JPH0422917B2

JPH0422917B2 -

Info

Publication number: JPH0422917B2
Application number: JP62230985A
Authority: JP
Inventors: Shokichi Oochi; Hiromi Watabe; Takashi Shomura; Masaji Sezaki; Haruo Yamamoto; Shinichi Kondo
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1987-09-17
Filing date: 1987-09-17
Publication date: 1992-04-20
Also published as: JPS6474993A

Description

【発明の詳細な説明】

産業上の利用分野本発明は、新規な生理活性物質SF2547物質及
びその製造法に関する。従来の技術及び発明が解決しようとする問題点従来、数多くの生理活性物質が発明され、医薬
品、動物用薬品、農薬等の分野で実用化されてい
る。しかしながらまだ有効な物質が見出だされてい
ないため解決されていない医療あるいは産業分野
が多く残されている。本発明者らは以上のような点に着目し、新規な
生理活性物質を提供するとともに、その製造法を
確立することによつてこれを解決しようとするも
のである。問題点を解決するための手段本発明者らは、新規有用生理活性物質の検索を
続けた結果、ストレプトマイセス属に属するある
菌株の培養物中に優れた抗腫瘍活性を有する新規
生理活性物質SF2547物質が生産されていること
を見出だし、本発明を完成した。すなわち、本発明は、新規な生理活性物質
SF2547物質及びその製造法を提供するものであ
る。以下にSF2547物質及びその製造法について具
体的に説明する。 (1) 生産菌及び生産菌の菌学的性状本発明の方法に使用されるSF2547物質生産菌
としては、その培養物中に採取するに充分な量の
SF2547物質を生産する能力を有するものであれ
ばいかなるものであつてもよいが、このような菌
株の例としては、本発明者らにより滋賀県の土壌
より新たに分離されたSF2547株がある。SF2547
株の菌学的性状は下記の通りである。形態基生菌糸は長く伸長し、よく分岐し、通常の条
件下では分断しない。気菌糸の着生は極めて貧弱
であり、シユクロース・硝酸塩寒天でごく僅かに
着生し、胞子形成もかろうじて認められる。気菌
糸の分岐は単純分岐であり、車軸分岐は見られな
い。気菌糸先端の胞子連鎖は主として直線状であ
るが、波状やループ状も認められる。電子顕微鏡
による観察では、胞子は円筒型で0.5−0.7×0.9−
1.4μｍの大きさを有し、表面は平滑である。胞子
は通常10胞子以上連鎖する。基生菌糸上での胞子
の着生及び胞子のう、運動性胞子、菌核などは観
察されない。各種培地上の生育状態 SF2547株の各種培地上の生育状態は第１表に
示す通りである。色の記載について［］内に示
す標準はコンテイナー・コーポレーシヨン・オ
ブ・アメリカ（Container Corporation of
America）社製の「カラー・ハーモニイー・マ
ニユアル（Color Harmony Manual）」に記載
のものを用いた。観察は28℃で14−21日培養後に
行つた。

【表】生理的性質 (1) 生育温度範囲：イースト・麦芽寒天において
15−34℃の温度範囲で生育し、25−30℃で良好
に生育する。 (2) ゼラチンの液化：陰性 (3) スターチの加水分解：陰性 (4) 硝酸塩の還元：陰性 (5) 脱脂乳のペプトン化：陰性脱脂乳の凝固：陰性 (6) 耐塩性：３％のNaCl含有培地では生育する
が、４％以上では生育しない。 (7) メラニン様色素の生成：陰性炭素源の利用性（ISP No.９培地使用） (1) 利用する：Ｄ−グルコース、グリセロール (2) 利用しない：Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノ
ース、ラフイノース、Ｄ−マンニトール、シユ
クロース (3) 利用が疑わしい：Ｄ−フラクトース、myo−
イノシトール、Ｌ−ラムノース細胞壁組成ベツカー（Becker）らの方法（Appl.
Microbiol.13：236，1965）により分析した結果、
細胞壁組成成分中のジアミノピメリン酸はLL型
であつた。以上の性状より、SF2547株は放線菌の中でス
トレプトマイセス属に属すると考えるのが妥当で
ある。本発明者らはSF2547株をストレプトマイ
セス・エスピー・SF2547（Streptomyces sp.
SF2547）と称することにした。なお、SF2547株
は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄
第9531号（FERM Ｐ−9531）として受託されて
いる。 SF2547株は他の放線菌の場合に見られるよう
に、その性状が変化しやすい。例えば、SF2547
株の、またはこの株に由来する突然変異株（自然
発生または誘発性）、形質接合体または遺伝子組
替え体であつても、新生理活性物質SF2547物質
を生産するものは全て本発明に使用できる。 (2) 培養法本発明の方法では、前記の菌を通常の微生物が
利用しうる栄養物を含有する培地で培養する。栄
養源としては、従来放線菌の培養に利用されてい
る公知のものが使用できる。例えば、炭素源とし
て、グルコース、水あめ、デキストリン、シユク
ロース、糖みつ、動・植物油等を使用しうる。ま
た窒素源として、大豆粉、小麦はい芽、コーンス
テイープリカー、綿実かす、肉エキス、ペプト
ン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ソー
ダ、尿素等を使用しうる。その他、必要に応じ、
ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウ
ム、コバルト、塩素、燐酸、硫酸、及びその他の
イオンを生成することができる無機塩類を添加す
ることは有効である。また菌の発育を助け、新生
理活性物質SF2547物質の生産を促進するような
有機及び無機物を適当に添加することができる。培養法としては、好気的条件での培養法、特に
深部培養法が最も適している。培養に適当な温度
は15−34℃であるが、多くの場合、28℃付近で培
養する。新生理活性物質SF2547物質の生産は培
地や培養条件により異なるが、振とう培養、タン
ク培養とも通常２−７日の間でその蓄積が最高に
達する。培養中の新生理活性物質SF2547物質の
蓄積量が最高になつた時に培養を停止し、培養液
から目的物質を単離精製する。 (3) 精製本発明によつて得られるSF2547物質の培養物
からの採取にあたつては、その性状を利用した通
常の分離手段、例えば、溶媒抽出法、イオン交換
樹脂法、吸着または分配カラムクロマト法、ゲル
ろ過法、透析法、沈澱法等を単独でまたは適宜組
合わせて抽出精製することができる。例えば、
SF2547物質は培養菌体中からはアセトン−水ま
たはメタノール−水で抽出される。また、水と混
ざらない有機溶剤、例えば、酢酸エチル、クロロ
ホルム等で抽出すれば、SF2547物質は有機溶剤
層に抽出される。 SF2547物質をさらに精製するには、シリカゲ
ル（ワコーゲルＣ−300、和光純薬工業株式会社
製）、アルミナ等の吸着剤やセフアデツクスLH
−20（フアルマシア社製）等を用いるクロマトグ
ラフイーを行うとよい。 (4) 物理化学的性質前記製造法に従つて得られた新生理活性物質
SF2547物質は下記の物理化学的性質を有する。物質の色及び性状：無色プリズム状結晶融点：227−228℃（分解）元素分析値：炭素55.62％，水素8.15％，窒
素11.45％比旋光度：［α］²⁴ _D＋138゜（c0.5，クロロホル
ム）紫外部吸収スペクトル： 150μｇ／mlの濃度のメタノール溶液中で測
定したスペクトルは第１図に示す通りであり、
その吸収値（λmax（MeOH））は210nmであ
る。赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠中で測定したスペクトルは第
２図に示す通りであり、その吸収値（cm^-1）は
以下のとおりである。 3350，3250，2950，2920，1740，1630，1490，
1440，1350，1320，1300，1255，1220，1200，
1185，1145，1120，1090，1045，1020，1000，
970，930，910，880，860，835，810，765，
690，655，590，525，490 ¹H NMRスペクトル（400MHz）：重クロロホルム溶液中、TMSを基準物質と
して測定した第３図に示す通りであり、そのδ
値（ppm）は以下のとおりである。 9.77（1H，ｓ），8.31（1H，ｓ），8.26（1H，ｄ），
6.89（1H，ｄ），6.51（1H，ｓ），5.97（1H，ｍ），
5.91（1H，ｓ），5.42（2H，ｍ），5.18（1H，ｄ），
5.06（1H，ｄ），4.81〜4.90（4H，ｍ），4.34
（1H，ｄ），3.61（2H，ｍ），3.49（1H，ｓ），
3.24（1H，ｍ），3.09（2H，ｍ），3.03（1H，ｍ），
2.92（1H，ｍ），2.80（1H，ｍ），2.46（1H，ｍ），
2.36（1H，ｍ），2.22（1H，ｍ），2.17（1H，ｍ），
2.01（1H，ｍ），1.90（1H，ｍ），1.85（1H，ｍ），
1.70〜1.78（3H，ｍ），1.67（1H，ｍ），1.51〜
1.59（3H，ｍ），1.47（3H，ｓ），1.46（3H，ｓ），
1.41（1H，ｍ），1.33〜1.42（5H，ｍ），1.25
（1H，ｍ），1.22（2H，ｍ），1.00〜1.16（8H，
ｍ），0.96（3H，ｄ），0.91（3H，ｄ），0.86（3H，
ｔ），0.81（3H，ｄ），0.80（3H，ｔ） ¹³C NMRスペクトル（100MHz）：重クロロホルム溶液中、TMSを基準物質と
して測定した第４図に示す通りであり、そのδ
値（ppm）は以下のとおりである。 179.6（ｓ），177.4（ｓ），171.4（ｓ），170.7（ｓ）
，
169.4（ｓ），168.1（ｓ），165.9（ｓ），99.0（ｓ）
，
78.4（ｓ），76.8（ｄ），75.7（ｄ），68.1（ｄ），62
.6
（ｄ），59.0（ｄ），55.9（ｄ），54.3（ｔ），50.9
（ｄ），49.9（ｄ），47.7（ｄ），46.6（ｔ），45.9
（ｄ），45.9（ｔ），38.1（ｔ），37.3（ｔ），35.8
（ｄ），31.0（ｄ），30.9（ｔ），29.4（ｄ），29.4
（ｔ），29.1（ｄ），27.8（ｔ），27.3（ｑ），24.8
（ｔ），24.8（ｔ），23.9（ｔ），20.6（ｔ），20.4
（ｑ），19.9（ｑ），19.6（ｑ），19.3（ｑ），18.6
（ｑ），15.5（ｑ），14.5（ｑ），11.6（ｑ），8.7（
ｑ）溶解性：クロロホルム、酢酸エチルに可溶、メタノー
ル、アセトンに難溶、水、ヘキサンに不溶。呈色反応：グレイグ・リーバツク（Greig−Leaback）
試薬及び10％硫酸試薬に陽性。薄層クロマトグラフイー：担体：シリカゲルプレート（メルク社製）

【表】 (5) 抗腫瘍作用新生理活性物質SF2547物質の各種癌細胞に対
する50％発育阻止濃度（IC₅₀）を第２表に示す。

【表】 (6) 抗菌作用１mg／mlの濃度で抗菌力を示さない（ペーパ
ー・デイスク法）。 (7) 急性毒性 ICRマウス（雄、５週令）に対する急性毒性を
１群３匹で行つたところ腹腔内投与でLD₅₀は4.7
mg／Kgであつた。従来、微生物が生産する種々の生理活性物質が
知られているが、上記した性状を有する本発明に
よる生理活性物質SF2547物質と類似の物質とし
てはアジノスリシン（Azinothricin）［J.
Antibiotics Vol.39，17−25（1986）］が挙げられ
る。しかし、SF2547物質の¹H NMRおよび
¹³C NMRスペクトルはアジノスリシンのそれと
異なること、さらにアジノスリシンがグラム陽性
菌に対して強い抗菌作用を有するのに反し、
SF2547物質は抗菌活性を示さない（１mg／ml、
ペーパー・デイスク法）こと、なならびにその他
の理化学的性状がアジノスリシンとは明らかに異
なり、明確に区別される。従つて本SF2547物質
は新規な物質である。実施例以下に本発明の実施例を示すが、これらは単な
る一例であつて本発明を限定するものではない。
ここに例示しなかつた多くの変法あるいは修手段
を用い得ることは無論のことである。実施例１種培地として、スターチ1.0％、グルコース2.0
％、小麦はい芽0.6％、ポリペプトン0.5％、酵母
エキス0.3％、大豆粉0.2％、炭酸カルシウム0.1％
を含む培地を用いた。また生産培地として、グル
コース4.0％、小麦はい芽2.0％、サングレインF2
（サングレイン社製）0.5％、酵母エキス0.5％、
硫酸マグネシウム（７水塩）0.1％、炭酸カルシ
ウム0.2％を含む培地を用いた。なお、殺菌前PH
はすべて7.0に調整して使用した。前記種培地20mlを分注した100ml容三角フラス
コを120℃で30分間殺菌し、これにストレプトマ
イセス・エスピー・SF2547（FERM Ｐ−9531）
の斜面培養の１−２白金耳を接種し、28℃で３日
間振とう培養し、第１種培養とした。ついで種培
地80mlを分注した500ml容三角フラスコを120℃で
30分間殺菌し、前記第１種培養２mlを接種し28℃
で２日間振とう培養し、これを第２種培養とし
た。あらかじめ120℃30分間殺菌した35Lの生産培
地を含む50L容ジヤーフアーメンター２基に前記
の第２種培養各160mlを接種し、28℃６日間通気
（20L／分）、撹拌（250rpm）培養した。培養終
了後、ろ過助剤としてけい藻土を加えてろ過し、
ろ液40Lと圧縮容量10Lの菌体を含む固形物が得
られた。実施例２実施例１で得られた菌体に40Lの50％アセトン
水を加え活性成分を抽出した。菌体をろ別後、菌
体抽出液を10Lまで濃縮し、培養ろ液40Lと共に
ダイヤイオンHP−20（三菱化成株式会社製）4L
のカラムに通過させた。この通過液から20Lの酢
酸エチルで活性成分を抽出した。抽出した酢酸エ
チル溶液を減圧濃縮すると2.07ｇの油状物質が得
られた。この油状物質2.07ｇをシリカゲル15ｇに
まぶし、減圧下乾燥後あらかじめクロロホルムで
充填したシリカゲルカラム300mlの上部に充填し
た。展開溶媒であるクロロホルム1000ml、クロロ
ホルム−メタノール（200：１）600ml、クロロホ
ルム−メタノール（100：１）1200mlを順に展開
すると、分画No.140−157（15ml／分画）にSF2547
物質を主に含む活性分画が得られた。この分画を
減圧濃縮し、あらかじめメタノールで充填したセ
フアデツクスLH−20（800ml）を使用するカラム
クロマトグラフイーに付し、メタノールで展開し
て活性分画を集め、減圧下濃縮乾固した。混合溶
媒クロロホルム−メタノールより結晶化すること
によりSF2547物質の無色プリズム状結晶（36mg）
が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図はSF2547物質の紫外部吸収スペクトル
（メタノール溶液中、150μｇ／ml）である。第２
図はSF2547物質の赤外部吸収スペクトル図（臭
化カリウム錠）である。第３図はSF2547物質の
¹H NMRスペクトル（重クロロホルム溶液中、
400MHz）である。第４図はSF2547物質の¹³C
NMRスペクトル（重クロロホルム溶液中、
100MHz）である。

Claims

【特許請求の範囲】１下記の理化学的性状を有する新生理活性物質
SF2547物質物質の色及び性状：無色プリズム状結晶融点：227−228℃（分解）元素分析値：炭素55.62％，水素8.15％，窒
素11.45％比旋光度：［α］²⁴ _D＋138゜（c0.5，クロロホル
ム）紫外部吸収スペクトル： 150μｇ／mlの濃度のメタノール溶液中で測
定したスペクトルは第１図に示す通りであり、
その吸収値（λmax（MeOH））は210nmであ
る。赤外部吸収スペクトル：臭化カリウム錠中で測定したスペクトルは第
２図に示す通りであり、その吸収値（cm^-1）は
以下のとおりである。 3350，3250，2950，2920，1740，1630，1490，
1440，1350，1320，1300，1255，1220，1200，
1185，1145，1120，1090，1045，1020，1000，
970，930，910，880，860，835，810，765，
690，655，590，525，490 ¹H NMRスペクトル（400MHz）：重クロロホルム溶液中、TMSを基準物質と
して測定したスペクトルは第３図に示す通りで
あり、そのδ値（ppm）は以下のとおりであ
る。 9.77（1H，ｓ），8.31（1H，ｓ），8.26（1H，ｄ），
6.89（1H，ｄ），6.51（1H，ｓ），5.97（1H，ｍ），
5.91（1H，ｓ），5.42（2H，ｍ），5.18（1H，ｄ），
5.06（1H，ｄ），4.81〜4.90（4H，ｍ），4.34
（1H，ｄ），3.61（2H，ｍ），3.49（1H，ｓ），
3.24（1H，ｍ），3.09（2H，ｍ），3.03（1H，ｍ），
2.92（1H，ｍ），2.80（1H，ｍ），2.46（1H，ｍ），
2.36（1H，ｍ），2.22（1H，ｍ），2.17（1H，ｍ），
2.01（1H，ｍ），1.90（1H，ｍ），1.85（1H，ｍ），
1.70〜1.78（3H，ｍ），1.67（1H，ｍ），1.51〜
1.59（3H，ｍ），1.47（3H，ｓ），1.46（3H，ｓ），
1.41（1H，ｍ），1.33〜1.42（5H，ｍ），1.25
（1H，ｍ），1.22（2H，ｍ），1.00〜1.16（8H，
ｍ），0.96（3H，ｄ），0.91（3H，ｄ），0.86（3H，
ｔ），0.81（3H，ｄ），0.80（3H，ｔ） ¹³C NMRスペクトル（100MHz）：重クロロホルム溶液中、TMSを基準物質と
して測定したスペクトルは第４図に示す通りで
あり、そのδ値（ppm）は以下のとおりであ
る。 179.6（ｓ），177.4（ｓ），171.4（ｓ），170.7（ｓ）
，
169.4（ｓ），168.1（ｓ），165.9（ｓ），99.0（ｓ）
，
78.4（ｓ），76.8（ｄ），75.7（ｄ），68.1（ｄ），62
.6
（ｄ），59.0（ｄ），55.9（ｄ），54.3（ｔ），50.9
（ｄ），49.9（ｄ），47.7（ｄ），46.6（ｔ），45.9
（ｄ），45.9（ｔ），38.1（ｔ），37.3（ｔ），35.8
（ｄ），31.0（ｄ），30.9（ｔ），29.4（ｄ），29.4
（ｔ），29.1（ｄ），27.8（ｔ），27.3（ｑ），24.8
（ｔ），24.8（ｔ），23.9（ｔ），20.6（ｔ），20.4
（ｑ），19.9（ｑ），19.6（ｑ），19.3（ｑ），18.6
（ｑ），15.5（ｑ），14.5（ｑ），11.6（ｑ），8.7（
ｑ）溶解性：クロロホルム、酢酸エチルに可溶、メタノー
ル、アセトンに難溶、水、ヘキサンに不溶。呈色反応：グレイグ・リーバツク（Greig−Leaback）
試薬及び10％硫酸試薬に陽性。薄層クロマトグラフイー：担体：シリカゲルプレート（メルク社製）【表】２ストレプトマイセス（Steptomyces）属に属
するSF2547物質生産菌を培地に培養し、その培
養物からSF2547物質を採取することを特徴とす
るSF2547物質の製造法。３ストレプトマイセス（Steptomyces）属に属
する生産菌がストレプトマイセス・エスピー・
SF2547（微工研菌寄第9531号）である特許請求の
範囲第２項記載の製造法。