JPH0420429B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野 本発明は新規抗生物質SF−2312物質及びその
製造法に関する。更に詳しく述べれば、放線菌を
培養することにより得られる新抗生物質SF−
2312物質又はその塩及びそれらの製造法に関する
ものである。 発明に到る経緯 本発明者らは種々のグラム陽性菌及び陰性菌に
抗菌活性を有する新規かつ有用な抗生物質を探索
した結果、ミクロモノスポーラ属に属する放線菌
を栄養培地中に培養することによつて新抗生物質
SF−2312物質が発酵的に生産されることを見い
出し、SF−2312物質を単離し、その理化学的性
状、生物学的性状を確定した。さらには本菌を培
養する際に培地中にビタミンB₁₂を添加すること
によりSF−2312物質の生産を著しく増大させる
ことを見い出した。本発明は上記の知見に基づい
て完成されたものである。 発明の要旨 したがつて第一の本発明は下記の式：、 で表わされる新抗生物質SF−2312物質及びその
塩を提供するものである。 さらに第二の本発明は、ミクロモノスポーラ属
に属するSF−2312物質生産菌を培養し、培養物
からSF−2312物質又はその塩を採取することを
特徴とする新抗生物質SF−2312物質又はその塩
の製造法を提供する。 発明の詳細な開示 本発明の方法で使用される新抗生物質SF−
2312物質生産菌の一例としては、本発明者らによ
り静岡県清水市の土壌より新たに分離されたSF
−2312株がある。SF−2312株の菌学的性状は下
記のとおりである。 形 態 基生菌糸は長く伸長、分枝し、その直径は約
0.5μｍである。気菌糸は通常放線菌の培養に用い
られている各種の寒天培地上で形成されない。ま
れに、胞子と思われる形態が基生菌糸上に１個ず
つ観察されるが（光学顕微鏡観察）、その形成は
寒天培養、振盪培養のいずれにおいても極めて貧
弱であり、現在までのところ、それを電子顕微鏡
で確認するに至つていない。胞子のう、鞭毛胞
子、菌核は調べた範囲では観察されない。 各種培地上の生育状態 SF−2312株の各種寒天培地上の生育状態は次
表に示すとおりである。色の記載について〔 〕
内に示す標準はContainer Corporation of
America社製の「Color Harmony Manual」を
用いた。観察は28℃、14〜21日培養後に行つた。

【表】 生理的性質 (1) 生育温度： 15〜38℃の温度範囲で生育し、至適温
度は26〜30℃である。 (2) ゼラチンの液化：陽性 (3) スターチの加水分解：陽性 (4) 硝酸塩の還元：陰性 (5) 脱脂乳のペプトン化：陰性 〃 の凝固：陰性 (6) 耐塩性：1.5％の食塩存在下で生育するが、
3.0％以上では生育しない。 (7) メラニン様色素の生成：陰性 炭素源の利用性 基本培地：イーストエキス（Difco） 1.0ｇ CaCO₃ 0.2ｇ 寒 天（Difco） 15ｇ 蒸 留 水 1000ml (1) 利用する：Ｄ−グルコース、Ｄ−キシロ−
ス、グリセロール (2) 利用しない：Ｌ−アラビノース、Ｌ−ラム
ノース、ｉ−イノシトール、 (3) 利用が疑わしい：Ｄ−フラクトース、Ｄ−
マンニトール、シユクロース、ラフイ
ノース 細胞壁組成 Lechervalierら（Intern.J.Syst.Bact.20：435〜
443、1970）の分類によると、SF−2312株の細胞
壁成は型で糖パターンはＤ型である。 以上より、SF−2312株は細胞壁組成が型、
糖パターンがＤ型の放線菌であり、中温菌で気菌
糸を形成せず、基生菌糸に胞子を１個ずつ形成す
ることから、Micromonospora属に属すると思わ
れる。しかしながら、胞子形成が貧弱なため、電
子顕微鏡による胞子の確認はまだなされていな
い。従つて、属の決定にはさらに検討が必要であ
るが、現時点では、本菌をミクロモノスポラ・エ
スピー・SF−2312（Micromonospora ap.SF−
2312）と称することにした。 本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に
1984年３月２日以来、微工研菌寄第7492号
（FERM−Ｐ 7492）として受託されている。 他の微生物の場合と同様、抗生物質SF−2312
を生産する菌株、SF−2312株はその性質が変化
しやすい。例えばSF−2312株の、またはこの株
に由来する、突然変異株（自然発生または誘発
性）、形質接合体または遺伝子組換え体であつて
も抗生物質SF−2312を生産するものはすべて本
発明に使用できる。 本発明の方法では前記菌株を通常の微生物が利
用しうる栄養物を含有する培地で培養する。栄養
源としては、従来放線菌の培養に利用されている
公知のものが使用できる。例えば、炭素源として
グルコース、グリセロール、澱粉、水あめ、シユ
クロース、デキストリン、糖みつ、植物油、動物
油等が使用できる。又、窒素源としては、大豆
粉、小麦胚芽、肉エキス、ペプトン、イーストエ
キス、コーンステイープリカー、綿実かす、魚
粉、硫安、硝酸ソーダ、尿素等を使用できる。そ
の他、必要に応じて、ナトリウム、カリウム、マ
グネシウム、カルシウム、コバルト、塩素、燐
酸、硫酸およびその他のイオンを生成することが
できる可溶性無機塩類を添加することは有効であ
る。 さらに、菌の発育を助け、抗生物質SF−2312
の生産を促進するような有機及び無機物を適当に
添加することができる。例えば、ビタミンB₁₂は
SF−2312株の生育を促進し、抗生物質SF−2312
の生産を著しく高めるのに極めて有効である。 培養法としては好気的条件下での培養法、特に
深部培養法が最も適している。培養に適当な温度
は15〜38℃であるが、多くの場合、26〜30℃付近
で培養する。抗生物質SF−2312の生産は培地や
培養条件により異なるが、振盪培養、タンク培養
ともに通常２〜10日の間でその蓄積が最高に達す
る。 SF−2312物質の検定にあたつては、次の方法
が用いられる。検定用培地としてマイシン寒天を
用いる。検定菌としてはセラチア・マルセツセン
ス（Serratia marcescens）を用いる。SF−2312
物質はこれを用いた検定において1000μｇ/ml〜
250μｇ/mlにおいて濃度の対数と阻止円径との関
係は直線関係を示し、それぞれ23.2〜15.8mmの阻
止円径を与える（ペーパーデイスク平板法）。 本発明により得られるSF−2312物質は水溶性
酸性物質である。これを培養物より採取するに当
つてその抽出精製には炭末、ダイヤイオンHP−
20等の吸着剤、ダイヤイオンWA−10、ダウエツ
クス１×２等の陰イオン交換樹脂、セフアデツク
スＧ−10等のゲル過剤等によるクロマトグラフ
イーが使用されるが以下に示す採取方法が効率的
である。 すなわち培養液より菌体その他の固形物を珪藻
土等の過助剤を用いて別し、次いで液中の
有効成分をダイヤイオンWA−10に吸着させる。
樹脂部を水洗後、１規定アンモニア水で溶出させ
る。この溶出液を減圧濃縮し、さらに炭末、ダウ
エツクス50W×２（H⁺）、セフアデツクスＧ−10
等のカラムクロマトグラフイーを適宜組み合わせ
ることにより高純度のSF−2312物質を遊離酸又
はNa塩として得ることができる。SF−2312物質
Na塩は温和な条件下に酸で加水分解すると、遊
離酸として収得できる。常法で塩基と反応させる
と、SF−2312物質の塩が得られる。この塩とし
ては、例えば、アルカリ金属塩、アンモニウム
塩、アルカリ土類金属塩がある。 以下にSF−2312物質（Na塩）の理化学的性状
を示す。 １ 外 観 白色の無定形粉末 ２ 融点 160℃付近より徐々に褐変するが、明
瞭な融点を示さない。 ３ 元素分析値 C21.12％、Ｈ 3.38％、 Ｎ 5.97％ ４ 紫外部吸収スペクトル 220nm〜370nmで特徴的吸収を示さない。 ５ 赤外部吸収スペクトル 臭化カリウム錠中で測定したスペクトルを第１
図に示す。 ６ 分子量 質量分析（SI−MS）よりSF−2312
物質（Na塩）の分子量は219である。 ７ 分子式 核磁気共鳴スペクトル、質量分析、
元素分析値による分子式はC₄H₇NO₆PNaであ
る。 ８ 水素核核磁気共鳴スペクトル SF−2312物質（遊離酸）の重水中で測定した
400MHz、¹H NMRのスペクトルを第２図に示
す。 ９ 比旋光度 〔α〕²⁰ _D＝＋12゜（cl.H₂O） 10 溶解性 水に可溶であるが、ベンゼン、アル
コール、例えばメタノール、酢酸エチル、クロ
ロホルム等の有機溶媒には難溶又は不溶であ
る。 11 呈色反応 陽性：レミユー、硫酸、塩化第二鉄、塩化第二
鉄−スルホサリチル酸試薬 陰性：ニンヒドリン試薬 12 シリカゲル薄層クロマトグラフイーのRf値 （メルク社製F₂₅₄） Rf 70％エタノール水 0.32 ｎ−プロパノール−酢酸−水（15：10：３：
12） 0.58 アセトニトリル−水（７：３） 0.26 13 高電圧紙電気泳動のRm値 Rm（グルタミン酸）1.07 ピリジン−酢酸緩衝液PH6.4. 3500V、15分間 Rm（フスフオマイシン）0.74 蟻酸−酢酸緩衝液PH1.8. 3500V、15分間 14 安定性 酸性、中性及びアルカリ性条件下に
おいて比較的安定である。 次にSF−2312物質（Na塩）の各種微生物に対
する抗菌活性を第１表に示す。

【表】 寒天希釈法 培地：ニユートリエントアガー（Nutrientagar） 第１表に示すごとく、SF−2312物質はグラム
陰性菌に抗菌力を有している。 以上の理化学的、生物学的性状を有すSF−
2312物質は文献上、これに該当するものがなく新
規物質と判定するに至つた。 すなわち、りんを含む水溶性酸性物質の抗生物
質としてはフオスフオマイシン
（Phosphomycin）（The Journal of Antibiotics
23：336〜347、1970）、フオスフオノクロリン
（Fosfonochlorin）（特開昭58−209986号公報）、
FR−31564（Fosmidomycin）（The Journal of
Antibioties 33：24〜35.1980）等が報告されてい
るが、SF−2312物質はこれらのいずれとも異な
り、新規抗生物質であることが明白となつた。 実施例 以下に本発明の実施例を示すがこれらは単なる
一例示であつて本発明を限定するものではない。 実施例 １ イースト麦芽寒天スラントに充分生育したミク
ロモノスポラ・エスピー・SF−2312株（微工研
菌寄第7492号）をグルコース1.0％、スターチ1.0
％、ポリペプトン0.5％、肉エキス0.2％、イース
トエキス0.3％、大豆粉0.2％、炭酸カルシウム0.2
％、PH7.0（殺菌前）の組成からなる種培地20ml
（100ml容三角フラスコ使用）に３白金耳接種し、
28℃で５日間振盪培養し、これを種培養とした。 生産培地として、水あめ2.0％、大豆油0.15％、
大豆粉1.0％、綿実かす0.5％、デイステイラー
ズ・ソリユーブル0.25％、炭酸カルシウム0.1％、
硫酸第１鉄0.0005％、塩化コバルト0.00005％、
塩化ニツケル0.00005％、PH7.0（殺菌前）の組成
の培地を用いた。 この生培地80ml（500ml容三角フラスコ使用）
に別殺菌したビタミンB₁₂を濃度を変えて無菌的
に添加し、そこへ前述の種培養を５％の割合で接
種し、28℃で６日間振盪培養した。その結果は次
表のとおりである。

【表】 以上の結果より、ビタミンB₁₂がSF−2312株の
抗生物質SF−2312生産を著しく高めることは明
らかである。 実施例 ２ 種培地としてスターチ2.0％、グルコース1.0
％、小麦胚芽0.6％、ペプトン0.5％、イーストエ
キス0.3％、大豆粉0.2％、炭察カルシウム0.1％を
含む培地を用いた。また生産培地として水飴2.0
％、小麦胚芽1.3％、綿実粕0.75％、コーンスチ
ープリカー1.0％、ビタミンB₁₂0.0001％（別殺
菌）を含む培地を用いた。殺菌前PHは種培地を
7.0、生産培地を7.5に調節し、使用した。 イースト・麦芽寒天スラントに充分生育したミ
クロモノスポラ・エスピー・SF−2312株（微工
研菌寄第7492号）を前記殺菌済の種培地20mlずつ
を分注した100ml容三角フラスコ２本に３〜４白
金耳接種し、28℃で４日間培養し、第一種培養と
した。ついで、種培地80mlずつを分注した500ml
容の三角フラスコ２本に前記の第一種培養４mlず
つを接種し、28℃で３日間振盪培養し、これを第
二種培養した。 ついで、種培地１ずつを分注した５容の三
角フラスコ２本に前記の第二種培養80mlずつを接
種し、28℃で２日間振盪培養し、これを第三種培
養とした。 ついで、この第三種培養を35の殺菌済生産培
地を含む50容のジヤーフアーメンター２基に接
種し、28℃で７日間通気、撹拌培養した（通気量
35/min、回転数は初期300rpm、41時間目から
500rpm）。 培養終了後、珪藻土を用いて過し、培養液
52を得た。 実施例 ３ SF−2312物質の採取 実施例２で得られた培養液52をダイヤイオ
ンWA−10（OH^-）（三菱化成社製）５の塔に通
し有効成分を吸着させる。20の水で洗浄後、１
規定アンモニア水で溶離すると、２分画でフラ
クシヨン１〜３に活性物質が溶出されてくる。こ
の活性画分６を濃縮して１とし、次に炭末１
の塔に通し、有効成分を通過させる。この通過
液を減圧下で濃縮して凍結乾燥するとSF−2312
物質の粗粉末が32ｇ得られた。次にこの粗粉末の
16ｇを予め90％エタノール水で充填したシリカゲ
ルＣ−200（和光純薬製）１の塔に付し、90％エ
タノール水２で洗浄した後、60％エタノール水
で溶離すると80ml分画でフラクシヨン４〜１２に
活性画分が得られた。これを減圧下で濃縮し、凍
結乾燥するとSF−2312物質の粗粉末が5.6ｇ得ら
れた。次にこの粗粉末5.6ｇを５mlの水に溶解さ
せ、塩酸にてPH2.0に調整し、予め水で充填した
炭末700mlの塔に付し、1.2の水で洗浄後、１規
定アンモニア水とアセトン（１：１）の溶媒で展
開すると、60ml分画でフラクシヨン８〜１４に活
性画分が得られ、これを減圧下で濃縮し、凍結乾
燥してSF−2312物質の粗粉末1.2ｇ（純度約20
％）を得た。 さらにこの粗粉末1.2ｇを少量の水で溶解した
後、予め水で充填したセフアデツクスＧ−10（フ
アルマシア社製）（800ml）の塔に付し水で展開す
ると、20ml分画でフラクシヨン１８〜２４に活性
画分を得、これを減圧下で濃縮凍結乾燥して520
mgの粗粉末を得た。次に、この粗粉末520mgを少
量の水に溶解し、予め水で充填したダウエツクス
50W×２（H⁺、100〜200メツシユ、500ml）（ダウ
ケミカル社製）の塔に付し水で展開すると、10ml
分画でフラクシヨン２１〜２５に活性画分を得、
これを２規定苛性ソーダでPH6.2に調整後、減圧
下で濃縮凍結乾燥することによりSF−2312物質
のナトリウム塩120mgが得られた。このものは前
記薄層クロマトグラフイーで単一のスポツトを与
えた。

【図面の簡単な説明】

第１図はSF−2312物質ナトリウム塩のKBr錠
中で測定した赤外部吸収スペクトルである。第２
図は重水中で測定したSF−2312物質遊離酸の
400MHz水素核核磁気共鳴スペクトルである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の式： で表わされる新抗生物質SF−2312物質及びその
   塩。 ２ ミクロモノスポーラ属に属するSF−2312物
   質生産菌を培養し、培養物からSF−2312物質又
   はその塩を採取することを特徴とする新抗生物質
   SF−2312物質又はその塩の製造法。