JPH04211096A - Ｌｈ−ｒｈ類似体の一時的最小保護合成法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【発明の分野】

［０００１］本発明は、最小保護法によりＬＨ−ＲＨ類
似体の固相合成法に関する。 ［０００２］

【発明の背景］　ＬＨ−ＲＨ類似体とは、構造がＬＨ−
ＲＨに類似しており、ＬＨ−ＲＨと同様の生物活性を示
すノナペプチド又はデカペプチドである。この類似体は
子宮内膜症、前立腺癌、思春期早発症、及び他のホルモ
ンが介在する疾患の症状を緩和する能力を有するため、
集中的に臨床研究が行われている。現在治療用に数種類
のＬＨ−ＲＨ類似体が入手できるが、その合成法は複雑
でお金がかかり、そのため治療を必要とする人たちの負
担が大きい。ＬＨ−ＲＨ類似体はその作用様式により、
従来アゴニスト（ａｇｏｎ　ｉ　ｓ　ｔ）又はアンタゴ
ニスト（ａｎ　ｔ　ａｇｏｎ　ｉ　ｓ　ｔ）として記載
されてきた。本発明に関係のあるＬＨ−ＲＨ類似体はノ
ナペプチドとデカペプチドであり、アゴニスト及びアン
タゴニストともに含まれる。本発明に有用なＬＨ−ＲＨ
アゴニストの例としては、ナファレリン（ｎａｆａｒｅ
　ｌ　ｉｎ）　、ロイプロレリン（ｌｅｕｐｒｏｒｅｌ
　ｉｎ）　、ブセレリン（ｂｕｓｅｒｅｌｉｎ）、ゴセ
レリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）、ヒステレリン（ｈｉｓ
ｔｅｒｅｌｉｎ）、トリプトレリン（ｔｒｉｐｔｏｒｅ
ｌ　ｉｎ）そしてデスロレリン（ｄｅｓ　１ｏｒｅ　ｌ
　ｉｎ）がある。これらはすべて６位のグリシン残基が
Ｄ−アミノ酸で置換されていることにより天然のＬＨ−
ＲＨとは異なる。合成アゴニストは天然に存在するホル
モンと同様に、２位にヒスチジン、４位にセリン、そし
て５位にチロシンを有しており、これらはすべて合成の
困難な反応性のある側鎖を有している。 ［０００３］　ＬＨ−ＲＨアンタゴニストは一般的に、
２位のヒスチジン残基が欠失又は置換されていることに
より、天然に存在するＬＨ−ＲＨとは異なる。合成とい
う面から見れば、ヒスチジンの欠失は好ましくない副反
応の機会を減少させてくれる。しかしまだセリンとチロ
シンが存在するために、側鎖の反応を避けるために特別
な操作が必要である。 ［０００４］　ＬＨ−ＲＨ類似体は以下の文献に記載さ
れているような種々の方法で合成することができるニジ
エイ・エム・スチュワートとジェイ・デイ−・ヤング（
Ｊ、Ｍ、Ｓｔｅｗａｒｔ　　ａｎｄ　　Ｊ、Ｄ、Ｙｏｕ
ｎｇ）、同相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ　　Ｐｈａｓｅ
　　Ｐｅｐｔｉｄｅ　　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ）、ダブリ
ュー・エイチ・フリーマン社（Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ
　　Ｃ０１）、サンフランシスコ、１９６９年；ジェイ
・マイネンホーフｙ　　（Ｊ、Ｍｅ　１ｎｅｎｈｏｆｅ
ｒ）　、ホルモン性蛋白とペプチド（Ｈｏｒｍｏｎａｌ
　　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　　ａｎｄ　　Ｐｅｐｔ　１ｄｅ
ｓ）　、第２巻、４６頁、アカデミツクブレス社（Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ）にューヨーク）、１９７
３年；及びイー・シュローダ−とケー・ルブケ（Ｅ、５
ｃｈｒｏｄｅｒ　　ａｎｄ　　Ｋ、Ｌｕｂｋｅ）、ペプ
チド（ＴｈｅＰｅｐｔｉｄｅＳ）、第１巻、アカデッミ
クプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ）　　に
ューヨーク）、１９６５年。これらの方法は広く液相法
又は固相法として分類される。 いずれの方法においても増殖しているペプチド鎖にアミ
ノ酸が連続的に付加される。普通最初のアミノ酸のアミ
ノ基又はカルボキシル基は適当な保護基で保護される。 次にこうして保護されたアミノ酸は、アミド結合を形成
するのに適当な条件下で次の保護されたアミノ酸を配列
に付加することにより、不活性の支持体に結合されるか
又は溶液中で利用される。次にこの新たに付加されたア
ミノ酸残基から保護基をはずし、そしてまた次のアミノ
酸が付加される。目的のアミノ酸をすべて正しい順序で
結合された後は、残っている保護基及び支持体をはずし
、最終のポリペプチドを得る。この一般的な方法を若干
変更することにより、増殖している鎖に一度に２つ以上
のアミノ酸を付加していくことが可能である（例えば保
護されたトリペプチドに保護されたジペプチドを結合さ
せてペンタペプチドを合成する）。 【０００５】しかし固相合成法のもっと厳しい条件下で
は、一般的にアミド結合の生成中はアミノ酸上のすべて
の反応性側鎖は保護されている必要がある。普通側鎖の
保護基は、完了したポリペプチドを不活性の支持体から
分離した後、又はそれと同時に別の方法ではずされる。 （０００６］　ＬＨ−ＲＨ類似体の調製に特に有効な１
つの固相合成法が、ネストールら（Ｎｅｓｔｏｒ　　ｅ
ｔａｌ、）の米国特許第４，２３４，５７１号に記載さ
れており、その開示内容は参考のため本明細書に引用さ
れている。この一般的に使用される方法では、各アミノ
酸のα−アミノ基（Ｎα）は酸又は塩基に感受性の基（
例えばｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ））で保護
され；セリン、ヒスチジン及びチロシン上に存在するよ
うな反応性の側鎖は、強く結合した基で保護されており
、その分離にはフッ化水素（ＨＦ）による処理又は類似
の激しい操作が必要である。α−アミノ保護基や側鎖保
護基の分離は、普通別のステップで実施される。 ［０００７］　このアプローチ法は研究で使用するよう
な量のペプチドの調製には充分であるが、ペプチドの大
規模な生産を考える場合はこれらの方法では不十分であ
る。側鎖が充分保護されたアミノ酸は高価であり、ペプ
チドの商業的規模の生産ではそのコストが大きくなる。 またフッ化水素の使用は環境に深刻な害を与えるだけで
なく、商業的には受は入れ難い収率の低下を招く。さら
に側鎖保護基の分離法には別の生産ステップが必要なた
め、合成に余分の時間とコストがかかる。 ［０００８］別のプロトコールもそれほど有効ではない
。チェノら（Ｔｉｅｎ　　ｅｔ　　ａｌ、）、ペプチド
化学（Ｐｅｐｔ、　　Ｃｈｅｍ、　）、３７５−３７９
頁、ティー・シバとニス・サカキバラ（Ｔ、５ｈｉｂａ
　　ａｎｄ　　Ｓ、５ａｋａｋｉｂａｒａ）編、蛋白研
究財団（Ｐｒｏｔｅｉｎ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　Ｆｏ
ｕｎｄａｔｉ。 ｎ）　　（大阪）　　（１９８８年）は、ヒスチジンの
トシル保護とチロシンとセリンのベンジル保護を使用す
るＬＨＲＨの合成を報告している。この方法はフッ化水
素の使用を避けてはいるが、ベンジル保護基をはずすの
に別の脱水素段階を必要とし、トリプトファンがある程
度還元される。 ［０００９］デイ−・エイチ・コイら（Ｄ、　Ｈ，Ｃｏ
ｙｅｔ　　ａｌ、）、インターナショナル・ジャーナル
・オブ・ペプチド・プロティン・リサーチ（Ｉ　ｎ　ｔ
。 Ｊ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、）、
第１４巻、３３９−３４３頁（１９７９年）は、種々の
側鎖保護プロトコール（セリンのみのベンジル側鎖保護
、アルギニンのみのトシル側鎖保護、セリンとアルギニ
ン側鎖保護、そしてセリン、アルギニン及びチロシンの
（２−ブロモベンジル−オキシカルボニル）側鎖保護）
を使用して、ＬＨ−ＲＨアンタゴニストである（Ｄ　−
ＰｂＯ２、Ｄ−Ｔｒｐ”、Ｄ−ＰｂＯ６：］　−ＬＨ−
ＲＨの合成を報告している。これらの方法はすべてＨＦ
脱保護を必要とする。　「セリンのみ」合成では、アル
ギニンの塩保護（例えばＡｒｇ　　ＨＣＩ）も使用され
た。その支持体から粗ペプチドを分離し、側鎖保護基を
はずすためにフッ化水素が使用された。ペプチドが「充
分に」非保護（アルギニンの塩保護のみ）である時、コ
イ（Ｃｏｙ）はフッ化水素処理を避けた。すべての保護
合成は、非保護の側鎖合成より収率が悪かった。 ［００１０１コイら（Ｃｏｙ　　ｅｔ　　ａｌ、）はさ
らに、ヒスチジンのみのジニトロフェニル側鎖保護、ア
ルギニンの塩保護、そしてＨＦ処理なしで、ＬＨ−ＲＨ
アゴニスト［：Ｄ−Ｌｅｕ６、デスＧ　ｌ　ｙ　　ＮＨ
２１０：］　　ＬＨＲＨエチルアミドの合成を報告した
。ジニトロフェニル側鎖保護基はペプチドをその支持体
から分離する時、ジメチルホルムアミド中のエチルアミ
ンの溶液を使用してはずされた。充分に保護した、ＨＦ
分離した合成の収率が２４％に対して、ヒスチジンのみ
保護した合成の収率は３４％であった。保護しない場合
の合成とは比較されなかった。 ［００１１１この技術は、種々の最小保護方法のうちで
もヒスチジンのみの保護は、充分に保護したいくつかの
ＬＨ−ＲＨアンタゴニストの合成の収率をある程度改良
するかも知れないことを示唆している。しかしＬＨ−Ｒ
Ｈアゴニストについて報告された側鎖保護アプローチで
は特に利点は認められていない。 ［００１２１ＨＦ脱保護をさけるための理想的なアプロ
ーチは、保護をせずに合成することであるが、ヒスチジ
ンの保護がないと過度のラセミ化が起こりやすい。しか
しわれわれは、コイら（Ｃｏｙ　　ｅｔ　　ａｌ、）の
方法でヒスチジンのみの保護法の使用では、セリン残基
のアシル化のためにビス−セリンの不純物の濃皮が高く
なることを見いだした。ＨＦ脱保護化段階を必要とせず
、未保護ではペプチドの純度と収率に悪影響を与えるよ
うな基の保護を与える、ＬＨ−ＲＨ類似体の実際的な最
小保護合成法を得るためには、前記の技術をかなり改良
しなければならない。 ［００１３］

【発明の要約】本発明の目的は、必須最小数のアミノ酸
残基のみの側鎖が保護されている、ＬＨ−ＲＨ類似体の
合成法を与えることである。 ［００１４］本発明の別の目的は、ＨＦ脱保護段階の必
要性をなくし、毒性のＨＦ試薬の使用を避け、従来法で
しばしば遭遇する毒性のある廃液を減少させるような、
ＬＨ−ＲＨ類似体の合成法を与えることである。 ［００１５］本発明の上記の顕著な面は、側鎖保護基を
はずすための余分な反応段階をなくす以外に、ＬＨ−Ｒ
Ｈ化合物の調製のコストを低下させるという追加の利点
を与える。 ［００１６］　ＬＨ−ＲＨ類似体に対する本発明の目的
は、ペプチド鎖にセリンを結合した後直ちにはずされる
基でアミノ酸残基セリンのヒドロキシ側鎖のみを保護す
ることよりなる、−時的最小保護法で達成される。側鎖
保護基は、α−アミノ保護基の分離除去に有効な条件と
同じ条件で不安定なものである。ヒスチジン残基を含む
ＬＨ−ＲＨ類似体については、イミダゾール側鎖も結合
サイクル中に不安定な基、適当にはアミノ基脱保護剤に
不安定な基で保護されるが、それは場合により、アミツ
リシス又はアンモノリシスではずし得る基で保護するこ
ともできる。 ［００１７］セリンの一時的側鎖保護と、もし存在する
場合には、ヒスチジンの側鎖保護は、ＨＦ又は他の別の
脱保護段階を必要とせずに、不純物の生成を最小限に抑
え最大の収率を与える。 ［００１８］

【発明の詳細な説明】

［００１９］

【方法とＬＨ−ＲＨ類似体の説明】本発明の一時的最小
保護法は、配列の残りがなんであるかに関係なく数個か
ら数十個の残基を有するセリン含有ポリペプチドの同相
合成法に適用できることが期待される。ＬＨ−ＲＨ類似
体や他のノナペプチド、デカペプチドは、好適な合成の
ターゲットである。本発明は１つずつのアミノ酸の連続
的付加について説明するが、本方法はセリン残基の側鎖
をセリン結合サイクルを通じて一時的に保護するという
条件で、より小さいポリペプチドのブロックを結合させ
てより大きなポリペプチドを合成する方法にも適用でき
る（例えばペンタペプチドにテトラペプチドを付加する
）ことは、当業者には容易に理解できるであろう。 ［００２０１−時的保護とは、合成サイクルの比較的短
時間の間セリン側鎖が保護されることを意味する。セリ
ンを結合させた後、側鎖保護基とα−アミノ保護基又は
カルボキシル保護基が同時にはずされる。一般的にセリ
ン側鎖保護基の選択の最も重要な条件はその基が、結合
条件には安定であるがα−アミノ脱保護条件に対して不
安定でなければならないということである。本発明の１
つの面においては、α−アミノ基保護を利用してセリン
側鎖は好ましくは、ｔ−ブチル、ｔ−ブチルジメチルシ
リル、トリメチルシリル、トリチル、ピバリル及びテト
ラヒドロピラン−２−イルより選択される基で保護され
る。 ［００２１］ヒスチジン残基を有するＬＨ−ＲＨ類似体
については、イミダゾール側鎖を保護することが一般的
に好ましい。この保護は一時的なものでもよい（即ち、
結合中子安定であるか、又はペプチドがその支持体から
はずされるまでは本来の場所に維持されている）。好ま
しくは、その支持体から樹脂を分離し、同時にヒスチジ
ン保護基をはずすために、アミツリシス又はアンモノリ
シスが使用される。 ［００２２］本発明の別の面では、この脱保護剤は、Ｃ
３からＣ６アルコールとジクロロメタン中の塩化水素の
溶液から選択される。好ましくはアルコールとジクロロ
メタンの比率は０．　１から１０．　０　（Ｖ／Ｖ）で
あり、酸の濃度は２Ｎから９Ｎである。最も好ましくは
アルコールはｉ−プロパツールである。 ［００２３］

【略語と定義】本発明においてｒＬＨ−ＲＨＪという用
語は、黄体形成ホルモン放出ホルモンを意味し、そして
ｒＬＨ−ＲＨ類似体」とはＬＨ−ＲＨ自身、及び構造が
ＬＨ−ＲＨに関連しているか又はＬＨ−ＲＨ由来であっ
て、ＬＨ−ＲＨに類似の生物活性を示す他のポリペプチ
ドを意味する。 ［００２４］種々の一般的なアミノ酸の略語は、生化学
的命名法に関するＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会（ＩＵＰＡ
Ｃ−ＩＵＢ　　Ｃｏｍｍ１ｓｓｉｏｎ　　ｏｎ　　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌ　　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）、
バイオケミストリー（Ｂ　ｉ　ｏｃｈｅｍｉ　ｓ　ｔ　
ｒｙ）第１１巻、１７２６頁（１９７２年）で推奨され
ているものである。 本明細書に記載されているすべてのペプチド配列は一般
的に受は入れられている方法に従っており、左側にＮ末
端を、そして右側にＣ−末端を記載しである。 ［００２５１本明細書中の略語はＬ−アミノ酸を意味し
ているが、非対掌性のアミノ酸グリシンと、天然に存在
しない非対掌性のアミノ酸又はＤ−又はり、　Ｌ−と明
記しであるものを除く。Ｅｔはエチルであり、Ｂｕはブ
チルであり、ｉＰｒはイソ−プロピルである。 ［００２６１本発明の説明に有用な他の略語としては、
天然のＬＨ−ＲＨペプチド中のアミノ酸を置換した以下
のようなものがあるニ アミノ酸残基　　　　　　　　　　　　　略　語３−（
２−ナフチル）−アラニル　　　　　　Ｎａｌ　　（２
）３−（ｐ−フルオロフェニル）−アラニル　　ｐ−Ｆ
−Ｐｈｅ３−（ｐ−クロロフェニル）−アラニル　　　
ｐ−ＣＩ−Ｐｈｅ３−（３−ピリジル）−アラニル　　
　　　　Ｐａ１（３）ＮＧ、Ｎ”−ビス（エチル）−ｈ
Ａｒｇ　（Ｅｔ）２ホモアルギニル ＮＧ、ＮＧ’−ビス（２，２，２−ｈＡｒｇ　（ＣＨ２
ＣＦ３）２トルフルオロエチル）− ホモアルギニル ＮＧ　−ブチル−ホモアルギニル　　　　　　　ｈＡｒ
ｇ　（Ｂｕ）Ｎε−イソプロピル−リジル　　　　　　
　　Ｌｙｓ　　（ｉＰｒ）（ベンジル）−ヒスチジル　
　　　　　　　　Ｈｉｓ（Ｂｚｌ）［００２７］本明細
書において「薬剤として許容される塩」とは、鋭化合物
の生物活性を有しているが、毒性の副作用のない塩をい
う。このような塩の例としては無機塩（例えば塩酸、臭
化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸など）と形成される酸付
加塩や、有機酸（例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハ
ク酸、マレイン酸、フマール酸、グルコン酸、クエン酸
、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、
パモイン酸（ｐａｍｏｉｃ　　ａｃｉｄ）、アルギン酸
、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレ
ンジスルホン酸、ポリガラフラール酸など）と形成され
る塩がある。 ［００２８］　　ｒＮ−Ａｃ　Ｊ　という略語は、一般
的に受は入れられている命名法に従い、Ｎ−アセチル保
護基（即ち末端アミノ酸に結合したアミン窒素上のアセ
チル基）を意味する。 ［００２９］

【好適な態様】本発明の１つの態様においては、　（ａ
）ラセミ化、副反応又は増殖しているペプチドの支持体
からの分離を引き起こすことなく、適当にはα−アミノ
保護基をはずすのに有用な試薬に対して不安定な基で４
位のセリンの側鎖を一時的に保護し、　（ｂ）ヒスチジ
ンが存在する場合は、その側鎖をα−アミノ基脱保護剤
、又はアミツリシス又はアンモノリシスに対して不安定
な基で保護することよりなる改良を含む、式

【化３】 Ｒ’−Ｒ２−Ｒ”−３ｅｔ−Ｔｙｒ−Ｒ’−Ｌｅｕ−Ｒ
５−Ｐｒｏ−Ｒ６（Ｉ）（式中、Ｒ１は（パイロ）Ｇｌ
ｕ及びＮ−Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ（２）から選択され；Ｒ２
はＨｉ　ｓ、　Ｄ−ｐ−ＣＩＰｈｅ及びＤ−ｐ−Ｆ−Ｐ
ｈｅから選択され；Ｒ３はＴｒｐ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｎ
ａｌ　　（２）及びＤ−Ｐａｌ（３）から選択され；Ｒ
４はＤ−Ｎａ　１　　（２）　、Ｄ−ｈＡｒｇ（Ｅｔ）
２、Ｄ−ｈＡｒｇ（Ｂｕ）　、Ｄ−ｈＡｒｇ　（ＣＨ２
ＣＦ３）　２、Ｄ−Ｈｉ　ｓ　（Ｂｚ　ｌ）　、Ｄ−Ｌ
ｅｕ％Ｄ−Ｐａｌ　　（３）　、Ｄ−８ｅｒ　（ｔＢｕ
）及びＤＴｒｐから選択され；Ｒ５はＡｒｇ、Ｌ−ｈＡ
ｒｇ　（Ｅｔ）２、Ｌ−ｈＡｒｇ　（Ｂｕ）　、Ｌ−ｈ
Ａｒｇ　（ＣＨ２ＣＦ３）２及びＬｙｓ　（ｉＰｒ）よ
り選択され；そしてＲ６はＧｌｙ　　ＮＲ２、Ｎ　ＨＮ
　ＨＣＯＮ　Ｒ２、Ｄ−ＡｌａＮＨ２及びＮＨＥｔより
選択され；アミノ酸はＮα保護されている）のアミノ酸
配列を有する化合物の、改良された最小保護固相合成法
が与えられる。 ［００３０１また別の態様において、以下の段階よりな
る式（Ｉ）の化合物の固相合成法の一時的最小保護法が
与えられる：（ａ）ポリペプチド中のアミノ酸のα−ア
ミノ基を保護し、　（ｂ）α−アミノ保護基をはずすの
に有用な薬剤に対して不安定な基でセリンの側鎖を保護
し、　（Ｃ）ヒスチジンが存在する場合は、その側鎖を
塩基性脱保護剤に対して不安定な基、又はアミツリシス
又はアンモノリシスではずされる基に対して不安定な基
で保護し、　（ｄ）　Ｃ−末端アミノ酸を不活性同相支
持体に結合させ、　（ｅ）　Ｃ−末端から始めて、１つ
又はそれ以上の選択されたアミノ酸をお互いに連続的な
サイクルで、適当な結合剤を使用して連続的に結合させ
、　（ｆ）各サイクルの後で脱保護剤で処理して保護基
を脱離させ（該脱保護剤は、ラセミ化、副反応、又は増
殖しているペプチドの支持体からの分離を引き起こすこ
となく、αアミノ保護基と側鎖保護基をはずすことがで
きる）、（ｆ）ノナペプチド又はデカペプチドを生成さ
せるのに必要に応じて結合と脱離の段階を繰り返し、（
ｇ）アミツリシス又はアンモノリシスにより支持体から
ポリペプチドを分離し、そして（ｈ）得られるポリペプ
チドを単離し精製する。もう一つの態様として、次の工
程からなる式（Ｉ）の化合物の同相合成法が提供される
。　（ａ）適当なりｏｃ−保護およびｔ−ブチル保護セ
リンを、連続サイクル中において、かつ式（Ｉ）の化合
物のアミノ酸配列の右から左への順序で、不活性固体支
持体に共有結合したＢｏｃ　−Ｒｅ　−０−から出発し
て固相合成により結合させ、　（ｂ）各サイクルの終り
に、ＨＣＩ／ＣＨ２ＣＩ２およびＨＣＩ／低級アルカノ
ール／ＣＨ２Ｃｌ２から選択される脱保護剤での処理に
よりセリンまたはＤセリンからＢｏｃ−保護基および同
時にｔ−ブチル基を除去して、前記固体支持体に結合し
たポリペプチドを形成させ、　（Ｃ）アンモノリシスに
より支持体からポリペプチドを開裂し、そして（ｄ）得
られたポリペプチドを単離する。 ［００３１１好適な態様では、上記の式においてＲ１は
（パイロ）Ｇｌｕ及びＮ−Ａｃ　−Ｄ−Ｎ　ａ　１　　
（２）であり；Ｒ２はＨｉｓ又はＤ−ｐ−ＣＩ　−Ｐｈ
　ｅであり；Ｒ３はＴｒｐ及びＤ−Ｐａｌ　（３）であ
り；Ｒ４はＤ−Ｎａ１　　（２）　、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−
Ｔｒｐ、Ｄ−８ｅｒ　（ｔＢｕ）　Ｄ−Ｈｉ　ｓ　（Ｂ
ｚ　ｌ）又はＤ　　ｈＡｒｇ　（Ｅｔ）　２であり；Ｒ
５はＡｒｇ又はｈＡｒ　ｇ　（Ｅ　ｔ）　２であり；そ
してＲ６はＧ　１　ｙ　　ＮＲ２、ＮＨＥ　ｔ、又はＤ
−ＡｌａＮＨ２であるポリペプチドの生産に対する、上
記方法が与えられる。 ［００３２］最も好ましくは、本発明は式（Ｉ）の化合
物のＬＨ−ＲＨアンタゴニスト、即ちナファレリン（こ
こでＲ１は（パイロ）Ｇｌｕであり、Ｒ２はＨｉｓであ
り、Ｒ３はＴｒｐであり、Ｒ４はＤ−Ｎａｌ　　（２）
であり、Ｒ５はＡｒｇであり、そしてＲ６はＧｌｙ　　
ＮＲ２である）、又は式（Ｉ）の化合物のＬＨ−ＲＨア
ンタゴニストにこでＲ１はＡｃ−Ｄ−Ｎａｌ　　（２）
であり；Ｒ２はＤ−ｐ−Ｃ１−Ｐｈ　ｅであり；Ｒ３は
Ｄ−Ｐａｌ（３）であり；Ｒ４はＤ−ｈＡｒ　ｇ　（Ｅ
　ｔ）　２であり；Ｒ５はＬ−ｈＡｒｇ　（Ｅｔ）２で
あり；そしてＲ６はＤ−Ａ１　ａ　−Ｎ　Ｒ２である）
の製造方法を与える。 ［００３３］好適な態様において、アミノ酸のα−アミ
ノ（Ｎａ）は酸又は塩基に感受性の基で保護される。該
保護基はペプチド結合形成の条件には安定であるが、増
殖中のペプチド鎖の破壊やその中の対掌中心のラセミ化
を引き起こすことなく容易に分離できる。適当な保護基
は、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ビフェニルイ
ソプロピルオキシカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボ
ニル、イソボルニルオキシカルボニル、α、α−ジメチ
ルー３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、０
ニトロフエニルスルフエニル、２−シアノ−ｔ−ブチル
オキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカル
ホニル（Ｆｍｏｃ）などがある。好ましくはα−アミノ
保護基はｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）である。 ブセレリンやゴセレリン（ここでは式（Ｉ）のＲ４はＤ
Ｓｅｒ　（ｔＢｕ）である）などのペプチドの調製が必
要な場合は、Ｄ−８ｅｒ　（ｔＢｕ）の付加を含み及び
その後に、結合サイクル中でＮα保護のためにはＦｍｏ
ｃが好ましい。Ｆｍｏｃは塩基性試薬（ｐＨ＞８．　５
）、たとえば、ヒペリジンに不安定であり、それはＤ−
８ｅｔ　（ｔＢｕ）からｔＢｕを分離しない。後のサイ
クルでＤ−８ｅｔ　（ｔＢｕ）の付加に続いて、塩基感
受性Ｎα保護を用いることが必要である。４位のセリン
の側鎖は、たとえば緩和なフルオリド処理で除去しうる
基で保護される。望ましいセリン側鎖保護基はｔ−ブチ
ルジメチルシリルである。 ［００３４］本発明の一般的な態様において説明したよ
うに、セリン残基のヒドロキシ側鎖は、増殖しているペ
プチドヘセリンが結合している間保護される。結合が完
了した後及び次のアミノ酸が付加される前に、側鎖保護
基ははずされる。セリン側鎖保護基は、Ｎα保護基をは
ずすのに使用される試薬と同じ試薬を使用してはずされ
る。セリンの好適な側鎖保護基は、ｔ−ブチル、ｔ−ブ
チルジメチルシリル、トリメチルシリル、トリチル、ピ
バリル、及びテトラヒドロピラン−２−イルである。 ［００３５］さらにＬＨ−ＲＨアゴニスト中に一般的に
存在するヒスチジンのイミダゾール側鎖も保護される。 ヒスチジン側鎖保護基も結合サイクル中不安定である（
例えばＮα基脱保護剤に不安定である）が、ペプチドが
その支持体から分離される時随時その分離が完了する。 ヒスチジンの好適な側鎖保護基はｐ−トルエンスルホニ
ルと２，４−ジニトロフェニルである。 ［００３６］合成を開始するためには、まず最初のアミ
ノ酸（普通は最終生成物中のＣ−末端アミノ酸である）
を、適当な同相支持体に結合させる。上記合成に有用な
適当な固相支持体は、使用される媒体に不溶性であると
ともに、段階的縮合−脱保護反応中の試薬や反応条件に
不活性である物質である。市販の樹脂の例としては、反
応性のある基で修飾したスチレン／ジビニルベンゼン樹
脂（例えばクロロメチル化スチレン／ジビニルベンゼン
共重合体、ヒドロキシメチル化スチレン／ジビニルベン
ゼン共重合体など）がある。メリフィールド（Ｍｅｒｒ
ｉｆｉｅｌｄ）樹脂（１％架橋クロロメチル化スチレン
／ジビニルベンゼン共重合体）が好適である。 ［００３７］樹脂、例えばクロロメチル化スチレンジビ
ニルベンゼン樹脂への結合は、Ｎαα保護−末端アミノ
酸の反応を利用して行われる。特にエタノール、アセト
ニトリル、Ｎ、　Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）
などの中のセシウム塩、テトラメチルアンモニウム塩、
１．５−ジアザビシクロ（５，４，０）ウンデク−５エ
ン、又は類似の塩（特にＤＭＦ中のセシウム塩）として
のＮα−Ｂｏｃアミノ酸を使用して、高めた温度（例え
ば約４０℃から６０℃、好ましくは約５０℃）で約１２
から７２時間（好ましくは約４８時間）クロロメチル化
樹脂で保護される。 ［００３８］保護されたアミノ酸の連続的結合は当業者
周知の方法、代表的には、自動ポリペプチド合成器を使
用して実施される。各保護アミノ酸は約１．５から約２
．５倍モル過剰で導入され、結合は不活性の非水性、極
性溶媒（例えばジクロロメタン、ＤＭＦ又はそれらの混
合物、好ましくはジクロロメタン）中で、大体周囲温度
で実施される。結合剤は単独、又は１−ヒドロキシベン
ゾトリアゾール（ＨＢｔ）、０−アシル尿素、ベンゾト
リアゾール−Δ−イルーオキシートリス（ピロリジノホ
スホニウム）へキサフルオロホスフェート（ＰｙＢ。 ｐ）、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド、他のＮ−ヒドロキ
シイミド又はオキシムの存在下でのＮ、　Ｎ’−ジシク
ロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）　、Ｎ、Ｎ’−ジ
−イソ−プロピルカルボジイミド（Ｄ　Ｉ　Ｃ）又は他
のカルボジイミドから選択される。あるいは保護された
アミノ酸活性エステル（例えばｐ−ニトロフェニル、ペ
ンタフルオロフェニルなど）又は対称性無水物を使用す
ることもできる。 ［００３９］ペプチド樹脂の完全な結合のチエツクには
、カイザー試験（Ｋａｉｓｅｒ　　Ｔｅ５ｔ）（アナリ
ティ力ルバイオケミストリー（Ａｎａｌ、　　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、）第３４巻、５９５頁（１９７０年））を使用
したが、プロリンへの結合の場合はクロラニル試験（Ｃ
ｈｌｏｒａｎｉｌ　　Ｔｅ５ｔ）　　（アナリティ力ル
バイオケミストリー（Ａｎａｌ、　　　Ｂｉｏｃｈｅｍ
、）第１１７巻、１４５頁（１９８１年））、又はイサ
チン試験（■５ａｔｉｎ　　Ｔｅ５ｔ）　　（アナル・
キム・アクタ（Ａｎａ　１．　Ｃｈ　ｉｍ、　Ａｃ　ｔ
　ａ）第１１８巻、１４９頁（１９８０年））を使用し
た。

【００４０】この結合の試験の結果が、反応が完了して
いないことを示唆している場合は、追加の酸付加はせず
に追加のアミノ酸を使用して結合を繰り返した。最後の
結合が完了した後、メタノール又はジクロロメタンを含
むメタノールで樹脂を洗浄し、最高６０℃で乾燥した。

【００４１】各サイクルの後（即ち増殖しているポリペ
プチド鎖に連続的に各Ｎα−保護アミノ酸を付加した後
）に、脱保護剤で処理して保護基をはずした。セリンを
付加した場合は、脱保護はＮα−Ｂｏｃ保護基とセリン
保護基をはずす。好適な脱保護剤にはジクロロメタン中
の塩化水素（ＨＣｌ　／　ＣＨ２ＣＩ　２　）　、ジク
ロロメタン中のトリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ／　ＣＨ
２ＣＩ　２　）　、及びＣ３−Ｃ６アルコール（好まし
くはイソプロパツール）に溶解しジクロロメタンと混合
した塩化水素がある。一般的にＨＣＩの濃度は２Ｎから
９Ｎであり、好ましくは４Ｎから５Ｎである。ＣＨ２Ｃ
ｌ２　とＣ３−Ｃ６アルコールの割合は、０．１から１
０　（Ｖ／Ｖ）であり、好ましくは１：１である。特に
好適な脱保護剤は、ｉ　−Ｐ　ｒＯＨ：　ＣＨ２ＣＩ２
　　（１：　１）中４．５ＮのＨＣｌである。脱保護段
階は一般的に０℃から４５℃の温度（好ましくは周囲温
度（２０℃から２７℃））で実施される。 ［００４２］本発明の目的を達成する薬剤でセリン残基
が脱保護されるなら、上記以外の薬剤を使用して結合／
脱保護が完全に適用できることが、当業者には理解でき
るであろう。各脱保護サイクルでＨＣ１／１−ＰｒＯＨ
／ＣＨ２Ｃｌ２　を使用する方法も利用できる。あるい
は、あるサイクルでＴＦＡ／ＣＨ２ＣＩ２　を使用し、
別のサイクルでＨＣｌ　／　ｉ　−Ｐ　ｒ　ＯＨ／　Ｃ
Ｈ２Ｃ１２を使用する組合せの方法も可能である。他の
サイクルも当業者には明白であろう。 ［００４３］固相合成の最後にポリペプチドを樹脂から
分離する。アルカリ性又はグリシンＣ−末端を有するぺ
プチドについては、分離は適当な溶媒中の飽和アンモニ
ア溶液を用いるアンモニア分解によってなされ；プロリ
ンＣ−末端を有するペプチドについては、アルキルアミ
ン又はフルオロアルキルアミンを用いるアミノ分解によ
ってＣ−末端分離が行われる。分離は１０℃から５０℃
の温度（好ましくは約２５℃）で、約１２から２４時間
（好ましくは約１８時間）行われる。適当な溶媒として
は、メタノール、エタノール、イソプロパツール、ジメ
チルホルムアミド、テトラヒドロフラン、Ｎ、　Ｎ−ジ
メチルエタノールアミン、ヘキサン及びそれらの混合物
がある。好ましくはメタノール中の飽和アンモニウム溶
液が使用される。あるいは塩基によるトランスエステル
化（ｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の後に
アミノ分解を行って、樹脂からペプチドをはずすことも
できる。 ［００４４］次に以下の任意のもの又はすべてを使用し
て一連のクロマトグラフィーによりポリペプチドを精製
する：酢酸型の弱塩基性樹脂によるイオン交換；疎水性
吸着クロマトグラフィー又は誘導体化していないポリス
チレン−ジビニルベンゼン（例えばアンバーライト（Ａ
ｍｂｅ　ｒ　ｌ　ｉ　ｔ　ｅＴＭ）　ＸＡＤ）　　；シ
リカゲル吸着クロマトグラフィー；カルボキシメチルセ
ルロース上のイオン交換クロマトグラフィー；分配型ク
ロマトグラフィー（例えばセファデックス（Ｓｅｐｈｄ
ｅｘ”）Ｇ−２５）、又は向流分配；高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）、特にオクチル−又はオクタデ
シルシリル−シリカ結合相カラム充填剤上の逆相ＨＰＬ
Ｃ。 ［００４５］もし１．２．３、又は６位の１つ又はそれ
以上でラセミ体アミノ酸が使用され各異性体が必要な場
合は、ジアステレオマーのノナペプチド又はデカペプチ
ド最終生成物が分離され、適当な位置にＤ−アミノ酸を
含む目的のペプチドが（好ましくは上記のクロマトグラ
フィー法で）単離し精製される。 ［００４６］単離し精製されたポリペプチドは随時薬剤
として許容される塩に変換される。 ［００４７］以下の例ではＬＨ−ＲＨアゴニストとＬＨ
ＲＨアンタゴニストの両方について、本発明の一時的保
護法を非保護法と比較している。これらの例は具体例と
して記載するのみであり、決して本発明の請求の範囲を
限定するものではない。 ［００４８］非保護合成法を使用する例２と４で得られ
た生成物に比較して、本発明の一時的最小保護法を使用
する例１と３の生成物では、不純物が有意に少ない。 ［００４９］不純物が少ない以外に本発明の方法は収率
が高く、より有害でない試薬を使用し、時間が短く、Ｌ
Ｈ−ＲＨ類似体の単離と精製に使用するエネルギーが少
ないという利点もある。さらに別の利点は、廃液の毒性
はかなり少なくその量も少ないことである。 ［００５０］

【調製Ａ】

［００５１１ ［Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−０−樹脂の調製１４．９ｇのＮａ−
Ｂｏｃ−グリシンを、５０ｍ１のメタノールと５０ｍ１
の蒸留水の混合液に溶解した。重炭酸セシウム水溶液で
溶液のｐＨを７．５にした。次に真空下で溶媒を除去し
た。 ［００５２］高真空下で１８時間乾燥した後、残渣を１
５０ｍ１の無水ＤＭＦ中に溶解した。２５ｇの１％クロ
ロメチル化ポリスチレン／ジビニルベンゼン（メリフィ
ールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ））樹脂（２５ミリモル
の塩化物に対応する）を添加した。混合物を５０℃で２
４時間攪拌し、濾過した後、樹脂を順番にＤＭＦ、水そ
してエタノールで洗浄した。樹脂を真空下で３日間乾燥
して、２８．３４ｇのＢｏｃ−Ｇｌｙ−０−樹脂を得た
。 ［００５３］

【調製Ｂ】

［Ｂｏｃ−Ａｌａ−０−樹脂の調製］調製Ａの方法に従
いＮａ−Ｂｏｃ−Ｄ−アラニンを１％メリフィールド（
Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ））樹脂に加えてＮａ−Ｂｏｃ−
Ｄ−Ａｌａ−０−樹脂とした。 ［００５４］

【例１】

【−時的セリン保護を用いるナファレリンの合成】この
例では以下の側鎖保護プロトコールに従ってナファレリ
ンを調製した：アルギニンの塩保護（塩化物として）、
ヒスチジンのトシル保護、そしてセリンのｔ−ブチル保
護。 （００５５１ＮＯ！−Ｂｏｃアミノ酸はバッケム（Ｂ　
ａ　ｃｈｅｍ）　　（トランス（Ｔｏ　ｒ　ｒ　ａｎｃ
　ｅ）　、カリフォルニア州）　　（Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、
Ｈｉ　ｓ　　（Ｔｏｓ）　、Ａｒｇ、ＴｒｐそしてＧｌ
ｙ）、スターバイオケミカルズ（Ｓｔａｒ　　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ）　　（トランス（Ｔｒｒａｎｃｅ）
、カリフォルニア州）（Ｐｒｏと５ｅｔ（ｔＢｕ））、
シンセテク（Ｓｙｎｔｈｅ　　Ｔｅｃｈ）　　（アルバ
ニー（Ａｌｂａｎい、オレゴン州）　（Ｄ−Ｎａｌ（２
））から得た。 ［００５６］冷却した１−ＰｒＯＨ中にＨＣＩを泡立た
せて、ｉ　　ＰｒＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２　　（１／１）中
の４−４．５ＮのＨＣＩ溶液を調製した。溶液が飽和し
た後（滴定で測定する、約９Ｎ）、溶液を最高３日間室
温に維持し、使用前に等量のＣＨ２Ｃｌ２で希釈した。 ［００５７］調製Ａからの１．０ミリモルのＮａ−Ｂ。 ｃ−Ａｌａ−０−樹脂を、試薬の添加、不活性の窒素雰
囲気の加圧、圧力抜き及び維持のためのアクセサリ−ビ
ンやフラスコのついた５、ＯＬのＶｅｇａ２９６自動固
相ペプチド合成機の反応容器中に入れた。 ［００５８１３時間のＤＩＣ又はＨＢｔ−補助ＤＩＣ結
合によって、Ｎａ−Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−０−樹脂に以下の
アミノ酸を添加した： Ｎａ−Ｂｏｃ−Ｐｒｏ　　２．０当量 Ｎａ−Ｂｏｃ−Ａｒｇ−ＨＣＩ　　２．０当量Ｎａ−Ｂ
ｏｃ−Ｌｅｕ−Ｈ２Ｏ２，Ｏ当量Ｎａ−Ｂｏｃ−Ｄ−Ｎ
ａｌ　　（２）　　　１．５当量／ＨＢｔＮａ−Ｂｏｃ
−Ｔｙｒ　　１．５当量／ＨＢｔＮａ−Ｂｏｃ−３ｅｒ
　　（ｔＢｕ）　　　２．０当量／ＨＢｔＮａ−Ｂｏｃ
−Ｔｒｐ　　１．７５当量／ＨＢｔＮａ−Ｂｏｃ−Ｈｉ
ｓ　　（Ｔｏｓ）　　　１．７５当量／ＨＢｔ（パイロ
）Ｇｌｕ２．５当量／ＨＢｔ ［００５９］各付加の後にＮα保護基をはずすのに以下
のプロトコールを使用した。 ［００６０１プログラムＡ：樹脂をまずＣＨ２ＣＩ２　
１Ｎ１分、ＴＦＡ−ＣＨ２ＣＩ２　　（４０／６０）Ｉ
ＸＩ分、ＴＦＡ−ＣＨ２Ｃ１２（４０／６０）ＩＸ３０
分、ＣＨ２ＣＩ　２　５　Ｘ　１分、Ｅ　ｔ３Ｎ　　Ｃ
Ｒ２ＣＩ２　　（５／９５）３Ｎ１分、ＣＨ２ＣＩ　２
４　Ｘ　１分で洗浄した。 ［００６１］プログラムＢ：樹脂をまずＣＨ２ＣＩ２　
１Ｎ１分、ＣＨ２ＣＩ２　／　ｉ　−Ｐ　ｒＯＨ（１／
　１）中４４．５Ｎ　　ＨＣＩＩＸＩ分、ＣＨ２Ｃ１２
／　ｉ　−Ｐ　ｒ。 Ｈ（１／１）中４−４．５ＮＨＣ１ＩＸ３０分、ＣＨ２
Ｃｌ２　３Ｎ１分、ＤＭＦ　Ｉ　Ｘ　１分、Ｅｔ３Ｎ　
　ＣＨ２ＣＩ２　　（５／９５）３Ｎ１分、ＤＭＦ　Ｉ
　Ｘ　１分、ＣＨ２Ｃｌ２４Ｘ１分で洗浄した。 ［００６２］　Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｌｅｕ、Ｄ−
Ｎａｌ（２）及びＴｙｒ上のＮα保護基をはずすのにプ
ログラムＡを使用した。ｓｅｔ、’ｒｒｐ、そしてＨｉ
ｓ上のＮα保護基の分離とセリン側鎖保護基の分離に、
プログラムＢを使用した。 ［００６３］各説保護と洗浄段階の後に、プロトコール
ＡとＢに従って、次のアミノ酸を順次添加し、樹脂をＣ
Ｈ２ＣＩ２　３Ｎ１分、ＭｅＯＨ４Ｘ１分、ＤＭＦ　２
　Ｘ　１分、そしてＣＨ２ＣＩ２４Ｎ１分で洗浄した。 配列が完了した時、メタノール中のアンモニアの飽和溶
液で約２５℃で約１８時間処理して、ペプチドを樹脂か
らの分離した。 ［００６４］粗ペプチドを２Ｍの酢酸に溶解し、ＡＧ３
Ｘ４Ａ樹脂（バイオラッド（Ｂ　ｉ　ｏ−Ｒａｄ）　）
のカラムに通電させて酢酸塩に変換した。この酢酸塩を
最小量のメタノールに溶解し、ペプチドを再沈降させる
ためにアセトンを添加した。逆相ＨＰＬＣ（パルチジル
（Ｐａｒ　ｔ　ｉ　ｓ　ｉ　ｌ）　０ＤＳ−３，４０μ
、０．５％酢酸含有アセトニトリル）を使用して極性及
び非極性の不純物を除去した。少なくとも９７％の酢酸
ナファレリンを含む両分を合併し、水で希釈し、逆相Ｈ
ＰＬＣカラムに再充填し、１％酢酸水で洗浄した。残留
物を沈澱させ、濾過し、洗浄し、次いで減圧乾燥した。 ［００６５］ベックマン１１９ＣＬアミノ酸分析機を使
用してアミノ酸分析を行った。アミノ酸分析の試料は４
ＮのＣＨｓ　　ＳＯｓ　Ｈ（０，２％３−（２−アミノ
メチルインドール）ＨＣＩ）で１１０℃で２０時間加水
分解した。 ［００６６］スペクトラフイジツクス（Ｓｐｅｃｔｒａ
Ｐｈｙｓｉｃｓ）８８００クロマトグラフ装置で、アル
チク（Ａｌｌｔｅｃｈ）のカラムを使用してＨＰＬＣ分
析を行った（５μ、４．６Ｘ２５０ｍｍ、１０μｌ注入
、流速−１，５ｍｌ／分、２７．５％ＣＨｓ　ＣＮ、　
７２．５％０．　１６Ｍ　　ＫＨ２ＰＯ４ｐＨ＝５．　
１、温度４０℃）。 ［００６７１粗ペプチドのＨＰＬＣ分析では、ナファレ
リンに対応する保持時間１８分のところに主ピークが現
れ、保持時間（ｒｔ）１４分で不純物は１％以下であっ
た。 ［００６８］

【例２】

【セリン保護なしのナファレリンの合成】Ｎａ−Ｂｏｃ
Ｓｅｒ　（ｔＢｕ）の代わりにＮａ−Ｂｏｃ−８ｅｒを
使用した以外は例１の方法に従った。 ［００６９］　ＨＰＬＣ分析では、ナファレリンに対応
する保持時間１８分のところに主ピークが現れ、保持時
間（ｒｔ）１４分のところで不純物は８．１から１１．
５％であった。 ［００７０１またこの「非保護」合成の収率は、ＨＦ処
理で充分に保護した合成の収率とほぼ同じであり、後者
の場合、収率は例１の一時的保護合成で得られた収率よ
り有意に低かった。 ［００７１］

【例３】

【−時的セリン保護を用いてのＬＨ−ＲＨアンタゴニス
トの合成】この例では以下の側鎖保護プロトコールを使
用して、ＬＨ−ＲＨアンタゴニストＮ−Ａｃ−Ｄ−Ｎａ
１　　（２）−Ｄ−ｐｃｌ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｐａｌ　　（
３）−８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−ｈＡｒｇ（Ｅｔ）２−Ｌｅ
ｕ−ｈＡｒ　ｇ　（Ｅ　ｔ）　２　−Ｐ　ｒ　ＯＤ−Ａ
　１　ａＮＨ２を調製した：Ｌ−及びＤ　　ｈＡｒ　ｇ
　（Ｅ　ｔ）　２の塩保護（塩化物として）とセリンの
ｔ−ブチル保護。 ［００７２］　Ｎａ−Ｂｏｃアミノ酸はバッケム（Ｂ　
ａ　ｃｈｅｍ）　　（トランス（Ｔｒｒａｎｃｅ）、カ
リフォルニア州）（Ｄ−Ａｌａ、Ａｒｇ及びＬｅｕ）；
スターバイオケミカルズ（Ｓｔａｒ　　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ）（トランス（Ｔｒｒａｎｃｅ）、カリフォ
ルニア州）（Ｐｒｏ）；シンセテク（Ｓｙｎｔｈｅ　　
Ｔｅｃｈ）（アルバニー（Ａｌｂａｎｙ）、オレゴン州
＞　　（Ｄ−Ｎａｌ（２））、インセル（Ｉｎｃｅｌｌ
）　　（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）　　（Ｄ
−Ｐａｌ　　（３））及びニーシービー・バイオプロダ
クツ（ＵＣＢ　　Ｂｉｏｐｒ。 ＊ｄｕｃｔｓ）　　（ベルギー（ｐ−Ｃ１−Ｐｈ　ｅ）
から得た。 ［００７３］調製ＢのＮａ−Ｂｏｃ−Ａｌａ−０−樹脂
に以下の配列でアミノ酸を添加した： Ｎａ−Ｂｏｃ−Ｐｒｏ　　２．３当量 Ｎａ−Ｂｏｃ−ｈＡｒｇ　（Ｅｔ）２−ＨＣｌ　　１当
量／ＨＢｔＮａ−Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｈ２Ｏ２，３当量Ｎ
ａ−Ｂｏｃ−Ｄ−ｈＡｒｇ　（Ｅｔ）２　・ＨＣｌ　　
１．６当量／ＨＢｔＮａ−Ｂｏｃ−Ｔｙｒ　　２．１当
量／ＨＢｔＮａ−Ｂｏｃ−３ｅｒ　　（ｔＢｕ）　　　
２．０当量Ｎａ−Ｂｏｃ−Ｄ−Ｐａｌ　　（３）　　　
１．８当景／ＨＢｔＮａ−Ｂｏｃ−ｐ−ＣＩ−Ｐｈｅ　
　２．Ｏ当量Ｎａ−Ｂｏｃ−Ｄ−Ｎａｌ　　（２）　　
　２．１当量／ＨＢｔ無水酢酸 ［００７４］アセチル化（キャッピング）はＡｌａ、Ｐ
ｒｏそしてＬｅｕの後に行った。過剰のＨＢｔ（２当量
）は塩基性アミノ酸、ｈＡｒｇ（Ｅｔ）２　　とＰａ１
（３）の結合に使用した。 ［００７５］３時間のＤＩＣ又はＨＢｔ−補助ＤＩＣ結
合によって、アミノ酸を結合し、樹脂をＣＨ２Ｃ１２３
×１分、ＭｅＯＨ４Ｘ１分、ＤＭＦ　２　Ｘ　１つの分
、そしてＣＨ２Ｃ１２４Ｘ　１分で順番に洗浄した。 ［００７６］各付加の後にＮａ　保護基をはずすのに以
下のプロトコールを使用した。 ［００７７］プログラムＡ：樹脂をまずＣＨ２ＣＩ２　
１×１分、ＴＦＡ−ＣＨ２ＣＩ２　　（４０／　６０）
　Ｉ　Ｘ　１分、ＴＦＡ−ＣＨ２Ｃ１２（４０／６０）
ＩＸ３０分、ＣＨ２ＣＩ２５％１分、Ｅｔ３Ｎ　　ＣＨ
２ＣＩ２　　（５／９５）３％１分、ＣＨ２ＣＩ　２４
　Ｘ　１分で洗浄した。 ［００７８］プログラムＢ：樹脂をまずＣＨ２ＣＩ２　
１×１分、ＣＨ２Ｃ１２／　ｉ　−Ｐ　ｒ　ＯＨ（１／
　１）中４４．５Ｎ　　ＨＣｌｌＸＩ分、ＣＨ２Ｃ１２
／ｉ　　Ｐｒ。 Ｈ（１／１）中４−４．５ＮＨＣ１ＩＸ３０分、ＣＨ２
Ｃｌ２　３％１分、ＤＭＦ　Ｉ　Ｘ　１分、Ｅｔ３Ｎ　
　ＣＲ２ＣＩ２　　（５／９５）３％１分、ＤＭＦ　Ｉ
　Ｘ　１分、ＣＨ２Ｃｌ２４Ｘ１分で洗浄した。 （００７９］　　Ａｌ　ａ、Ｐｒｏ、Ｌ−ｈＡｒｇ　　
（Ｅｔ）２、Ｌｅｕ及びＤ−Ｎａｌ　　（２）上の保護
基をはずすのにプログラムＡを使用した。Ｄ−ｈＡｒｇ
　（Ｅｔ）２　、Ｔｙ　ｒ、　Ｓｅ　ｒ、　Ｄ−Ｐａ　
１　　（３）及びｐ−ＣＩＰｈｅ上の保護基の分離に、
プログラムＢを使用した。 ［００８０１各脱保護と洗浄段階の後に、プロトコール
ＡとＢに従って、配列の次のアミノ酸を添加し、樹脂を
ＣＨ２ＣＩ　２３　Ｘ　１分、ＭｅＯＨ４Ｘ１分、ＤＭ
Ｆ　２　Ｘ１分、そしてＣＨ２ＣＩ　２４　Ｘ　１分で
洗浄した。配列が完了した時、メタノール中のアンモニ
アの飽和溶液で約２５℃で約１８時間処理して、ペプチ
ドを樹脂から分離した。 ［００８１１粗ペプチドをまず２Ｍの酢酸に溶解し、Ａ
Ｃ３−Ｘ４Ａ樹脂（バイオラッド（Ｂ　ｉ　ｏ−Ｒａｄ
）　）のカラムに通過させて酢酸塩に変換した。この酢
酸塩をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃ
１２／１−ＰｒＯＨ／ＭｅＯＨ／Ｈ２０／ＨＯＡｃ溶媒
）にかけ；酢酸塩画分を水に溶解し、逆相ＨＰＬＣカラ
ム（Ｖｙｄｅｃ　　Ｃ−１８，１５−２ａいにかけ、そ
してアセトニトリル／ＴＥＡＰ　（ｐＨ３）を用いて精
製した。 所望の純度の両分を合併し、水で希釈し、そして逆相Ｈ
ＰＬＣカラムに再充填し、次いで１％酢酸水で洗浄した
。このペプチドをＭｅＯＨ／ＣＨ３ＣＮ／ＨＯＡｃ／Ｈ
２０（４４／　５０／　１／　５）の混合液でストリッ
ピングした。残渣をメタノール又は酢酸に溶解し、エー
テル上で沈澱させ、濾過し、エーテルで洗浄し真空下で
乾燥した。 ［００８２］ベックマン１１９ＣＬアミノ酸分析機を使
用してアミノ酸分析を行った。アミノ酸分析の試料は６
ＮＨＣ１を用いて１１０℃で２０時間加水分解した。 ［００８３］スペクトラフイジツクス（Ｓｐｅｃｔｒａ
Ｐｈｙｓｉｃｓ）８８００クロマトグラフ装置で、スフ
ェリソルブ（Ｓｐｈｅｒ　ｉ　５ｏｒｂ）Ｃ−８（アル
チク（Ａｌｌｔｅｃｈ））を用いて行った（５μ、４．
６％２５０ｍｍ、１０μｌ注入、流速＝１．５ｍｌ／分
、３０％ＣＨ３ＣＮ１７０％ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４０，０４
Ｍ、ジメチルオクチルアミン４．　３Ｘ１０−３、温度
＝４０℃）。

【００８４】保持時間１８分のところに主ピークが現れ
ることにより、アンタゴニストの合成を確認した。１％
以上の他のピークは保持時間（ｒｔ）１６分で認められ
なかった。 ［００８５］

【例４】 ［−時的セリン保護を使用しないＬＨ−ＲＨアンタゴニ
ストの合成］　Ｎａ−Ｂｏｃ−８ｅｒ　（ｔＢｕ）の代
わりにＮａ−Ｂｏｃ−８ｅｒを使用して例３を繰り返し
た。 ［００８６］　ＨＰＬＣ分析では、アンタゴニストに対
応する保持時間１８分のところに主ピークが現れ、保持
時間（ｒｔ）１６分のところで不純物は６．５％であっ
た。 ［００８７］以下の請求の範囲により出願人が発明と考
える主題を具体的かつ明白に記載する。これらの請求の
範囲は、当業者が固相ペプチド合成の全範囲と考えるも
のに及ぶものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】　少なくとも１つのセリン残基を含むＬＨ
   −ＲＨ類似体の固相合成法において、α−アミノ保護基
   をはずすのに有用な試薬に対して不安定な保護基でセリ
   ン残基の側鎖のみを一時的に保護することよりなる改良
   方法。 【請求項２】　セリン側鎖は、ｔ−ブチル、トリチル、
   ピバリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、トリメチルシリ
   ル、及びテトラヒドロピラン−２−イルより選択される
   ：基で保護される、請求項１に記載の方法。 【請求項３】　セリン側鎖保護基はＣ３−Ｃ６アルコー
   ル／ジクロロメタン溶液中で塩化水素で処理することに
   よりはずされる、請求項２に記載の方法。 【請求項４］　　Ｃ３−Ｃ６アルコールはイソプロパツ
   ールである、請求項３に記載の方法。 【請求項５】　式 【１】 ％式％（） （式中、Ｒ１は（パイロ）Ｇｌｕ及びＮ−Ａｃ−Ｄ−Ｎ
   ａｌ（２）から選択され；Ｒ２はＨｉ　ｓ、　Ｄ−ｐ−
   ＣＩＰｈｅ及びＤ−ｐ−Ｆ−Ｐｈｅから選択され；Ｒ３
   はＴｒｐ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｎａｌ　　（２）及びＤ−
   Ｐａｌ（３）から選択され；Ｒ４はＤ−Ｎａ　１　　（
   ２）　、Ｄ−ｈＡｒｇ（Ｅｔ）２、Ｄ−ｈＡｒｇ　（Ｂ
   ｕ）　、Ｄ−ｈＡｒｇ　（ＣＨ２ＣＦ３）　２、Ｄ−Ｈ
   ｉ　ｓ　（Ｂｚ　ｌ）　、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｐａｌ　　
   （３）　、Ｄ−３ｅｒ　（ｔＢｕ）及びＤＴｒｐから選
   択され；Ｒ５はＡｒｇ、Ｌ−ｈＡｒｇ　（Ｅｔ）２、Ｌ
   −ｈＡｒｇ　（Ｂｕ）　、Ｌ−ｈＡｒｇ　（ＣＨ２ＣＦ
   ３）２及びＬｙｓ　（ｉＰｒ）より選択され；そしてＲ
   ６はＧｌｙ　　ＮＲ２、ＮＨＮＨＣＯＮＨ２、Ｄ−Ａｌ
   ａＮＨ２及びＮＨＥｔより選択され；アミノ酸はＮ保護
   で与えられる）のアミノ酸配列を有する化合物の固相合
   成法において、　（ａ）４位のセリンの側鎖のみを一時
   的に保護し、　（ｂ）ヒスチジンが存在する場合は、そ
   の側鎖をα−アミノ基脱保護剤、又はアミツリシス又は
   アンモノリシスに対して不安定な基で保護することより
   なる改良方法。 【請求項６】　セリンの側鎖をα−アミノ保護基を除去
   するのに有用な試薬に不安定な基で保護する請求項５に
   記載の方法。 【請求項７】　セリン側鎖保護基は、ｔ−ブチル、トリ
   チル、ピバリル、テトラヒドロピラン−２−イル、トリ
   メチルシリル及びｔ−ブチルジメチルシリル、好ましく
   はｔ−ブチルから選択される、請求項６に記載の方法。 【請求項８】　　α−アミノ保護基は、ｔ−ブチルオキ
   シカルボニル、ｔ−アミルオキシカルボニル、イソボル
   ニルオキシカルボニル、α、α−ジメチルー３，５−ジ
   メトキシベンジルオキシ力ルポニル、０−ニトロフェニ
   ルスルフェニル、２−シアノ−ｔ−ブチルオキシカルボ
   ニル及び９−フルオレニルメチルオキシカルボニルから
   選択される、請求項５に記載の方法。 【請求項９】　　α−アミノ保護基はｔ−ブチルオキシ
   カルボニルであり、セリン側鎖保護基はｔ−ブチルであ
   り、ヒスチジン側鎖保護基はｐ−トルエンスルホニルで
   ある、請求項５に記載の方法。 【請求項１０】　　脱保護剤はＨＣｌ　／　ＣＨ２ＣＩ
   　２、ＴＦＡ／　ＣＲ２ＣＩ　２及びＨＣ１／　（Ｃ３
   −Ｃ６）アルコール／ＣＨ２Ｃｌ２から選択される、請
   求項１又は５に記載の方法。 【請求項１１】　　脱保護剤はＨＣ１／１ＰｒＯＨ／Ｃ
   Ｈ２Ｃｌ２である、請求項１０に記載の方法。 ［請求項１２］　　Ｒ１はＡｃ　−Ｄ−Ｎａｌ　　（２
   ）であり；Ｒ２はＤ−ｐ−ＣＩ−Ｐｈｅであり；Ｒ３は
   Ｄ−Ｐａ１（３）であり；Ｒ４はＤ−ｈＡｒｇ　（Ｅｔ
   ）２であり；Ｒ５はＬ−ｈＡ　ｒ　ｇ　（Ｅ　ｔ）　２
   であり；そしてＲ６はＤ−Ａｌａ　　ＮＲ２である、請
   求項５に記載の方法。 【請求項１３］　　Ｒ１は（パイロ）Ｇｌｕであり、Ｒ
   ２はＨｉｓであり、Ｒ３はＴｒｐであり、Ｒ４はＤ−Ｎ
   ａｌ（２）であり、Ｒ５はＡｒｇであり、そしてＲ６は
   ＧｌｙＮＨ２である、請求項５に記載の方法。 【請求項１４】　式 【２】 ％式％（） （式中、Ｒ１は（パイロ）Ｇｌｕ及びＮ−Ａｃ−Ｄ−Ｎ
   ａｌ（２）から選択され；Ｒ２はＨｉ　ｓ、　Ｄ−ｐ−
   ＣＩＰｈｅ及びＤ−ｐ−Ｆ−Ｐｈｅから選択され；Ｒ３
   はＴｒｐ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｎａｌ　　（２）　、及び
   Ｄ−Ｐａｌ（３）から選択され；Ｒ４はＤ−Ｎａ　ｌ　
   　（２）　、ＤｈＡｒ　ｇ　（Ｅ　ｔ）　２、Ｄ−ｈＡ
   ｒｇ（Ｂｕ）　、Ｄ−ｈＡｒ　ｇ　（ＣＨ２ＣＦ３）　
   ２、Ｄ−Ｈｉ　ｓ　（Ｂｚ　ｌ）　、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−
   Ｐａｌ　　（３）　、Ｄ−８ｅｒ　（ｔＢｕ）及びＤＴ
   ｒｐから選択され；Ｒ５はＡｒｇ、Ｌ−ｈＡｒｇ（Ｅｔ
   ）２、Ｌ−ｈＡｒｇ（Ｂｕ）　、Ｌ−ｈＡｒｇ（ＣＨ２
   ＣＦ３）２及びＬｙｓ　　（ｉＰｒ）より選択され；そ
   してＲ６はＧｌｙ　　ＮＲ２、Ｎ　ＨＮ　ＨＣＯＮ　Ｒ
   ２、Ｄ−Ａ１　ａ　−Ｎ　Ｒ２及びＮＨＥｔより選択さ
   れる）のアミノ酸配列を有する化合物の同相合成法にお
   いて、　（ａ）適当なりｏｃ−保護しｔ−ブチル保護し
   たセリンを、不活性固相支持体に共有結合したＢｏｃ−
   Ｒ６−０−から始めて、式（Ｉ）の化合物のアミノ酸配
   列の右から左の順で連続的なサイクルで、固相合成法に
   より結合させる段階、　（ｂ）各サイクルの最後に、Ｈ
   Ｃ１／　ＣＨ２ＣＩ　２とＨＣＩ／低級アルカノール／
   ＣＨ２Ｃｌ２から選択される脱保護剤で処理して、セリ
   ン又はＤ−セリンからＢｏｃ保護基とｔ−ブチル基を同
   時に脱離させて、該固相支持体に結合したポリペプチド
   を形成させる段階、　（Ｃ）アンモノリシスにより支持
   体からポリペプチドを分離する段階、そして（ｄ）得ら
   れるポリペプチドを単離する段階よりなる、上記方法。