JPH04228073A - ペニシリンｇアシラーゼ、それをコードする遺伝子及び該酵素の製造方法 - Google Patents
ペニシリンｇアシラーゼ、それをコードする遺伝子及び該酵素の製造方法Info
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- JPH04228073A JPH04228073A JP3179436A JP17943691A JPH04228073A JP H04228073 A JPH04228073 A JP H04228073A JP 3179436 A JP3179436 A JP 3179436A JP 17943691 A JP17943691 A JP 17943691A JP H04228073 A JPH04228073 A JP H04228073A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【産業上の利用分野】本発明は、ペニシリンＧアシラー
ゼをコードする遺伝子、該遺伝子によりコードされたペ
ニシリンＧアシラーゼ及び該酵素の製造方法に関する。
ゼをコードする遺伝子、該遺伝子によりコードされたペ
ニシリンＧアシラーゼ及び該酵素の製造方法に関する。
【先行技術】ペニシリンＧアシラーゼ（ペニシリンアミ
ダーゼとも称されるベンジルペニシリンアミドヒドロラ
ーゼ、ＥＣ３．５．１．１１）は、ペニシリンＧ又は３
−デスアセトキシセファロスポリンＧを、半合成ペニシ
リン及びセファロスポリンの工業的生産の最も重要な中
間体であるフェニル酢酸と６−アミノペニシラン酸（６
−ＡＰＡ）又は７−アミノデスアセトキシセファロスポ
ラン酸（７−ＡＤＣＡ）のそれぞれに加水分解するのに
産業上使用されている酵素である。この酵素は、逆反応
、即ち６−ＡＰＡ及び７−ＡＤＣＡを有機エステルでＮ
−アシル化してそれぞれ対応するＮ−アセチル化ペニシ
リン及び３−セフェム化合物を産生する反応も触媒する
。Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ｅ．Ｊ．，ＭｉｃｒｏｂｉａｌＥ
ｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏ
ｎｓ中の研究、Ｅ．Ｈ．Ｒｏｓｅ（Ｅｄ．）．Ｅｃｏｎ
ｏｍｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５，４６７
−５５２（１９８０）；及びＰ．Ｂ．Ｍａｈａｊａｎ，
Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
１，８３−８６（１９８２）を参照のこと。ペニシリ
ンＧ及び３−デスアセトキシセファロスポリンＧの脱ア
シル化に有用なペニシリンＧアシラーゼ産生株として種
々のタイプの微生物が文献に提案されている。これらの
アシラーゼ産生株の例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ，Ｋｌｕｙｖｅｒａ ｃｉｔｒｏｐｈｉｌａ
及びＰｒｏｔｅｕｓ ｒｅｔｔｇｅｒｉ種のいくつか
の株である。Ａｌｃａｌｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉ
ｓの全細胞フラクション中のペニシリンＧアシラーゼ活
性が報告されていることも挙げられる（Ｃ．Ａ．Ｃｌａ
ｖｅｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
４７３３，２３７−２３８（１９６０））。しかしなが
ら、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓから
のこの活性を司る酵素は今まで報告されたことはない。 組換ＤＮＡ法の使用は、産業上使用されるペニシリンＧ
アシラーゼの生産レベルを上げることを可能にし（Ｍａ
ｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ． Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ． １，８３−８６（１９８２））、これら
の酵素のプロセッシングについての考察を拡大した（Ｓ
ｃｈｕｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４， ５７１３
−５７２７（１９８６）。Ｅ．ｃｏｌｉのペニシリンＧ
アシラーゼは、巨大な前駆体タンパク質として産生され
、この前駆体はさらに小さい（α）サブユニット及び大
きい（β）サブユニットを構成するペリプラスミック成
熟タンパク質にプロセッシングされることが判明した。 Ｋｌｕｙｖｅｒａ ｃｉｔｒｏｐｈｉｌａアシラーゼ
遺伝子をクローン化及び配列決定したところ、Ｅ．ｃｏ
ｌｉアシラーゼ遺伝子とよく一致していることが判明し
ている（Ｊ．Ｌ．Ｂａｒｂｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，
Ｇｅｎｅ ４９，６９−８０（１９８６））。Ｐｒｏ
ｔｅｕｓ ｒｅｔｔｇｅｒｉペニシリンＧアシラーゼ
遺伝子についても、小さなサブユニットと大きなサブユ
ニットが記載されている（Ｇ．Ｏ．Ｄａｕｍｙ ｅｔ
ａｌ．，Ｇｅｎｅ ４９，６９−８０（１９８６
）； スペイン特許出願Ｎｏ．８６０２９３３）。
ダーゼとも称されるベンジルペニシリンアミドヒドロラ
ーゼ、ＥＣ３．５．１．１１）は、ペニシリンＧ又は３
−デスアセトキシセファロスポリンＧを、半合成ペニシ
リン及びセファロスポリンの工業的生産の最も重要な中
間体であるフェニル酢酸と６−アミノペニシラン酸（６
−ＡＰＡ）又は７−アミノデスアセトキシセファロスポ
ラン酸（７−ＡＤＣＡ）のそれぞれに加水分解するのに
産業上使用されている酵素である。この酵素は、逆反応
、即ち６−ＡＰＡ及び７−ＡＤＣＡを有機エステルでＮ
−アシル化してそれぞれ対応するＮ−アセチル化ペニシ
リン及び３−セフェム化合物を産生する反応も触媒する
。Ｖａｎｄａｍｍｅ，Ｅ．Ｊ．，ＭｉｃｒｏｂｉａｌＥ
ｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏ
ｎｓ中の研究、Ｅ．Ｈ．Ｒｏｓｅ（Ｅｄ．）．Ｅｃｏｎ
ｏｍｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ５，４６７
−５５２（１９８０）；及びＰ．Ｂ．Ｍａｈａｊａｎ，
Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
１，８３−８６（１９８２）を参照のこと。ペニシリ
ンＧ及び３−デスアセトキシセファロスポリンＧの脱ア
シル化に有用なペニシリンＧアシラーゼ産生株として種
々のタイプの微生物が文献に提案されている。これらの
アシラーゼ産生株の例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ，Ｋｌｕｙｖｅｒａ ｃｉｔｒｏｐｈｉｌａ
及びＰｒｏｔｅｕｓ ｒｅｔｔｇｅｒｉ種のいくつか
の株である。Ａｌｃａｌｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉ
ｓの全細胞フラクション中のペニシリンＧアシラーゼ活
性が報告されていることも挙げられる（Ｃ．Ａ．Ｃｌａ
ｖｅｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
４７３３，２３７−２３８（１９６０））。しかしなが
ら、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓから
のこの活性を司る酵素は今まで報告されたことはない。 組換ＤＮＡ法の使用は、産業上使用されるペニシリンＧ
アシラーゼの生産レベルを上げることを可能にし（Ｍａ
ｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ． Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ． １，８３−８６（１９８２））、これら
の酵素のプロセッシングについての考察を拡大した（Ｓ
ｃｈｕｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １４， ５７１３
−５７２７（１９８６）。Ｅ．ｃｏｌｉのペニシリンＧ
アシラーゼは、巨大な前駆体タンパク質として産生され
、この前駆体はさらに小さい（α）サブユニット及び大
きい（β）サブユニットを構成するペリプラスミック成
熟タンパク質にプロセッシングされることが判明した。 Ｋｌｕｙｖｅｒａ ｃｉｔｒｏｐｈｉｌａアシラーゼ
遺伝子をクローン化及び配列決定したところ、Ｅ．ｃｏ
ｌｉアシラーゼ遺伝子とよく一致していることが判明し
ている（Ｊ．Ｌ．Ｂａｒｂｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，
Ｇｅｎｅ ４９，６９−８０（１９８６））。Ｐｒｏ
ｔｅｕｓ ｒｅｔｔｇｅｒｉペニシリンＧアシラーゼ
遺伝子についても、小さなサブユニットと大きなサブユ
ニットが記載されている（Ｇ．Ｏ．Ｄａｕｍｙ ｅｔ
ａｌ．，Ｇｅｎｅ ４９，６９−８０（１９８６
）； スペイン特許出願Ｎｏ．８６０２９３３）。
【発明の構成】本発明の一つの形態によれば、図１に示
す構造を実質的に有する、ペニシリンＧアシラーゼをコ
ードする遺伝子が提供される。遺伝子は好ましくはＡ．
ｆａｅｃａｌｉｓから得られるものである。本発明の別
の形態によれば、前記遺伝子を含むベクターが提供され
る。また該遺伝子の１以上のコピーを含む宿主系も提供
される。本発明はさらに、転写及び／又は翻訳調節配列
を含むレギュロンの制御下にあり、該調節配列の一方又
は両方がそれぞれ他の転写及び／又は翻訳調節配列に置
き換えられている遺伝子を提供する。これら後者の調節
配列は、同じ又は異なる生物から得られたものとするこ
とができる。本発明はさらに、上記に示した制御配列に
関して操作された、前記ペニシリンＧアシラーゼ遺伝子
を含むベクター、及び該ベクターを含む宿主を提供する
。該遺伝子の発現により得られたペニシリンＧアシラー
ゼ酵素は極めて良好な安定性と高い比活性を有する。 さらに本発明の別の形態によれば、前記ペニシリンＧア
シラーゼ酵素は、単離形態で提供される。大規模なアシ
ル化又は脱アシル化工程で使用する場合には固定化形態
で使用するのが好適である。本発明はさらに、ペニシリ
ンＧアシラーゼをコードされた形質転換宿主を培養し、
単離形態のペニシリンＧアシラーゼを回収することから
なるペニシリンＧアシラーゼの製造方法を提供する。こ
れら及びその他の実施態様を以下に詳細に説明する。 配列リストの簡単な説明 配列リスト１：Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａ
ｌｉｓのペニシリンＧアシラーゼ遺伝子のヌクレオチド
配列及び誘導された新規ｐａｃ酵素のアミノ酸配列。 配列リスト２：ｔａｃプロモーターのヌクレオチド配列
。 配列リスト３：ｔｒｐプロモーターのヌクレオチド配列
。 配列リスト４：ｐ７８プロモーターのヌクレオチド配列
配列リスト５：ｐｆ３プロモーターのヌクレオチド配列
特定の実施態様 新規なＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓペ
ニシリンＧアシラーゼ（ｐａｃ）酵素は、それ自体公知
の方法により単離することができる。例えば、Ａｌｃａ
ｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓを適当な培養培地
で増殖させることにより可能であり、培地は例えばｐＨ
６−８、特にｐＨ７で任意にインデューサーＫＰＡを含
む特にリン酸バッファーで緩衝化された緩衝溶液中の酵
母抽出物とすることができる。任意のＡｌｃａｌｉｇｅ
ｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ株を使用することができる
。酵素はそれ自体公知の方法で精製するが精製は好まし
くは、第１に例えば、エステル化セルロースで行い、次
に例えば特にヒドロキシアパタイトを使用したゲロクロ
マトグラフィーを使用する二段階で行うのが好ましい。 精製酵素は、好ましくは各サブユニットのＮＨ２−末端
の、ペプチドフラグメントのアミノ酸分析にかけること
ができる。決定されたアミノ酸配列から、該遺伝子配列
検出のためのプローブを得ることができる。Ａ．ｆａｅ
ｃａｌｉｓのペニシリン加水分解活性が精製ペニシリン
アシラーゼに存在することが初めて示され、該酵素は２
６ｋＤ及び５９ｋＤの大きさの２つのサブユニットのヘ
テロ２量体からなることが判明した。Ａ．ｆａｅｃａｌ
ｉｓ ｐａｃ遺伝子は、それ自体公知の方法でクロモ
ソームＤＮＡから同定することができる。該遺伝子は、
実質的に図１に示した構造を有する。図１に示した配列
とハイブリダイズすることができ、実質的に同じ構造の
酵素をコードする全ての相同遺伝子は、本発明に包含さ
れるものと理解される。ハイブリッド安定性についての
種々の因子の影響の分析から得られた下記式、Ｔｍ＝８
１＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｃｉ）＋０．４（％Ｇ＋Ｃ）
−６００／ｎ−１．５％不適合（Ａｕｓｕｂａｌ ｅ
ｔ ａｌ．、前出）ｎ＝プローブの最短鎖長Ｃｉ＝イ
オン強度（Ｍ）Ｇ＋Ｃ＝塩基組成は、ＤＮＡ−ＤＮＡハ
イブリダイゼーション法を使用して相同性のどのレベル
が検出できるかを決定するのに使用することができる。 従って、『実質的にその構造』という用語は、コンサー
バティブ突然変異を含む配列を包含し、そのような配列
では同じアミノ酸をコードするが、上記式に従いＤＮＡ
中３５％まで、典型的には１０％まで異なってもよい。 新規なＡ．ｆａｅｃａｌｉｓ ｐａｃ酵素のアミノ酸
配列と、明らかにされているＥ．ｃｏｌｉペニシリンＧ
アシラーゼのアミノ酸配列（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ
ｅｔ ａｌ、前出）との相同性の比較によれば、全体
的な相同性は４３％にすぎないことが判明した。さらに
、Ｋｌｕｙｖｅｒａ ｃｉｔｒｏｐｈｉｌａｐａｃ酵
素の公知のアミノ酸配列（Ｂａｒｂｅｒｏ ｅｔ
ａｌ．，前出）との相同性も４４％にすぎなかった。Ａ
．ｆａｅｃａｌｉｓ ｐａｃ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ
中それ自身のプロモーター及び／又は誘導可能ｔａｃ又
はｔｒｐプロモーターの指令下に発現させることができ
る（第４図及び第５図参照）。ペニシリンＧアシラーゼ
生産の結果は極めて良好であった。このｐａｃ遺伝子を
ｔａｃプロモーターと共に使用した場合、生産は当初Ａ
．ｆａｅｃａｌｉｓ株と同等であったが、後者の場合は
インデューサーとしてフェニル酢酸カリウムが必要であ
った。ｔｒｐプロモーターの制御下にあるＡ．ｆａｅｃ
ａｌｉｓ ｐａｃ遺伝子を有するＥ．ｃｏｌｉ株は、
何の誘導もなしに、上記の株の５倍高いペニシリンＧア
シラーゼ産生を示す。 これにより、両株における、高価なフェニル酢酸カリウ
ムインデューサーを使用した誘導を避けることができる
。相同ＤＮＡのみを有する生産株を得るために、Ａ．ｆ
ａｅｃａｌｉｓ自体への形質転換を行った。二つの異な
る方法により、Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓへのＤＮＡ形質転
換を満足に行うことができた。先ず第１に、Ｅ．ｃｏｌ
ｉからＡ． ｆａｅｃａｌｉｓへの広範囲宿主プラス
ミドの抱合体転移を行うことができた。第２に、ＲＳＦ
１０１０レプリコンに基づくプラスミドによるＡ．
ｆａｅｃｌｉｉｓのエレエクトロポレーションをおこな
うことができた（ＢＩＯＲＡＤ−ジーンパルサー）。Ａ
．ｆａｅｃａｌｉｓ 遺伝子のクローニングに際して
は、種々の転写配列を使用することができる。第１に、
Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ ｐａｃ遺伝子を、それ自体の
プロモーターの制御下にあるＡ．ｆａｅｃａｌｉｓ中に
クローン化できる。外部ｐａｃ遺伝子を持たないＡ．ｆ
ａｅｃａｌｉｓと比較して、ペニシリンＧアシラーゼの
生産は非常に高くなり、フェニル酢酸カリウム誘導を殆
ど必要としない。第２に、インデューサーとは別にＥ．
ｃｏｌｉ ｔｒｐプロモーターを使用すると、同様に
高い量のペニシリンＧアシラーゼが得られた。第３に、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａファ
ージｐｆ３から得られた二つの発現エレメント、プロモ
ーターｐｆ３及びｐ７８（Ｌｕｉｔｅｎ，ＰｈＤ ｔ
ｈｅｓｉｓ，Ｎｉｊｍｅｇｅｎ（１９８６））を使用す
ると、ペニシリンＧアシラーゼの産生は、それ自体の又
はＥ．ｃｏｌｉ ｔｒｐプロモーターの制御下にある
外部ｐａｃ遺伝子を有するＡ．ｆａｅｃａｌｉｓで得ら
れたものよりもいくらか低かったが、それでも外部ｐａ
ｃ遺伝子を有しないＡ．ｆａｅｃａｌｉｓ株と比較する
と改善されており、フェニル酢酸カリウム誘導に対する
依存はずっと低い。先行技術は、ペニシリンＧアシラー
ゼを単離形態で製造するためにＡ．ｆａｅｃａｌｉｓを
使用することを開示していない。また、新規なＡ．ｆａ
ｅｃａｌｉｓのペニシリンＧアシラーゼ酵素の、Ｅ．ｃ
ｏｌｉのそれに対する改良された性質、あるいは組換Ｄ
ＮＡ法を使用してＡ．ｆａｅｃａｌｉｓからのペニシリ
ンＧアシラーゼの産生を増加させ容易にすることについ
てはいずれも今までの先行技術には提案されていない。 特にグラム陰性微生物、好ましくはＡｌｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓ又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の微生物、より好ま
しくはＡ．ｆａｅｃａｌｉｓ中にクローン下されたＡ．
ｆａｅｃａｌｉｓ ｐａｃ遺伝子を使用して産生され
るペニシリンＧアシラーゼは、極めて多量に産生される
。さらに、該ペニシリンＧアシラーゼの安定性及び特に
比活性は、今まで公知のペニシリンアシラーゼのものよ
りもはるかに高い。Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓの精製調製物
も得られ、これは現在公知のペニシリンアシラーゼのい
ずれよりも高い、好ましい基質ペニシリンＧに対する比
活性を示す。 さらに、この精製調製物をＡ．ｆａｅｃａｌｉｓペニシ
リンＧアシラーゼのＥ．ｃｏｌｉペニシリンアシラーゼ
と比較した温度安定性を測定するのに使用した。Ａ．ｆ
ａｅｃａｌｉｓペニシリンＧアシラーゼの安定性は、Ｅ
．ｃｏｌｉペニシリンＧアシラーゼのそれよりも有意に
優れており、工業的条件下で長期間使用することができ
る。本発明はさらに、工業的過程において好ましく使用
される、固定化形態のペニシリンＧアシラーゼを提供す
る。その上に酵素を固定するキャリアーは、典型的には
、任意にキトサンで架橋されたゼラチン、酸化アルミニ
ウム、酸化ケイ素、イオン交換樹脂、アクリレートビー
ズ等であり、例えばＥｕｐｅｒｇｉｔ（商標）である。 以下の実施例により、本発明をさらに説明する。 材料及び方法 アシラーゼ遺伝子のクローニング及び検出全体的なクロ
ーニング方法は、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．
（１９８２及び１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）又はＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ
ａｌ．（１９８７，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏ
ｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎ
ｓ Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ）又はＢ．Ｐｅｒｂａ
ｌ（１９８８，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄ
ｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
，第２版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏ
ｎｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されて
いるように行った。これらのハンドブックは、ｒＤＮＡ
分子の構築及び増幅のプロトコール、遺伝子ライブラリ
ーの作製方法及び部位特異的又はランダムなＤＮＡミュ
ーテーション惹起のプロトコールについて詳細に記載し
ている。ＤＮＡ操作に使用した酵素は、市場の供給者か
ら購入しその説明に従い使用した。プラスミド及びＥ．
ｃｏｌｉクローニング宿主は、Ｔｈｅ Ｐｈａｂａｇ
ｅｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｕｔｒｅｃｈｔ）のよ
うな公共のカルチュアコレクションから入手した。 培地 フェニルアセチルＬ−ロイシン（ｆａｌ）の選択培地は
、（Ｇａｒｃｉａ ｅｔａｌ 同書）に記されてい
るように調製した。最小プレートは以下の通りある：Ｍ
６３最小アガー、２ｇ／ｌグルコース、１ｍｇ／ｌ
チアミン、１０ｍｇ／ｌＬ−プロリン及び適当な抗生物
質（５０μｇ／ｍｌ クロラムフェニコール（ｃａｐ
）又は２５μｇ／ｍｌアンピシリン（ａｍｐ））。アシ
ルＬ−ロイシンの存在下で唯一増殖したＥ．ｃｏｌｉＨ
Ｂ１０１（Ｌｅｕ−）の形質転換体がアシラーゼ遺伝子
を有しているものとした。 最小Ｅ＊ 培地：１６ｇ／ｌ Ｄｉｆｃｏ アガ
ー、芽胞因子（ｓｐｏｒｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）０．２
ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ，１０ｇ／ｌ ＫＨ
２ＰＯ４，３．５ｇ／ｌ Ｎａ（ＮＨ４）ＨＰＯ４
１．６ｇ／ｌクエン酸ナトリウム４ｘＬＢＣ
培地 酵母エキス２０ｇ／ｌ， バクトトリプトン４０ｇ／
ｌ，ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ，ｃａｓ アミノ酸（ｃ
ａｓａｍｏｎｏａｃｉｄ）４ｇ／ｌ， バシルドン０
．２５ｇ／ｌ，（消泡剤８６−０１３，Ｂａｓｉｌｄｏ
ｎ ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ），ｐ
Ｈ７．０。ＡＦ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃ
ａｌｉｓ）培地酵母エキス１５ｇ／ｌ，Ｎａ２ＨＰＯ４
．２Ｈ４Ｏ ４．５ｇ／ｌ，ＫＨ２ＰＯ４ ３．４
ｇ／ｌ，ｐＨ７．０（誘導の場合：フェニル酢酸カリウ
ム（ＫＰＡ）１．０ｇ／ｌ） ２ｘＴＹ 培地 １６ｇ／ｌ バクトトリプトン，１０ｇ／ｌ 酵母
エキス，５ｇ／ｌ ＮａＣｌ。フェニルアセチルロイ
シンはＬＧＳＳ，Ｔｒａｎｓｆｅｒ−ｂｕｒｅａｕ
Ｎｉｊｍｅｇｅｎから購入した。 Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ株ＡＴＣＣ １９０１８（ＮＣ
ＴＣ ４１５としても寄託）をＡ．ｆａｅｃａｌｉｓ
ｐａｃ遺伝子の供与株、及び組換プラスミドの宿主
として使用した。 Ｅ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０１，ＷＫ６ 及びＨＢ１０１
（Ｐｈａｂａｇｅｎ，Ｕｔｒｅｃｈｔ）を組換プラスミ
ドの宿主として使用した。実施例１ Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ ペニシリンアシラーゼの精製
及び特性化 Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ株ＡＴＣＣ １９０１８をＡＦ
培地で増殖させた。細胞を遠心分離により回収し、下記
のバッファー：Ｔｒｉｓ ０．１Ｍ ｐＨ８．０；
ＥＤＴＡ ０．２ｍＭ；リゾチーム０．０２ｍｇ／ｍ
ｌに再懸濁し、３０℃で２時間インキュベートした。細
胞断片は遠心分離により除去した。ペニシリンＧアシラ
ーゼ（ｐａｃ）を２段階で精製した。最初のものは、カ
ルボキシメチルセルロース（ＣＭ−５２Ｗｈａｔｍａｎ
）により得た。第２のものは、ヒドロキシアパタイトゲ
ルクロマトグラフィー（Ｂｉｏｇｅｌ ＨＴＰ，Ｂｉ
ｏｒａｄ）を通して混入タンパク質を除去することによ
り得た。得られた純粋なｐａｃは、二つの異なるサブユ
ニットからなることが示された。この小サブユニット（
α）と大サブユニット（β）のＮＨ２−末端アミノ酸分
析を行った。結果は以下の通りである。 サブユニットα（２６ ＫＤａ） ＮＨ２−Ｑ−Ｘ
−Ｑ−Ｘ−Ｖ−Ｅ−Ｍ−Ｘ−Ｔ サブユニットβ（５９ ＫＤａ） ＮＨ２−Ｓ−Ｎ
−Ｌ−Ｗ−Ｓ−Ｔ−Ｘ−Ｐ−Ｅ−Ｘ−Ｖ 実施例２ Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ ペニシリンアシラーゼ遺伝子
のクローニング Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ（ＡＴＣＣ １９０１８）のク
ロモソームＤＮＡを単離し、Ｓａｕ３Ａにより部分的に
消化した。４ｋｂから７ｋｂの範囲のフラクションを精
製しベクターｐＡＣＹ１８４中に結合し、これをＢａｍ
ＨＩで消化した。ＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
中に形質転換し、ｆａｌ−プレート上にプレート化した
（方法の項参照）。二つの陽性クローンｐＡＦ１とｐＡ
Ｆ２が同定された。これらのクローンは、Ｓｅｒｒａｔ
ｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ オーバーレイ法（Ｍ
ｅｅｖｏｏｔｉｓｏｍ，ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ
．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５，
３７２−３７８（１９８７））による試験でも陽性であ
った。ｐＡＦ１プラスミドの６．４ｋｂインサートを図
１に示した。該遺伝子の位置決定は、Ａ．ｆａｅｃａｌ
ｉｓ ｐａｃのβサブユニットのＮＨ２−末端配列に
ついて設計したオリゴヌレオチドを使用して行った。下
記のオリゴヌクレオチドをｐＡＦ１インサート上のハイ
ブリダイゼーションプローブとして使用した：ＡＧＣ
ＡＡＣ ＣＴＧ ＴＧＧ ＡＧＣ Ａ／Ｃ
Ｃ／Ｇ Ｃ ＴＧＣＣＣＧ ＧＡＧ ＴＧＣ
ＧＴ制限地図上のハイブリダイゼーションシグナル
の位置から、Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ ｐａｃ遺伝子の
方向を決定した（図１）。 実施例３ Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ ペニシリンアシラーゼの配列
決定 前記６．４ｋｂ インサートの３．９ｋｂ Ｓａｕ
３Ａ−ＮｄｅＩサブクローンがｐａｃ活性を与え、３．
１ｋｂ Ｓａｕ３Ａ−Ｓｐｈ１フラグメントは非活性
であることが示された（図１）。３．９ｋｂインサート
のＤＮＡ配列は、ｐＴＺ１８Ｒ及びｐＴＺ１９Ｒ（Ｐａ
ｒｍａｃｉａ）中の適当なフラグメントのデオキシ配列
決定により行った。Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ ｐａｃを
コードするＤＮＡ配列及び得られるアミノ酸配列を配列
リスト１に示した。得られたアミノ酸配列から、Ａ．ｆ
ａｅｃａｌｉｓ ｐａｃは単一の大ペプチド鎖として
コードされ、これがプロセッシングを受けて二つの異な
るサブユニット、即ちα及びβとなると結論される。該
前駆体の５’部位に、該酵素のペリプラズムへのトラン
スロケーションに関わる典型的なシグナル配列がみられ
る。 実施例４ Ｅ．ｃｏｌｉにおけるペニシリンアシラーゼの発現プラ
スミドｐＡＦ１をＳａｌＩで消化し、４．８ｋｂフラグ
メントを精製した。該フラグメントを、ＳａｌＩ直線化
ベクターｐＭＣＴ−Ｎｄｅに結合した。この後者のベク
ターは、プラスミドｐＭｃ５−８（ＥＰ−Ａ−０３５１
０２９）から、ｔａｃプロモーターを含むフラグメント
、続いてＲＢＳ 部位及びＮｄｅＩクローニング部位
をインサートすることにより構築した（図２）。Ｅ．ｃ
ｏｌｉＨＢ１０１中に形質転換した後、得られたプラス
ミドｐＭｃＴＡＦ１Ａ（図３）は、それ自体のプロモー
ター及び／又は誘導可能ｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，８０，２１（１９８３））の作用下にｐ
ａｃを発現する。ｐａｃの発現レベルをさらに改善する
ために、二つの強力なＥ．ｃｏｌｉ プロモーターを
正確な癒合（ｆｕｓｉｏｎ）によりアシラーゼ出発コド
ンにクローン化した。このために、プラスミドｐＭｃＴ
ＡＦ１Ａのオリゴヌクレオチド部位指向性突然変異誘発
（Ｓｔａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）
を使用してＮｄｅＩ部位をＡＴＧ出発コドンに構築し、
プラスミドｐＭｃＴＡＦ１ＡＮｄｅを得た。このプラス
ミドをＮｄｅＩで消化して再度環化し、ｔａｃプロモー
ターをアシラーゼ遺伝子の前に正確に位置させた（プラ
スミドｐＭｃＡＦｔａｃ）。他のプロモーターをインサ
ートするために、ｐＭｃＴＡＦ１ＮｄｅをＥｃｏＲＩ及
びＮｄｅＩで消化し、大フラグメントをアガロースゲル
上で精製した。トリプトファンプロモーターフラグメン
トを、６合成オリゴヌクレオチドを使用してこのｐＭｃ
ＴＡＦ１ＡＮｄｅの精製ＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩフラグメ
ントにインサートした。これらのプロモーターのＤＮＡ
配列は、配列リスト２及び３に、またこれらのプロモー
ターの構造を図４及び図５にそれぞれ示した。これらの
プロモーター構築物をＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１中に
形質転換し、ｐａｃの発現について試験した。表１は、
Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ１９０１８の発現レ
ベルと比較した結果を示している。イソプロピルチオβ
−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）によるｔａｃプロモーター
の誘導及びインドールアクリル酸（ＩＡＡ）によるｔｒ
ｐプロモーターの誘導も試験した。 実施例５ Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ 中におけるペニシリンアシラ
ーゼの発現 Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ 中への遺伝情報の安定な転移
を可能にするため、ＤＮＡトランスフォーメーション系
及び安定なクローニングベクターを研究する必要があっ
た。驚くべきことに、Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｇｅｎｅ １８，２８９−２９６（１９８２）
に記載された方法を下記の改変を加えて使用すると、プ
ラスミドｐＫＴ２４８（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １６，２３７−２４７（１
９８１））のＡ．ｆａｅｃａｌｉｓへの３世代交配（ｔ
ｒｉｐａｒｅｎｔａｌ ｍａｔｉｎｇ）が可能である
ことが判明した。−ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３
（Ｆｉｇｕｒｓｋｉ ＆ Ｈｅｌｉｎｓｋｉ，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６，１６４８（
１９７９））を有するＥ．ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１を
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＫＴ２４８）及びＡ．
ｆａｃａｌｉｓ 感受性株と２ｘＴＹアガープレート
上で混合した。−プレートを３０℃で一晩インキュベー
トし、コンジュゲーションを生起させた。−クエン酸塩
、芽胞因子及び選択抗生物質量（５０ μｇ／ｍｌ）
及びｃａｐ（２５ μｇ／ｍｌ）を含む最小Ｅ＊培地
からなる選択アガープレートに、前記コンジュゲーショ
ンプレートをレプリカした。３０℃一晩のインキュベー
トを行う。栄養要求マーカーによりＥ．ｃｏｌｉ 株
について逆選択する。次にＡ．ｆａｅｃａｌｉｓ コ
ロニーを３００ μｌ／ｍｌストレプトマイシンを含
む２ｘＴＹプレート上に展開する。Ａ．ｆａｅｃａｌｉ
ｓ ｐａｃ遺伝子のサブクローニングをプラスミドｐ
ＫＴ２４８中の単一のＳａａｌＩ部位に行った。プラス
ミドｐＡＦ１のＴｔｈＩＩＩ−ＨｐａＩフラグメントを
単離し、クレノーポリメラーゼにより充填した。直線化
したｐＫＴ２４８のＳａｌＩ部位もブラント化し、Ｅ．
ｃｏｌｉ ＨＢ１０１中への形質転換及びｆａｌプレ
ート上での選択によりプラスミドｐＫＴＡＦＡ（図６）
を得た。このプラスミドを単離した後、上述した三世代
交配法によりＡ．ｆａｅｃａｌｉｓ 中に移した。得
られた株をＡ．ｆａｅｃａｌｉｓ 増殖培地と共に振
盪フラスコ中で増殖させ、当初の株と比較した。表２か
ら判るように、ｐＫＴＡＦＡを有する株におけるｐａｃ
産生は高度に改善されている。さらに、インデューサー
ＫＰＡがなくても高い産生が得られることが判る。これ
により工業用培養培地から高価なインデューサーＫＰＡ
を除外することができる。 ｐａｃ遺伝子の前にある非均一プロモーターを試験する
ために、ｐＭｃＡＦｔｒｐ，ｐＭｃＡＦｐｆ３及びｐＭ
ｃＡＦｐ７８のそれぞれのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグ
メントを、ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ直線化ベクターｐＪＲ
Ｄ２１５（Ｄａｖｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎ
ｅ ５１，２７５−２８０（１９８７））中にサブク
ローン化した。ｐＪＲＤＡＦｔｒｐ，ｐＪＲＤＡＦｐｆ
３及びｐＪＲＤＡＦｐ７８としてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ
１０１ 中に得られた３つのプロモーター構築物を次
にＡ．ｆａｅｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ １９０１８中
に移した。これらのプラスミドからのｐａｃの発現をＫ
ＰＡの存在下及び非存在下に試験した（表２）。 実施例６ Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ ペニシリンアシラーゼの安定
性以下の手順を使用して、Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ ペ
ニシリンアシラーゼ及びＥ．ｃｏｌｉ ペニシリンア
シラーゼを温度安定性について試験した：１００ｍＭリ
ン酸ナトリウム，ｐＨ７．５溶液中、酵素溶液を種々の
温度で５分間インキュベートする。５０ｍＭペニシリン
Ｇを基質として３５℃で残存活性を測定した。５分後に
、１００％，５０％及び０％活性を示す温度を決定した
。表２から、Ａ．ｆａｅｃｌｉｓ 酵素は、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ 酵素よりも有意に安定であることが判る。
す構造を実質的に有する、ペニシリンＧアシラーゼをコ
ードする遺伝子が提供される。遺伝子は好ましくはＡ．
ｆａｅｃａｌｉｓから得られるものである。本発明の別
の形態によれば、前記遺伝子を含むベクターが提供され
る。また該遺伝子の１以上のコピーを含む宿主系も提供
される。本発明はさらに、転写及び／又は翻訳調節配列
を含むレギュロンの制御下にあり、該調節配列の一方又
は両方がそれぞれ他の転写及び／又は翻訳調節配列に置
き換えられている遺伝子を提供する。これら後者の調節
配列は、同じ又は異なる生物から得られたものとするこ
とができる。本発明はさらに、上記に示した制御配列に
関して操作された、前記ペニシリンＧアシラーゼ遺伝子
を含むベクター、及び該ベクターを含む宿主を提供する
。該遺伝子の発現により得られたペニシリンＧアシラー
ゼ酵素は極めて良好な安定性と高い比活性を有する。 さらに本発明の別の形態によれば、前記ペニシリンＧア
シラーゼ酵素は、単離形態で提供される。大規模なアシ
ル化又は脱アシル化工程で使用する場合には固定化形態
で使用するのが好適である。本発明はさらに、ペニシリ
ンＧアシラーゼをコードされた形質転換宿主を培養し、
単離形態のペニシリンＧアシラーゼを回収することから
なるペニシリンＧアシラーゼの製造方法を提供する。こ
れら及びその他の実施態様を以下に詳細に説明する。 配列リストの簡単な説明 配列リスト１：Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａ
ｌｉｓのペニシリンＧアシラーゼ遺伝子のヌクレオチド
配列及び誘導された新規ｐａｃ酵素のアミノ酸配列。 配列リスト２：ｔａｃプロモーターのヌクレオチド配列
。 配列リスト３：ｔｒｐプロモーターのヌクレオチド配列
。 配列リスト４：ｐ７８プロモーターのヌクレオチド配列
配列リスト５：ｐｆ３プロモーターのヌクレオチド配列
特定の実施態様 新規なＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓペ
ニシリンＧアシラーゼ（ｐａｃ）酵素は、それ自体公知
の方法により単離することができる。例えば、Ａｌｃａ
ｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓを適当な培養培地
で増殖させることにより可能であり、培地は例えばｐＨ
６−８、特にｐＨ７で任意にインデューサーＫＰＡを含
む特にリン酸バッファーで緩衝化された緩衝溶液中の酵
母抽出物とすることができる。任意のＡｌｃａｌｉｇｅ
ｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ株を使用することができる
。酵素はそれ自体公知の方法で精製するが精製は好まし
くは、第１に例えば、エステル化セルロースで行い、次
に例えば特にヒドロキシアパタイトを使用したゲロクロ
マトグラフィーを使用する二段階で行うのが好ましい。 精製酵素は、好ましくは各サブユニットのＮＨ２−末端
の、ペプチドフラグメントのアミノ酸分析にかけること
ができる。決定されたアミノ酸配列から、該遺伝子配列
検出のためのプローブを得ることができる。Ａ．ｆａｅ
ｃａｌｉｓのペニシリン加水分解活性が精製ペニシリン
アシラーゼに存在することが初めて示され、該酵素は２
６ｋＤ及び５９ｋＤの大きさの２つのサブユニットのヘ
テロ２量体からなることが判明した。Ａ．ｆａｅｃａｌ
ｉｓ ｐａｃ遺伝子は、それ自体公知の方法でクロモ
ソームＤＮＡから同定することができる。該遺伝子は、
実質的に図１に示した構造を有する。図１に示した配列
とハイブリダイズすることができ、実質的に同じ構造の
酵素をコードする全ての相同遺伝子は、本発明に包含さ
れるものと理解される。ハイブリッド安定性についての
種々の因子の影響の分析から得られた下記式、Ｔｍ＝８
１＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｃｉ）＋０．４（％Ｇ＋Ｃ）
−６００／ｎ−１．５％不適合（Ａｕｓｕｂａｌ ｅ
ｔ ａｌ．、前出）ｎ＝プローブの最短鎖長Ｃｉ＝イ
オン強度（Ｍ）Ｇ＋Ｃ＝塩基組成は、ＤＮＡ−ＤＮＡハ
イブリダイゼーション法を使用して相同性のどのレベル
が検出できるかを決定するのに使用することができる。 従って、『実質的にその構造』という用語は、コンサー
バティブ突然変異を含む配列を包含し、そのような配列
では同じアミノ酸をコードするが、上記式に従いＤＮＡ
中３５％まで、典型的には１０％まで異なってもよい。 新規なＡ．ｆａｅｃａｌｉｓ ｐａｃ酵素のアミノ酸
配列と、明らかにされているＥ．ｃｏｌｉペニシリンＧ
アシラーゼのアミノ酸配列（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ
ｅｔ ａｌ、前出）との相同性の比較によれば、全体
的な相同性は４３％にすぎないことが判明した。さらに
、Ｋｌｕｙｖｅｒａ ｃｉｔｒｏｐｈｉｌａｐａｃ酵
素の公知のアミノ酸配列（Ｂａｒｂｅｒｏ ｅｔ
ａｌ．，前出）との相同性も４４％にすぎなかった。Ａ
．ｆａｅｃａｌｉｓ ｐａｃ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ
中それ自身のプロモーター及び／又は誘導可能ｔａｃ又
はｔｒｐプロモーターの指令下に発現させることができ
る（第４図及び第５図参照）。ペニシリンＧアシラーゼ
生産の結果は極めて良好であった。このｐａｃ遺伝子を
ｔａｃプロモーターと共に使用した場合、生産は当初Ａ
．ｆａｅｃａｌｉｓ株と同等であったが、後者の場合は
インデューサーとしてフェニル酢酸カリウムが必要であ
った。ｔｒｐプロモーターの制御下にあるＡ．ｆａｅｃ
ａｌｉｓ ｐａｃ遺伝子を有するＥ．ｃｏｌｉ株は、
何の誘導もなしに、上記の株の５倍高いペニシリンＧア
シラーゼ産生を示す。 これにより、両株における、高価なフェニル酢酸カリウ
ムインデューサーを使用した誘導を避けることができる
。相同ＤＮＡのみを有する生産株を得るために、Ａ．ｆ
ａｅｃａｌｉｓ自体への形質転換を行った。二つの異な
る方法により、Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓへのＤＮＡ形質転
換を満足に行うことができた。先ず第１に、Ｅ．ｃｏｌ
ｉからＡ． ｆａｅｃａｌｉｓへの広範囲宿主プラス
ミドの抱合体転移を行うことができた。第２に、ＲＳＦ
１０１０レプリコンに基づくプラスミドによるＡ．
ｆａｅｃｌｉｉｓのエレエクトロポレーションをおこな
うことができた（ＢＩＯＲＡＤ−ジーンパルサー）。Ａ
．ｆａｅｃａｌｉｓ 遺伝子のクローニングに際して
は、種々の転写配列を使用することができる。第１に、
Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ ｐａｃ遺伝子を、それ自体の
プロモーターの制御下にあるＡ．ｆａｅｃａｌｉｓ中に
クローン化できる。外部ｐａｃ遺伝子を持たないＡ．ｆ
ａｅｃａｌｉｓと比較して、ペニシリンＧアシラーゼの
生産は非常に高くなり、フェニル酢酸カリウム誘導を殆
ど必要としない。第２に、インデューサーとは別にＥ．
ｃｏｌｉ ｔｒｐプロモーターを使用すると、同様に
高い量のペニシリンＧアシラーゼが得られた。第３に、
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａファ
ージｐｆ３から得られた二つの発現エレメント、プロモ
ーターｐｆ３及びｐ７８（Ｌｕｉｔｅｎ，ＰｈＤ ｔ
ｈｅｓｉｓ，Ｎｉｊｍｅｇｅｎ（１９８６））を使用す
ると、ペニシリンＧアシラーゼの産生は、それ自体の又
はＥ．ｃｏｌｉ ｔｒｐプロモーターの制御下にある
外部ｐａｃ遺伝子を有するＡ．ｆａｅｃａｌｉｓで得ら
れたものよりもいくらか低かったが、それでも外部ｐａ
ｃ遺伝子を有しないＡ．ｆａｅｃａｌｉｓ株と比較する
と改善されており、フェニル酢酸カリウム誘導に対する
依存はずっと低い。先行技術は、ペニシリンＧアシラー
ゼを単離形態で製造するためにＡ．ｆａｅｃａｌｉｓを
使用することを開示していない。また、新規なＡ．ｆａ
ｅｃａｌｉｓのペニシリンＧアシラーゼ酵素の、Ｅ．ｃ
ｏｌｉのそれに対する改良された性質、あるいは組換Ｄ
ＮＡ法を使用してＡ．ｆａｅｃａｌｉｓからのペニシリ
ンＧアシラーゼの産生を増加させ容易にすることについ
てはいずれも今までの先行技術には提案されていない。 特にグラム陰性微生物、好ましくはＡｌｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓ又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の微生物、より好ま
しくはＡ．ｆａｅｃａｌｉｓ中にクローン下されたＡ．
ｆａｅｃａｌｉｓ ｐａｃ遺伝子を使用して産生され
るペニシリンＧアシラーゼは、極めて多量に産生される
。さらに、該ペニシリンＧアシラーゼの安定性及び特に
比活性は、今まで公知のペニシリンアシラーゼのものよ
りもはるかに高い。Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓの精製調製物
も得られ、これは現在公知のペニシリンアシラーゼのい
ずれよりも高い、好ましい基質ペニシリンＧに対する比
活性を示す。 さらに、この精製調製物をＡ．ｆａｅｃａｌｉｓペニシ
リンＧアシラーゼのＥ．ｃｏｌｉペニシリンアシラーゼ
と比較した温度安定性を測定するのに使用した。Ａ．ｆ
ａｅｃａｌｉｓペニシリンＧアシラーゼの安定性は、Ｅ
．ｃｏｌｉペニシリンＧアシラーゼのそれよりも有意に
優れており、工業的条件下で長期間使用することができ
る。本発明はさらに、工業的過程において好ましく使用
される、固定化形態のペニシリンＧアシラーゼを提供す
る。その上に酵素を固定するキャリアーは、典型的には
、任意にキトサンで架橋されたゼラチン、酸化アルミニ
ウム、酸化ケイ素、イオン交換樹脂、アクリレートビー
ズ等であり、例えばＥｕｐｅｒｇｉｔ（商標）である。 以下の実施例により、本発明をさらに説明する。 材料及び方法 アシラーゼ遺伝子のクローニング及び検出全体的なクロ
ーニング方法は、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．
（１９８２及び１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌ
ｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）又はＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ
ａｌ．（１９８７，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏ
ｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎ
ｓ Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ）又はＢ．Ｐｅｒｂａ
ｌ（１９８８，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄ
ｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
，第２版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏ
ｎｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されて
いるように行った。これらのハンドブックは、ｒＤＮＡ
分子の構築及び増幅のプロトコール、遺伝子ライブラリ
ーの作製方法及び部位特異的又はランダムなＤＮＡミュ
ーテーション惹起のプロトコールについて詳細に記載し
ている。ＤＮＡ操作に使用した酵素は、市場の供給者か
ら購入しその説明に従い使用した。プラスミド及びＥ．
ｃｏｌｉクローニング宿主は、Ｔｈｅ Ｐｈａｂａｇ
ｅｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｕｔｒｅｃｈｔ）のよ
うな公共のカルチュアコレクションから入手した。 培地 フェニルアセチルＬ−ロイシン（ｆａｌ）の選択培地は
、（Ｇａｒｃｉａ ｅｔａｌ 同書）に記されてい
るように調製した。最小プレートは以下の通りある：Ｍ
６３最小アガー、２ｇ／ｌグルコース、１ｍｇ／ｌ
チアミン、１０ｍｇ／ｌＬ−プロリン及び適当な抗生物
質（５０μｇ／ｍｌ クロラムフェニコール（ｃａｐ
）又は２５μｇ／ｍｌアンピシリン（ａｍｐ））。アシ
ルＬ−ロイシンの存在下で唯一増殖したＥ．ｃｏｌｉＨ
Ｂ１０１（Ｌｅｕ−）の形質転換体がアシラーゼ遺伝子
を有しているものとした。 最小Ｅ＊ 培地：１６ｇ／ｌ Ｄｉｆｃｏ アガ
ー、芽胞因子（ｓｐｏｒｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）０．２
ｇ／ｌ ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ，１０ｇ／ｌ ＫＨ
２ＰＯ４，３．５ｇ／ｌ Ｎａ（ＮＨ４）ＨＰＯ４
１．６ｇ／ｌクエン酸ナトリウム４ｘＬＢＣ
培地 酵母エキス２０ｇ／ｌ， バクトトリプトン４０ｇ／
ｌ，ＮａＣｌ １０ｇ／ｌ，ｃａｓ アミノ酸（ｃ
ａｓａｍｏｎｏａｃｉｄ）４ｇ／ｌ， バシルドン０
．２５ｇ／ｌ，（消泡剤８６−０１３，Ｂａｓｉｌｄｏ
ｎ ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ），ｐ
Ｈ７．０。ＡＦ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃ
ａｌｉｓ）培地酵母エキス１５ｇ／ｌ，Ｎａ２ＨＰＯ４
．２Ｈ４Ｏ ４．５ｇ／ｌ，ＫＨ２ＰＯ４ ３．４
ｇ／ｌ，ｐＨ７．０（誘導の場合：フェニル酢酸カリウ
ム（ＫＰＡ）１．０ｇ／ｌ） ２ｘＴＹ 培地 １６ｇ／ｌ バクトトリプトン，１０ｇ／ｌ 酵母
エキス，５ｇ／ｌ ＮａＣｌ。フェニルアセチルロイ
シンはＬＧＳＳ，Ｔｒａｎｓｆｅｒ−ｂｕｒｅａｕ
Ｎｉｊｍｅｇｅｎから購入した。 Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ株ＡＴＣＣ １９０１８（ＮＣ
ＴＣ ４１５としても寄託）をＡ．ｆａｅｃａｌｉｓ
ｐａｃ遺伝子の供与株、及び組換プラスミドの宿主
として使用した。 Ｅ．ｃｏｌｉ株ＪＭ１０１，ＷＫ６ 及びＨＢ１０１
（Ｐｈａｂａｇｅｎ，Ｕｔｒｅｃｈｔ）を組換プラスミ
ドの宿主として使用した。実施例１ Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ ペニシリンアシラーゼの精製
及び特性化 Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ株ＡＴＣＣ １９０１８をＡＦ
培地で増殖させた。細胞を遠心分離により回収し、下記
のバッファー：Ｔｒｉｓ ０．１Ｍ ｐＨ８．０；
ＥＤＴＡ ０．２ｍＭ；リゾチーム０．０２ｍｇ／ｍ
ｌに再懸濁し、３０℃で２時間インキュベートした。細
胞断片は遠心分離により除去した。ペニシリンＧアシラ
ーゼ（ｐａｃ）を２段階で精製した。最初のものは、カ
ルボキシメチルセルロース（ＣＭ−５２Ｗｈａｔｍａｎ
）により得た。第２のものは、ヒドロキシアパタイトゲ
ルクロマトグラフィー（Ｂｉｏｇｅｌ ＨＴＰ，Ｂｉ
ｏｒａｄ）を通して混入タンパク質を除去することによ
り得た。得られた純粋なｐａｃは、二つの異なるサブユ
ニットからなることが示された。この小サブユニット（
α）と大サブユニット（β）のＮＨ２−末端アミノ酸分
析を行った。結果は以下の通りである。 サブユニットα（２６ ＫＤａ） ＮＨ２−Ｑ−Ｘ
−Ｑ−Ｘ−Ｖ−Ｅ−Ｍ−Ｘ−Ｔ サブユニットβ（５９ ＫＤａ） ＮＨ２−Ｓ−Ｎ
−Ｌ−Ｗ−Ｓ−Ｔ−Ｘ−Ｐ−Ｅ−Ｘ−Ｖ 実施例２ Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ ペニシリンアシラーゼ遺伝子
のクローニング Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ（ＡＴＣＣ １９０１８）のク
ロモソームＤＮＡを単離し、Ｓａｕ３Ａにより部分的に
消化した。４ｋｂから７ｋｂの範囲のフラクションを精
製しベクターｐＡＣＹ１８４中に結合し、これをＢａｍ
ＨＩで消化した。ＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
中に形質転換し、ｆａｌ−プレート上にプレート化した
（方法の項参照）。二つの陽性クローンｐＡＦ１とｐＡ
Ｆ２が同定された。これらのクローンは、Ｓｅｒｒａｔ
ｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ オーバーレイ法（Ｍ
ｅｅｖｏｏｔｉｓｏｍ，ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ
．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２５，
３７２−３７８（１９８７））による試験でも陽性であ
った。ｐＡＦ１プラスミドの６．４ｋｂインサートを図
１に示した。該遺伝子の位置決定は、Ａ．ｆａｅｃａｌ
ｉｓ ｐａｃのβサブユニットのＮＨ２−末端配列に
ついて設計したオリゴヌレオチドを使用して行った。下
記のオリゴヌクレオチドをｐＡＦ１インサート上のハイ
ブリダイゼーションプローブとして使用した：ＡＧＣ
ＡＡＣ ＣＴＧ ＴＧＧ ＡＧＣ Ａ／Ｃ
Ｃ／Ｇ Ｃ ＴＧＣＣＣＧ ＧＡＧ ＴＧＣ
ＧＴ制限地図上のハイブリダイゼーションシグナル
の位置から、Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ ｐａｃ遺伝子の
方向を決定した（図１）。 実施例３ Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ ペニシリンアシラーゼの配列
決定 前記６．４ｋｂ インサートの３．９ｋｂ Ｓａｕ
３Ａ−ＮｄｅＩサブクローンがｐａｃ活性を与え、３．
１ｋｂ Ｓａｕ３Ａ−Ｓｐｈ１フラグメントは非活性
であることが示された（図１）。３．９ｋｂインサート
のＤＮＡ配列は、ｐＴＺ１８Ｒ及びｐＴＺ１９Ｒ（Ｐａ
ｒｍａｃｉａ）中の適当なフラグメントのデオキシ配列
決定により行った。Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ ｐａｃを
コードするＤＮＡ配列及び得られるアミノ酸配列を配列
リスト１に示した。得られたアミノ酸配列から、Ａ．ｆ
ａｅｃａｌｉｓ ｐａｃは単一の大ペプチド鎖として
コードされ、これがプロセッシングを受けて二つの異な
るサブユニット、即ちα及びβとなると結論される。該
前駆体の５’部位に、該酵素のペリプラズムへのトラン
スロケーションに関わる典型的なシグナル配列がみられ
る。 実施例４ Ｅ．ｃｏｌｉにおけるペニシリンアシラーゼの発現プラ
スミドｐＡＦ１をＳａｌＩで消化し、４．８ｋｂフラグ
メントを精製した。該フラグメントを、ＳａｌＩ直線化
ベクターｐＭＣＴ−Ｎｄｅに結合した。この後者のベク
ターは、プラスミドｐＭｃ５−８（ＥＰ−Ａ−０３５１
０２９）から、ｔａｃプロモーターを含むフラグメント
、続いてＲＢＳ 部位及びＮｄｅＩクローニング部位
をインサートすることにより構築した（図２）。Ｅ．ｃ
ｏｌｉＨＢ１０１中に形質転換した後、得られたプラス
ミドｐＭｃＴＡＦ１Ａ（図３）は、それ自体のプロモー
ター及び／又は誘導可能ｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．，８０，２１（１９８３））の作用下にｐ
ａｃを発現する。ｐａｃの発現レベルをさらに改善する
ために、二つの強力なＥ．ｃｏｌｉ プロモーターを
正確な癒合（ｆｕｓｉｏｎ）によりアシラーゼ出発コド
ンにクローン化した。このために、プラスミドｐＭｃＴ
ＡＦ１Ａのオリゴヌクレオチド部位指向性突然変異誘発
（Ｓｔａｎｓｓｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）
を使用してＮｄｅＩ部位をＡＴＧ出発コドンに構築し、
プラスミドｐＭｃＴＡＦ１ＡＮｄｅを得た。このプラス
ミドをＮｄｅＩで消化して再度環化し、ｔａｃプロモー
ターをアシラーゼ遺伝子の前に正確に位置させた（プラ
スミドｐＭｃＡＦｔａｃ）。他のプロモーターをインサ
ートするために、ｐＭｃＴＡＦ１ＮｄｅをＥｃｏＲＩ及
びＮｄｅＩで消化し、大フラグメントをアガロースゲル
上で精製した。トリプトファンプロモーターフラグメン
トを、６合成オリゴヌクレオチドを使用してこのｐＭｃ
ＴＡＦ１ＡＮｄｅの精製ＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩフラグメ
ントにインサートした。これらのプロモーターのＤＮＡ
配列は、配列リスト２及び３に、またこれらのプロモー
ターの構造を図４及び図５にそれぞれ示した。これらの
プロモーター構築物をＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１中に
形質転換し、ｐａｃの発現について試験した。表１は、
Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ１９０１８の発現レ
ベルと比較した結果を示している。イソプロピルチオβ
−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）によるｔａｃプロモーター
の誘導及びインドールアクリル酸（ＩＡＡ）によるｔｒ
ｐプロモーターの誘導も試験した。 実施例５ Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ 中におけるペニシリンアシラ
ーゼの発現 Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ 中への遺伝情報の安定な転移
を可能にするため、ＤＮＡトランスフォーメーション系
及び安定なクローニングベクターを研究する必要があっ
た。驚くべきことに、Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｇｅｎｅ １８，２８９−２９６（１９８２）
に記載された方法を下記の改変を加えて使用すると、プ
ラスミドｐＫＴ２４８（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １６，２３７−２４７（１
９８１））のＡ．ｆａｅｃａｌｉｓへの３世代交配（ｔ
ｒｉｐａｒｅｎｔａｌ ｍａｔｉｎｇ）が可能である
ことが判明した。−ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３
（Ｆｉｇｕｒｓｋｉ ＆ Ｈｅｌｉｎｓｋｉ，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６，１６４８（
１９７９））を有するＥ．ｃｏｌｉ ＭＣ１０６１を
Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１（ｐＫＴ２４８）及びＡ．
ｆａｃａｌｉｓ 感受性株と２ｘＴＹアガープレート
上で混合した。−プレートを３０℃で一晩インキュベー
トし、コンジュゲーションを生起させた。−クエン酸塩
、芽胞因子及び選択抗生物質量（５０ μｇ／ｍｌ）
及びｃａｐ（２５ μｇ／ｍｌ）を含む最小Ｅ＊培地
からなる選択アガープレートに、前記コンジュゲーショ
ンプレートをレプリカした。３０℃一晩のインキュベー
トを行う。栄養要求マーカーによりＥ．ｃｏｌｉ 株
について逆選択する。次にＡ．ｆａｅｃａｌｉｓ コ
ロニーを３００ μｌ／ｍｌストレプトマイシンを含
む２ｘＴＹプレート上に展開する。Ａ．ｆａｅｃａｌｉ
ｓ ｐａｃ遺伝子のサブクローニングをプラスミドｐ
ＫＴ２４８中の単一のＳａａｌＩ部位に行った。プラス
ミドｐＡＦ１のＴｔｈＩＩＩ−ＨｐａＩフラグメントを
単離し、クレノーポリメラーゼにより充填した。直線化
したｐＫＴ２４８のＳａｌＩ部位もブラント化し、Ｅ．
ｃｏｌｉ ＨＢ１０１中への形質転換及びｆａｌプレ
ート上での選択によりプラスミドｐＫＴＡＦＡ（図６）
を得た。このプラスミドを単離した後、上述した三世代
交配法によりＡ．ｆａｅｃａｌｉｓ 中に移した。得
られた株をＡ．ｆａｅｃａｌｉｓ 増殖培地と共に振
盪フラスコ中で増殖させ、当初の株と比較した。表２か
ら判るように、ｐＫＴＡＦＡを有する株におけるｐａｃ
産生は高度に改善されている。さらに、インデューサー
ＫＰＡがなくても高い産生が得られることが判る。これ
により工業用培養培地から高価なインデューサーＫＰＡ
を除外することができる。 ｐａｃ遺伝子の前にある非均一プロモーターを試験する
ために、ｐＭｃＡＦｔｒｐ，ｐＭｃＡＦｐｆ３及びｐＭ
ｃＡＦｐ７８のそれぞれのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩフラグ
メントを、ＥｃｏＲＩ，ＳａｌＩ直線化ベクターｐＪＲ
Ｄ２１５（Ｄａｖｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎ
ｅ ５１，２７５−２８０（１９８７））中にサブク
ローン化した。ｐＪＲＤＡＦｔｒｐ，ｐＪＲＤＡＦｐｆ
３及びｐＪＲＤＡＦｐ７８としてＥ．ｃｏｌｉ ＨＢ
１０１ 中に得られた３つのプロモーター構築物を次
にＡ．ｆａｅｃａｌｉｓ ＡＴＣＣ １９０１８中
に移した。これらのプラスミドからのｐａｃの発現をＫ
ＰＡの存在下及び非存在下に試験した（表２）。 実施例６ Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ ペニシリンアシラーゼの安定
性以下の手順を使用して、Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ ペ
ニシリンアシラーゼ及びＥ．ｃｏｌｉ ペニシリンア
シラーゼを温度安定性について試験した：１００ｍＭリ
ン酸ナトリウム，ｐＨ７．５溶液中、酵素溶液を種々の
温度で５分間インキュベートする。５０ｍＭペニシリン
Ｇを基質として３５℃で残存活性を測定した。５分後に
、１００％，５０％及び０％活性を示す温度を決定した
。表２から、Ａ．ｆａｅｃｌｉｓ 酵素は、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ 酵素よりも有意に安定であることが判る。
【図１】図１は、Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ ペニシリン
Ｇアシラーゼ遣伝子領域の形態地図を示す。ｐＡＦ１の
インサートが示されている。
Ｇアシラーゼ遣伝子領域の形態地図を示す。ｐＡＦ１の
インサートが示されている。
【図２】図２は、プラスミドｐＭｃＴＮｄｅの構造を示
す。
す。
【図３】図３は、プラスミドｐＭＣＴＡＦ１Ａの構造を
示す。
示す。
【図４】図４は、ｔａｃプロモーターの構造を示す。
【図５】図５は、ｔｒｐプロモーターの構造を示す。
【図６】図６は、プラスミドｐＫＴＡＦＡの構造を示す
。
。
【図７】図７は、ｐ７８プロモーターの構造を示す。
【図８】図８は、ｐｆ３プロモーターの構造を示す。
Claims (18)
- 【請求項１】 配列リスト１に記載のヌクレオチド配
列を実質的に有するペニシリンＧアシラーゼをコードす
る遺伝子。 - 【請求項２】 Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃ
ａｌｉｓから単離された請求項１記載の遺伝子。 - 【請求項３】 請求項１又は２記載のペニシリンＧア
シラーゼ遺伝子の転写調節配列。 - 【請求項４】 請求項１又は２記載のペニシリンＧア
シラーゼ遺伝子の翻訳調節配列。 - 【請求項５】 転写及び／又は翻訳調節配列を含むレ
ギュロンの制御下にある請求項１又は２記載の遺伝子で
あって、該調節配列の一方又は両方がそれぞれ同じ又は
異なる生物から得られた他の転写及び／又は翻訳調節配
列に置き換えられている前記遺伝子。 - 【請求項６】 請求項１、２又は５記載のペニシリン
Ｇアシラーゼ遺伝子を１以上含むベクター。 - 【請求項７】 ペニシリンＧアシラーゼ遺伝子の転写
配列がｔｒｐプロモーターで置換されている請求項６記
載のベクター。 - 【請求項８】 請求項６又は７記載のベクターを含む
形質転換宿主。 - 【請求項９】 グラム陰性微生物である請求項８記載
の形質転換宿主。 - 【請求項１０】微生物がＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属又は
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属のものである請求項９記載の
形質転換宿主。 - 【請求項１１】微生物がＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆ
ａｅｃａｌｉｓである請求項１０記載の形質転換宿主。 - 【請求項１２】請求項８から１１のいずれかに記載の形
質転換宿主を培養し、単離形態のペニシリンＧアシラー
ゼを回収することからなるペニシリンＧアシラーゼの製
造方法。 - 【請求項１３】請求項１から５のいずれかに記載の遺伝
子によりコードされたアミノ酸配列から実質的になる単
離された形態のペニシリンＧアシラーゼ。 - 【請求項１４】固定化された形態の請求項１３記載のペ
ニシリンＧアシラーゼ。 - 【請求項１５】（ｉ）請求項６又は７記載のＤＮＡベク
ターを調製し、 （ｉｉ）該ベクターで宿主を形質転換し、（ｉｉｉ）得
られた形質転換体をクローン化し選択することからなる
、宿主中でペニシリンＧアシラーゼを産生又はその産生
を増強する方法。 - 【請求項１６】グラム陰性の微生物を形質転換すること
を特徴とする請求項１５記載の方法。 - 【請求項１７】Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属又はＥｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ属の微生物を形質転換することを特徴と
する請求項１６記載の方法。 - 【請求項１８】Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａ
ｌｉｓを形質転換することを特徴とする請求項１７記載
の方法。
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