JPH04211390A - β−（２−クロロ−４−ニトロフェニル）−マルトペンタオシドの製造法 - Google Patents
β−（２−クロロ−４−ニトロフェニル）−マルトペンタオシドの製造法Info
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- JPH04211390A JPH04211390A JP5084691A JP5084691A JPH04211390A JP H04211390 A JPH04211390 A JP H04211390A JP 5084691 A JP5084691 A JP 5084691A JP 5084691 A JP5084691 A JP 5084691A JP H04211390 A JPH04211390 A JP H04211390A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はα−アミラーゼ活性測定
用基質として使用されているβ−（２−クロロ−４−ニ
トロフェニル）−マルトペンタオシドの新規製造法に関
する。
用基質として使用されているβ−（２−クロロ−４−ニ
トロフェニル）−マルトペンタオシドの新規製造法に関
する。
【０００２】
【従来の技術】従来、α−アミラーゼ活性測定に用いら
れてきたのは主に天然のデンプンであり、アミラーゼ反
応の結果、増加する還元糖を測定するｓａｃｃｈａｒｏ
ｇｅｎｉｃ 法やヨードデンプン反応を利用し、基質の
分解により青色の色調を比色するｉｏｄｏｍｅｔｒｉｃ
法などがα−アミラーゼ活性測定法として広く行なわれ
てきた。しかし、これらの方法はデンプンが水に溶けに
くいこと、デンプンの種類によって測定値が変動するこ
と、種々の干渉物質の影響を受けることなど精度、正確
性に問題を有していた。その後、色素を結合したデンプ
ンを基質とし、加水分解により遊離する色素を測定する
方法が開発されたが、この方法においても反応時間が長
く、また遠心操作を含むことから自動分析装置に適用す
ることができず、昨今のニーズに応えることができなか
った。
れてきたのは主に天然のデンプンであり、アミラーゼ反
応の結果、増加する還元糖を測定するｓａｃｃｈａｒｏ
ｇｅｎｉｃ 法やヨードデンプン反応を利用し、基質の
分解により青色の色調を比色するｉｏｄｏｍｅｔｒｉｃ
法などがα−アミラーゼ活性測定法として広く行なわれ
てきた。しかし、これらの方法はデンプンが水に溶けに
くいこと、デンプンの種類によって測定値が変動するこ
と、種々の干渉物質の影響を受けることなど精度、正確
性に問題を有していた。その後、色素を結合したデンプ
ンを基質とし、加水分解により遊離する色素を測定する
方法が開発されたが、この方法においても反応時間が長
く、また遠心操作を含むことから自動分析装置に適用す
ることができず、昨今のニーズに応えることができなか
った。
【０００３】そこで、これらの欠点を解消するため、α
−アミラーゼ活性を化学量論的に測定でき、レイトアッ
セイ（Ｒａｔｅ Ａｓｓａｙ） が可能な方法が開発さ
れた。そのなかで、特開昭６０−２１９９号公報による
β−（２−クロロ−４−ニトロフェニル）−マルトペン
タオシドを基質として用いる方法が優れた方法の一つと
して用いられている。このβ−（２−クロロ−４−ニト
ロフェニル）−マルトペンタオシドを合成する方法とし
ては、全工程化学合成で行なう方法と一部サイクロデキ
スキリングルカノトランスフェラーゼの分子間転位作用
を利用する方法が考えられる。前者の方法で高純度のβ
−（２−クロロ−４−ニトロフェニル）−マルトペンタ
オシドを得ようとした場合、特開昭６０−７８９９４号
公報、特開昭６２−２８９５９５号公報によるように、
マルトペンタオースのアセチル化工程、２−クロロ−４
−ニトロフェノールとの結合工程、脱アセチル化工程、
カラムクロマトによる精製工程を経なければならず、作
業の割には収率もよいとは言えない。また特開平１−１
０１８９４号公報による方法は、後者の方法の一つであ
るが、この方法でβ−（２−クロロ−４−ニトロフェニ
ル）−マルトペンタオシドを合成する場合、同公報の実
施例２のようにマルトヘキサオースに２−クロロ−４−
ニトロフェニル−β−グルコシドの存在下、サイクロデ
キストリングルカノトランスフェラーゼを作用させるこ
とによって糖鎖再配列反応を行なわせるが、アクセプタ
ーの２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−グルコシド
の水に対する溶解度が２５℃で１％未満であるため、効
率が非常に悪く工業的でない。また、同公報の明細書に
記載はないが、仮にサイクロデキストリングルカノトラ
ンスフェラーゼによる糖鎖再配列反応を水と水可溶性有
機溶媒との混合溶媒中で行なうことによって容積効率を
ある程度は上げることができたとしても、現時点ではマ
ルトヘキサオースはマルトペンタオースと比較してかな
り高価であるため、この方法は経済的とは言えない。
−アミラーゼ活性を化学量論的に測定でき、レイトアッ
セイ（Ｒａｔｅ Ａｓｓａｙ） が可能な方法が開発さ
れた。そのなかで、特開昭６０−２１９９号公報による
β−（２−クロロ−４−ニトロフェニル）−マルトペン
タオシドを基質として用いる方法が優れた方法の一つと
して用いられている。このβ−（２−クロロ−４−ニト
ロフェニル）−マルトペンタオシドを合成する方法とし
ては、全工程化学合成で行なう方法と一部サイクロデキ
スキリングルカノトランスフェラーゼの分子間転位作用
を利用する方法が考えられる。前者の方法で高純度のβ
−（２−クロロ−４−ニトロフェニル）−マルトペンタ
オシドを得ようとした場合、特開昭６０−７８９９４号
公報、特開昭６２−２８９５９５号公報によるように、
マルトペンタオースのアセチル化工程、２−クロロ−４
−ニトロフェノールとの結合工程、脱アセチル化工程、
カラムクロマトによる精製工程を経なければならず、作
業の割には収率もよいとは言えない。また特開平１−１
０１８９４号公報による方法は、後者の方法の一つであ
るが、この方法でβ−（２−クロロ−４−ニトロフェニ
ル）−マルトペンタオシドを合成する場合、同公報の実
施例２のようにマルトヘキサオースに２−クロロ−４−
ニトロフェニル−β−グルコシドの存在下、サイクロデ
キストリングルカノトランスフェラーゼを作用させるこ
とによって糖鎖再配列反応を行なわせるが、アクセプタ
ーの２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−グルコシド
の水に対する溶解度が２５℃で１％未満であるため、効
率が非常に悪く工業的でない。また、同公報の明細書に
記載はないが、仮にサイクロデキストリングルカノトラ
ンスフェラーゼによる糖鎖再配列反応を水と水可溶性有
機溶媒との混合溶媒中で行なうことによって容積効率を
ある程度は上げることができたとしても、現時点ではマ
ルトヘキサオースはマルトペンタオースと比較してかな
り高価であるため、この方法は経済的とは言えない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、β−（２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル）−マルトペンタオシドの効
率的な製造方法の開発が望まれている。
ロロ−４−ニトロフェニル）−マルトペンタオシドの効
率的な製造方法の開発が望まれている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者は、α−アミラ
ーゼ活性測定用基質として有用なβ−（２−クロロ−４
−ニトロフェニル）−マルトペンタオシドを効率よく得
る経済性を備えた製造法を開発することを目的として、
サイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを用
いる生化学的合成法について鋭意検討を行なったところ
、アクセプターとして２−クロロ−４−ニトロフェニル
−β−マルトシドを用い、水と水可溶性有機溶媒との混
合溶媒中で、サイクロデキストリングルカノトランスフ
ェラーゼをマルトペンタオースに作用させ糖転位反応を
行なうと、効率よく目的物が得られることを見出し、本
発明を完成した。
ーゼ活性測定用基質として有用なβ−（２−クロロ−４
−ニトロフェニル）−マルトペンタオシドを効率よく得
る経済性を備えた製造法を開発することを目的として、
サイクロデキストリングルカノトランスフェラーゼを用
いる生化学的合成法について鋭意検討を行なったところ
、アクセプターとして２−クロロ−４−ニトロフェニル
−β−マルトシドを用い、水と水可溶性有機溶媒との混
合溶媒中で、サイクロデキストリングルカノトランスフ
ェラーゼをマルトペンタオースに作用させ糖転位反応を
行なうと、効率よく目的物が得られることを見出し、本
発明を完成した。
【０００６】すなわち、本発明は（１）式
【化４】
で表わされるマルトペンタオースと式
【化５】
で表わされる２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−マ
ルトシドとに、サイクロデキストリングルカノトランス
フェラーゼを作用させることを特徴とする式
ルトシドとに、サイクロデキストリングルカノトランス
フェラーゼを作用させることを特徴とする式
【化６】
で表わされるβ−（２−クロロ−４−ニトロフェニル）
−マルトペンタオシドの製造法、
−マルトペンタオシドの製造法、
【０００７】（２）サイクロデキストリングルカノトラ
ンスフェラーゼによる糖転位反応を水と水可溶性有機溶
媒との混合溶媒中で行なうことを特徴とする前記（１）
記載の製造法、および
ンスフェラーゼによる糖転位反応を水と水可溶性有機溶
媒との混合溶媒中で行なうことを特徴とする前記（１）
記載の製造法、および
【０００８】（３）水可溶性有機溶媒が低級アルコール
、極性非水溶媒、エチレングリコールエーテル類または
グリコール類であることを特徴とする前記（１）または
（２）記載の製造法に関する。
、極性非水溶媒、エチレングリコールエーテル類または
グリコール類であることを特徴とする前記（１）または
（２）記載の製造法に関する。
【０００９】本発明で使用されるサイクロデキストリン
グルカノトランスフェラーゼは起源、由来に特に限定は
なく、バチルス マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍ
ａｃｅｒａｎｓ） 、バチルス メガテリウム（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ） 、バチルス
ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅ
ａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｓ） 等を由来とする酵
素を用いることができる。
グルカノトランスフェラーゼは起源、由来に特に限定は
なく、バチルス マセランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍ
ａｃｅｒａｎｓ） 、バチルス メガテリウム（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ） 、バチルス
ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅ
ａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｓ） 等を由来とする酵
素を用いることができる。
【００１０】本発明で用いられる水と水可溶性有機溶媒
との混合溶媒とは、ｐＨ５〜８の緩衝液と水可溶性有機
溶媒との混合液のことであり、緩衝液の種類については
特に指定はなく、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、グッドの
緩衝液等が挙げられる。水可溶性有機溶媒とはメタノー
ル、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコー
ル等の低級アルコール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルホスホルアミド
等の極性非水溶媒、β−オキシエチルメチルエーテル、
β−オキシエチルエーテル等のエチレングリコール類、
エチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコ
ール類であり、中でも低級アルコールが望ましい。 混合液中でのこれら水可溶性有機溶媒の濃度は３０〜７
０％が望ましい。
との混合溶媒とは、ｐＨ５〜８の緩衝液と水可溶性有機
溶媒との混合液のことであり、緩衝液の種類については
特に指定はなく、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、グッドの
緩衝液等が挙げられる。水可溶性有機溶媒とはメタノー
ル、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコー
ル等の低級アルコール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルホスホルアミド
等の極性非水溶媒、β−オキシエチルメチルエーテル、
β−オキシエチルエーテル等のエチレングリコール類、
エチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコ
ール類であり、中でも低級アルコールが望ましい。 混合液中でのこれら水可溶性有機溶媒の濃度は３０〜７
０％が望ましい。
【００１１】本反応中でのマルトペンタオースと２−ク
ロロ−４−ニトロフェニル−β−マルトシドのモル比率
は前者１に対し後者１．１〜５が望ましく、サイクロデ
キストリングルカノトランスフェラーゼの使用量は、マ
ルトペンタオース１モルに対し１０００００ユニット〜
３００００ユニットが望ましい。また、反応は３０〜５
０℃の温度で行なわれる。
ロロ−４−ニトロフェニル−β−マルトシドのモル比率
は前者１に対し後者１．１〜５が望ましく、サイクロデ
キストリングルカノトランスフェラーゼの使用量は、マ
ルトペンタオース１モルに対し１０００００ユニット〜
３００００ユニットが望ましい。また、反応は３０〜５
０℃の温度で行なわれる。
【００１２】反応終了後は反応液を酢酸でｐＨ４．０以
下に調整して酵素を失活させ、逆層クロマトグラフィー
により精製を行なうことによって目的物を得ることがで
きる。
下に調整して酵素を失活させ、逆層クロマトグラフィー
により精製を行なうことによって目的物を得ることがで
きる。
【００１３】なお、本発明で用いられるマルトペンタオ
ースは安価な市販品を用いることができる。また、アク
セプターとしての２−クロロ−４−ニトロフェニル−β
−マルトシドはＢ．Ｈｅｌｆｅｒｉｃｈ によるβ−
Ｄ−グリコシド（β−Ｄ−ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ）の合
成報告〔Ｂｅｒ．７７ ，１９４（１９４４）； Ｚ．
Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２８３，１７９（１９
４８） 〕を参考に、それに改良を加えて安価に入手可
能なマルトースより合成することができる。マルトース
のアセチル化工程、２−クロロ−４−ニトロフェノール
との結合工程、それに引続く脱アセチル化工程は経なく
てはならないが、カラムクロマトに依らなくても２回の
再結晶操作で効率よく純品が得られる。この原料化合物
の製造方法は、後述の参考例により説明する。
ースは安価な市販品を用いることができる。また、アク
セプターとしての２−クロロ−４−ニトロフェニル−β
−マルトシドはＢ．Ｈｅｌｆｅｒｉｃｈ によるβ−
Ｄ−グリコシド（β−Ｄ−ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ）の合
成報告〔Ｂｅｒ．７７ ，１９４（１９４４）； Ｚ．
Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２８３，１７９（１９
４８） 〕を参考に、それに改良を加えて安価に入手可
能なマルトースより合成することができる。マルトース
のアセチル化工程、２−クロロ−４−ニトロフェノール
との結合工程、それに引続く脱アセチル化工程は経なく
てはならないが、カラムクロマトに依らなくても２回の
再結晶操作で効率よく純品が得られる。この原料化合物
の製造方法は、後述の参考例により説明する。
【００１４】
【作用】本発明方法においては、水と低級アルコール等
の水可溶性有機溶媒との混合液を用いることにより、ア
クセプターの２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−マ
ルトシドを１０％以上の濃度で完全に溶解させることが
できるため、効率のよい高濃度反応が可能となり、さら
に、原料化合物の加水分解反応が抑制され、サイクロデ
キストリングルカノトランスフェラーゼによる糖転位反
応が著しく促進される。これらの効果は５０％プロパノ
ール液で最も発揮された。また、原料化合物であるマル
トペンタオースは純度９９％の高純度品がマルトヘキサ
オース、マルトテトラオース等、他のマルトオリゴ糖と
比較してかなり安価に入手できるので、従来の方法より
も経済的である。
の水可溶性有機溶媒との混合液を用いることにより、ア
クセプターの２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−マ
ルトシドを１０％以上の濃度で完全に溶解させることが
できるため、効率のよい高濃度反応が可能となり、さら
に、原料化合物の加水分解反応が抑制され、サイクロデ
キストリングルカノトランスフェラーゼによる糖転位反
応が著しく促進される。これらの効果は５０％プロパノ
ール液で最も発揮された。また、原料化合物であるマル
トペンタオースは純度９９％の高純度品がマルトヘキサ
オース、マルトテトラオース等、他のマルトオリゴ糖と
比較してかなり安価に入手できるので、従来の方法より
も経済的である。
【００１５】
【実施例】以下、本発明を参考例、実施例によってさら
に詳しく説明するが、本発明はこれらによって何ら限定
されるものではない。
に詳しく説明するが、本発明はこれらによって何ら限定
されるものではない。
【００１６】参考例１：２−クロロ−４−ニトロフェニ
ル−β−マルトシドの合成マルトース５６ｇ、無水酢酸
５９０ｍｌおよび無水酢酸ナトリウム４５．８ｇの混合
物を１２５〜１３０℃で２時間攪拌する。次いで、トル
エン１リットル、１０％食塩水を加え、分液操作を行な
う。トルエン層を１０％食塩水６００ｍｌで５回、さら
に蒸留水６００ｍｌで１回洗浄する。トルエン層を濃縮
乾固するとオクタアセチルマルトース１０８．９ｇを得
た（ＨＰＬＣ分析によりα体：β体＝１２：８８）。 （このものはこのままで次工程に進むが、一部とり含水
エタノールから最結晶を行なうと、融点１５９〜１６０
℃のβ体の純品が得られる。）オクタアセチルマルトー
ス１０８．９ｇ、２−クロロ−４−ニトロフェノール１
００ｇを酢酸３００ｍｌに溶解後、塩化亜鉛液（塩化亜
鉛５．７５ｇ、酢酸４５ｍｌ、無水酢酸２．５ｍｌを混
合して密栓し、一夜静置後、塩化亜鉛より水分を除去し
、溶解させた液）１１ｍｌを添加し、減圧下７５℃で酢
酸を留去する。１２０℃に昇温し、１０〜７ｍｍＨｇの
減圧下で４時間反応を行なう。終了後、スラリーを酢酸
エチル９００ｍｌに溶解し、１０％食塩水５００ｍｌを
加え、分液を行なう。酢酸エチル層を２．５％水酸化ナ
トリウム水６７０ｍｌで４回、１０％食塩水５００ｍｌ
で３回、蒸留水で１回洗浄する（なお、１回の分液操作
につき、酢酸エチル層に酢酸エチル１００ｍｌを追加し
ていく）。酢酸エチル層を濃縮乾固すると粗α，β−（
２−クロロ−４−ニトロフェニル）−ヘプタアセチルマ
ルトシド１２４ｇを得た（ＨＰＬＣ分析によりフェニル
化率は８５％）。（本品はこのままで次工程に進むが、
一部とりトルエンから再結晶すると、融点１６５〜１６
７℃、白色のβ体の純品が得られる。）
ル−β−マルトシドの合成マルトース５６ｇ、無水酢酸
５９０ｍｌおよび無水酢酸ナトリウム４５．８ｇの混合
物を１２５〜１３０℃で２時間攪拌する。次いで、トル
エン１リットル、１０％食塩水を加え、分液操作を行な
う。トルエン層を１０％食塩水６００ｍｌで５回、さら
に蒸留水６００ｍｌで１回洗浄する。トルエン層を濃縮
乾固するとオクタアセチルマルトース１０８．９ｇを得
た（ＨＰＬＣ分析によりα体：β体＝１２：８８）。 （このものはこのままで次工程に進むが、一部とり含水
エタノールから最結晶を行なうと、融点１５９〜１６０
℃のβ体の純品が得られる。）オクタアセチルマルトー
ス１０８．９ｇ、２−クロロ−４−ニトロフェノール１
００ｇを酢酸３００ｍｌに溶解後、塩化亜鉛液（塩化亜
鉛５．７５ｇ、酢酸４５ｍｌ、無水酢酸２．５ｍｌを混
合して密栓し、一夜静置後、塩化亜鉛より水分を除去し
、溶解させた液）１１ｍｌを添加し、減圧下７５℃で酢
酸を留去する。１２０℃に昇温し、１０〜７ｍｍＨｇの
減圧下で４時間反応を行なう。終了後、スラリーを酢酸
エチル９００ｍｌに溶解し、１０％食塩水５００ｍｌを
加え、分液を行なう。酢酸エチル層を２．５％水酸化ナ
トリウム水６７０ｍｌで４回、１０％食塩水５００ｍｌ
で３回、蒸留水で１回洗浄する（なお、１回の分液操作
につき、酢酸エチル層に酢酸エチル１００ｍｌを追加し
ていく）。酢酸エチル層を濃縮乾固すると粗α，β−（
２−クロロ−４−ニトロフェニル）−ヘプタアセチルマ
ルトシド１２４ｇを得た（ＨＰＬＣ分析によりフェニル
化率は８５％）。（本品はこのままで次工程に進むが、
一部とりトルエンから再結晶すると、融点１６５〜１６
７℃、白色のβ体の純品が得られる。）
【００１７】粗
α，β−（２−クロロ−４−ニトロフェニル）−ヘプタ
アセチルマルトシド１２４ｇを４５℃で無水メタノール
５００ｍｌに溶解し、２８％ナトリウムメトキシド１２
．１ｍｌを加え、４５℃で３時間反応を行なう。次いで
、酢酸６ｍｌを加え中和後、濃縮乾固するとα，β−（
２−クロロ−４−ニトロフェニル）−マルトシド７９．
７ｇを得た。これを蒸留水２４０ｍｌに加熱溶解し、室
温にもどるまで静置する。析出した結晶を氷冷下に濾過
し、冷水１０ｍｌで２回洗浄後、乾燥させると、薄黄色
の精製α，β−（２−クロロ−４−ニトロフェニル）−
マルトシド６０．３ｇを得た（ＨＰＬＣ分析により、α
体：β体＝４：９６）。得られたα，β−（２−クロロ
−４−ニトロフェニル）マルトシド６０．３ｇをメタノ
ール１８０ｍｌに加熱溶解後、室温にもどるまで静置す
る。析出した結晶を氷冷下に濾過を行ない、冷却メタノ
ール１０ｍｌで２回洗浄後乾燥すると、白色の２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル−β−マルトシドの純品４１．
２ｇを得た（融点２０３〜２０７℃）。本品がβ体であ
ることは、α−グルコシダーゼおよびβ−グルコシダー
ゼの両酵素を作用させることにより確認した。
α，β−（２−クロロ−４−ニトロフェニル）−ヘプタ
アセチルマルトシド１２４ｇを４５℃で無水メタノール
５００ｍｌに溶解し、２８％ナトリウムメトキシド１２
．１ｍｌを加え、４５℃で３時間反応を行なう。次いで
、酢酸６ｍｌを加え中和後、濃縮乾固するとα，β−（
２−クロロ−４−ニトロフェニル）−マルトシド７９．
７ｇを得た。これを蒸留水２４０ｍｌに加熱溶解し、室
温にもどるまで静置する。析出した結晶を氷冷下に濾過
し、冷水１０ｍｌで２回洗浄後、乾燥させると、薄黄色
の精製α，β−（２−クロロ−４−ニトロフェニル）−
マルトシド６０．３ｇを得た（ＨＰＬＣ分析により、α
体：β体＝４：９６）。得られたα，β−（２−クロロ
−４−ニトロフェニル）マルトシド６０．３ｇをメタノ
ール１８０ｍｌに加熱溶解後、室温にもどるまで静置す
る。析出した結晶を氷冷下に濾過を行ない、冷却メタノ
ール１０ｍｌで２回洗浄後乾燥すると、白色の２−クロ
ロ−４−ニトロフェニル−β−マルトシドの純品４１．
２ｇを得た（融点２０３〜２０７℃）。本品がβ体であ
ることは、α−グルコシダーゼおよびβ−グルコシダー
ゼの両酵素を作用させることにより確認した。
【００１８】
実施例１
プロパノール１８０ｍｌと５ｍＭ塩化カルシウム含有１
００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）１８０ｍｌとを混合
し、均一溶液とする。この溶液にマルトペンタオース５
８ｇ、２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−マルトシ
ド４１ｇを溶解し、サイクロデキストリングルカノトラ
ンスフェラーゼ４７４０ユニットを加え、３７℃で８時
間攪拌する。反応液を酢酸でｐＨ４．０とし、１時間静
置後、活性炭８ｇを加え２時間攪拌する。濾過後、濾液
を外浴４５℃で約２００ｍｌまで減圧濃縮する。
００ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）１８０ｍｌとを混合
し、均一溶液とする。この溶液にマルトペンタオース５
８ｇ、２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−マルトシ
ド４１ｇを溶解し、サイクロデキストリングルカノトラ
ンスフェラーゼ４７４０ユニットを加え、３７℃で８時
間攪拌する。反応液を酢酸でｐＨ４．０とし、１時間静
置後、活性炭８ｇを加え２時間攪拌する。濾過後、濾液
を外浴４５℃で約２００ｍｌまで減圧濃縮する。
【００１９】メタノールで十分デカントしたオクタデシ
ルシリル化シリカゲル６００ｇ相当分を内径６．５ｃｍ
のカラム（約１２００ｍｌ容）に充填し、カラムを蒸留
水で置換した後、濃縮液を負荷する。蒸留水５リットル
を一定流速で流して無機塩類、非フェニル化糖を除去し
た後、５％アセトニトリル水４リットルにて溶出し、黄
色を除去する。さらに１０％アセトニトリル水９リット
ルで溶出し、１フラクション当り１００ｍｌずつ採取す
る。１．２リットル流したあたりからβ−（２−クロロ
−４−ニトロフェニル）−マルトペンタオシドが溶出し
始める。β−（２−クロロ−４−ニトロフェニル）−マ
ルトペンタオシドに富む画分を集めて減圧濃縮すると、
ＨＰＬＣで純度９９％のβ−（２−クロロ−４−ニトロ
フェニル）−マルトペンタオシドの白色結晶２０．７ｇ
を得た（融点１９２〜２０１℃）。本品がβ体であるこ
とは、本品に管理血清（ヒューミラーゼＨ）を作用させ
た後、α−グルコシダーゼおよびβ−グルコシダーゼを
作用させることにより確認した。ＨＰＬＣ分析条件；カ
ラムＩＮＥＲＴＳＩＬ ＯＤＳ−２，４．６×１５０ｍ
ｍ、移動相：アセトニトリル／水＝１７／８３、温度：
４０℃、流速：０．８ｍｌ／分、検出器：ＵＶ検出器（
２８０ｎｍ）
ルシリル化シリカゲル６００ｇ相当分を内径６．５ｃｍ
のカラム（約１２００ｍｌ容）に充填し、カラムを蒸留
水で置換した後、濃縮液を負荷する。蒸留水５リットル
を一定流速で流して無機塩類、非フェニル化糖を除去し
た後、５％アセトニトリル水４リットルにて溶出し、黄
色を除去する。さらに１０％アセトニトリル水９リット
ルで溶出し、１フラクション当り１００ｍｌずつ採取す
る。１．２リットル流したあたりからβ−（２−クロロ
−４−ニトロフェニル）−マルトペンタオシドが溶出し
始める。β−（２−クロロ−４−ニトロフェニル）−マ
ルトペンタオシドに富む画分を集めて減圧濃縮すると、
ＨＰＬＣで純度９９％のβ−（２−クロロ−４−ニトロ
フェニル）−マルトペンタオシドの白色結晶２０．７ｇ
を得た（融点１９２〜２０１℃）。本品がβ体であるこ
とは、本品に管理血清（ヒューミラーゼＨ）を作用させ
た後、α−グルコシダーゼおよびβ−グルコシダーゼを
作用させることにより確認した。ＨＰＬＣ分析条件；カ
ラムＩＮＥＲＴＳＩＬ ＯＤＳ−２，４．６×１５０ｍ
ｍ、移動相：アセトニトリル／水＝１７／８３、温度：
４０℃、流速：０．８ｍｌ／分、検出器：ＵＶ検出器（
２８０ｎｍ）
【００２０】
【発明の効果】本発明方法によれば、α−アミラーゼ活
性測定用基質として有用なβ−（２−クロロ−４−ニト
ロフェニル）−マルトペンタオシドをサイクロデキスト
リングルカノトランスフェラーゼの糖転位反応により効
率よく、かつ経済的に合成することができるので、本方
法によって大幅なコストダウンが可能となる。
性測定用基質として有用なβ−（２−クロロ−４−ニト
ロフェニル）−マルトペンタオシドをサイクロデキスト
リングルカノトランスフェラーゼの糖転位反応により効
率よく、かつ経済的に合成することができるので、本方
法によって大幅なコストダウンが可能となる。
Claims (3)
- 【請求項１】 式 【化１】 で表わされるマルトペンタオースと式 【化２】 で表わされる２−クロロ−４−ニトロフェニル−β−マ
ルトシドとに、サイクロデキストリングルカノトランス
フェラーゼを作用させることを特徴とする式【化３】 で表わされるβ−（２−クロロ−４−ニトロフェニル）
−マルトペンタオシドの製造法。 - 【請求項２】 サイクロデキストリングルカノトラン
スフェラーゼによる糖転位反応を水と水可溶性有機溶媒
との混合溶媒中で行なうことを特徴とする請求項１記載
の製造法。 - 【請求項３】 水可溶性有機溶媒が低級アルコール、
極性非水溶媒、エチレングリコールエーテル類またはグ
リコール類であることを特徴とする請求項１または２記
載の製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5084691A JPH04211390A (ja) | 1990-02-23 | 1991-02-22 | β−（２−クロロ−４−ニトロフェニル）−マルトペンタオシドの製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-42914 | 1990-02-23 | ||
| JP4291490 | 1990-02-23 | ||
| JP5084691A JPH04211390A (ja) | 1990-02-23 | 1991-02-22 | β−（２−クロロ−４−ニトロフェニル）−マルトペンタオシドの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04211390A true JPH04211390A (ja) | 1992-08-03 |
Family
ID=26382654
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5084691A Pending JPH04211390A (ja) | 1990-02-23 | 1991-02-22 | β−（２−クロロ−４−ニトロフェニル）−マルトペンタオシドの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04211390A (ja) |
-
1991
- 1991-02-22 JP JP5084691A patent/JPH04211390A/ja active Pending
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