JPH04218775A - 免疫測定用容器、免疫測定方法及び免疫測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、上部に少なくとも二つ
の開口を有し、下方に筒状である容器を用いてなる免疫
測定法に関する。更には、血液あるいは体液中の微量成
分の定量により臨床検査に用いる免疫測定法に関する。

【０００２】

【従来の技術】放射免疫測定法（以下ＲＩＡと省略する
）及び酵素免疫測定法（以下ＥＩＡと省略する）は、検
体中の測定対象物を検出する高感度な測定法ではあるが
、検体中に存在する測定対象物以外の物質の影響を受け
るため、これを除く方法として、バインド／フリー（Ｂ
／Ｆ）分離操作が測定中に用いられている。この操作を
効率よく行うため、抗原又は抗体を結合した固相を用い
る固相法がある。一般に、固相法によるＲＩＡ及びＥＩ
Ａは、測定中に反応、洗浄、検出等の工程を含んでおり
、この工程を実施するために、分注、希釈、攪拌、Ｂ／
Ｆ分離、固相の移動等の複雑な操作を繰り返し行ってい
る。その操作に対し、いくつかの改良技術が知られてい
る。その一つに測定のために用いられる容器の改良があ
る。容器の改良の例として、磁性粒子を入れるための専
用容器であるマイクロプレート及びこのプレートに合う
磁石の入った磁気分離デバイスを用いる方法が報告され
ている（特開平１−２０１１５６号参照）。さらに他の
例としては、自動化を目指し、繊維状マトリクスを有す
る反応ウエル、試料ウエル等の複数のウエルを有する容
器を用いる方法が知られている（特開昭６３−２８１０
５３号参照）。

【０００３】一方、ＲＩＡ及びＥＩＡにおいて、多量の
検体の測定のため自動化された測定機器が開発されてい
る。この機器は、測定の際使用する固相及び標識物の種
類により各種知られている（「酵素免疫測定法」石川栄
治著、医学書院１８０〜２０７ページ（１９８７）参照
）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】一般に固相を用いるＲ
ＩＡ及びＥＩＡは、測定操作中に繁雑な分注、希釈、攪
拌、Ｂ／Ｆ分離、固相の移動等の操作を必要としている
。これを解決する手段として、前記したマイクロプレー
ト及び磁気分離デバイスを用いる方法、さらには複数の
ウエルを有する容器を用いる方法が知られているものの
、測定時間が１〜１８時間と長く、緊急の検査ができな
いこと、大量の検体の測定が迅速に行えないこと、抗原
検出系又は抗体検出系の異なった検出系に対し同一の容
器による測定が簡単にできないこと等の欠点を有してい
た。さらに前記した改良された容器を用いた場合でも、
測定機器は、未だ複雑な測定操作を必要としていた。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、測定対象物で
ある血清あるいは体液中の抗原又は抗体の測定にあたり
、上部に少なくとも二つの開口を有し、下方に筒状であ
る容器を用いることより、従来の繁雑かつ複雑な測定操
作を改善し、短時間で各検出系の多項目の測定対象物に
も対応できる免疫測定法を提供しようとするものである
。特に、自動化された測定機器を用いる免疫測定には威
力を発揮する方法である。

【０００６】本発明は、ＥＩＡ及びＲＩＡに採用するこ
とができる。ＥＩＡ及びＲＩＡは、標識物を用いる１ス
テップ法又は２ステップ法の固相法免疫測定法であり、
抗原あるいは抗体を測定することができる。例えば２ス
テップ法の抗原検出系では、まず一つの筒状部に他の標
識抗体溶液を入れた筒状部から分取した溶液と検体とを
加え混合する。この混合液の一部をさらにもう一つの抗
体結合固相の入った筒状部に加え攪拌し、反応させたの
ち、Ｂ／Ｆ分離後基質との反応を行い固相に結合した抗
原量をこの筒状部内で測定する方法である。この測定法
は、この三つの開口を有する容器の中で各測定工程の操
作である分注、希釈、攪拌、Ｂ／Ｆ分離、測定等のすべ
ての操作を行う方法である。前記した抗体結合固相の入
った筒状部は、固相及び反応液を入れ、さらに外部より
の検出を容易にするため他の二本より下方に長く、筒状
であり容量の大きい形状であることが好ましい。

【０００７】また容器の開口の数は、少なくとも二つの
開口を有するものを使用することができ、測定対象物に
よつても決まるがその数には制限はなく、操作性及び簡
便性により決めることができる。例えば、２種の抗体結
合固相を別々の筒状部にそれぞれ入れ、１つの検体に対
して同時に２項目の測定を行うことができる。又、同種
の抗体結合固相を別々の筒状部に入れ、同時に２つの検
体を処理することもできる。更に、四つの開口を有する
容器を用いて４つ目の筒状部を検体希釈槽として使うこ
ともできる。前記した抗体結合固相の入った筒状部は、
固相及び反応液を入れ、さらに外部よりの検出を容易に
するため他の一本又は二本の筒状部より下方に長く、筒
状であり容量の大きい形状であることが好ましい。本発
明を実施するための容器は、プラスチック製、例えばポ
リスチレン樹脂製、アクリル樹脂製、塩化ビニル樹脂製
等、又はガラス製のものを使用することができるが、低
価格であり、光透過性がよく、取扱いが容易なポリスチ
レン樹脂製のものを好適に使用することができる。この
容器は、少なくとも二つの開口を有しているが、筒状部
以外の部分には、本発明の目的を達成するため必要に応
じ突起部等を付加することもできる。また、容器は試薬
等を入れ、容器の上面をシールしても使用することがで
きる。この時、容器の上面は平らであることが好ましい
。この方法により容器には、試薬類、例えば抗原もしく
は抗体の結合した固相又は基質等を入れておき、使用時
まで安定性よく保存することができる。シール剤は、ア
ルミはく、各種高分子フィルム等を単独又はラミネート
して使用することができ、使用開始時にブレーカーによ
り破って使用するものである。

【０００８】本発明を実施するために用いられる試薬の
うち抗原又は抗体結合固相は、筒状部内壁に従来のＥＩ
Ａで行われているように、抗原又は抗体を化学的にある
いは物理的に結合させたもの、抗原又は抗体を同様に結
合させたビーズあるいは粒子等を挙げることができる。 このビーズは、通常ＥＩＡで用いられるポリスチレン製
のビーズ等である。さらに粒子は磁性粒子例えば、磁性
体、磁性体を含む粒子であり、具体的にはフェライト粒
子等である。

【０００９】磁性粒子は、外部磁力によりＢ／Ｆ分離操
作を容易に行うことができるため測定に好適に用いるこ
とができる。この際、Ｂ／Ｆ分離操作は、他の筒状部よ
り下方に長い前記した筒状部で行うことにより、外部よ
りの磁力を磁性粒子の近くに置くことができ効率よく実
施することができる。

【００１０】固相に結合される抗原及び抗体は、検体中
の測定対象物により決めることができる。抗体は薬剤例
えばテオフィリン、フェニトイン、バルプロ酸；低分子
ホルモンとして、例えばサイロキシン、エストロゲン、
エラストラジオール；癌マーカーとして、例えばＣＥＡ
、ＡＦＰ；例えばＨＩＶ、ＡＴＬＡ、ＨＢＶ；高分子ホ
ルモンとして、例えば甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、
インスリン；サイトカインとして、例えばＩＬ−Ｉ、Ｉ
Ｌ−２、ＩＬ−６；各種グロスファクター、例えばＥＧ
Ｆ、ＰＤＧＦ；更に前記ウイルスの適当なＤＮＡ、ＲＮ
Ａなどに対する抗体である。これら抗体は、モノクロー
ナル抗体又はポリクローナル抗体であってもよく、さら
には抗体の分解物であるＦ（ａｂ’）２　、Ｆａｂ’、
Ｆａｂであってもよい。また、抗原は、ウイルス、例え
ばＨＩＶ、ＡＴＬＡ、ＨＢＶ；前記のウイルスのＤＮＡ
；高分子ホルモン、例えばインスリン、ＴＳＨ等である
。

【００１１】固相への結合方法は、物理吸着法又は化学
結合法を採用することができる。物理吸着法は、適当な
緩衝液中で前記固相と抗原あるいは抗体とを反応させる
ことにより行うものである。この反応の際に使用する緩
衝液としては、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、炭
酸緩衝液等である。反応は、両者を４℃〜３７℃、好適
には室温にて混合することにより容易に進行し、目的物
を得ることができる。又、化学結合法は、いわゆるペプ
チド結合法におけるカルボジイミド法を採用することが
できる。さらにその他の化学結合法としては、グルター
ルアルデヒドや塩化シアヌルなどの二価性架橋試薬の存
在下に行う方法も採用することができる（「ペプチド合
成法」丸善株式会社（昭和５０年発行）及び「酵素免疫
測定法」共立出版株式会社、「蛋白質核酸酵素」別冊第
３１号（１９８７年）参照）。

【００１２】ＥＩＡで用いられる酵素標識抗体の製造に
あたり、用いる抗体は測定対象物により決まり、固相結
合抗体と異なるエピトープを認識する抗体あるいは同じ
エピトープを認識する抗体であってもよい。さらに、抗
体検出系ではイムノグロブリンに対する抗体を用いるこ
とができる。また、抗体と酵素との結合方法は、公知の
共有結合又は非共有結合を作る方法を利用して製造する
ことができる（例えば、「蛋白質核酸酵素」別冊第３１
号、３７〜４５ページ（１９８７）参照）。

【００１３】使用する酵素は、パーオキシダーゼ、アル
カリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコー
スオキシダーゼなどである、この際基質は、用いる酵素
に適したものを用いることは言うまでもなく、例えばＡ
ＢＴＳ、ルミノール−Ｈ２　Ｏ２　（パーオキシダーゼ
用）、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、メチルウンベ
リフェニルホスフェート、３−（２’−ピロ−ハアダマ
ンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキ
シ）フェニル−１，２−ジオキセタン　　二ナトリウム
塩（以下ＡＭＰＰＤと省略する）（アルカリホスファタ
ーゼ用）、ｐ−ニトロフェニル−β−ｏ−ガラクトース
、メチルウンベリフェニル−β−ｏ−ガラクトース　　
（β−ガラクトシダーゼ用）などを使用することができ
る。 測定は４〜４０℃で反応させ、生じた発色、蛍光あるい
は発光量を検出装置により測定することにより行うもの
である。これらの測定法は、それぞれ比色法、蛍光法及
び化学発光法の酵素免疫測定法と呼ばれている。検出装
置としては、分光光度計、フォトンカウンター等の他、
写真フイルム等を用いることもできる。さらに測定は、
４℃〜４０℃の範囲で加温しながら行ういわゆるレート
法を採用することもできる。

【００１４】又、ＲＩＡは、上記酵素標識の代わりに　
１２５Ｉなどの放射性同位元素を標識し、行うものであ
る。放射能を測定する以外は、操作は前記ＥＩＡの場合
と同じである。

【００１５】又、抗原あるいは抗体の放射標識は、既に
市販されているボルトインハンター試薬により容易に調
製することができる。例えば、０．１Ｍ炭酸水素ナトリ
ウム水溶液に溶かした抗原あるいは抗体溶液にこのボル
トインハンター試薬を加え１〜２時間後に、Ｇ−２５の
脱塩カラム等を用いて未反応のボルトインハンター試薬
を除去することにより調製することができる。この他、
クロラミンＴ法やヨードジン法などを採用することによ
り容易に　１２５Ｉの放射標識を行うことができる。免
疫反応を行うにあたっては固相に試料を加え、４℃〜４
０℃好ましくは２０℃〜３８℃で１〜１８時間反応させ
るものである。この後、蒸留水あるいは生理食塩水等で
洗浄を行い、放射標識抗体を固相に加え、４℃〜４０℃
好ましくは２０℃〜３８℃で１〜１８時間反応させ、蒸
留水あるいは生理食塩水等で洗浄を行い、その放射活性
を計測するものである。測定にはシンチレーションカウ
ンターを使用するものである。

【００１６】以上、本発明をマニュアルによる操作に従
って説明してきたが、それぞれの操作を機械化し、自動
免疫測定装置を組むことができる。本発明を実施するこ
とができる自動免疫測定装置としては、例えば第７図に
示すような装置が考えられる。第７図に示された装置は
、前記開口を有する容器が反応ライン部１１１をＳから
Ｅ方向へ移動する間に検体と酵素標識抗体及び基質液と
の混合、攪拌、反応、測定等の一連の処理が為され、途
中で人手を介することなく免疫測定が終了するものであ
る。

【００１７】

【作用】次に、図面を参照して本発明を詳細に説明する
。図１は容器の構成を示す一例である。ここで本発明を
実施するにあたり使用する容器は、開口１，２及び３を
有している。開口１を有する筒状部８は、他の二本より
も下方に長い筒状を有し、抗原又は抗体結合固相を入れ
反応、Ｂ／Ｆ分離及び検出を行うためのものである。 開口２を有する筒状部９は、血清又は希釈液を入れ、反
応又は希釈を行うための筒状部である。この筒状部９は
、検体中の抗原検出系では反応のために、抗体検出系で
は希釈のためのものである。開口３を有する筒状部１０
は、ＥＩＡでは酵素標識した抗体又ＲＩＡでは放射性同
位元素を標識した抗体を入れるためのものである。

【００１８】図２は、別の容器の構成を示す一例である
。この容器は、開口４及び５を有しており、各々、第１
図の筒状部８及び１０に相当する作用を持つ筒状部１１
及び１２がある。二つの開口を有する容器は、希釈操作
を行わず測定するために好適に用いることができる。

【００１９】図３は、免疫測定の効率化を計るために工
夫された容器の構成を示す一例である。この容器は、３
つの開口部を有しており、各々、第１図の筒状部８及び
１０に相当する作用を持つ筒状部１３，１５及び１４が
ある。この容器は筒状部１３及び１５に同じ種類の抗原
又は抗体結合固相を入れることにより、同時２血清測定
に用いることができる。又異なる種類の抗原結合固相を
入れることにより、同時２項目測定に用いることもでき
る。

【００２０】図４は、別の容器の構成を示す一例である
。この容器は、４つの開口部を有しており、各々、第１
図の筒状部８及び１０に相当する作用を持つ筒状部１６
，１９及び１７がある。筒状部１８を有するこの容器は
希釈操作を行なう同時２項目測定を行なうために好適に
用いることができる。

【００２１】図５は、固相として磁性粒子を用いたとき
のＢ／Ｆ分離操作を行う構成を示す一例である。図中６
は、筒状部８に隣接して置かれ磁力を発生する装置であ
り、永久磁石でも電磁石であってもよい。

【００２２】図６は、検出を行うための構成を示す一例
である。図中７は、検出装置であり、ＥＩＡでは使用す
る基質に応じ、発色量、蛍光量又は発光量を検出するた
めの装置である。ＲＩＡではシンチレーションカウンタ
ーである。

【００２３】図７は、本発明を実施するに当り、用いる
ことのできる自動測定装置を示す一例である。

【００２４】

【実施例】以下参考例、実施例及び測定例により更に詳
細に本発明を説明する。

【００２５】（参考例１）カルボキシル化フェライト粒
子の調製 カルボキシル化フェライト粒子は、予め超音波洗浄機（
バット型、日本精機製作所製）を用いて蒸留水で６０秒
ずつ５回洗浄した。日本ペイント社製フェライト被覆粒
子（核の平均粒径０．３μｍのポリスチレン製）５ｇに
３−アミノプロピルトリエトキシシラン５０ｍｌを加え
、更に氷酢酸３０ｍｌを添加し、室温下３時間反応し、
洗浄後、無水グルタル酸を反応させることにより得られ
る。氷酢酸は氷冷下攪拌しながら滴下し、洗浄は蒸留水
、メタノール、蒸留水で各々３回ずつ洗浄し更に、０．
１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液で３００ｍｌずつ５回洗浄
した。無水グルタル酸との反応は、粒子の５ｗｔ％（０
．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液）１００ｍｌに無水グル
タル酸２．８５ｇを加え、１０分間反応させた。反応終
了後、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液で３００ｍｌず
つ３回洗浄し、更に蒸留水で５回洗浄し、これをカルボ
キシル化フェライト粒子として用いた。

【００２６】（参考例２）抗ＴＳＨ結合カルボキシル化
フェライト粒子の調製 ２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ４．５）５ｍｌに参考例１
で調製したカルボキシル化フェライト粒子５０ｍｇを分
散させ、これに水溶性カルボジイミド５０ｍｇ加えた。 室温で２０分間反応させた後、上清を除去し、抗ＴＳＨ
マウスＩｇＧ溶液（１ｍｇ／ｍｌ，０．０２Ｍリン酸緩
衝液、ｐＨ４．５）５ｍｌを加え、エンドオーバーエン
ドミキサーで攪拌した。２時間後この粒子を２％ＢＳＡ
溶液（０．１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ　　Ｍｇ
Ｃｌ２　、ｐＨ７．５）で５回洗浄し、これを同じＢＳ
Ａ溶液に分散させ、抗ＴＳＨマウスＩｇＧ結合カルボキ
シル化フェライト粒子とした。

【００２７】（実施例１）抗ＴＳＨマウスＩｇＧ結合容
器の調製 第１図に示した筒状部８に抗ＴＳＨマウスＩｇＧ溶液（
４μｇ／ｍｌ，１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０）を
２００μｌ入れ室温で１８時間放置した。この筒状部８
を生理食塩水で３回洗浄し、２％ＢＳＡ溶液（０．１Ｍ
　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　、ｐＨ
７．６）を３００μｌ加え、抗ＴＳＨマウスＩｇＧ結合
筒状部とした。

【００２８】（実施例２）抗ＴＳＨマウスＩｇＧ結合ポ
リスチレンビーズの調製 抗ＴＳＨマウスＩｇＧ溶液２５ｍｌ（４μｇ／ｍｌ，１
０ｍＭ　　リン酸緩衝液）中に１／８インチポリスチレ
ンビーズ１００個を浸し、室温で一夜放置した。このビ
ーズを生理食塩水で３回洗浄し、２％ＢＳＡ溶液（上記
に同じ）を２５ｍｌ加え抗ＴＳＨマウスＩｇＧ結合ポリ
スチレンビーズとした。

【００２９】（実施例３）ＴＳＨ測定用筒状部の調製（
３−１）粒子型ＴＳＨ測定用筒状部の調製参考例２で調
製した抗ＴＳＨマウスＩｇＧ結合フェライト粒子（０．
０４％粒子）２５０μｌを第１図で示した筒状部８に入
れ、筒状部１０にアルカリホスファターゼ結合抗ＴＳＨ
マウスＩｇＧ−Ｆａｂ溶液（０．１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、０．１ｍＭ　　ＺｎＣｌ２　、１ｍＭ　　ＭｇＣ
ｌ２　、ｐＨ７．５、２％ＢＳＡ、５００ｎｇ／ｍｌア
ルカリホスファターゼ結合抗ＴＳＨマウスＩｇＧＦａｂ
含有）１００μｌを入れた。この筒状部を接着面がポリ
ビニルクロライドでコートされたアルミホイルでカバー
し、ヒートシールした。これを粒子型ＴＳＨ測定用筒状
部として用いた。

【００３０】（３−２）チューブ型ＴＳＨ測定用筒状部
の調製 実施例１で調製した抗ＴＳＨマウスＩｇＧ結合筒状部１
０にアルカリホスファターゼ結合抗ＴＳＨマウスＩｇＧ
−Ｆａｂ溶液（０．１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１
ｍＭ　　ＺｎＣｌ２　、１ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　、ｐＨ
７．５、２％ＢＳＡ、５００ｎｇ／ｍｌアルカリホスフ
ァターゼ結合抗ＴＳＨマウスＩｇＧＦａｂ含有）１００
μｌを入れた。 このカートリッジを接着面がポリビニルクロライドでコ
ートされたアルミホイルでカバーし、ヒートシールした
。これをチューブ型ＴＳＨ測定用筒状部として用いた。

【００３１】（３−３）ビーズ型ＴＳＨ測定用筒状部の
調製 実施例２で調製した抗ＴＳＨマウスＩｇＧ結合ポリスチ
レンビーズ１個を第１図で示した筒状部８にいれ２％Ｂ
ＳＡ溶液を２５０μｌ加えた。次にこの筒状部１０にア
ルカリホスファターゼ結合抗ＴＳＨマウスＩｇＧ−Ｆａ
ｂ溶液（０．１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１ｍＭ　
　ＺｎＣｌ２　、１ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　、ｐＨ７．５
、２％ＢＳＡ、５００ｎｇ／ｍｌアルカリホスファター
ゼ結合抗ＴＳＨマウスＩｇＧＦａｂ含有）１００μｌを
入れた。この筒状部を接着面がポリビニルクロライドで
コートされたアルミホイルでカバーし、ヒートシールし
た。これをビーズ型ＴＳＨ測定用筒状部として用いた。

【００３２】（実施例４）ＨＴＬＶ−Ｉ抗原結合フェラ
イト粒子の調製 日本ペイント社製フェライト粒子１０％濃度で８００μ
ｌに分散させ、これにＨＴＬＶ−Ｉ抗原（４００μｇ／
ｍｌ）２ｍｌ加え室温で一夜エンドオバーエンドミキサ
ーで攪拌した。この粒子を２％ＢＳＡ溶液（０．１Ｍ　
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　、ｐＨ７
．５）で５回洗浄し、これを同じＢＳＡ溶液に分散させ
ＨＴＬＶ−Ｉ抗原結合フェライト粒子とした。

【００３３】（参考例４）ＨＴＬＶ−Ｉ抗体検出用筒状
部の調製 第１図で示した筒状部８に実施例３で調製したＨＴＬＶ
−Ｉ抗原結合フェライト溶液（０．００８％／粒子／Ｂ
ＳＡ溶液）３５０μｌを入れた。次に３のホールに抗ヒ
トＩｇＧマウスＩｇＧ結合アルカリホスファターゼ３０
０μｌを入れた。この筒状部をアルミホイルでカバーし
ヒートシールして目的の筒状部とした。

【００３４】（実施例５）各筒状部によるＴＳＨの測定
各筒状部８，９及び１０のシールをアルミブレーカーで
やぶり、５０μｌのＴＳＨを含むサンプル（０、１０μ
Ｕ／ｍｌ）及び各筒状部８に入った抗ＴＳＨＦａｂ’を
結合したアルカリホスファターゼコンジュゲート５０μ
ｌ（コンジュゲート濃度０．５μｇ／ｍｌ、０．１Ｍ　
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２％ＢＳＡ、１ｍＭＭｇＣｌ２　
、０．１ｍＭ　　ＺｎＣｌ２　、ｐＨ７．５）を各筒状
部９に入れ混合した。

【００３５】（５−１）ビーズ型ＴＳＨ測定用筒状部に
よる測定 １０分後、筒状部９に入った混合液３０μｌをビーズの
入った１の筒状部に加え攪拌した。１０分後上清をアス
ピレートして除き、生理食塩水で４回洗浄した。この筒
状部８にＡＭＰＰＤ１００μｇ／ｍｌを含む基質液（０
．１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１μＭ　　ＭｇＣｌ２　
、０．１ｍＭ　　ＺｎＣｌ２　、ｐＨ９．８）３００μ
ｌを加え室温で反応させた。１０分間反応を行った後ル
ミノメーター（アロカ社製）で測定した。結果を第５図
に示す。

【００３６】（５−２）チューブ型ＴＳＨ測定用筒状部
による測定 １０分後、筒状部９に入った混合液３０μｌを抗体の結
合した筒状部８に加え攪拌した。１０分後上清をアスピ
レートして除き、生理食塩水で４回洗浄した。この筒状
部８に実施例５−１と同じＡＭＰＰＤ溶液を３００μｌ
を加え室温で反応させ、５分後にルミノメーターで測定
した。結果を第５図に示す。

【００３７】（５−３）粒子型ＴＳＨ測定用筒状部によ
る測定 １０分後、筒状部９に入った混合液３０μｌを抗体結合
粒子の入った筒状部８に加え攪拌し、１０分間放置した
。この筒状部８を表面磁場が３０００ガウスの磁石に接
して、フェライト粒子を集磁させ、上清をアスピレーシ
ョンにより排液した。この筒状部８に生理食塩水を分注
した後、前述の磁石によりフェライト粒子を集磁し、上
清をデカンテーションにより排液した。この操作を４回
繰り返した。この筒状部８に実施例５−１と同じＡＭＰ
ＰＤ溶液を３００μｌを加え室温で反応させ、５分後に
ルミノメーターでその発光量を測定した。結果を第５図
に示す。

【００３８】（実施例６）ＨＴＬＶ−Ｉ用筒状部を用い
るＨＴＬＶ−Ｉ抗体の測定 実施例３で調製した筒状部９のシールをシールブレーカ
ーで穴をあけ、筒状部に血清２０μｌを入れ、更に希釈
液（１０％ＮＲＳ、２％　　ＢＳＡを含む０．１Ｍ　　
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ　　ＭｇＣｌ２　、０．１ｍ
Ｍ　　ＺｎＣｌ２　、ｐＨ７．０）１８０μｌを加えた
。この希釈血清２０μｌを筒状部８に入ったＨＴＬＶ−
Ｉ抗原結合粒子と混合し、攪拌後３７℃で１０分間放置
した。この筒状部８の外側から表面磁場が３０００ガウ
スの永久磁石を接してフェライト粒子を集磁させ、上清
をアスピレーションにより排液した。この後、０．４％
食塩水４００μｌを加え攪拌した。この筒状部を前述の
磁石により集磁させ、上清をアスピレーションして排液
した。この操作を２回繰り返した。

【００３９】この筒状部８に抗ヒトＩｇＧマウスＩｇＧ
結合アルカリホスファターゼ溶液（３００ｎｇ／ｍｌタ
ンパク溶液）２５０μｌを加え１０分間放置した。この
筒状部を表面磁場が３０００ガウスの磁石に接して、フ
ェライト粒子を集磁させ、上清をアスピレーションによ
り排液した。この後０．４％食塩水４００μｌを加え攪
拌した。この筒状部を前述の磁石に接して上清をアスピ
レーションにより排液した。この操作を４回繰り返した
。 この筒状部に実施例５−１と同じＡＭＰＰＤ溶液を３０
０μｌ加え室温で５分間反応させた。５分後にルミノメ
ーター５秒間の発光量を測定した。各血清サンプルにつ
いて、結果を表−１に示す。

【表１】

【００４０】（実施例７）　　ＣＡ１９−９の測定（７
−１）ＣＡ１９−９抗体結合粒子の調製参考例２と同様
に抗ＣＡ１９−９モノクローナル抗体（ＭＣＡ）２ｍｇ
を反応させ、充分洗浄して抗ＣＡ１９−９ＭＣＡ結合フ
ェライト粒子を調製した（０．０４％粒子／２％ＢＳＡ
、０．１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ　　ＭｇＣｌ
２　、０．１ｍＭ　　ＺｎＣｌ２　、ｐＨ７．５）。

【００４１】（７−２）粒子型ＣＡ１９−９測定用筒状
部の調製 実施例７−１で調製した抗ＣＡ１９−９マウスＩｇＧ結
合フェライト粒子２５０μｌを第２図で示した筒状部１
１に入れ、筒状部１２にアルカリホスファターゼ結合抗
ＣＡ１９−９マウスＩｇＧ−Ｆａｂ溶液（０．５μｇ／
ｍｌ）を３５０μｌ入れた。これの上部をＰＥＴラミネ
ートアルミホイルで熱シールした。

【００４２】（７−３）ＣＡ１９−９の測定予め、実施
例７−２で調製した筒状部のアルミシールをシールブレ
ーカーでやぶり、筒状部１１に血清２０μｌを加え攪拌
し、室温で１０分間放置した。次にこの筒状部１１のチ
ューブの外側に表面磁場が３０００ガウスの磁石を接し
てフェライト粒子を集磁させ、上清をデカンテーション
により排液し、この後、０．２％食塩水を加えて攪拌し
た。この後上述と同様に粒子を集磁させ上清を除去した
。この操作を２度行い、筒状部１２から標識抗体液２５
０μｌ取り出し筒状部１１に加え攪拌した。 室温で１０分後、前述の磁石でフェライト粒子を集磁さ
せ上清を除去した。次に洗浄液４００μｌを加え攪拌し
、再度集磁させ上清を除去した。この操作を４回繰り返
した。次に実施例４と同じ基質液を３００μｌ加え、攪
拌し室温で５分間放置し、直ちにルミノメーター（アロ
カ社製）で５秒間の発光量を測定した。各血清サンプル
の結果を表−２に示す。

【表２】

【００４３】（実施例８）　　粒子型ＣＡ１９−９測定
用筒状部の調製 （８−１）　　実施例７−１で調製した抗ＣＡ１９−９
マウスＩｇＧ結合フェライト粒子２５０μｌを第４図で
示した筒状部１３，１５に入れ、筒状部１４にアルカリ
ホスファターゼ結合抗ＣＡ１９−９マウスＩｇＧ−Ｆａ
ｂ溶液（０．５μｇ／ｍｌ）を３５０μｌ入れた。これ
の上部をＰＥＴラミネートアルミホイルで熱シールした
。

【００４４】（８−２）　　ＣＡ１９−９の測定予め、
実施例８で調製した筒状部のアルミシールをシールブレ
ーカーでやぶり、筒状部１３，１５に２種類の血清を各
々２０μｌを加え攪拌し、室温で１０分間放置した。次
にこの筒状部１３，１５のチューブの外側に表面磁場が
３０００ガウスの磁石を接してフェライト粒子を集磁さ
せ、上清をデカンテーションにより排液し、この後、０
．２％食塩水を加えて攪拌した。この後上述と同様に粒
子を集磁させ上清を除去した。この操作を２度行い、筒
状部１４から標識抗体液２５０μｌを筒状部１３，１５
に加え攪拌した。室温で１０分後、前述の磁石でフェラ
イト粒子を集磁させ上清を除去した。次に洗浄液４００
μｌを加え攪拌し、再度集磁させ上清を除去した。この
操作を４回繰り返した。次に実施例４と同じ基質液を３
００μｌ加え、攪拌し室温で５分間放置し、直ちにルミ
ノメーター（アロカ社製）で５秒間の発光量を測定した
。各血清サンプルの結果を表−３に示す。

【表３】

【００４５】（実施例９）　　ＨＢｓ　抗原結合フェラ
イト粒子の調製 日本ペイント社製フェライト粒子５％濃度で８００μｌ
に分散させ、これにＨＢｓ　抗原（４００μｇ／ｍｌ）
２ｍｌ加え室温で一夜エンドオバーエンドミキサーで攪
拌した。この粒子を２％ＢＳＡ溶液（０．１Ｍ　　Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭＭｇＣｌ２　、ｐＨ７．５）で５
回洗浄し、これを同じＢＳＡ溶液に分散させＨＢｓ　抗
原結合フェライト粒子とした。

【００４６】（参考例５）　　粒子型ＨＴＬＶ−Ｉ及び
ＨＢｓ　抗体検出用筒状部の調製 第４図で示した筒状部１６に実施例３で調製したＨＴＬ
Ｖ−Ｉ抗原結合フェライト溶液（０．００８％／粒子／
ＢＳＡ溶液）３５０μｌを入れた。さらに筒状部１７に
実施例９で調製したＨＢｓ　抗原結合フェライト溶液（
０．００８％／粒子／ＢＳＡ溶液）３５０μｌを入れた
。次にホール１７に抗ヒトＩｇＧマウスＩｇＧ結合アル
カリホスファターゼ３００μｌを入れた。この筒状部を
アルミホイルでカバーしヒートシールして目的の筒状部
とした。

【００４７】（実施例１０）　　ＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＢ
ｓ　抗体の測定 参考例５で調製した筒状部１６，１７，１８，１９のシ
ールをシールブレーカーで穴をあけ、筒状部１８に血清
２０μｌを入れ、更に希釈液（１０％ＮＲＳ、２％　　
ＢＳＡを含む０．１Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ　
　ＭｇＣｌ２　、０．１ｍＭ　　ＺｎＣｌ２　、ｐＨ７
．０）１８０μｌを加えた。この希釈血清２０μｌを筒
状部１６，１７に入ったＨＴＬＶ−Ｉ抗原結合粒子及び
ＨＢｓ　抗原結合粒子と混合し、攪拌後３７℃で１０分
間放置した。この筒状部１６，１９の外側から表面磁場
が３０００ガウスの永久磁石を接してフェライト粒子を
集磁させ、上清をアスピレーションにより排液した。こ
の後、０．４％食塩水４００μｌを加え攪拌した。この
筒状部を前述の磁石により集磁させ、上清をアスピレー
ションして排液した。この操作を２回繰り返した。

【００４８】この筒状部１６，１９に筒状部の抗ヒトＩ
ｇＧマウスＩｇＧ結合アルカリホスファターゼ溶液（３
００ｎｇ／ｍｌタンパク溶液）を各々２５０μｌづつ加
え１０分間放置した。この筒状部を表面磁場が３０００
ガウスの磁石に接して、フェライト粒子を集磁させ、上
清をアスピレーションにより排液した。この後０．４％
食塩水４００μｌを加え攪拌した。この筒状部を前述の
磁石に接して上清をアスピレーションにより排液した。 この操作を４回繰り返した。この筒状部に実施例５−１
と同じＡＭＰＰＤ溶液を各々３００μｌづつ加え室温で
５分間反応させた。５分後にルミノメーター５秒間の発
光量を測定した。各血清サンプルについて、結果を表−
４に示す。

【表４】

【００４９】（実施例１１）本発明の実施に用いること
のできる装置 本発明を実施するにあたって用いることのできる装置の
例を図７に従って説明する。図中１０２は起動釦、測定
方法選択釦等を備えた入力部であり、１０３は測定結果
を出力する出力部であり、１１０は検体１４４と酵素標
識抗体及び基質液との混合，攪拌，反応，測定等の一連
の処理を行う処理部であり、１３０はこの処理部１１０
に反応容器１０４を供給する供給部であり、１０５はこ
の装置各部を制御する制御部であり、１０１はケース本
体である。

【００５０】前記処理部１１０は、モータ（図示省略）
を備え方向Ａに反応容器１０４を移動させると共にこの
移動経路Ｌ中の各所定位置で反応及び測定等を行い得る
反応ライン部１１１と、複数の検体１４４を収容する検
体収容部１１２と、複数のチップ１１３ａを収容するチ
ップ収容部１１３と、チップ収容部１１３からチップ１
１３ａを取り出し、検体収容部１１２に収容された検体
１４４を適宜のポンプ手段によりチップ１１３ａ内に所
定量吸引し、反応ライン部１１１を移動する反応容器１
０４に分注し、更に酵素標識抗体を収容する反応容器１
０４の酵素標識抗体を収容する筒状部から反応容器１０
４の他方の反応管に適宜のポンプ手段により酵素標識物
を吸引，分注して混合液を得る吸引分注部１１６ａと、
混合液を攪拌する攪拌部１１７と、混合液の反応物と未
反応物との分離を磁気的に行う磁気分離部１１８と、未
反応物を洗浄除去する洗浄部１１９と、基質液を収容す
る試薬収容部１１５より前記基質液を分注する吸引分注
攪拌部１１６ｂと、前記反応物と前記基質液の反応によ
り生ずる発光情報を光学的方法により測定する測定部１
２０と、反応ライン部１１１の終端部Ｅ近傍に配置され
反応容器１０４を排出する排出部１２１とを有している
。

【００５１】前記制御部１０５は、この装置１０１各部
を制御し１ステップ測定法，２ステップ測定法，ディレ
イ反応測定法及び希釈液を用いる２ステップ測定法その
他酵素免疫測定プログラムを記憶しているプログラムメ
モリ１２２と、測定部１２０が測定した測定情報に基づ
いて免疫情報を求めるための計算式等の情報を記憶して
いるメモリ１２３と、この装置各部の制御を司るＣＰＵ
１２４とを有している。またこの制御部１０５は、入力
部１０２の測定法選択釦の選択操作に基づく酵素免疫測
定法を実行し得るものである。

【００５２】

【発明の効果】本発明の方法は、上部に少なくとも二つ
の開口を有し、下方に筒状である容器を用い免疫反応に
より検体中の微量成分の検出を行うものである。本発明
によれば、各検出系の多項目の測定対象物に対し、簡便
にしかも迅速に測定することができかつ自動化された測
定機器に適用することができるため、臨床検査の分野に
大きな貢献をする。

【図面の簡単な説明】

【図１】三つの開口を有する容器の断面図である。

【図２】二つの開口を有する容器の断面図である。

【図３】同時２血清測定又は同時２項目測定に用いる三
つの開口を有する容器の断面図である。

【図４】四つの開口を有する容器の断面図である。

【図５】Ｂ／Ｆ分離操作を行うときの構成例を示すもの
である。

【符号の説明】

６は磁力発生装置である。

【図６】検出操作を行うときの構成例を示すものである
。

【符号の説明】

７は検出装置である。

【図７】本発明を実施する際に用いることができる装置
の概要構成図である。

【図８】粒子型、チューブ型、及びビーズ型の各固相を
用い、発光法によるＴＳＨの測定結果である。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　上部に少なくとも二つの開口を有し、
   下方に筒状である容器を用いてなる免疫測定法。
2. 【請求項２】　　少なくとも一つの筒状部は、他の筒状
   部よりも下方に長いことを特徴とする請求項（１）記載
   の方法。
3. 【請求項３】　　少なくとも筒状部の一つは、抗原又は
   抗体結合固相を入れるためのものである請求項（１）記
   載の方法。
4. 【請求項４】　　筒状部のいずれか一つは、血清又は希
   釈液を入れるためのものである請求項（１）記載の方法
   。
5. 【請求項５】　　筒状部のいずれか一つは、標識抗体を
   入れるためのものである請求項（１）記載の方法。
6. 【請求項６】　　固相が磁性粒子である請求項（３）記
   載の方法。
7. 【請求項７】　　容器の内壁に抗原又は抗体を結合した
   請求項（３）記載の方法。
8. 【請求項８】　　固相がビーズである請求項（３）記載
   の方法。
9. 【請求項９】　　酵素免疫測定法である請求項（１）記
   載の方法。