローマ細胞としてＰ３Ｘ
６３−Ａｇ８−６５３を使用した場合にはＨＡＴ培地で
７〜１４日間程度培養することによりハイブリドーマの
みを選別することができる。
１０７〜１０８個のミエローマ細胞と上記の抗体産生細
胞を混合比１：１〜１：１０て混合して行う。細胞融合
促進物質としては平均分子量２０００〜６０００のポリ
エチレンクリコール（ＰＥＧ）やポリビニルアルコーノ
ベセンダイウイルス等が使用でき、通常２５℃で１〜３
分間、好ましく：ま２分間の融合を行えばよい。特にＰ
ＥＧを用′、）る二とが好まし゛、）ｅ 細胞融合処理後の細胞からノ飄イブリドーマを選別する
には選択培地における選択的増殖を行えばよい。例えば
、細胞をＤＭＥ培地等の培地で１０Ｓ個／ｍｊ２と一；
るように希釈した後に、マイクロタイタープレート上に
１０４細胞数／ウエルと一；る様に各ウェルに細胞を入
れ、各ウェルに例えばＨＡＴ培地等の選択培地を加えて
、以後適当な間隔、例えば７日間隔て選択培地を交換し
て培養すればよい。例えばミエローマ細胞としてＰ３Ｘ
６３−Ａｇ８−６５３を使用した場合にはＨＡＴ培地で
７〜１４日間程度培養することによりハイブリドーマの
みを選別することができる。
該ペプチドに特異的なモアツクローナル抗体を産生ずる
ハイブリドーマを選択するには、例えば酵素免疫測定法
（ＥＬ Ｉ ＳＡ）により以下の様にして行えばよい。
ハイブリドーマを選択するには、例えば酵素免疫測定法
（ＥＬ Ｉ ＳＡ）により以下の様にして行えばよい。
予め該ペプチドを含む検体をリン酸緩衝液（ＰＢＳ；
Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ５ａｌｉｎｅ
）等の緩衝液に溶解し、ポリスチレン、ポリビニール、
ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアクリルアミ
ド、シリコン、デキストラン、セルロース等のソフトプ
レート、ガラスプレート、ビーズ、シート、ウェル、チ
ューブ等の固相に添加して、例えば４°Ｃで一晩放置し
て吸着させる０次に抗原溶液を捨てＰＢＳで洗浄した後
に、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳを加
えて例えば４°Ｃで一晩放置して、抗原の結合していな
い部位をＢＳＡでブロックする。その後に、ハイブリド
ーマの上清を１００μ！ずつ加えて例えば室温で１時間
放置してＰＢＳで３回洗浄する０次に酵素結合抗マウス
イムノグロブリン抗血清（第２抗体）を加えて室温で１
時間放置する。ＰＢＳで３回洗浄した後に、酵素の基質
を加えて発色させた後に吸光光度計、螢光光度計等で測
定すれば抗原と結合力のある抗体を産生してハイブリド
ーマが検索される。
Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ５ａｌｉｎｅ
）等の緩衝液に溶解し、ポリスチレン、ポリビニール、
ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリアクリルアミ
ド、シリコン、デキストラン、セルロース等のソフトプ
レート、ガラスプレート、ビーズ、シート、ウェル、チ
ューブ等の固相に添加して、例えば４°Ｃで一晩放置し
て吸着させる０次に抗原溶液を捨てＰＢＳで洗浄した後
に、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳを加
えて例えば４°Ｃで一晩放置して、抗原の結合していな
い部位をＢＳＡでブロックする。その後に、ハイブリド
ーマの上清を１００μ！ずつ加えて例えば室温で１時間
放置してＰＢＳで３回洗浄する０次に酵素結合抗マウス
イムノグロブリン抗血清（第２抗体）を加えて室温で１
時間放置する。ＰＢＳで３回洗浄した後に、酵素の基質
を加えて発色させた後に吸光光度計、螢光光度計等で測
定すれば抗原と結合力のある抗体を産生してハイブリド
ーマが検索される。
上記の様にして抗体産生細胞を選別した後、コロニー形
成法、限界希釈法等によりクローニングを行うことによ
り単一のハイブリドーマを起源とする抗体産生細胞を得
ることができる。
成法、限界希釈法等によりクローニングを行うことによ
り単一のハイブリドーマを起源とする抗体産生細胞を得
ることができる。
上記のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマによる抗
体は、培養フラスコや培養瓶を用いて１０〜１５％ウシ
胎児血清含有ＲＰＭ１１６４０培地、又は無血清培地等
の動物細胞培養用培地で培養して、その培養上清液から
得ることができ、培養方法及び条件は通常の動物細胞培
養方法に準じて当業者が容易に選択し得るものである。
体は、培養フラスコや培養瓶を用いて１０〜１５％ウシ
胎児血清含有ＲＰＭ１１６４０培地、又は無血清培地等
の動物細胞培養用培地で培養して、その培養上清液から
得ることができ、培養方法及び条件は通常の動物細胞培
養方法に準じて当業者が容易に選択し得るものである。
さらに大量の抗体を産生ずる方法としては、例えばハイ
ブリドーマの親ミエローマ細細の由来動物と同系動物に
ブリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン）等の鉱物油を腹腔内に投与した後、ハイブリド
ーマを腹腔的投与して大量に増殖させる方法を採用する
ことができる。
ブリドーマの親ミエローマ細細の由来動物と同系動物に
ブリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタ
デカン）等の鉱物油を腹腔内に投与した後、ハイブリド
ーマを腹腔的投与して大量に増殖させる方法を採用する
ことができる。
該方法によれば、ハイブリドーマは１４〜２１日程で腹
水腫瘍を形成し、血清及び腹水中に高濃度（約１〜１０
■／ ｍ ｉ、）の抗体が産生される。
水腫瘍を形成し、血清及び腹水中に高濃度（約１〜１０
■／ ｍ ｉ、）の抗体が産生される。
さらに精製が必要な場合には、該腹水を硫安分画した後
に、ＤＥＡＥセルロースイオン交換クロマトグラフィー
、該ペプチドを結合させたセファロース４Ｂ等を用いた
アフィニティーカラムクロマトグラフィー、分子ふるい
カラムクロマトグラフィー等によって精製することが可
能である。
に、ＤＥＡＥセルロースイオン交換クロマトグラフィー
、該ペプチドを結合させたセファロース４Ｂ等を用いた
アフィニティーカラムクロマトグラフィー、分子ふるい
カラムクロマトグラフィー等によって精製することが可
能である。
上記のようにして得られるハイブリドーマの例としては
、３ｃ、９ｂ、１２４ａ、１２４ｂ。
、３ｃ、９ｂ、１２４ａ、１２４ｂ。
１７６ｃ、３７６ａ、３７６ｂ、８０−１．及び８０−
Ａ株等を挙げることができ、これらのハイブリドーマか
らは該ペプチドに特異的に反応するモノクローナル抗体
が得られる。これらのうち、コロニー形成法によりクロ
ーニングできるものは、１２４ａ、１２４ｂ、１７６ｃ
、３７６ａ。
Ａ株等を挙げることができ、これらのハイブリドーマか
らは該ペプチドに特異的に反応するモノクローナル抗体
が得られる。これらのうち、コロニー形成法によりクロ
ーニングできるものは、１２４ａ、１２４ｂ、１７６ｃ
、３７６ａ。
３７６ｂ、８０−１の６株であり、また限界希釈法によ
りクローニングできるものは、３ｃと９ｂの２株である
。
りクローニングできるものは、３ｃと９ｂの２株である
。
上記ハイブリドーマのうち９ｂ及び１２４ｂは、平成２
年１１月１６日付けで工業技術院微生物工業技術研究所
に受託番号微工研菌寄第１１８５３号及び第１１８５４
号としてそれぞれ受託された。
年１１月１６日付けで工業技術院微生物工業技術研究所
に受託番号微工研菌寄第１１８５３号及び第１１８５４
号としてそれぞれ受託された。
また、上言己ハイフ′リドーマのうち、３７６ｂは、平
成２年１１月２２日付けで受託番号微工研菌寄第１１８
５９号として受託された。
成２年１１月２２日付けで受託番号微工研菌寄第１１８
５９号として受託された。
（発明の効果）
これらのモノクローナル抗体は、７ａｔ−ｍ遺伝子を有
するウィルス、例えばエイズウィルスの感染有無の診断
に有用である。また、ＮＨ２−ＹＧＲＫＫ ＲＲＱ Ｒ
ＲＰ Ｐ Ｑ−Ｃｏｏ）ｌのシーフェンスを持つペプチ
ドまたは蛋白質を検出、同定したり、単離、精製するこ
とが可能になり、その結果これらのペプチドまたは蛋白
質の解析も容易となる。さらにＴａｔ−ｍ遺伝子を有す
るウィルスの遺伝子転写機構の解析、感染メカニズムの
解明等にも利用できる。
するウィルス、例えばエイズウィルスの感染有無の診断
に有用である。また、ＮＨ２−ＹＧＲＫＫ ＲＲＱ Ｒ
ＲＰ Ｐ Ｑ−Ｃｏｏ）ｌのシーフェンスを持つペプチ
ドまたは蛋白質を検出、同定したり、単離、精製するこ
とが可能になり、その結果これらのペプチドまたは蛋白
質の解析も容易となる。さらにＴａｔ−ｍ遺伝子を有す
るウィルスの遺伝子転写機構の解析、感染メカニズムの
解明等にも利用できる。
（実施例）
以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、
本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（参考例）オリゴペプチドＮ１（２−ＹＧＲＫＫＲＲＱ
ＲＲＲＰ Ｐ Ｑ Ｃ−Ｃ０ＯＨの製造オリゴペプチド
ＮＨ２−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣ−ＣＯＯＨは
、ｔ−ＢＯＣアミノ酸を用いた固相合成法にて合成し、
フッ化水素法にて粗ペプチドとし、ＨＰＬＣを用いて精
製ペプチドを得た。
ＲＲＲＰ Ｐ Ｑ Ｃ−Ｃ０ＯＨの製造オリゴペプチド
ＮＨ２−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣ−ＣＯＯＨは
、ｔ−ＢＯＣアミノ酸を用いた固相合成法にて合成し、
フッ化水素法にて粗ペプチドとし、ＨＰＬＣを用いて精
製ペプチドを得た。
（実施例１）ハイブリドーマの取得 ｌ参考例で製造し
たペプチドをさらに、ＭＢＳ（マイレミドベンゾイルヒ
ドロキシサクシイミドエステル）で処理したＫＬＨとペ
プチドをインキユベーションすることにより、このペプ
チドのスペーサーであるＣのＳＨ基にＫＬＨを結合させ
た。上記ヘブチドーＫＬＨ複合体１ｍｇ（ペプチド量に
して１００μｇ＞を５ａｎｄ Ｓ社のニトロセルロース
フィルター（孔径０．４５μｍ）を乳鉢ですりつぶして
微粒化し高圧滅菌したＩＱｍｇのニトロセルロース微粒
子に４℃３０分でインキュベーションによって結合させ
た後、ＰＢＳ １ｍβに懸濁して抗原懸濁液とした。該
懸濁液をマウス（オス、４週令）の腹腔に注射した（初
回免疫）。初回免疫より４７日、９２日、１０２８目ｊ
こ、１ｍｇ／ｍＩの上記抗原懸濁液１０μ！ （ペプチ
ド量にして１μｇ）を９倍量のＰＢＳを加えて１００μ
βにした後、同様の方法により注射した。最後の追加免
疫より約６０時間後に、膵臓液を取り圧して５ａｌｉｎ
ｅ液（生理塩類液）で洗浄した。マウスミエローマＰ３
−Ｘ６３を１０％牛脂児血清添加Ｄ Ｍ Ｅ ＠地で継
代後２日間培養したものを、細胞融合直前に５ａｌｉｎ
ｅ液で洗浄し、マウスミエローマ細胞を調製した。
たペプチドをさらに、ＭＢＳ（マイレミドベンゾイルヒ
ドロキシサクシイミドエステル）で処理したＫＬＨとペ
プチドをインキユベーションすることにより、このペプ
チドのスペーサーであるＣのＳＨ基にＫＬＨを結合させ
た。上記ヘブチドーＫＬＨ複合体１ｍｇ（ペプチド量に
して１００μｇ＞を５ａｎｄ Ｓ社のニトロセルロース
フィルター（孔径０．４５μｍ）を乳鉢ですりつぶして
微粒化し高圧滅菌したＩＱｍｇのニトロセルロース微粒
子に４℃３０分でインキュベーションによって結合させ
た後、ＰＢＳ １ｍβに懸濁して抗原懸濁液とした。該
懸濁液をマウス（オス、４週令）の腹腔に注射した（初
回免疫）。初回免疫より４７日、９２日、１０２８目ｊ
こ、１ｍｇ／ｍＩの上記抗原懸濁液１０μ！ （ペプチ
ド量にして１μｇ）を９倍量のＰＢＳを加えて１００μ
βにした後、同様の方法により注射した。最後の追加免
疫より約６０時間後に、膵臓液を取り圧して５ａｌｉｎ
ｅ液（生理塩類液）で洗浄した。マウスミエローマＰ３
−Ｘ６３を１０％牛脂児血清添加Ｄ Ｍ Ｅ ＠地で継
代後２日間培養したものを、細胞融合直前に５ａｌｉｎ
ｅ液で洗浄し、マウスミエローマ細胞を調製した。
上記の免疫マウス膵臓細胞（３Ｘ１０’個）と上記マウ
スミエローマ細胞（１，５Ｘ １０７個）を混合してＤ
Ｍ Ｅ培地で数回洗浄した後に培地を除去し、細胞融
合剤として５ａｌｉｎｅ液に５０％濃度に溶解したＰＥ
Ｇ溶液を２ｍ！加えて３７℃で２分間融合処理を行った
。その後にＤＭＥ培地で数回洗浄を行い、細胞数が培地
１ｍβあたり１０５個になる様に上計選択培地で希釈し
た。該希釈細胞浮遊液を９６ウエル・マイクロカルテ丁
−プレートに１ウエルあたり１００μ矛ずつ分注し３７
℃で培養すると７〜１４日目力＼ろハイブリドーマの増
殖したコロニーが出現した。
スミエローマ細胞（１，５Ｘ １０７個）を混合してＤ
Ｍ Ｅ培地で数回洗浄した後に培地を除去し、細胞融
合剤として５ａｌｉｎｅ液に５０％濃度に溶解したＰＥ
Ｇ溶液を２ｍ！加えて３７℃で２分間融合処理を行った
。その後にＤＭＥ培地で数回洗浄を行い、細胞数が培地
１ｍβあたり１０５個になる様に上計選択培地で希釈し
た。該希釈細胞浮遊液を９６ウエル・マイクロカルテ丁
−プレートに１ウエルあたり１００μ矛ずつ分注し３７
℃で培養すると７〜１４日目力＼ろハイブリドーマの増
殖したコロニーが出現した。
抗体産生細胞の確認にはＥＬＩＳＡ法を用−ハ、ポリス
チレン製９６ウエル・マイクロテストプレート（コース
タ−社製）に１ウエルあたりＮＨ，−ＹＧＲＫＫＲＲＱ
ＲＲＲＰＰＱＣ−ＣＯＯＮ １００μｇをｌ Ｑｍｌ
のＰＢＳに溶解した溶液１００μβを滴下して吸着させ
た後に、上記のハイブリドーマを培養した培養上清１０
０μβを反応させた。洗浄後に１００μβのアルカリ性
フォスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体く２５μｇ
／ ｍり、又はアルカリ性フォスファターゼ結合抗マウ
スＩｇＭ抗体（２，５μｇ／ｍｌ）を反応させ、ＰＢＳ
で洗浄した後に１００μβの４−ニトロフェニルホスフ
ェ−） 溶液（１ｍｇ／ｍβ）を発色基質とじて反応さ
せ、４０５ｎｍの吸光度を測定して定量を行上記の様に
して、抗体産生の確認された細胞が増殖して”、）るウ
ェルの細胞を取り圧し、これを培地（１０％の牛胎児血
清を含むＤ ？ＶＩ Ｅ培地）１雁あたり１０３個とな
る様に調製し、この細胞希釈液を寒天培地にまいた後、
３７℃で１０〜１４日間培養するとコロニーが１培地あ
たり約１００個の割合で出現した。上記のクローニング
を２回繰り返して単一のハイブリドーマを起源とするモ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマ が得られた。
チレン製９６ウエル・マイクロテストプレート（コース
タ−社製）に１ウエルあたりＮＨ，−ＹＧＲＫＫＲＲＱ
ＲＲＲＰＰＱＣ−ＣＯＯＮ １００μｇをｌ Ｑｍｌ
のＰＢＳに溶解した溶液１００μβを滴下して吸着させ
た後に、上記のハイブリドーマを培養した培養上清１０
０μβを反応させた。洗浄後に１００μβのアルカリ性
フォスファターゼ結合抗マウスＩｇＧ抗体く２５μｇ
／ ｍり、又はアルカリ性フォスファターゼ結合抗マウ
スＩｇＭ抗体（２，５μｇ／ｍｌ）を反応させ、ＰＢＳ
で洗浄した後に１００μβの４−ニトロフェニルホスフ
ェ−） 溶液（１ｍｇ／ｍβ）を発色基質とじて反応さ
せ、４０５ｎｍの吸光度を測定して定量を行上記の様に
して、抗体産生の確認された細胞が増殖して”、）るウ
ェルの細胞を取り圧し、これを培地（１０％の牛胎児血
清を含むＤ ？ＶＩ Ｅ培地）１雁あたり１０３個とな
る様に調製し、この細胞希釈液を寒天培地にまいた後、
３７℃で１０〜１４日間培養するとコロニーが１培地あ
たり約１００個の割合で出現した。上記のクローニング
を２回繰り返して単一のハイブリドーマを起源とするモ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマ が得られた。
（実施例２）ハイブリドーマの取得 ２限界希釈法でク
ローニングした他は、実施例１の方法を繰り返した。本
実施例の限界希釈法によるクローニングは、ハイブリド
ーマ希釈液（１０Ｃｅ ｌ Ｉ ｓ／ｍりを９６ウエル
マイクロタイタープレート （ファルコン社製）に１ウ
エルあたり１００μβずつ分注した後、３７℃で１０〜
１４日間培養すると、コロニーが１ウエルあたり約１個
の割合で出現した。上記のクローニングを２回繰り返し
て単一のハイブリドーマを起源とするモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマが得られた。
ローニングした他は、実施例１の方法を繰り返した。本
実施例の限界希釈法によるクローニングは、ハイブリド
ーマ希釈液（１０Ｃｅ ｌ Ｉ ｓ／ｍりを９６ウエル
マイクロタイタープレート （ファルコン社製）に１ウ
エルあたり１００μβずつ分注した後、３７℃で１０〜
１４日間培養すると、コロニーが１ウエルあたり約１個
の割合で出現した。上記のクローニングを２回繰り返し
て単一のハイブリドーマを起源とするモノクローナル抗
体産生ハイブリドーマが得られた。
（実施例３）モノクローナル抗体の生産■ハイブリドー
マ培養上清による生産 バイブリド−７３Ｃ，９ｂ、 １２４ａ、 １２４
ｂ、１７６ｃ、３７６ａ、３７６ｂ、８０−１゜及び８
０−Ａをそれぞれ１０％の牛胎児血清を含むＤＭＥ培地
で９６穴ウエルプレート、Ｔ２５フラスコ、Ｔ７５フラ
スコとスケールアップしながらそれぞれ３７℃で５日間
炭酸ガス培養培地にて培養して培養上清を集めた。
マ培養上清による生産 バイブリド−７３Ｃ，９ｂ、 １２４ａ、 １２４
ｂ、１７６ｃ、３７６ａ、３７６ｂ、８０−１゜及び８
０−Ａをそれぞれ１０％の牛胎児血清を含むＤＭＥ培地
で９６穴ウエルプレート、Ｔ２５フラスコ、Ｔ７５フラ
スコとスケールアップしながらそれぞれ３７℃で５日間
炭酸ガス培養培地にて培養して培養上清を集めた。
■マウスの腹水による生産
６週令のＢａ１ｌ／（マウスの腹腔に０．５ ｍ ｌの
ブリスタン（アルドリッチ社）を注射し、１週間〜１０
日後に３ｃ、９ｂ、１２４ａ、１２４ｂ。
ブリスタン（アルドリッチ社）を注射し、１週間〜１０
日後に３ｃ、９ｂ、１２４ａ、１２４ｂ。
１７６ｃ、３７６ａ、３７６ｂ、８０−１．及び８０−
Ａの各ハイブリドーマ細胞をマウスあたり２Ｘ１０６個
の割合で腹腔内注射した。ハイブリドーマを注射し、２
週間後に、腹部が肥大しているのを確認後１８ゲージの
注射針により覆水を回収した。１匹のマウスから約５ｍ
ｌの腹水を採取した。復水１ｍβ中にモノクローナル抗
体タンパクが約１ ｍｇ含まれていた。
Ａの各ハイブリドーマ細胞をマウスあたり２Ｘ１０６個
の割合で腹腔内注射した。ハイブリドーマを注射し、２
週間後に、腹部が肥大しているのを確認後１８ゲージの
注射針により覆水を回収した。１匹のマウスから約５ｍ
ｌの腹水を採取した。復水１ｍβ中にモノクローナル抗
体タンパクが約１ ｍｇ含まれていた。
（実施例４）モノクローナル抗体の生化学的性質実施例
３＄の培養上ａ１００ＡＬβを、ペプチドＮＨ，−ＹＧ
ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣ−ＣＯＯＨ５０ｎｇを吸着
した９６穴マイクロタイタープレートに添加して３７℃
６０分で反応させた後、ＰＢＳで洗浄し、１００μｌの
アルカリホスファターゼ結合抗マウス■ｇＧ１特異的抗
体＜２．５ｐｇ／ｍｉ＞を３７℃６０分で反応させたＣ
ＰＢＳで洗浄した後に、１００μβの４−ニトロフェニ
ルホスフェートを発色基質として２０℃３０分反応させ
、その後１００μβのＩＮ ＮａＯＨで反応を停止し
た後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
３＄の培養上ａ１００ＡＬβを、ペプチドＮＨ，−ＹＧ
ＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱＣ−ＣＯＯＨ５０ｎｇを吸着
した９６穴マイクロタイタープレートに添加して３７℃
６０分で反応させた後、ＰＢＳで洗浄し、１００μｌの
アルカリホスファターゼ結合抗マウス■ｇＧ１特異的抗
体＜２．５ｐｇ／ｍｉ＞を３７℃６０分で反応させたＣ
ＰＢＳで洗浄した後に、１００μβの４−ニトロフェニ
ルホスフェートを発色基質として２０℃３０分反応させ
、その後１００μβのＩＮ ＮａＯＨで反応を停止し
た後、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
次に、二次抗体としてアルカリホスファターゼ結合抗マ
ウスＩｇＭμ鎖特異的抗体を用″、）だ他は、上記方法
を繰り返した。また、コントロールとしてＤＭＥ培地１
００μｍを用ヒ）で、上記反応を繰り返した。
ウスＩｇＭμ鎖特異的抗体を用″、）だ他は、上記方法
を繰り返した。また、コントロールとしてＤＭＥ培地１
００μｍを用ヒ）で、上記反応を繰り返した。
その結果を表１に示す。
この結果かみ、ハイブリドーマｏｂ、８０−１゜及び８
０−Ａを培養した培養上清子の抗体力ぐ、マウスＩｇＧ
抗体てあり、ハイブリドーマ３Ｃ。
０−Ａを培養した培養上清子の抗体力ぐ、マウスＩｇＧ
抗体てあり、ハイブリドーマ３Ｃ。
１２４ ａ、 １２４ ｂ、 ｌ ７６ ｃ、
３７６ ａ、及び３７６ｂを培養した培養上清中Ｏ抗体
力く、マウスＩｇ〜１抗体であることがわかった。
３７６ ａ、及び３７６ｂを培養した培養上清中Ｏ抗体
力く、マウスＩｇ〜１抗体であることがわかった。
表１
ハイブリドーマの産生ずる抗体のクラスと抗体価
第１図は、旧ν″Ｔａｔ−Ｉｎ遺伝子産物のアミノ酸配
列を表す。 第１図中、Ｌ Ａ ＶはＬｙｍｐｈｏａｄｅｎｏｐａ
ｔｈｙ−ａｓｓｏｃ ｔａｔｅｄＶ＋ｒｕｓ を示し、
Ａ ＲＶ はＡＩＤＳ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｅ
ｔｒｏｖｉｒｕｓを示し、ＬＡ〜′の後の三文字はウィ
ルスが単離された患者名を示す。 尚、第１図の各アミノ酸配列中、アミノ酸の異なる部位
に下線を付した。
列を表す。 第１図中、Ｌ Ａ ＶはＬｙｍｐｈｏａｄｅｎｏｐａ
ｔｈｙ−ａｓｓｏｃ ｔａｔｅｄＶ＋ｒｕｓ を示し、
Ａ ＲＶ はＡＩＤＳ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｅ
ｔｒｏｖｉｒｕｓを示し、ＬＡ〜′の後の三文字はウィ
ルスが単離された患者名を示す。 尚、第１図の各アミノ酸配列中、アミノ酸の異なる部位
に下線を付した。
Claims (4)
- （１）ＮＨ＿２−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ−ＣＯ
ＯＨであるペプチドに特異的に反応するモノクローナル
抗体。 - （２）Ｔａｔ−IIIタンパクに特異的に反応する請求項
（１）記載のモノクローナル抗体。 - （３）ＮＨ＿２−ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ−ＣＯ
ＯＨであるペプチドに特異的に反応するモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマ。 - （４）Ｔａｔ−IIIタンパクに特異的に反応するモノク
ローナル抗体を産生することを特徴とする請求項（３）
記載のハイブリドーマ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2324712A JPH04190798A (ja) | 1990-11-27 | 1990-11-27 | モノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2324712A JPH04190798A (ja) | 1990-11-27 | 1990-11-27 | モノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04190798A true JPH04190798A (ja) | 1992-07-09 |
Family
ID=18168868
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2324712A Pending JPH04190798A (ja) | 1990-11-27 | 1990-11-27 | モノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04190798A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002308900A (ja) * | 2001-04-04 | 2002-10-23 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | 抗ヒト肝性トリグリセリドリパーゼ抗体 |
-
1990
- 1990-11-27 JP JP2324712A patent/JPH04190798A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| PROC.NATL.ACAD.SCI.USA=1986 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002308900A (ja) * | 2001-04-04 | 2002-10-23 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | 抗ヒト肝性トリグリセリドリパーゼ抗体 |
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