PT96807B

PT96807B - Processo melhorado para a sintese de analogos de lh-rh (hormona de libertacao da hormona de luteinizacao) com proteccao minima temporaria

Info

Publication number: PT96807B
Application number: PT96807A
Authority: PT
Inventors: John J Nestor Jr; Natalie L Mc Clure; Humberto Arzeno
Original assignee: Syntex Inc
Priority date: 1990-02-20
Filing date: 1991-02-19
Publication date: 1998-07-31
Also published as: NO309428B1; EP0443532B1; ATE107931T1; CA2036657A1; CA2036657C; AU7117691A; DE69102659D1; ZA911233B; FI910788A0; JP2927978B2; HU910543D0; FI102538B; EP0443532A3; FI102538B1; EP0443532A2; NO910664L; HU208158B; HK43097A; IE71945B1; PT96807A

Description

PROCESSO MELHORADO PARA A SÍNTESE DE ANALOBOB DE LH-RH (HORMONA DE LUTEINIZAÇÃO-HORMONA DE LIBERTAÇÃO) COM PROTECÇÃO MiNIMA TEMPORÁRIA

MEMÓRIA DESCRITIVA

RESUMO

O presente invento diz respeito a um processo para levar a cabo uma síntese em fase sólida da análogos ds LH-RH (hormona de libertação da. hormona de luteinização) em que os aminoácidos serina s histidina, se presentes, são protegidos nas cadeias laterais durante a síntese com grupos sensíveis a. agentes de desprotecção da «-amino selsccionedos, f

CAMPO DO INVENTO

Este invento está relacionado com a síntese em fase sólida de análogos de LH-RH por um processo de protecção mínima.

FUNDAMENTO DO INVENTO

Os análogos de LH-RH são nona ou decapeptídeos que estão estruturalmente relacionados coro LH-RH e que apresentam actividade biológica semelhante à de LH-RH, Os análogos são tema de intensa investigação clínica devido à sua capacidade demonstrada de aleviar os sintomas da endometriose, cancro da próstata, puberdade precoce eoutras perturbações hormonais» Se bem que existam normalmente certos análogos de LH-RH disponíveis para uso terapêutico,, a. sua síntese é um processo complicado e consequen— temente caro que necessariamente aumenta o custo para os que necessitam de tratamento» Ds análogos de LH—RH são convencionalmente descritos como agonistas ou antagonistas, dependendo do seu modo de actuacão»

Ds análogos de LH-RH com interesse neste inverh nona e decapeptídeos s incluem agonistas e antagonistas» São exemplos de agonistas LHRH úteis no presente invento nafarelina, leuprorelina, buserelina, goserelina, histerelina, triptore.1 ina e deslorelina; estes diferem todos do LH-RH natural pela substituição de um resíduo glicina na posição 6 por um D-aminoácido» Os agonistas sintéticos têm pois em comum com a hormona natural a histidina na posição 2, serina na posição 4 e tirosina na posição 5, todos eles tendo cadeias laterais rsactivas que podem apresentar dificuldades de síntese,

Os antagonistas de LH-RH diferem do LH-RH natural geralffiente pela deleção ou substituição do resíduo histidilo na posição 2. Da perspectiva de síntese, a deleção de histidina reduz as oportunidades de reaoçSes secundárias indesejáveis; no entanto, a presença de serina e de realizados passos especiais lateral.

tirosina axnda requere que sejam par ívitar reacçSes da cadeia

Os análogos de LH-RH podem ser sintetizados por métodos, tais como os ensinados por J.M, jsn rranci‘ vârxos Younq,

Solid Phase Peptide Synthesis, W = H» Freeman Co».

1969? J, Meinenhoíer, Hormonal Proteins and Peptides, Vol» 2, página 46, Academic Press (New York), 1973; e E« Schroder e K. Lubke, The Feotides, Vcd, i, Academic Press (New York), Í965» Os métodos podem ser de uma maneira geral earaeterizados como técnicas em solução ou em fase sólida» Ambos os métodos envolvem a. adição sequenciada de aminoácidos a uma cadeia peptídica nascente» Normalmente., o grupo amina ou o grupo carbonilo do primeiro aminoácido é protegido por um grupo protector adequado» 0 aminoácido protegido pode ser então ligado a um suporte sólido inerte ou utilizado em solução através adição do aminoácido protegido seguinte na sequência em condições adequadas à formação da ligação amida» 0 grupo protector é então removido deste resíduo de aminoácido adicionado e adiciona-se o aminoácido seguinte e assim sucessivamente., Após terem sido ligados todos os aminoácidos pretendidos na sequência correcta, quaisquer grupos protectores residuais s qualquer suporte sólido são removidos para dar o polipeptídeo final» Através de modificação simples deste processo geral, á possível adicionar mais de um aminoácido uma cadeia crescente, por exemplo, através do de cada νβΖ et acoplamento de um tripeptídeo protegido com um dipeptídeo protegido para formar um pentapeptídeo»

No entanto as condições mais rigorosas da síntese em fase sólida geralmente requerem que quaisquer cadeias laterais reactivas nos aminoácidos sejam protegidas durante a formação da ligação amida. Ds grupos protectores de cadeias laterais são geralmente removidos num passo separado após clivagem do poiipeptídeo completo do suporte inerte no qual ê feito ou em simultâneo com esta» Um método de síntese em fase sólida particularmente útil para preparar análogos de LH-RH ê divulgado em Nestor et

Patente U.S» 4,234,071, a divulgação da qual 1 esta aqui incluída corno reierãncis» Nesta aborde gem vulgarmente usada, a função a-aaiins ds cada aminoácído è protegida por um grupo sensível aos ácidos ou às bases, tal como t-fautoxicarbonilo ÍBoclj quaisquer cadeias laterais reactivas, tal como estão presentes em serina, histidina s tirosina, são também protegidas com grupos que se ligam fortemente, os quais requerem tratamento com fluoreto de hidrogénio ÍHF5 ou processos drásticos semelhantes para a sua remoção» Também, a remoção dos grupos protectores de q-amina e dos grupos protectores das cadeias laterais são geral.mente realizados em passos separados»

Esta abordagem é adequada para a preparação de quantidades dos peptídeos adequadas para investigação mas quando se considera uma produção eni larga escala, estes métodos não são satisfatórios. Os aminoácidos com cadeias laterais totalmente protegidas são caros- e os custos podem ser significativos numa produção em escala comercial dos peptídeos» Também a utilização de fluoreto de hidrogénio para além dos perigos ambientais sérios que coloca, contribui para perdas de rendimento comerciâlmsnte inaceitáveis» Ainda, devido a ser necessário um passo de produção separado para remover os grupos protectores de cadeias laterais, isto envolve tempo e custos adicionais no processo de síntese» τ

Os protocolos alternativos não são mais convidativos. Tien et al», F‘spt» Chem» .5/5—379, T. Shxba e S» bakakxbara (Ed»), Protein Research Foundation, Osafca (1989), descreveram a síntese de LH-RH usando protecção com tosxlo em histxdxna e protscçSo com benzilo em tirosina e serina» Esta abordagem, se bem que evite a utilização de fluoreto de hidrogénio, requere ainda um passo de desidrogenação separado para remover os grupos protectores benzilo com alguma redução de trxptofano.

D.H» Coy et al., Inf. 3= Pepfcide Protein Res», Í4, 339-343 (1979) descrevem s. síntese do antagonista. LH-RH, CD-Fen*-,

-y f

Eí-Trp’·*, D-Fen^w3-LH-RH usando uma variedade de protocolos de protecção de cadeias laterais, todas eles requerendo desprotecção com HFs proporcionando protecção da cadeias laterais com benzilo apenas de serina, protecção de cadeias laterais com tosxlo apenas para arginina, protecção de cadeias laterais de serina e de arginina e protecção de cadeias laterais de serina, arginina e tirosina (com 2-bromobenzíl-oxicarbonxlo). A protecção de arginina com sais (como Arg HC1) foi também usado apenas na síntss de serina apenas. 0 fluoreto de hidrogénio foi usado para clivar o peptídeo bruto do seu suporte e para remover os grupos protectores das cadeias laterais» Apenas quando os peptídeo está totalmente desprotegido Ce apenas protecção com sal da arginina) Coy evitou o tratamento com fluoreto de hidrogénio. Toda a síntese protegida deu rendimentosd mais baixos do que a síntese de cadeias laterais desprotegidas»

Coy et al», descreveram ainda a síntese do agonista LH-RH CD-Leu&_? desSli-WH^,^^v3-LH-RH etilamida com protecção das cadeias laterais com dinitrofenxlo da hxstxdina apenas, protecção com sal da arginina e nenhum tratamento com HF» □ grupo proteotor de cadeias laterais dinitrofenxlo foi removido durante a clivagem do peptídeo do seu suporte com uma solução de etilamina em τ

diroetilformamida» 0 rendimento protegida foi de apenas 34% ver te protegida e clivagem com HF» com uma

Lntese desprotegi/

da síntese apenas com histidina tis 24% para uma síntese totalmenNão foi feita qualquer comparação

Os resu1tados estratégias de probecçáo pode proporcionar algum publicados sugerem que, d,as vêrias mínima, a protecção apenas de histidina aumento no rendimento reiativamente ã síntese totalmente protegida para certos antagonistas de LH-RHí no entanto, nenhum beneficio particular está associado com qualquer uma das abordagens de protecção de cadeias laterais descritas para os acionistas de LH-RH.

Se bem que a abordagem ideal para a eliminação do passo de desprotecção com HF possa ser realizar uma síntese desprotegida, a ausência de protecção da histidina leva a uma racemização excessiva» Segundo Coy et al», no entanto, encontrámos que a utilização de protecção -apenas com histidina também resulta em níveis elevados de uma impureza bis-serina, devido á acilação do resíduo serina» é necessário um melhoramento significativo relativamente aos ensinamentos de trabalhos publicados para se obter uma síntese: com protecção mínima praticável dos análogos LHRH que não necessite de um passo de desprotecção com HF, mas que proporcione protecção dos grupos que, caso estejam desprotegidos, afectarão adversamente a pureza e rendimento do peptídeo»

SUMÁRIO DO INVEÍMTO

Constitui um objectivo deste invento proporcionar um processo para a síntese de análogos LH-RH em que as cadeias laterais de apenas um número mínimo essencial de resíduos de aminoácidos sejam protegidas.

Constitui ainda um

bonstxtui ainoa um outro ot proporcionar um processo para a síntese de análogos LH-RHque evite a necessidade de um passo de desprotecçSo com HF e assim também evite a utilização do reagente tóxico HF, diminuindo assim

ΧΓί VlsíJ * tO a corrente de convenctonais ,ixo tóxico muitas vezes encontrada em processos us aspectos· strâs referidos do presente invento oferecem vantagens adicionais de decréscimo dos custos de preparação dos compostos LHRH, assim como evitando um passo adicional do processo para remover os grupos protectores das cadeias laterais»

Ds objectivos deste invento são conseguidos para os análogos de LH-EH por um processo de protecçSo mínima temporária em que apenas a cadeia lateral hidroxilo do resíduo ds aminoácido serina é protegida com um grupo que é removido imediatamente após a acoplagem da serina â cadeia peptídica» 0 grupo protector da cadeia, lateral é um que seja, sensível nas mesmas condições úteis para a remoção do grupo protector ds a-amino,, Para os análogos de LH-EH que contenham um resíduo histldina, & cadeia lateral imidazole pode também ser protegida com um grupo sensível durante o ciclo de acoplagem, adequadamente, sensível a um agente tíesprotector do grupo u-amino, mas -faculta ti vamente ele pode também ser protegido com um grupo removível por aminólise ou amonólise»

A protecção temporária das cadeias laterais de serina e a protecçSo das cadeias laterais de histidina, se presentes, minimiza a formação de impurezas e maximiza os rendimentos sem requerer um passo de desprotecçSo separado com HF ou outro passo alternativo.

1/b.SCW i CSU Dfc. I ALHAuA DU I NVfc.M I U

Descrição do processo e análogos d© LHRH processo de protecção mínima temporária deste invento espera-se que seja aplicável à síntese em fase sólida de qualquer polipeptídeo contendo serina tendo entre alguns e várias dúzias de resíduos, independentemente da restante sequência. Ds análogos LH-RH e outros nona e decapeptídeos são alvos sintéticos preferidos. Se bem que o invento seja descrito com referência à adição sequenciada de aminoácidos individuais, matéria reconhecerão que o processo é síntese em que blocos de polipeptídeos mais pequenos são acoplados para formar um polipeptídeo maior, e«g«, pela adição de um tetrapeptídeo a um pentapeptídeo, desde gue a cadeia lateral de quaisquer resíduos serina seja temporariamente protegida durante o ciclo de acoplamento da serina.

os familiarizados com a iqualmente aplicável a e o grupo após ser critério

A protecção temporária significa que a cadeia lateral de serina é protegida durante um tempo relativamente curto do ciclo de síntese. 0 grupo protector de cadeias laterais protector de «-amino são removidos simultaneamente, efectuada a acoplagem de serina» De um modo geral, o crítica para a selecção fito grupo protector de cadeias laterais de serina é que o grupo seja estável às condições de acoplamento mas sensível ás condições de desprotecção de «-amino. Num aspecto deste invento, empregando a protecção de «--amino, a cadeia lateral de serina é preferencialmente protegida por um grupo seleccionado de t-hutilo, t-fautildímetiIsililo, trimetilsililo, tritilo, pivalilo s tetra-hidropiran-2-ilo.

Para os análogos de LH-KH que tenham resíduos de histidina é geralmente desejável proteger a cadeia, latsrsi

imidazole» Esta -protecção pode ser também de variedade temporária, i.e. sensível durante o ciclo de acoplamento ou pode permanecer no lugar até o peptídeo ser removida do seu suporte. De preferência, a aminólise ou amonólise é usada para clivar a resina do seu. suporte e simultaneamente remover o grupo protector de histidina» !Mum outro aspecto deste invento, tecção é seleccionado a partir de alcoóis o agente de desproe diclorometano. De preferSncia, a razão de álcool 10,0 ív/v) e a concentração de ácido é 2N a 9N. Mais cialmente, o álcool é i-propanol.

ptáí diclorometano é de € õ»1 para pref erenAbreviaturas e definições

Para fins deste invento, sx pressão LH-RH”

Bi à hormona de libertação da hormona luteiriizante e “análogos de LH-RH” pretende incluir a própria LH-RH assim como outros polipeptideos que estejam estruturalmente relacionados com LH-RH ou derivados dele e que apresentem actividade biológica semelhante à de LH-RH»

As abre¹/ recomendadas pela ture, Biochemistry iaturas dos vários aminoácidos comuns IUPAC-IUB Commission on Biochemical M li-s 1726 C1972). Todas as sequências

São □tnenc psptí

dicas referidas aqui estão escritas de acordo com a convenção geralmente aceite pela qual o amincàcido N-terminal está à esquerda ε o aminoàcido C-terminal está â direita»

As abreviaturas aqui eidos, do aminoàcido aquiral quaisquer aminoácidos que não apresentadas representam L-aminoáglicina e ainda com excepção de sejam naturais que sejam aquirais

ί 0 ou de outra forma designadas D-· ou D,L- = tt é e iPr é isopropilo,

DUCliO uutra;

abreviaturas úteis na descrição do invente envolvem substituições dos aminoácidos no peptídeo LH-RH natural pelo segu in te ϊ íduo de amineácidí

Horeviaiura

3~ í 2-nafti 1) —alaml o

3~ (p— f 1 uo r o f en i 1) — a 1 an i 1 o 3-C ρ-c1oro f en i1)-a1an i1o 3-í 3-p í r i d i 1) - a 1 a n i 1 o N^G,M^{S 5}

-bisCef.il )-homoarginilo iriflu homoarg in i1o G

N -butil-homoarginilo N 1 sopropi 1 -1 i si 1 p.

Cbenzi1/-histidilo

NalC25 p-F-Fen p-Cl-Fen

Pal<3) hftrgCEt)2 .-.L;

hftrgí CH2 hftrg C Bu} Lis CiPr) HisCBzl)

CF_>

Tal como aqui é usado, o termo sais farmaceuticaraente aceitáveis¹·' refere-se a sais que retêm a actividade biológica pretendida do composto parental sem efeitos secundários tóxicos„ São exemplos de tais sais os sais de adição de ácido;:! formados com ácidos inorgânicos, por exemplo ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico e similaresy e sais formados cdri ácidos orgânicos tais como, por oxálico, ácido tartárico,

1?!

á.c ido ácido ácido exemplo, ácido acético, ácido suecinico, ácido maleico, ácido fumãrico, ácido glucónico, cítrico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzóico, tãnico, ácido pamóico, ácido algínico, ácido poliglutãmico, ácidos naftalenossulfónicos, ácidos naftalenodissulfónico, ácido poiigalacturónico e similares»

A abreviatura N~Ac refere-se especificamente a um grupo protector de N-acetilo, i.e., um grupo acetílo ligado a um resíduo de aminoécido terminalno azoto da amina, de acordo com a nomenclatura geralmente aceite.

Realizações preferidas

Numa realização do invento ê proporcionado um processo melhorado de protecção mínima para a síntese em fase sólida de um composto tendo uma sequência de aminoácidos da fórmula

R¹-R²-R³-Ser-Ti r-R⁴-Leu-R⁵-Pro-R^é em que 1

R é seleccionado de (piro)Slu- e N-Ac-D-Nal (2)?

R* é seleccionado de His, B-p-Cl-Fen e D-p-F-Feng

R'~‘ é seleccionado de Trp, D-Trp, D-Nslí2> e D~PaI<3)?

_

R é seleccionado de D-NalcZ), D-hArgítt D-hArgíBu),

D-hArg C CH^CF-.), D~His (Bz 1), B~Leu

D-Palí39, D-SerítBu)

D—T rp:

é seleccionado de Arg, L-hftrgCEt)^, L-hArgíBu>,

L—hArqCCH„CF^.).-t e LisíiPr)? e ji. 'Jf Z.

é seleccionado de Sli-NH„, NH-WHCONH..,, B-Ala-NH^ e NHEt 5 em que os aminoácidos são fornecidos com protecção de tu em que o melhoramento se caracteriza por ía) protecção temporária da cadeia lateral de serina com um grupo sensível aos agentes úteis para a remoção de grupos protectores de q-amino sem indução de racemização, reacções secundárias ou clivagem do

peptídeo crescente do seu suporte de resina e Cb) protecção da cadeia lateral de histidina, se presente, com um grupo sensível a um agente de desprotecção do grupo «-amino ou -a aminólise ou siitono1xse»

Numa outra realização, proporcwnaao um processo protecção mínima temporária para a síntese em fase sólida de de um composto da Fórmula Cl), o qual compreende os se»guintes passos; ía) protecção dos grupos «-amino dos aminoácidos no polipeptídeo, Cb) protecção ds cadeia lateral de serina com um grupo sensível aos agentes úteis na. remoção do grupo protector de «-amino, Cc) protecção da cadeia lateral da histidina, se presente, com um grupo sensível a agentes de desprotecção básicos ou com um grupo removível por aminólise ou amonólise, Cd) ligação do a.minoâcido C-terminal a um suporte inerte, Ce) acoplagem sequenciada com um agente de ac.opla.gem adequado de um ou mais aminoácidos seleccionados uns aos outros em ciclos sucessivos, começando no extremo C e Cf) eliminação» no final de cada ciclodos grupos de protectores por tratamento com um agente de desprotecção, o referido agente desprotectoe sendo seleccionado de entre os -agentes capazes de remover o grupo protector de «-amina e o grupo protector das cadeias laterais- sem induzir r-acemização, reacçSes secundárias ou clivagem do peptídeo crescente da resina, Cf) repetição dos passos de ac.opla.gem e eliminação conforme necessário para formar um nona ou decapeptídeo, Cg) clivagem do polipeptídeo a partir do suporte por aminólise ou amonólise e Ch) isolamento e purificação do polipeptídeo resultante»

Numa outra realização ainda preferida, é fornecido um processo para a síntese em fase sólida de um composto da fórmula CI), processo esse que compreende os passos de;

Ca) acoplamento por meio de síntese em fase sólida da apropriada serina protegida por Boc e protegida por t-butilo em ciclos sucessivos e na ordem da direita para a esquerda da sequãncía de aminoácidos do composto de Fórmula (I), começando

A com Boc—R~-U- covalente liqado um suporte sólido inerte?

seleccionado a partir de modo a formar um

Cb) eliminação, no fim de cada ciclo, do grupo pro~ tector Boc e simultaneamente do grupo t-butilo da serina ou da D-serina por meio de tratamento com um agente de desprotecção de HCI/CFL-jCl.., e HCl/alcanol inferior/CH^Cl_opolipeptídeo ligado ao referido suporte sólido?

Cc) clivagem do polipeptídeo meio de amonólise; e partir do suporte por

Cd) isolamento do polipeptídeo resultante,

Numa realização preferida, é proporcionado um processo como descrito atrás para a produção de um polipeptídeo tendo a fórmula acima em qu.e,

R^x é (piro)Glu— e N-Ae—D-Nal (2); R* ê His ou D-p-Cl-Fen;

R'‘ é frp, e D~HslC3> ,

R⁴ é D~NaiC2), D-Leu, D-Tr

D-hArqCEt) -4

- Λ.R é Arq, ou hArqCEt),

B-Ber ( tiíu), D~His C δ'ζ I) ou ê Gli-NH-, D-Ala-NfL e NHEts ?

Mais preferencial.mente, o processo para a produção do antagonj i.e», nafareiina, em que, in ven to proporc ion-i

LH-RH

Fórmula um

CI),

R¹	.ώ	C p i ro) G1 u,
r-j
R-	é	His,

R'“	è	Trp,
A
R		D-Nal(2),
cr
H¹”	é	A rg e
.·
_Rw	é	8I.i~NH.~i, •AÍ
an tagon ista LH-!
r- 1 R	é	Ac-D-NalC2

	é	D—p~C1—1~ en
T
R'*	íè	D-Pa1C 3)?
R^	é	D-hArgC Et),
cr
R	é	L-hArgC tt).
R^ó	è	D—AIa—NH„»
Na	realização
?s	es	tá proteqid
\|ru	po	protector
:<ep	tí	dicas, se

função α-amino (W^a> do« o> sensível a ácidos ou ê i que seja facilmente removxvei sem destruição da cadeia psptidica crescente ou racsmizaçãode qualquer ust dos centros quirais nela contidos. Os grupos protectores adequados são t-butoxicarbonilo (Boc), bifeni1isopropiloxicarbonilo, t-am i 1 o x i ca r bon i 1 o, isobor n i 1 ο κ ic ar bon i 1 ο -, α, σ,-ti i metil-3,5-dime·toxibenz i 1 oxicarboni 1 o, o-nitrofeni 1 sul feni 1 o.

ianu~ t-bu ti1 o x i c a r bon i 1 o e 9- f 1 uo r en i 1 me t i 1 o x i c a r bon i 1 o CF moc 5 e similares» De preferência o grupo protector de α-amina e t-butoxicarbonilo (Boc). Suando se pretende preparar um peptídeo como seja buserelina ou gosereíina, em que Fr na Fórmula Cl) acima, é

D-SerCt-Bu), i-ffioc é preferido para a proteeção N” noí acoplagem incluindo e após a adição do B-Ser(tBu),

Fi»oc é Sefiiiívsl a ayentes bássiuOi» (pM>8,5), Luís Cuflio piperidina, os quais não removerão tBu da D—SerCtBu). Nos ciclos posteriores, que se seguem à adição da D-SerítBu), é requerida a utilização de proteeção do Ν’^Λ sensível a bases. A cadeia lateral da serina na posição 4 é protegida com um grupo que pode ser removido com, por exemplo, um tratamento suave com fluoreto. Um grupo protector preferido da cadeia lateral de serina é o t-butil dimetilsililo»

A cadeia lateral hidroxilo do resíduo serina ê protegida durante a acoplagem de serina ao peptídeo crescente, como descrito para a realização genérica deste invento» 0 grupo protector da cadeia lateral é removido após a acoplagem ser efectuada e antes da adição do aminoácido seguinte» 0 grupo protector da da cadeia lateral de serina é removido com o mesmo agente usado para remover o grupo protector de N st protectores de cadeias laterais preferidos para serina é t-buti1o, t-bu ti1dimeti1si1i1o, tetra—hidropiranilo.

.lilo, trítilo, pivalilo e .Ainda, a cadeia lateral imidazole da histidina, geralmente presente em agonistss d-e LH—RH é também protegida. 0 grupo protrector da cadeia latral cie histidina pode também ser sensível durante o ciclo de acoplagem, por exemplo-, sensível a um grupo da desprotecção do grupo N'², mas facultativamente a sua remoção pode ser completada quando o peptídeo é clivado do seu suporte» Osgrupos protectores de cadeias laterais preferidos para histidina são p-tolusno-sulfoni)

Para iniciar a síntese, o primeiro aminoácido, o qual será geraimente sminoácido C-terminai no produto final, é

~~ ί i>

ligado a ura suporte sólido adequado» Os suportes sólidos adequados úteis para a síntese acima são os materiais que seja.ni inertes para os reagentes e condições de reacção das reacçSes de condensação-desprotecção, assim como sendo insolúveis nos meios usados» Exemplos de resinas que podem ser adquiridas comercialmente incluem resinas de estireno/dívinilbenzeno modificadas com um grupo reactivo, e»g», copolímero de estireno/diviniIbenzeno clorometilado, copolímero de estireno/dívinilbenzeno hidroximetilado e similares» Prefere-se a resina de Merrifield (copolímero de estireno/dívinilbenzeno clorometilado com IX de ligações cruzadas)»

A ligação à resina., por exemplo, uma. resina, de estire— no/diviniIbenzeno clorometilada e feita por meio da reacção do aminoácido, ds termznsi. u, N protegido, especial mente o N — ejoc™ —aminoácido na forma de um sal de césio, tetrametilamónio, trietilaraónio, í,5~diâzshicicloC5»4»@3undec-5-eno ou sais semelhantes em etanol, acetonitrilo, Ν,Μ-dimeti1formamida CDMF) e similares, especialmente o sal de césio am DMF, com a resina clorometilada. a uma temperatura, elevada, por exemplo entre cerca de 4®*C e ó0°C, de preferência entre cerca de 12 s 72 horas, de preferência cerca de 48 horas»

A acoplagem de aminoácidos sucessivos protegidos é realizada, por métodos bem conhecidos nesta técnica, tipicamente num sintetizador de polipeptídeos automático» Cada um dos aminoácidos protegidos é introduzido num excesso molar de desde cerca de 1,5 vezes até cerca de 2,5 vazes e a acoplagem é realizada num solvente inerte polar nao aquoso tal como diclorometano, DMF ou suas misturas, de preferência em diclorometano á volta da temperatura ambiente» 0 agente de acoplagem é seleccionado entre N, N ’ -d i c i c 1 o- he x i 1 c a r bod i i m i d a C D CC), N, N⁵ -tí i - i so~ pro ρ i1c a r bod iimida (DIC) ou outra carbodiimida sózinha ou na oresenca de

1-hidroxibenzotriazole (HBt), G-acil-ureias, benz o tr i a z o1e-/\-i1-oxi-trisCpirrolidino íosíónio)hexafluorofosfato (PyBop), N-hidroxi-succinimida, outras N-hidroximidas ou oximas. Como alternativas podem ser usados os ésteres activos de aminoácidos protegidos íe.g», ρ-nitrofenilo, psntafluorofenilo e similares) ou anidridos simétricos, □ peptideo-resina foi testado relativamente è acoplagem completa usando o teste de Kaiser (An a 1. B i ac hem.. 34, 595 (197®)), excepto para a acoplagem Chloranil (Anal, Biochem.« da prolina em λ tf i t4> i (Anal» Chim. Acta, 118, 149 (198®)), que se usou .es se (1981)) ou o teste Isatin

Se oís) testeis) da acoplagem completa sugeriríem) que acoplagem ê repetida usando mais a reacçáo náo bslS compiet-a.

□Hl aminoácidos mas omitindo a desprotecção adicional Quando a última acoplagem está completa, a resina é lavada com metanol ou metanol contendo diclorometano e seco a um máximo de 6®°C.

SC1QOS,

No final de cada ciclo, i.e., aminoácido sucessivo Ν'³—protegido à cadeia polipeptídica crescente, o grupo protector é removido por tratamento com um agente desprotector» Suando se remove o grupo protector adiciona, serina, o agente desprotector N‘^ji-Boc e o grupo protector de serina. Entre os agentes desprotectores preferidos estão o cloreto de hidrogénio em diclorometano (HC1ZCH.-.C1.-.) „ ácido trif Iuoroacético “ Z.

em diclorometano (TFAZCH-jCl--,) e cloreto de hidrogénio dissolvido num álcool de preferência isopropanol, misturado com diclorometano. De uma forma geral, a concentração do HC1 será 2N a 9N, de preferência 4M a 5N, A proporção de CH^Cl^ para o álcool jE jí.

C_7i-C^ é o,l para 1® CvZv), de preferência cerca de 1:1« Um agente desprotector particularmente preferido é 4,5N HC1 em i-PrDHsCH.-sCl---

ía

Íiíl). 0 passo de desprotecção geralmente tem lugar a temperaturas entre 0*C e 45*C, de preferência a temperaturas ambiente Í2©*C a 27*0.

Os familiarizadas com a matéria apreciarão que a selecção de um protocolo de acopl-agem/desprotecção utilizando agentes diferentes dos descritos atrás é totalmente adequado desde que o resíduo serina seja desprotegido com um agente que permita atingir os objsctivos deste invento.Pode ser empregue um protocolo que utiliza HCl/iPr0H/CH^Cl_o para cada ciclo ds desprotecção» Como alternativa, um protocolo misto em que TFA/CH_OC1^ é usado para certos ciclos e HCl/iFTOH/CH.-.Cl.-, para outros é também útil» Outros ciclos serão facilmente aparentes para os familiarizados com a matéria»

No final	da	síntese em	T cíSSf	sólida o polipeptídeo	foi
separada da resina»	A	clivagem é	por	-άίΒυΠο X 1SE Coíjí LlíâH cz-O 1 *-··?· -áO
saturada de amónia	num	solvente	adequado para peptídeos com	uma
alanina ou glicina	no	«♦λ t.PfcfíDtõ L- jí	para	os peptídeos que têm	uma
prolina no extremo	C e	c 1 i vaqem	é por	meio de aminó-lise com	uma

alquilamina ou fluoroalquilamina» A clivagem é realizada a uma temperatura entre cerca de 10°C e 50*C, de preferência cerca de 25'“’C, entre cerca de Í2 e 24 horas, de preferência cerca de 18 horas» Os solventes adequados incluem metanol, etanol, isopropa— nol, dimetilformamida, hexanos e suas misturas» De preferência, usa-se uma solução s va, o peptídeo pode iturada tíe amónia em metanol» Como alternati— =-er removido da resina por transesterificação com uma base, seguido de aminólise» polipeptídeo foi então purificado por uma de passos cromatograficos empregando qualquer um ou tipos que se seguems permuta iónica numa resina básica sequência todos os fraca na forma de acetato?

cromatoqrafia de adsorção hidrofóbíca ou

polistireno-divinilbenzeno não derivatizado íe.g., Amberlite XAD) 5 cromatografia de adsorção em gel de silica? cromatografia de permuta iónica em carboximetilcelulcsa? cromatografia d p

partição (e.g., em Sephadex'^ 8-25 > ou distribuição te? cromatografia líquida de alta resolução (HRLC),

HPLC em fase reversa em coluna com fase ligada de octil oc tadec i1si1i1o.

£3 con t.rdcorrsn~· , especialmente ou posiçoes 1 individuais :-e um amxnoâcitío racemico for usaoo numa ou mais oas t 2, 3 ou 6 e se se pretender produtos iso.méricos s, os produtos finais nonapeptídeo ou decapeptídeo diastereoméricos são separados ε o peptídeo pretendido contendo um D-aminoácido na posição adequada έ isolado e purificado, da preferência durante o processo cromatoqráíico atras descrito.

Facultativamente, o polipeptídeo isolado e purificado ã convertido num salç íarmaceuticamente «aceitável.

Os Exemplos que se seguem comparam o processo de protecção temporária deste invento com um processo desprotegido para um agonista da LH-RH e um antagonista de LH-RH. Estes exemplos são apresentados para fins ds especificidade apenas e não devem ser pensados como colocando limitações ao âmbito do invento reivindicado.

Para além de alguma impurezas, o processo deste invento oferece as vantagens adicionais de proporcionar rendimentos superiores e o emprego de reagentes menos perigosos, durante um período de tempo mais curto e com gastos de energia mais baixos no isolamento e purificação de análogos LH-RH. Uma outra vantagem é a geração de quantidades roais pequenas de uma corrente de lixo consideravelmente-; menos tóxico.

PREPAkAçãO A

Preparação de Boc-Ala-O-Resina solvente

4,9 g de hT-Boc~gl icina foi dissolvido numa mistura 50 ml de metanol e 5® ml de áqua destilada» 0 pH da solução levado a 7,5 com bicarbonato ds césio aquoso.

então removido sob vácuo»

QÇt· foi foi

HpoS Ití dissolvido em Í5® horas de secagem sob vácuo.

o resíduo foi 25 q de 1’i de ml de DMF seco» Adicionou—se resina polistireno/divinilbenzeno clorometilada (Merrifield) (correspondendo a 25 (amoles de cloreto), A mistura foi agitada a 5®°C durante 24 horas, filtrada e a resina foi então lavada sequenciadamente com DMF, água e etanol» A resina foi vácuo durante 3 dias para dar 28,34a de Boc~BIi~-0~-Resin-í cS

PREPARAÇÃO B

Preparação de doe Alai 0 Resina

Seguindo os processos da Preparação foi adicionado a 1% de resina Merrifield N^-Boc-D-A1a—O-Resina» δ, N^vl—Soc-D-a. 1 an ina para proporcionar

EXEMPLO

3ÍNTESE DE NAFARELINA COM PROTECcSD TEMPORÁRIA DE SERINA

Neste exemplo, preparou-se nafarelina usando o protocolo de protecção de cadeias laterais que se segues protecção de arginina com sal ina forma de cloreto), protecção de histidina com tosilo e protecção de serina com t-butilo»

Os hT-Boc-aminoácidos foram adquiridos à Sachem (Torram ce, CA3 (Leu, Tir, HisíTos), Arg, Trp e Sli), Star Biochemicals (Tor rance, CA) (Pro e Ser(tBu)3, Synthe Tech (Alfaany, OR) <D-Nal(233«

As soluções de 4-4,5 N HC1 em i-ProOH/CH„Cl_í1/13 foram

prepa radas fa zen α o	borbulhar	HC1 em i—PrOH	ar
saturada a solução	(determinado por titulação c
madamente 95M 3, a	solução	foi mantida à	temi
durante não mais de	í 3 dias	e diluída com i	gua 1
antes de usar»
1,0 mffiol	de N^-Boc	—G1i-O-resma	i Ο X ’
de reacção de 5,0	1 de um	sintetízador	de p:
sólida automático	Vega 296	equipado com	gsrr

vo 1 ume de GH.-..Lr 1.

:o locado num ss acessórias ε frascos para adição de reagentes e para pressurização, despressurização e manutenção de uma atmosfera inerte de azoto»

Os aminoácidos que se seguem foram adicionados â N^ÍJÍ“Boc-Sli-O-resina por acoplagem DIC ou DIC assistida com HBt d u ran te três horass

iM^a-Boe-Pro 2,0	equiv.
N^a-	Boc-Arg»HC1	2,0 equiv
N«~	•Boc-Leu»H._,0	2,0 equiv
N*~	-Boc-D-Na1(23	1,5 equi

iM^a-Boc~Tir 1,5 equiv» /HBt N^—Boc--Ser(tBu3 2,0 equiv./HBt N^-Boc.Trρ 1,75 equiv»/HBt H^-Boc-His í Tos ) 1,75 equiv» /HBt

CpirolGlu 2,5 equiv./HBt

Os protosalos que se seguem foram usados para remover o grupo protector de N^u após cada adição.

Programa As A resina foi primeiro lavada com CK₇C1.₇ íxí min,, TFA-CH.₇C1^ (4©/ó©) Ixlmín,, TFA-CH.-.C 1í4©/6©) 1x3© min,, CbL.CL-, Sximin,, Et-^W-CH^C 1.-,(5/95) 3xímin,, CH_OC1₇ 4xlmin.

X- ♦.»* a^. ai. ai» ai»

Programa Bs A resina foi primeiro lavada, com CH₇Cl₇/i-aí. aí.

-PrQHCl/l) Ixlmin., 4-4,5N HC1 em CH_oCl_oZi~Pr0H (1/15 Ixlmin,,

Programa A foi usado para remover os grupos protsctores de N’⁴ em Sli, Pro, Arg, Leu, D-Nal(2) e Tir. 0 Programa B foi usado para remover os grupos protestares de IM em óer, trp e His e para a remoção do grupo protector das cadeias laterais de serína.

Para cada passo de desprotecção e lavagem, seguindo o protocolo A ou B, o aminoácido seguinte na sequência foi adicionado e a resina lavada com CH._C1^ 3xímin«, MeOH 4Klmin., DMF Sximin e C’ri₇Cl₇ 4xlmin, Quando a sequência estava completa, o peptídeo foi clivado da resina por tratamento com uma solução saturada de amónia em metanol durante cerca de 18 horas a cerca de 25 *C.

□	peptídeo	bruto foi di	ssolvido	em âcidi
convertido	para o sal	•9-CGhizltD p-ur	passagem	através
de resina	ΑΘ3-Χ4Α í	Βίο—Rad), 0	acetato	foi d
quantidade	mínima de	metanol e ad	icionada	exsrtonâ
tar o peptí	deo. Usou	-se HPLC em	fase re	vsrss CP

numa ini —

4©μ, acetonitrilo com ©,5% de ácido acético) para remover as impurezas polares e não polares. As frscçSes contendo pelo menos

977„ de acetato de nafarelina foram combinadas s diluídas com áqua e recarregadas sobre uma coluna de HPLC em fase lavadas com ácido acético a l“i. em água. 0 resíduo foi do, filtrado, lavado e em seguida seco sobre vácuo» reversa, e precipitaAs análises de aminoácidos foram realizadas num analisador de aminoácidos Beckman iiPCL. As amostras para as análises de aminoâcidí foram hidrolisadas com CH_CQ_H C©,2X 3-í2-aminometi1 indo1 e > HC1) duranfcí

A análise por HPLC do peptídeo bruto mostrou um pico principal com um tempo de retenção de 18 min» correspondendo è nafarelina e sem mais de 1% de impurezas, num tempo de retenção de 14 min.

EXEHPLO 2

SÍNTESE DE NAFARELINA SEM PROTECçSG DE SERINA processa do Exemplo i foi seguido excepto N^,Jl-Boc—Ser ser substituída por N^u-Boc-Ser<tBu)»

A análise por HPLC mostrou um pico principal aos 18 min. correspondendo· a nafarelina e 8,1 a 11,5% de uma impureza num tempo de retenção Crtl de 14 min»

Também, o rendimento desta síntese desprotegida foi aproximadamente c mesmo do obtido a partir de uma síntese

? no último exemplo, ao conseguido com a totalmente protegida com um tratamento por HF o rendimento -foi significativamente inferior síntese com protecçSo temporária do Exemplo 1

EXEMPLO 3

SÍNTESE DE UM ANTAGONISTA DE LH-RH USANDO PROTECÇSO TEMPORÁRIA DE SERINA

Neste Exemplo preparou-se um antagonista de LH-RH, N-ftc-D-Na 1(23 -D-pC 1 -Fen-D-PaIC 3 3 -Ser-Tir-D-hArg C E13 ._-LsuhArg(Et3^-Pro-D-AlaNH„, usando o seguinte protocolo de protecçSo de cadeias lateraiss protecçSo com sal para L- e D-hArg(Et)_o(como cloreto) e protecçSo com t-butílo para -serina»

Os aminoácidos N^-Boc foram adquiridos à Bachem (forran ce, CA) (D-Ala, Arg e Leu3, Star Biochemicals (Forrance, CA) (Pro); Synthe Tech (Albany, OR) (D-Nal(233, Incei1 (Milwaukee,

WI) (D-Palí3)3 e UCB Bioproducts (Bélqii í ρ—Cl—f-en 3

Os aminoácidos foram adicionados à N^y'-Boí na da Preparação B na seguinte sequências

Ala-O-Res:

N^a-tíoc-pro 2,3 equiv»

N^-Boc-hArg (Et»HC1 1 equiv./HBt N^-Boc-Leu.H^O 2,3 equiv»

N¹'—Boc—D-hArg (Et 3 ,._T>»HC1 1,6 equiv» /HBt N ^---Boc-Tir 2,1 equiv» /HBt !M^U--Boc“Ser (tBu 3 2, © equiv» í-ai(3> 1,8 equiv»/HBt

N^a-Boc~D--~·’

Im~ Boc D p Ll Fen 2,k? equiv» iM^—Boe—D—Na 1(2) 2 = 1 equiv„/HBt

Anidrido acético

-X

Fez-se unta acetilação após Ala, Pre e Leu» Usou-se excesso de HBt <2 equiv») para a acoplagem dos aminoácidos básicos, hArg (E15e Pa 1(3)»

Os aminoácidos foram ligados por acoplagem por DIC ou DIC assistida com HBt durante 3 horas e a resina foi subsequentemente lavada com CH^C1_O 3xímin», MeOH 4ximin», DMF 2xlmin. e CH_r,Cl._, 4xímin.

X— ui.

Os protocolos que se seguem foram usados para remover o grupo protector de após cada adição;

Programa As A resina foi primeiro lavada com CH.~_sCl..-_t Ixí min . , TFA—CH=,C1=, <4®/ó©> íxímin», Ti-A—CH =,01=-, <46/601 1x3®

CH^CL_? Sxlmin., Et^N-CH^Cl^(5/95) 3xímin», CH^Cl^ 4ximin„

Programa Bs A resina foi primeiro lavada com CH.-,C1^ íxímin», 4—4,5MHC1 em CH_OCL,/í-PrOHC 1/15 íxímin., 4-4,5N HC3. em j£. aC

CH,,Cl=,/i— PruH C1/1) Xx3®íBin«, L-H=-,C1,-, 3x1 mm., DMF 1x1 mm»,

Et^N-CH^Cl^CS/PS) 3x1min», DMF íxímin», CH^Cl^ 4xlmin.

programa A foi usado para a remoção dos grupos protectores em Ala, pro, L-hftrg(Et)^, Leu e D-NalC2)g o Programa B foi usado para a remoção dos grupos protectores em D-hArg(Et), Tir, Ser, D-PalC3) e p-Cl-Fen.

Após cada passo ds desprotecção e lavagem, após o protocolo ft ou B, o aminoacido seguinte na sequência foi adicionado e a resina lavada com CH^Cl^ 3xlmin., MeOH 4xlmin., DMF 2xlmin« e CH»,CL-, 4xímin» Quando completada a sequência, o peptídeo foi clivadu da rssins por xratsmenbo com uma soiução saturada de amónia em metanol durante cerca de ÍS horas a cerca tíe 2S*C»

peptídeo bruto foi primeiro dissolvido era ácido acético 2H e convertido no seu sal ds acetato por passagem através de unia coluna ds resina AG3-X4A CBio-Rad). □ acetato foi sujeito a cromatografia sobrs uma coluna de gel de silica vente CH-Cl _/i-PrQH/MeOH/H„D/HQAc) s as fr-= dissolvidas em água?

(Vydec C-Í8, 15-20μ) ípH 3). As fracções s purificadas utilizando com a pureza desejada 1 diluídas cdíí reversa, em

3l-

Sss	ds	acetato
	•r op çs	rsvsrse.

ac eton i tr i1 o / Tb. AP
iram ?	combii	natias e
sa de	HPLC	em fase

seguida lavadas com ácido acético 1% sra água.

peptídeo foi resolvido com uma mistura ds MeUH/CH-.CW/HuAc/H.-.O

Ο -ά (44/50/1/5). 0 resíduo foi dissolvido em metanol ou ácido acético e precipitado com éter e seco sob vácuo.

As análises de aminoácidos fo zador de aminoácidos Beckman 117CL. As de aminoácidos forma hidrolizadas com ram realizadas num analiamostras para as análises 6N HC1 a 110°C durante 20 hrs»

Realizou~se HPLC analítica Physics 8800, usando uma Spherisorb Cmm, ΙΟ μΐ inj. fluxo=l,5 ml/min», 30% d imeti loc ti lamina 4,3 x 10 , temp. 4í num cromatógrafo Spectra 8 CAlltech), 5μ, 4,6 x 250 CH_.CN, 7©% NHjjH^PO-T 0,@4M, ^{1 C}C» de um

A síntese do antagonista pico principal num rt de 18 de 1% foi detectado, num rt de 16 min foi confirmada pela presença min»| nenhum outro pico acima

ZXhMPLO 4

SÍNTESE 'C.

ANTAGONISTA TEMPORÁRIA DE )E LH-RH SEM PROTE· SERINA çTSD

Exemplo N^-Boc-Ser í tBu) ..

foi repetido usando hP-tíoc-Ser em vez de

A análise por HPLC mostrou a presença de um pico principal a Í8 min» correspondendo ao antagonista e a presença de uma impureza de 6_f5’í à rt de 16 min»

Hl· reiviní <&ρυΠ te&Ul p-Sí tl·XL_ϋ. 13te?

sente matéria que os requeEstas reivindicações desti— valentes reconhecíveis pelosde peptídeos em fase sólida» distintamente a reivindicação da pre rentes consideram como seu invento» nam-se a abranger toda a gama de equi familiarizados com a área da síntese

Claims

REIVIND1CACSE3 lã.

Processo melhorado para a síntese em fa?

sólida hormona de aracteri za— de um análogo de LH-RH (hormona de libertação da luteinizacão) contendo pelo menos um resíduo serina, do por o melhoramento compreender a protecção temporária apenas da cadeia lateral do resíduo serina com um grupo de protecção que seja sensível aos agentes úteis na remoção de grupos- protectores de a—amino.
2â terizado por

Processo de acordo com a Reivindicação uaraua cadeia lateral da serina ser grupo seleccionado de entre t-butilo, tritilo, pivalilo, t-butildimefcilsililo, trimefcilsililo e tetra-hidropiran-2-ilo.

protegida com um
3ã„ - Processo de acordo com s Reivindicação 2, caracterizado por o grupo de protecção da cadeia lateral da serina ser removido por tratamento com ácido clorídrico numa solução de um á1cool C3-C6/dic1orometano»
4â,

Processo de acordo com a Reivindicação 3, caracterizado por o álcool Co-Có ser isopropanol.
5â. - Processo melhorado para a síntese em fase sólida de um composto tendes uma sequência de aminoácidos da fórmula r 1 ...p2..._R3__Ser„_{Ti r}__ _r4__l .eu—R ^U-P r o-R < i >

em que Ri é se1eccionado db- (pir o)8 lu~ e M~Ac—D—Nal (2) 5 ·~1 R- é seleccionado de His, D- ρ-Cl—Fen e D-p-F —Fen £ R³ é seleccionado de Trp, D- Trp, D-Na1(2) e D-PalC

4.

R~ è seleuuiunado de ,-.
6

D-Na 1C 2), D—hArq i Et í D-hArg í CH.₇CF^.), B-His C Bz 1), D-Leu D-Palí3), D-SerítBu) e B-Trp;

Arg, L-hArg C Et >, L-hArg C Bu)

L-hArg í CH_OCF_T>e Lis í iPr) s e

NH~NHC0NH_o, B~Ala—NH_o e ,, έ se1ecc ionado de B1 i—NH.-,,

NHL t, em que os aminoácidos são proporcionados com protecção

Ν' caracterizado por o melhoramento compreender Ca) protecção temporária apenas da. cadeia lateral de serina posição 4 e (b) a proteccão da. cadeia, lateral de histidina presente, com um grupo sensivsi a

na grupo α-aiBino, ou á aminólise ou um agente de desprotecção do •ΞΙΓΰΟΠΟ 1 iss? _s

6ã» - Processo de acordo cuiii a Re i v i nd i c ação rac— por a cadeia lateral da seri na ser proteg ida czoni um sível aos agentes úteis para a remoção de :pQ'S de

protecção do ct-amino»
7â„ - Processo de acordo com a Reivindicação 6, caracterizado por o grupo de protecção da cadeia lateral da serina ser seleccionado entre t-butilo, tritilo, pivalilo, tetra-hidropiran-2-ilo, trimetilsililo e t-butíidimetilsililo, de preferência t-butílo»

Sã» - Processo d-e acordo com a Reivindicação 5, caracterizado por o grupo de protecção da «-amina ser -seleccionado de entre t-butiIcxicarboniIo, t~amiloxicarboniIo, isoborniloxicarbonilo, o-nitrofenilsulfenilo, 2-ciano-t-butiIoxicarbonilo e
9-f1uoreni1me tilo x ic arbon i1o»

9ã» - Processo de acordo com a Reivindicação 5, caracterizado por o grupo de protecção de s-asiina ser t— butiloxicar- bonilo_y o grupo de protecção da cadeia lateral de serina ser t-butilo e o grupo de profecçâo da cadeia lateral de histidina