JPH04234821A - 酵素の利用およびデリバリー - Google Patents
酵素の利用およびデリバリーInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【産業上の利用分野】本発明は酵素を利用して所望の機
能を発揮させる技術およびその目的に適う製品に係る。 そのような機能の一例は口内微生物相に存在する微生物
種を攻撃（殺傷、ａｔｔａｃｋ）することである。本発
明では２種の酵素を利用するが、そのうちの一方はもう
一方の酵素に対する基質となる中間物質を発生させる酵
素である。もう一方の酵素は、この中間体を、ある標的
に対して活性をもつ物質に変換する。この一方の酵素と
して可能なひとつの例はグルコースオキシダーゼである
。この酵素は、グルコースが分子状酸素によってグルコ
ン酸に酸化される過程を触媒し、この過程で過酸化水素
が生成する。この場合もう一方の酵素はペルオキシダー
ゼとすることができ、これは、たとえば、ヨウ化物ドイ
オンなどのようなハロゲン化物との反応により次亜ヨウ
素酸塩を生成させる過程、またはチオシアン酸塩との反
応によりハイポチオシアン酸塩を生成させる過程によっ
て、過酸化水素をより強力な酸化状態の分子種に変換す
る機能を果たす。過酸化水素は細胞障害活性を示すがイ
ンビボでは急速に分解する。ペルオキシダーゼの作用に
よって生成する酸化種はさらに強い活性をもっているが
、インビボでの寿命が過酸化水素より短い。
能を発揮させる技術およびその目的に適う製品に係る。 そのような機能の一例は口内微生物相に存在する微生物
種を攻撃（殺傷、ａｔｔａｃｋ）することである。本発
明では２種の酵素を利用するが、そのうちの一方はもう
一方の酵素に対する基質となる中間物質を発生させる酵
素である。もう一方の酵素は、この中間体を、ある標的
に対して活性をもつ物質に変換する。この一方の酵素と
して可能なひとつの例はグルコースオキシダーゼである
。この酵素は、グルコースが分子状酸素によってグルコ
ン酸に酸化される過程を触媒し、この過程で過酸化水素
が生成する。この場合もう一方の酵素はペルオキシダー
ゼとすることができ、これは、たとえば、ヨウ化物ドイ
オンなどのようなハロゲン化物との反応により次亜ヨウ
素酸塩を生成させる過程、またはチオシアン酸塩との反
応によりハイポチオシアン酸塩を生成させる過程によっ
て、過酸化水素をより強力な酸化状態の分子種に変換す
る機能を果たす。過酸化水素は細胞障害活性を示すがイ
ンビボでは急速に分解する。ペルオキシダーゼの作用に
よって生成する酸化種はさらに強い活性をもっているが
、インビボでの寿命が過酸化水素より短い。
【従来技術の概要】細胞を殺傷するために酵素を利用す
ることはすでに提案されており、中には２種類の酵素を
利用しようとしたものもある。Ｋｎｏｗｌｅｓ ｅｔ
ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ， ５２，１４４
３（１９７３）には、標的細胞に結合することができる
抗体と化学的に結合したグルコースオキシダーゼを利用
することによって、これら選択的に除去したい細胞に対
する細胞殺傷活性を選択的に標的に作用させる（ｔａｒ
ｇｅｔｉｎｇ）ことが記載されている。ペルオキシダー
ゼとハロゲン化物の溶液を使用して細菌細胞を殺傷でき
ることが示されている。Ｏｋｕｄａ ｅｔ ａｌ，
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，
２７，６９０（１９８０）には、標的細胞に結合するこ
とができる抗体と化学的に結合したラクトペルオキシダ
ーゼおよびキサンチンオキシダーゼ（これは、少なくと
も主として、過酸化物より超酸化物を生成する）を利用
することが記載されている。９０分にわたるインビトロ
実験ではＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの生菌細
胞を減少させることができた。これは、ラクトペルオキ
シダーゼの溶液で得られた結果より１〜２のオーダーだ
け優れていた。
ることはすでに提案されており、中には２種類の酵素を
利用しようとしたものもある。Ｋｎｏｗｌｅｓ ｅｔ
ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａ
ｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ， ５２，１４４
３（１９７３）には、標的細胞に結合することができる
抗体と化学的に結合したグルコースオキシダーゼを利用
することによって、これら選択的に除去したい細胞に対
する細胞殺傷活性を選択的に標的に作用させる（ｔａｒ
ｇｅｔｉｎｇ）ことが記載されている。ペルオキシダー
ゼとハロゲン化物の溶液を使用して細菌細胞を殺傷でき
ることが示されている。Ｏｋｕｄａ ｅｔ ａｌ，
Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，
２７，６９０（１９８０）には、標的細胞に結合するこ
とができる抗体と化学的に結合したラクトペルオキシダ
ーゼおよびキサンチンオキシダーゼ（これは、少なくと
も主として、過酸化物より超酸化物を生成する）を利用
することが記載されている。９０分にわたるインビトロ
実験ではＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓの生菌細
胞を減少させることができた。これは、ラクトペルオキ
シダーゼの溶液で得られた結果より１〜２のオーダーだ
け優れていた。
【発明の概要】本発明においては、１種以上のビヒクル
（媒体としての賦形剤）が、 ｉ） ある標的に対して活性を有する物質を発生させ
るひとつの酵素と、この第一の酵素に対する基質となる
中間体を発生させる第二の酵素とからなる２種類の酵素
のうちの少なくとも１種と、 ｉｉ） 標的部位に結合する（ｂｉｎｄ）ことができ
る抗体または抗体断片の少なくとも１種とを、同一のビ
ヒクル中に、あるいは複数のビヒクル間に分配された形
で含有している。ここで、前記酵素の各々は前記抗体も
しくは抗体断片に結合している（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）
か、あるいは、ビヒクルが使用時に前記酵素を前記抗体
もしくは抗体断片に結合させる（ｂｉｎｄ）手段を含有
しており、その結果、使用時には前記酵素が互いに近接
して前記標的部位に結合する（ｃｏｕｐｌｅ）ようにな
っている。本発明によると、２種の酵素と標的はすべて
近接して保持されるため、これら２種類の酵素が互いに
共働して標的部位に近接した位置で活性物質、たとえば
寿命の短い酸化状態の分子種を発生させることができる
。本発明のひとつの局面は上記ビヒクルを含む製品にあ
る。もうひとつの局面はビヒクルの投与による酵素の搬
送（デリバリー）方法である。酵素は両方が１つのビヒ
クル中に含まれていてもよいし、または複数のビヒクル
（同じである必要はない）中に含まれていてもよい。 あるいは、一方の酵素がインビボで標的部位の近傍に存
在する物質であって、使用時に前記抗体または抗体断片
を介して標的部位に結合する（ａｔｔａｃｈ）ようにな
っていてもよい。こうすると、この酵素は他の酵素およ
び標的部位に近接した位置に濃縮されることになる。本
発明で使用する酵素は、過酸化水素を発生させるオキシ
ダーゼと、過酸化水素を基質として利用して、たとえば
次亜ハロゲン酸塩を生成するペルオキシダーゼとの組合
せとすることができる。この後者の酵素ではスーパーオ
キサイドラジカルとヒドロキシル基を生成することもで
きる。また、ペルオキシダーゼは、過酸化物を利用して
チオシアン酸塩をハイポチオシアン酸塩に変換すること
もできる。本発明では、特にグルコースオキシダーゼが
考えられる。別の可能な酵素はガラクトースオキシダー
ゼであり、これを使用するとヨーグルト中に天然に存在
するガラクトースを基質として利用することができる。 ホースラディッシュペルオキシダーゼは市販されており
、上記のオキシダーゼのいずれとも組合せて使用するこ
とができる。さらに別の可能性はラクトペルオキシダー
ゼである。本発明にはさまざまな応用が考えられる。 特に考えられる応用は歯肉の口内微生物相の菌種を攻撃
することである。ただし、特定の用途に限定されること
はない。口内微生物相は、広範な微生物種を含む複雑な
生態系である。これらの微生物種のひとつを標的部位と
して選択することができる。しかし、ひとつの種を標的
とすると、その効果として、この種とこれに近接して存
在する他の種の両方が攻撃される。したがって、歯垢内
に存在するひとつの種に向けて搬送（デリバリー）する
ことによって、細胞障害剤がこの歯垢に搬送され、歯垢
の形成に関与する種を含めて歯垢中に共に存在する種す
べてに対して作用することになる。これらの微生物によ
って産生される細胞外デキストラン自体も、デキストラ
ンに対する結合親和力をもつ抗体またはその断片を使用
すれば標的部位として利用できるであろう。ひとつの可
能な標的部位はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔ
ａｎｓである。これは歯垢の重大な一因として認められ
ており、無菌動物において単一菌感染とした場合臨床的
に齲食病巣を引き起こし得ることが示されている。Ｓ．
ｍｕｔａｎｓは食餌の炭水化物を利用して不溶性の多糖
マトリックスを合成する能力をもっており、このため、
歯の硬質表面への付着および定着（コロニー形成）が容
易になると共にエナメル質の溶解を引き起こし得る酸が
生成する。これらの特徴は重要な毒性決定因子（ｖｉｒ
ｕｌｅｎｃｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）として認識
されている。他の種および属も酸とプラーク（歯垢）の
両方を生成することが可能であり、さらには無菌動物に
おいて齲食を発生させ得ることが立証されているが、Ｓ
．ｍｕｔａｎｓはその酸と多糖の産生量が多いために齲
食の重大原因の少なくともひとつとして広く認められて
いる。標的種として選択できるその他の種はＳ．ｓａｎ
ｇｕｉｓ、Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓおよびＡ．ｎａｅｓｌ
ｕｎｄｉｉである。これらの菌種はすべて歯垢中に通常
認められる種のかなりの割合として存在している。これ
ら３種は出現頻度が高いので標的部位として好ましいと
思われる。他の応用は、歯周疾患の原因である歯肉下の
微生物相の種を攻撃することである。この標的種はＢａ
ｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓとするこ
とができるであろう。可能な美容用途は歯の染み・着色
の低下である。この応用では、次亜ハロゲン酸塩イオン
などのような漂白作用をもつ物質を生じる酵素を使用す
る。 標的部位は歯の表面である。本発明に従って酵素を標的
に結合させると歯の表面付近に酵素を局在化させるのに
役立つ。その結果、染みが存在し得る歯の表面に近いと
ころで漂白性物質が生成する。口内（歯）に応用する場
合はいずれも、本発明の製品中に使用するビヒクルは口
内での使用が許容できるものである必要があろう。たと
えば、口内局所使用に適したビヒクルを使用する。さら
に別の応用は、ヒトの腫瘍細胞、特に、放射線療法を受
けている患者の身体から一時的に取り出された骨髄中の
腫瘍細胞の攻撃である。
（媒体としての賦形剤）が、 ｉ） ある標的に対して活性を有する物質を発生させ
るひとつの酵素と、この第一の酵素に対する基質となる
中間体を発生させる第二の酵素とからなる２種類の酵素
のうちの少なくとも１種と、 ｉｉ） 標的部位に結合する（ｂｉｎｄ）ことができ
る抗体または抗体断片の少なくとも１種とを、同一のビ
ヒクル中に、あるいは複数のビヒクル間に分配された形
で含有している。ここで、前記酵素の各々は前記抗体も
しくは抗体断片に結合している（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）
か、あるいは、ビヒクルが使用時に前記酵素を前記抗体
もしくは抗体断片に結合させる（ｂｉｎｄ）手段を含有
しており、その結果、使用時には前記酵素が互いに近接
して前記標的部位に結合する（ｃｏｕｐｌｅ）ようにな
っている。本発明によると、２種の酵素と標的はすべて
近接して保持されるため、これら２種類の酵素が互いに
共働して標的部位に近接した位置で活性物質、たとえば
寿命の短い酸化状態の分子種を発生させることができる
。本発明のひとつの局面は上記ビヒクルを含む製品にあ
る。もうひとつの局面はビヒクルの投与による酵素の搬
送（デリバリー）方法である。酵素は両方が１つのビヒ
クル中に含まれていてもよいし、または複数のビヒクル
（同じである必要はない）中に含まれていてもよい。 あるいは、一方の酵素がインビボで標的部位の近傍に存
在する物質であって、使用時に前記抗体または抗体断片
を介して標的部位に結合する（ａｔｔａｃｈ）ようにな
っていてもよい。こうすると、この酵素は他の酵素およ
び標的部位に近接した位置に濃縮されることになる。本
発明で使用する酵素は、過酸化水素を発生させるオキシ
ダーゼと、過酸化水素を基質として利用して、たとえば
次亜ハロゲン酸塩を生成するペルオキシダーゼとの組合
せとすることができる。この後者の酵素ではスーパーオ
キサイドラジカルとヒドロキシル基を生成することもで
きる。また、ペルオキシダーゼは、過酸化物を利用して
チオシアン酸塩をハイポチオシアン酸塩に変換すること
もできる。本発明では、特にグルコースオキシダーゼが
考えられる。別の可能な酵素はガラクトースオキシダー
ゼであり、これを使用するとヨーグルト中に天然に存在
するガラクトースを基質として利用することができる。 ホースラディッシュペルオキシダーゼは市販されており
、上記のオキシダーゼのいずれとも組合せて使用するこ
とができる。さらに別の可能性はラクトペルオキシダー
ゼである。本発明にはさまざまな応用が考えられる。 特に考えられる応用は歯肉の口内微生物相の菌種を攻撃
することである。ただし、特定の用途に限定されること
はない。口内微生物相は、広範な微生物種を含む複雑な
生態系である。これらの微生物種のひとつを標的部位と
して選択することができる。しかし、ひとつの種を標的
とすると、その効果として、この種とこれに近接して存
在する他の種の両方が攻撃される。したがって、歯垢内
に存在するひとつの種に向けて搬送（デリバリー）する
ことによって、細胞障害剤がこの歯垢に搬送され、歯垢
の形成に関与する種を含めて歯垢中に共に存在する種す
べてに対して作用することになる。これらの微生物によ
って産生される細胞外デキストラン自体も、デキストラ
ンに対する結合親和力をもつ抗体またはその断片を使用
すれば標的部位として利用できるであろう。ひとつの可
能な標的部位はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔ
ａｎｓである。これは歯垢の重大な一因として認められ
ており、無菌動物において単一菌感染とした場合臨床的
に齲食病巣を引き起こし得ることが示されている。Ｓ．
ｍｕｔａｎｓは食餌の炭水化物を利用して不溶性の多糖
マトリックスを合成する能力をもっており、このため、
歯の硬質表面への付着および定着（コロニー形成）が容
易になると共にエナメル質の溶解を引き起こし得る酸が
生成する。これらの特徴は重要な毒性決定因子（ｖｉｒ
ｕｌｅｎｃｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）として認識
されている。他の種および属も酸とプラーク（歯垢）の
両方を生成することが可能であり、さらには無菌動物に
おいて齲食を発生させ得ることが立証されているが、Ｓ
．ｍｕｔａｎｓはその酸と多糖の産生量が多いために齲
食の重大原因の少なくともひとつとして広く認められて
いる。標的種として選択できるその他の種はＳ．ｓａｎ
ｇｕｉｓ、Ａ．ｖｉｓｃｏｓｕｓおよびＡ．ｎａｅｓｌ
ｕｎｄｉｉである。これらの菌種はすべて歯垢中に通常
認められる種のかなりの割合として存在している。これ
ら３種は出現頻度が高いので標的部位として好ましいと
思われる。他の応用は、歯周疾患の原因である歯肉下の
微生物相の種を攻撃することである。この標的種はＢａ
ｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓとするこ
とができるであろう。可能な美容用途は歯の染み・着色
の低下である。この応用では、次亜ハロゲン酸塩イオン
などのような漂白作用をもつ物質を生じる酵素を使用す
る。 標的部位は歯の表面である。本発明に従って酵素を標的
に結合させると歯の表面付近に酵素を局在化させるのに
役立つ。その結果、染みが存在し得る歯の表面に近いと
ころで漂白性物質が生成する。口内（歯）に応用する場
合はいずれも、本発明の製品中に使用するビヒクルは口
内での使用が許容できるものである必要があろう。たと
えば、口内局所使用に適したビヒクルを使用する。さら
に別の応用は、ヒトの腫瘍細胞、特に、放射線療法を受
けている患者の身体から一時的に取り出された骨髄中の
腫瘍細胞の攻撃である。
本発明はさまざまな態様で実施できる。そのうちのいく
つかを添付の図面に例示した。 これらの図は標的と酵素の配置関係を概略的に示したも
のである。図中で、Ｇ．Ｏｘはグルコースオキシダーゼ
、ＨＲＰはホースラディッシュペルオキシダーゼ、ＰＥ
Ｉはポリエチレンイミンを表わしている。上述したよう
に、本発明のひとつの特徴は、２つの共働する酵素が標
的部位に結合するようになるということである。ひとつ
の可能性は、これらの酵素が標的部位に結合するが、互
いには直接連結されていない場合である。たとえば両方
の酵素が、それぞれ標的部位に結合することができる抗
体に結合（ａｔｔａｃｈ）しており、たとえば、共有結
合を介して結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）している場合で
ある。この様子を図１と図２に示した。図１で符号１０
は標的を示しており、これは抗原部位１２をもつＳ．ｍ
ｕｔａｎｓである。符号１４は抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓ抗
体を示しており、これにはグルコースオキシダーゼ（Ｇ
．Ｏｘ）が結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）している。 符号１６はホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）が結合している抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓ抗体を示す。 図２では、多重抗体を使用しているために化学結合の必
要性が回避されている。これは、本出願と同日付の別出
願の主題である。符号２０は第一の抗体を示しており、
これはラビットの抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓ抗体である。符
号２２はグルコースオキシダーゼが結合しているラビッ
トの抗グルコースオキシダーゼ抗体を示す。符号２４は
ホースラディッシュペルオキシダーゼが結合しているラ
ビットの抗−ホースラディッシュペルオキシダーゼを示
す。符号２６はヤギの抗−ラビットイムノグロブリンを
示しており、これは抗体２２と２４を抗−標的抗体２０
に結合する機能を果たす。もうひとつ別の可能性は、本
発明の製品が、少なくともその使用時に酵素を互いに連
結する手段を含んでいる場合である。この連結（ｌｉｎ
ｋｉｎｇ）手段は、標的部位に結合することができる抗
体とは別であるが、これに結合しているかまたは結合す
ることができるものとすることができる。酵素は、標的
部位（これは細胞であることもある）に直接結合する抗
体に化学結合（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｎｊｕｇａｔ
ｉｏｎ）以外の方法で互いに連結するのが好ましい。標
的特異的抗体は、酵素を互いに連結するのに使用できる
他の抗体やその他の材料より入手が容易でないのが普通
である。したがって、これらの標的特異的抗体は、酵素
と抗体を結合する共有結合を形成するのに使用される人
工的な化学反応に供さない方が好ましいと思われる。標
的部位または標的特異的抗体を介する以外の方法で酵素
を互いに連結すると、酵素の分配の制御が容易にできる
と共に２種類の酵素を互いに近接して配置させるのが容
易にできるようになるため、一方の酵素の生成物である
中間体が他方の酵素に近接して発生する。したがって、
連結手段は、酵素が結合しているかまたは結合すること
ができ、かつ標的部位に結合することができる抗体に結
合しているかまたは結合することができる、１種または
それ以上の仲介手段であると有利であり得る。また、連
結手段と標的部位に結合する抗体との結合（ａｔｔａｃ
ｈｍｅｎｔ）は、抗原−抗体結合によるのが好ましい。 これは標的特異的抗体との化学結合を避ける意味で有益
である。ひとつの好ましい態様では、標的部位に結合す
る最初に述べた抗体以外にさらに２種の抗体を使用する
。 この態様では、一方の酵素（たとえばホースラディッシ
ュペルオキシダーゼ）が、第一の抗体に結合することが
できる第二の抗体に結合（たとえば共有結合によって化
学結合）しており、他方の酵素（たとえばグルコースオ
キシダーゼ）が、第二の抗体に結合することができる第
三の抗体に結合している。この場合、連結手段は第二の
抗体と第三の抗体との組合せである。この態様の一例を
図３に示す。符号３０はＳ．ｍｕｔａｎｓ標的１０に対
するウシの抗体を意味する。符号３２は、ホースラディ
ッシュペルオキシダーゼが結合しておりウシの抗体３０
に結合するラビットの抗−ウシイムノグロブリンを意味
する。符号３４は、グルコースオキシダーゼが結合して
いるヒツジの抗−ラビットイムノグロブリンを意味する
。これは抗体３２に結合する。変形例を図４に示す。 これは図２と多少とも類似している。符号１０、１２、
２０および２２は図２と同じ意味をもっているが、符号
３６はホースラディッシュペルオキシダーゼが結合して
いるヤギの抗−ラビットイムノグロブリンを表わす。さ
らに別の可能性は、２種の酵素が、第一の抗体に結合し
ている単一の仲介手段に結合している場合である。この
ような仲介手段として考えられる一例は、化学反応によ
り酵素の結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）を可能にする化
学的官能性を備えた合成ポリマーである。適切なポリマ
ーはポリエチレンイミンであり、これは分枝の末端にア
ミノ基を有する分枝ポリマーである。このようなポリマ
ーに両方の酵素が共有結合を介して結合している複合体
（ｃｏｍｐｌｅｎ）は各種の方法で標的部位に結合する
ことができよう。ひとつの可能性は、本発明の製品が、
酵素の一方に対する抗体と、この抗体および標的部位に
結合する抗体の両方に結合することによってブリッジを
形成することができる別の抗体とを含んでいる場合であ
る。この場合を図５に例示する。これは図２の態様とよ
く似ている。もうひとつの可能性は、本発明の製品が、
酵素の一方に結合すると共に標的に結合する抗体にも結
合する能力を有する２つの特異性を備えた二重抗体複合
体（ｄｏｕｂｌｅａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｊｕｇａ
ｔｅ）を含んでいる場合である。二重抗体複合体そのも
のは公知である。この態様を図６に例示する。符号３０
はＳ．ｍｕｔａｎｓ標的に対するウシの抗体を表わして
いる。符号３７は抗−ウシ抗体と抗−グルコースオキシ
ダーゼ抗体の二重抗体複合体を表わしている。さらに別
の可能性は、ポリエチレンイミンポリマーが標的に特有
の抗原部位をもっている場合であり、この抗原部位はポ
リマーに共有結合している。目的とする標的に結合する
ことができる抗体はポリマー上のこれら抗原部位にも結
合し、そうしてポリマーを標的部位に結合する（ｃｏｕ
ｐｌｅ）ことになろう。この態様を図７に例示する。符
号３８はポリエチレンイミンに結合している抗原を意味
し、符号３９は標的１０をこの抗原に結合する抗−標的
抗体を意味する。グルコースオキシダーゼとホースラデ
ィッシュペルオキシダーゼはいずれも、グリコシル側鎖
（ｐｅｎｄａｎｔ ｇｌｙｃｏｓｙｌ ｃｈａｉｎ
）を有する酵素である。このような酵素はポリエチレン
イミンと共有結合させることができる。そのためには、
まず最初に水溶液中で過ヨウ素酸塩を用いて酵素を酸化
してグリコシル側鎖中にアルデヒド基を発生させる。こ
れらの基は次に、アルカリ性ｐＨ（たとえばｐＨ９．５
）でポリエチレンイミン上のアミノ基と共にシッフ塩基
を形成する。その後、水素化ホウ酸塩（ｂｏｒｏｈｙｄ
ｒｉｄｅ）による還元反応を用いて、未反応のアルデヒ
ド基を還元すると共に、シッフ塩基の還元によって安定
性を増大させることができる。これらの酵素はまた同じ
技法によって抗体に結合することもできる。本発明で使
用する抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよ
い。 ある特異性をもった抗体とこれとは異なる特異性をもっ
た別の抗体とを共に使用する場合、一方をモノクローナ
ルとし、他方をポリクローナルとすることが可能である
。本発明は、抗体断片を用いて実施することもできる。 特に、ひとつの抗体断片を標的部位に結合し、それと共
にこの第一の断片に酵素を結合するのに１種以上の別の
断片を利用して本発明を実施することもできる。標的部
位に結合する第一の抗体断片は所望の標的に対する抗体
のＦｖ断片とすることができる。そのような断片は抗体
のＬ鎖およびＨ鎖の可変領域のみを含んでいる。断片は
、２つの結合部位を提供するＦ（ａｂ）２断片とするこ
とも可能である。あるいは、ひとつの抗体の一方の鎖の
単一の可変領域ほどの小さな部分であってもよい。 生物学的に活性な抗体断片をＥ．ｃｏｌｉ中で効率的に
生産する技術は、Ａ．ＳｋｅｖｉａおよびＡ．Ｐｌｕｃ
ｋｔｈｕｎ （１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０
，１０３８；Ｍ．Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ，（１
９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０，１０４１；なら
びにＥ．Ｓ．Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ，（１９８９）
，Ｎａｔｕｒｅ，３４１，５４４に記載されている。抗
体断片をコードしている遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ中でクロ
ーニングして発現させる技術もまた、ヨーロッパ特許出
願公開第３６８６８４号（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ）に記載されている。第一
の抗体断片が付加的なペプチド鎖をもっており、別の断
片がこのペプチド鎖に酵素を結合させるようにするのが
好ましい。Ｃ末端にすでに結合した余分なペプチド鎖を
もっている可変領域を生産するような細菌を作成するこ
とができる。 これは標準的な遺伝子手法によって行なうことができる
。たとえば、可変領域をコードしている遺伝子は、部位
特異的変異誘発法により、可変領域に結合させるべきペ
プチドをコードしているインビトロで合成したオリゴヌ
クレオチドを用いて容易に延長することができる。部位
特異的変異誘発法はいまや広く使用されている手法であ
り、適切な手順は発行されたいくつかの単行本、たとえ
ばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，（１９８９），
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅ
ｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋに記載されている。付加した余分なペプ
チドは治療薬の結合にとって極めて便利な「手段」とな
る。第一の断片に酵素を結合させる別の抗体断片は、抗
原−抗体結合によって酵素に結合することができる第二
の抗体断片、および第一の抗体断片と第二の抗体断片と
に結合することができ、特に第一および第二抗体断片に
結合している抗原性のペプチドに結合することができる
Ｆ（ａｂ）２断片（これは二価である）が好ましい。図
８に、抗体断片を利用する好ましい態様を例示する。抗
原部位４２を有する標的４０に結合するにはＦｖ抗体断
片４４を使用する。この抗体断片４４では、いくつか繰
返されるペプチド４６がＦｖ断片の２つの鎖のうちの一
方の鎖の端部（Ｃ末端）に結合している。グルコースオ
キシダーゼ（Ｇ．Ｏｘ）とホースラディッシュペルオキ
シダーゼ（ＨＲＰ）には、それぞれ対応するＦｖ断片４
８、５０が結合する。このＦｖ断片４８、５０はそれぞ
れの酵素に対する特異性をもっており、かつ、同じペプ
チドの単一の繰返し４６が断片の一方の鎖に結合してい
る。抗−酵素Ｆｖ断片４８、５０に結合しているペプチ
ド４６はこれらのペプチドに特異的に結合するＦ（ａｂ
）２断片５２によって抗−標的Ｆｖ断片上のペプチド４
６に連結されるようになる。Ｆ（ａｂ）２断片は二価で
あるので、酵素に結合した抗−酵素断片を抗−標的断片
４４に結合するブリッジを形成することができる。複数
のポリクローナル抗体を使用する場合、酵素と抗体を本
発明の製品中の２つ以上のビヒクル間に分配して、使用
時まで酵素と抗体両方の完全な複合体が形成しないよう
にするのが望ましいことが分かるであろう。ポリクロー
ナル抗体との大きな複合体は貯蔵中、標的部位に結合す
る能力が低下し易いことが判明している。モノクローナ
ル抗体を使用すれば、複合体の構成成分を複数のビヒク
ル間に分配する必要はないであろう。一般に、モノクロ
ーナル抗体は小さめの複合体を形成し、貯蔵中ポリクロ
ーナル抗体との間で形成される複合体より活性保持が良
いことが期待される。これは、抗体断片を使用する場合
にもいえることである。抗体断片の利点は、抗原−抗体
結合によって形成される複合体がかなり小さくて全抗体
との間で形成される複合体より安定であるということで
ある。 製品が２種のビヒクル間に分配された酵素と１種以上の
抗体とを有する場合、一方のビヒクルが標的に結合する
ことができる抗体を含み、他方のビヒクルが酵素とそれ
を互いに連結する手段とを、おそらくは予備的に形成さ
れた複合体として含むことができよう。酵素と１種以上
の抗体または抗体断片とを含む１つ以上のビヒクルから
なる製品はいろいろな形態をとることができよう。標的
部位が口の中であれば、うがい薬、練り歯磨および口の
中で溶ける薬用ドロップが考えられる。これらの製品形
態は複数のビヒクルが必要な場合にも使用することがで
きよう。たとえば、製品は、ユーザーが使用の直前に混
合する２成分型のうがい薬とすることができよう。製品
は２つの成分を有する練り歯磨とすることもできる。こ
れは、別々に保存するかまたは少なくとも混合しないで
おくが、ユーザーの口の中では一緒に分配されて混合す
るように、練り歯磨容器中に貯蔵される。このような２
成分型の練り歯磨製品は公知である。複数のビヒクルを
使用する製品の別の可能な形態は口の中でなめる薬用ド
ロップであろう。このような薬用ドロップには別々の部
分にいろいろな成分を含ませることができる。複数のビ
ヒクルを使用する方法として、２種のビヒクル形態を組
合せて使用することもできよう。たとえば、練り歯磨の
後にうがい薬または薬用ドロップを使用する。本発明の
製品は、酵素によって発生する中間体とは別に、酵素に
対する基質をいくつかまたはすべて含んでいてもよいし
、あるいは標的部位に存在する酵素基質のいくつかまた
はすべてを利用することもできる。したがって、グルコ
ースオキシダーゼを使用し、標的部位が口内である場合
、本発明の製品は酵素基質として食餌のグルコースを利
用することもできるし、あるいはグルコースオキシダー
ゼとは別にグルコースを含んでいてもよい。
つかを添付の図面に例示した。 これらの図は標的と酵素の配置関係を概略的に示したも
のである。図中で、Ｇ．Ｏｘはグルコースオキシダーゼ
、ＨＲＰはホースラディッシュペルオキシダーゼ、ＰＥ
Ｉはポリエチレンイミンを表わしている。上述したよう
に、本発明のひとつの特徴は、２つの共働する酵素が標
的部位に結合するようになるということである。ひとつ
の可能性は、これらの酵素が標的部位に結合するが、互
いには直接連結されていない場合である。たとえば両方
の酵素が、それぞれ標的部位に結合することができる抗
体に結合（ａｔｔａｃｈ）しており、たとえば、共有結
合を介して結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）している場合で
ある。この様子を図１と図２に示した。図１で符号１０
は標的を示しており、これは抗原部位１２をもつＳ．ｍ
ｕｔａｎｓである。符号１４は抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓ抗
体を示しており、これにはグルコースオキシダーゼ（Ｇ
．Ｏｘ）が結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）している。 符号１６はホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ）が結合している抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓ抗体を示す。 図２では、多重抗体を使用しているために化学結合の必
要性が回避されている。これは、本出願と同日付の別出
願の主題である。符号２０は第一の抗体を示しており、
これはラビットの抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓ抗体である。符
号２２はグルコースオキシダーゼが結合しているラビッ
トの抗グルコースオキシダーゼ抗体を示す。符号２４は
ホースラディッシュペルオキシダーゼが結合しているラ
ビットの抗−ホースラディッシュペルオキシダーゼを示
す。符号２６はヤギの抗−ラビットイムノグロブリンを
示しており、これは抗体２２と２４を抗−標的抗体２０
に結合する機能を果たす。もうひとつ別の可能性は、本
発明の製品が、少なくともその使用時に酵素を互いに連
結する手段を含んでいる場合である。この連結（ｌｉｎ
ｋｉｎｇ）手段は、標的部位に結合することができる抗
体とは別であるが、これに結合しているかまたは結合す
ることができるものとすることができる。酵素は、標的
部位（これは細胞であることもある）に直接結合する抗
体に化学結合（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｎｊｕｇａｔ
ｉｏｎ）以外の方法で互いに連結するのが好ましい。標
的特異的抗体は、酵素を互いに連結するのに使用できる
他の抗体やその他の材料より入手が容易でないのが普通
である。したがって、これらの標的特異的抗体は、酵素
と抗体を結合する共有結合を形成するのに使用される人
工的な化学反応に供さない方が好ましいと思われる。標
的部位または標的特異的抗体を介する以外の方法で酵素
を互いに連結すると、酵素の分配の制御が容易にできる
と共に２種類の酵素を互いに近接して配置させるのが容
易にできるようになるため、一方の酵素の生成物である
中間体が他方の酵素に近接して発生する。したがって、
連結手段は、酵素が結合しているかまたは結合すること
ができ、かつ標的部位に結合することができる抗体に結
合しているかまたは結合することができる、１種または
それ以上の仲介手段であると有利であり得る。また、連
結手段と標的部位に結合する抗体との結合（ａｔｔａｃ
ｈｍｅｎｔ）は、抗原−抗体結合によるのが好ましい。 これは標的特異的抗体との化学結合を避ける意味で有益
である。ひとつの好ましい態様では、標的部位に結合す
る最初に述べた抗体以外にさらに２種の抗体を使用する
。 この態様では、一方の酵素（たとえばホースラディッシ
ュペルオキシダーゼ）が、第一の抗体に結合することが
できる第二の抗体に結合（たとえば共有結合によって化
学結合）しており、他方の酵素（たとえばグルコースオ
キシダーゼ）が、第二の抗体に結合することができる第
三の抗体に結合している。この場合、連結手段は第二の
抗体と第三の抗体との組合せである。この態様の一例を
図３に示す。符号３０はＳ．ｍｕｔａｎｓ標的１０に対
するウシの抗体を意味する。符号３２は、ホースラディ
ッシュペルオキシダーゼが結合しておりウシの抗体３０
に結合するラビットの抗−ウシイムノグロブリンを意味
する。符号３４は、グルコースオキシダーゼが結合して
いるヒツジの抗−ラビットイムノグロブリンを意味する
。これは抗体３２に結合する。変形例を図４に示す。 これは図２と多少とも類似している。符号１０、１２、
２０および２２は図２と同じ意味をもっているが、符号
３６はホースラディッシュペルオキシダーゼが結合して
いるヤギの抗−ラビットイムノグロブリンを表わす。さ
らに別の可能性は、２種の酵素が、第一の抗体に結合し
ている単一の仲介手段に結合している場合である。この
ような仲介手段として考えられる一例は、化学反応によ
り酵素の結合（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）を可能にする化
学的官能性を備えた合成ポリマーである。適切なポリマ
ーはポリエチレンイミンであり、これは分枝の末端にア
ミノ基を有する分枝ポリマーである。このようなポリマ
ーに両方の酵素が共有結合を介して結合している複合体
（ｃｏｍｐｌｅｎ）は各種の方法で標的部位に結合する
ことができよう。ひとつの可能性は、本発明の製品が、
酵素の一方に対する抗体と、この抗体および標的部位に
結合する抗体の両方に結合することによってブリッジを
形成することができる別の抗体とを含んでいる場合であ
る。この場合を図５に例示する。これは図２の態様とよ
く似ている。もうひとつの可能性は、本発明の製品が、
酵素の一方に結合すると共に標的に結合する抗体にも結
合する能力を有する２つの特異性を備えた二重抗体複合
体（ｄｏｕｂｌｅａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｊｕｇａ
ｔｅ）を含んでいる場合である。二重抗体複合体そのも
のは公知である。この態様を図６に例示する。符号３０
はＳ．ｍｕｔａｎｓ標的に対するウシの抗体を表わして
いる。符号３７は抗−ウシ抗体と抗−グルコースオキシ
ダーゼ抗体の二重抗体複合体を表わしている。さらに別
の可能性は、ポリエチレンイミンポリマーが標的に特有
の抗原部位をもっている場合であり、この抗原部位はポ
リマーに共有結合している。目的とする標的に結合する
ことができる抗体はポリマー上のこれら抗原部位にも結
合し、そうしてポリマーを標的部位に結合する（ｃｏｕ
ｐｌｅ）ことになろう。この態様を図７に例示する。符
号３８はポリエチレンイミンに結合している抗原を意味
し、符号３９は標的１０をこの抗原に結合する抗−標的
抗体を意味する。グルコースオキシダーゼとホースラデ
ィッシュペルオキシダーゼはいずれも、グリコシル側鎖
（ｐｅｎｄａｎｔ ｇｌｙｃｏｓｙｌ ｃｈａｉｎ
）を有する酵素である。このような酵素はポリエチレン
イミンと共有結合させることができる。そのためには、
まず最初に水溶液中で過ヨウ素酸塩を用いて酵素を酸化
してグリコシル側鎖中にアルデヒド基を発生させる。こ
れらの基は次に、アルカリ性ｐＨ（たとえばｐＨ９．５
）でポリエチレンイミン上のアミノ基と共にシッフ塩基
を形成する。その後、水素化ホウ酸塩（ｂｏｒｏｈｙｄ
ｒｉｄｅ）による還元反応を用いて、未反応のアルデヒ
ド基を還元すると共に、シッフ塩基の還元によって安定
性を増大させることができる。これらの酵素はまた同じ
技法によって抗体に結合することもできる。本発明で使
用する抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよ
い。 ある特異性をもった抗体とこれとは異なる特異性をもっ
た別の抗体とを共に使用する場合、一方をモノクローナ
ルとし、他方をポリクローナルとすることが可能である
。本発明は、抗体断片を用いて実施することもできる。 特に、ひとつの抗体断片を標的部位に結合し、それと共
にこの第一の断片に酵素を結合するのに１種以上の別の
断片を利用して本発明を実施することもできる。標的部
位に結合する第一の抗体断片は所望の標的に対する抗体
のＦｖ断片とすることができる。そのような断片は抗体
のＬ鎖およびＨ鎖の可変領域のみを含んでいる。断片は
、２つの結合部位を提供するＦ（ａｂ）２断片とするこ
とも可能である。あるいは、ひとつの抗体の一方の鎖の
単一の可変領域ほどの小さな部分であってもよい。 生物学的に活性な抗体断片をＥ．ｃｏｌｉ中で効率的に
生産する技術は、Ａ．ＳｋｅｖｉａおよびＡ．Ｐｌｕｃ
ｋｔｈｕｎ （１９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０
，１０３８；Ｍ．Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ，（１
９８８），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０，１０４１；なら
びにＥ．Ｓ．Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ，（１９８９）
，Ｎａｔｕｒｅ，３４１，５４４に記載されている。抗
体断片をコードしている遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ中でクロ
ーニングして発現させる技術もまた、ヨーロッパ特許出
願公開第３６８６８４号（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ）に記載されている。第一
の抗体断片が付加的なペプチド鎖をもっており、別の断
片がこのペプチド鎖に酵素を結合させるようにするのが
好ましい。Ｃ末端にすでに結合した余分なペプチド鎖を
もっている可変領域を生産するような細菌を作成するこ
とができる。 これは標準的な遺伝子手法によって行なうことができる
。たとえば、可変領域をコードしている遺伝子は、部位
特異的変異誘発法により、可変領域に結合させるべきペ
プチドをコードしているインビトロで合成したオリゴヌ
クレオチドを用いて容易に延長することができる。部位
特異的変異誘発法はいまや広く使用されている手法であ
り、適切な手順は発行されたいくつかの単行本、たとえ
ばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，（１９８９），
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅ
ｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋに記載されている。付加した余分なペプ
チドは治療薬の結合にとって極めて便利な「手段」とな
る。第一の断片に酵素を結合させる別の抗体断片は、抗
原−抗体結合によって酵素に結合することができる第二
の抗体断片、および第一の抗体断片と第二の抗体断片と
に結合することができ、特に第一および第二抗体断片に
結合している抗原性のペプチドに結合することができる
Ｆ（ａｂ）２断片（これは二価である）が好ましい。図
８に、抗体断片を利用する好ましい態様を例示する。抗
原部位４２を有する標的４０に結合するにはＦｖ抗体断
片４４を使用する。この抗体断片４４では、いくつか繰
返されるペプチド４６がＦｖ断片の２つの鎖のうちの一
方の鎖の端部（Ｃ末端）に結合している。グルコースオ
キシダーゼ（Ｇ．Ｏｘ）とホースラディッシュペルオキ
シダーゼ（ＨＲＰ）には、それぞれ対応するＦｖ断片４
８、５０が結合する。このＦｖ断片４８、５０はそれぞ
れの酵素に対する特異性をもっており、かつ、同じペプ
チドの単一の繰返し４６が断片の一方の鎖に結合してい
る。抗−酵素Ｆｖ断片４８、５０に結合しているペプチ
ド４６はこれらのペプチドに特異的に結合するＦ（ａｂ
）２断片５２によって抗−標的Ｆｖ断片上のペプチド４
６に連結されるようになる。Ｆ（ａｂ）２断片は二価で
あるので、酵素に結合した抗−酵素断片を抗−標的断片
４４に結合するブリッジを形成することができる。複数
のポリクローナル抗体を使用する場合、酵素と抗体を本
発明の製品中の２つ以上のビヒクル間に分配して、使用
時まで酵素と抗体両方の完全な複合体が形成しないよう
にするのが望ましいことが分かるであろう。ポリクロー
ナル抗体との大きな複合体は貯蔵中、標的部位に結合す
る能力が低下し易いことが判明している。モノクローナ
ル抗体を使用すれば、複合体の構成成分を複数のビヒク
ル間に分配する必要はないであろう。一般に、モノクロ
ーナル抗体は小さめの複合体を形成し、貯蔵中ポリクロ
ーナル抗体との間で形成される複合体より活性保持が良
いことが期待される。これは、抗体断片を使用する場合
にもいえることである。抗体断片の利点は、抗原−抗体
結合によって形成される複合体がかなり小さくて全抗体
との間で形成される複合体より安定であるということで
ある。 製品が２種のビヒクル間に分配された酵素と１種以上の
抗体とを有する場合、一方のビヒクルが標的に結合する
ことができる抗体を含み、他方のビヒクルが酵素とそれ
を互いに連結する手段とを、おそらくは予備的に形成さ
れた複合体として含むことができよう。酵素と１種以上
の抗体または抗体断片とを含む１つ以上のビヒクルから
なる製品はいろいろな形態をとることができよう。標的
部位が口の中であれば、うがい薬、練り歯磨および口の
中で溶ける薬用ドロップが考えられる。これらの製品形
態は複数のビヒクルが必要な場合にも使用することがで
きよう。たとえば、製品は、ユーザーが使用の直前に混
合する２成分型のうがい薬とすることができよう。製品
は２つの成分を有する練り歯磨とすることもできる。こ
れは、別々に保存するかまたは少なくとも混合しないで
おくが、ユーザーの口の中では一緒に分配されて混合す
るように、練り歯磨容器中に貯蔵される。このような２
成分型の練り歯磨製品は公知である。複数のビヒクルを
使用する製品の別の可能な形態は口の中でなめる薬用ド
ロップであろう。このような薬用ドロップには別々の部
分にいろいろな成分を含ませることができる。複数のビ
ヒクルを使用する方法として、２種のビヒクル形態を組
合せて使用することもできよう。たとえば、練り歯磨の
後にうがい薬または薬用ドロップを使用する。本発明の
製品は、酵素によって発生する中間体とは別に、酵素に
対する基質をいくつかまたはすべて含んでいてもよいし
、あるいは標的部位に存在する酵素基質のいくつかまた
はすべてを利用することもできる。したがって、グルコ
ースオキシダーゼを使用し、標的部位が口内である場合
、本発明の製品は酵素基質として食餌のグルコースを利
用することもできるし、あるいはグルコースオキシダー
ゼとは別にグルコースを含んでいてもよい。
【実施例】本発明の系のインビトロでの有効性を立証す
る以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する
。以下の実施例で「ＰＢＳ」は特に断わらない限りｐＨ
が８のリン酸塩緩衝生理食塩水を意味する。希釈度は「
１／ｎ」の形で表わすが、これはある量の出発溶液を希
釈剤と混合して、濃度が出発溶液のｎ分の１になった溶
液を得たことを意味する。 実施例１：第１部──使用した材料 ラビット抗−ウシイムノグロブリンに結合（ｃｏｎｊｕ
ｇａｔｅ）したホースラディッシュペルオキシダーゼは
市販品である（Ｓｉｇｍａ）。ヒツジ抗−ラビットイム
ノグロブリンに結合したグルコースオキシダーゼも市販
品である（Ｓｅｒｏｔｅｃ）。ウシ抗−Ｓ．ｍｕｔａｎ
ｓは以下のようにして調製した。すなわち、Ｓ．ｍｕｔ
ａｎｓをＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔブロスで一晩培養し、
培養細胞を熱で殺し、無菌生理食塩水およびヒュームド
シリカ（Ｇａｓｉｌ）アジュバントと混合して、１ｍｌ
中にＧａｓｉｌを０．１ｇと細胞を１０８個含む溶液を
作成し、この溶液２ｍｌをコウシの筋肉内に注射し、３
週間後同様な注射をし、さらに２週間後全血から抗血清
を抽出した。ラビット抗−ウシイムノグロブリン（比較
のために使用）も市販品である（Ｓｉｇｍａ）。試薬溶
液と洗浄用に使用したＰＢＳはすべて、界面活性剤Ｔｗ
ｅｅｎ２０（すなわちポリオキシエチレン（２０）ソル
ビタンモノラウレート）を０．１５％ｖ／ｖ含んでいた
。 実施例１：第２部──手順 Ｓ．ｍｕｔａｎｓをウシ抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓに暴露し
た後、このウシ抗体を介してＳ．ｍｕｔａｎｓに結合す
る細胞殺傷性コンプレックス（複合体）を形成する材料
に暴露するという実験手順を実施した。コントロールは
、以下の手順の適当なステップを省くかまたは変更して
実施した。手順は次の一連のステップからなる。 １． Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔブロスで培養したＳ．
ｍｕｔａｎｓの細胞試料１０ｍｌを無菌のＭｃＣａｒｔ
ｎｅｙボトルに移した。細菌を遠心にかけてペレットと
し、ｐＨ８のＰＢＳで三回洗い、９ｍｌのＰＢＳに再懸
濁した。 ２． ウシ抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓ懸濁液１ｍｌを加え
た。この懸濁液は、ｐＨ８のＰＢＳ中で全血清濃度１／
１０に希釈し、▲ろ▼過により滅菌したものである。コ
ントロールでは、ｐＨ８のＰＢＳ１ｍｌを加えた。 ３． この懸濁液を室温で１時間インキュベートした
後、前と同様にして細胞を遠心にかけてペレットとし、
ＰＢＳで三回洗い、９ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。 ４． ▲ろ▼過滅菌したホースラディッシュペルオキ
シダーゼ／ラビット抗−ウシ複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔ
ｅ）（ｐＨ８のＰＢＳで１／１０に希釈）を１ｍｌ加え
て、最終希釈度を１／１００とした。室温で２０分イン
キュベートした後、前と同様にして細胞を遠心してペレ
ットにし、ｐＨ８のＰＢＳで三回洗い、９ｍｌのＰＢＳ
に再懸濁した。コントロールでは、複合体の代わりにＰ
ＢＳを１ｍｌ加えた。比較実験では、複合体の代わりに
ラビット抗−ウシイムノグロブリンを使用した。 ５． ここで、▲ろ▼過滅菌したグルコースオキシダ
ーゼ／ヒツジ抗−ラビット複合体（ｐＨ８のＰＢＳで１
／１０に希釈）を１ｍｌ加えて、添加後の最終希釈度を
１／１００とした。懸濁液を再度室温で２０分インキュ
ベートした後、細胞を遠心してペレットにし、ＰＢＳで
三回洗った。 ６． 細胞を、ヨウ化カリウム１５μｇ／ｍｌとＤ−
グルコース５％ｗ／ｖとを含有する▲ろ▼過滅菌したＰ
ＢＳ（ｐＨ６．５）１０ｍｌに再懸濁した。 ７． 得られた懸濁液を３７℃で２４時間インキュベ
ートした。混合直後およびその後一定間隔で０．５ｍｌ
のサンプルを採取した。各サンプルを遠心してペレット
にすることによって細菌を分離し、このペレットをＰＢ
Ｓで三回洗った。各サンプル中で生存する細胞をＭｉｌ
ｅｓ，Ｍｉｓｒａ ａｎｄ Ｉｒｗｉｎ，Ｊ．Ｈｙ
ｇｉｅｎｅ，３８，７３２−７４９（１９３８）の方法
で分析した。加えた材料の組合せと生存細胞のカウント
数は下記表に示してある。 ８． 双方の酵素が同時に細胞に結合しているかどう
か確認するために、ステップ６で得られた懸濁液のサン
プルを比色法で分析した。すなわち、細胞を４０００ｒ
ｐｍで５分間遠心した後、３ｍｌのＰＢＳにペレットを
再懸濁して再度遠心することによって三回洗浄した。最
後の遠心の後、グルコース１００ｍＭとテトラメチルベ
ンジジン１μｇ／ｍｌとを含有する０．５ｍｌのＰＢＳ
に細胞を再懸濁した。この系では、グルコースオキシダ
ーゼとペルオキシダーゼが共に存在する場合のみ発色す
る。５分間発色させた後、０．２ＭのＨＣｌを５０μｌ
添加して発色を停止させた。光学密度を測定した。これ
も表１に示す。
る以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明する
。以下の実施例で「ＰＢＳ」は特に断わらない限りｐＨ
が８のリン酸塩緩衝生理食塩水を意味する。希釈度は「
１／ｎ」の形で表わすが、これはある量の出発溶液を希
釈剤と混合して、濃度が出発溶液のｎ分の１になった溶
液を得たことを意味する。 実施例１：第１部──使用した材料 ラビット抗−ウシイムノグロブリンに結合（ｃｏｎｊｕ
ｇａｔｅ）したホースラディッシュペルオキシダーゼは
市販品である（Ｓｉｇｍａ）。ヒツジ抗−ラビットイム
ノグロブリンに結合したグルコースオキシダーゼも市販
品である（Ｓｅｒｏｔｅｃ）。ウシ抗−Ｓ．ｍｕｔａｎ
ｓは以下のようにして調製した。すなわち、Ｓ．ｍｕｔ
ａｎｓをＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔブロスで一晩培養し、
培養細胞を熱で殺し、無菌生理食塩水およびヒュームド
シリカ（Ｇａｓｉｌ）アジュバントと混合して、１ｍｌ
中にＧａｓｉｌを０．１ｇと細胞を１０８個含む溶液を
作成し、この溶液２ｍｌをコウシの筋肉内に注射し、３
週間後同様な注射をし、さらに２週間後全血から抗血清
を抽出した。ラビット抗−ウシイムノグロブリン（比較
のために使用）も市販品である（Ｓｉｇｍａ）。試薬溶
液と洗浄用に使用したＰＢＳはすべて、界面活性剤Ｔｗ
ｅｅｎ２０（すなわちポリオキシエチレン（２０）ソル
ビタンモノラウレート）を０．１５％ｖ／ｖ含んでいた
。 実施例１：第２部──手順 Ｓ．ｍｕｔａｎｓをウシ抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓに暴露し
た後、このウシ抗体を介してＳ．ｍｕｔａｎｓに結合す
る細胞殺傷性コンプレックス（複合体）を形成する材料
に暴露するという実験手順を実施した。コントロールは
、以下の手順の適当なステップを省くかまたは変更して
実施した。手順は次の一連のステップからなる。 １． Ｔｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔブロスで培養したＳ．
ｍｕｔａｎｓの細胞試料１０ｍｌを無菌のＭｃＣａｒｔ
ｎｅｙボトルに移した。細菌を遠心にかけてペレットと
し、ｐＨ８のＰＢＳで三回洗い、９ｍｌのＰＢＳに再懸
濁した。 ２． ウシ抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓ懸濁液１ｍｌを加え
た。この懸濁液は、ｐＨ８のＰＢＳ中で全血清濃度１／
１０に希釈し、▲ろ▼過により滅菌したものである。コ
ントロールでは、ｐＨ８のＰＢＳ１ｍｌを加えた。 ３． この懸濁液を室温で１時間インキュベートした
後、前と同様にして細胞を遠心にかけてペレットとし、
ＰＢＳで三回洗い、９ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。 ４． ▲ろ▼過滅菌したホースラディッシュペルオキ
シダーゼ／ラビット抗−ウシ複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔ
ｅ）（ｐＨ８のＰＢＳで１／１０に希釈）を１ｍｌ加え
て、最終希釈度を１／１００とした。室温で２０分イン
キュベートした後、前と同様にして細胞を遠心してペレ
ットにし、ｐＨ８のＰＢＳで三回洗い、９ｍｌのＰＢＳ
に再懸濁した。コントロールでは、複合体の代わりにＰ
ＢＳを１ｍｌ加えた。比較実験では、複合体の代わりに
ラビット抗−ウシイムノグロブリンを使用した。 ５． ここで、▲ろ▼過滅菌したグルコースオキシダ
ーゼ／ヒツジ抗−ラビット複合体（ｐＨ８のＰＢＳで１
／１０に希釈）を１ｍｌ加えて、添加後の最終希釈度を
１／１００とした。懸濁液を再度室温で２０分インキュ
ベートした後、細胞を遠心してペレットにし、ＰＢＳで
三回洗った。 ６． 細胞を、ヨウ化カリウム１５μｇ／ｍｌとＤ−
グルコース５％ｗ／ｖとを含有する▲ろ▼過滅菌したＰ
ＢＳ（ｐＨ６．５）１０ｍｌに再懸濁した。 ７． 得られた懸濁液を３７℃で２４時間インキュベ
ートした。混合直後およびその後一定間隔で０．５ｍｌ
のサンプルを採取した。各サンプルを遠心してペレット
にすることによって細菌を分離し、このペレットをＰＢ
Ｓで三回洗った。各サンプル中で生存する細胞をＭｉｌ
ｅｓ，Ｍｉｓｒａ ａｎｄ Ｉｒｗｉｎ，Ｊ．Ｈｙ
ｇｉｅｎｅ，３８，７３２−７４９（１９３８）の方法
で分析した。加えた材料の組合せと生存細胞のカウント
数は下記表に示してある。 ８． 双方の酵素が同時に細胞に結合しているかどう
か確認するために、ステップ６で得られた懸濁液のサン
プルを比色法で分析した。すなわち、細胞を４０００ｒ
ｐｍで５分間遠心した後、３ｍｌのＰＢＳにペレットを
再懸濁して再度遠心することによって三回洗浄した。最
後の遠心の後、グルコース１００ｍＭとテトラメチルベ
ンジジン１μｇ／ｍｌとを含有する０．５ｍｌのＰＢＳ
に細胞を再懸濁した。この系では、グルコースオキシダ
ーゼとペルオキシダーゼが共に存在する場合のみ発色す
る。５分間発色させた後、０．２ＭのＨＣｌを５０μｌ
添加して発色を停止させた。光学密度を測定した。これ
も表１に示す。
【表１】
表から明らかなように、細胞は通常それに対する抗体の
存在下で生存する（実験Ａ）。グルコースオキシダーゼ
複合体が存在すると（実験Ｇ。ただし、Ｓ．ｍｕｔａｎ
ｓ細胞に結合できない）細胞殺傷効果を示す。この複合
体は、標的であるＳ．ｍｕｔａｎｓ細胞に結合すると（
実験Ｄ）それより大きい細胞殺傷効果を示す。驚くべき
ことに、ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体は
グルコースオキシダーゼなしでも多少の細胞殺傷効果を
示した（実験Ｆ）。実験Ｃでは、両方の複合体が存在し
ており、一緒にコンプレックスを形成することができる
が、標的のＳ．ｍｕｔａｎｓ細胞には結合できない。 この場合、細胞殺傷効果は、結合していないグルコース
オキシダーゼ複合体の場合（実験Ｇ）またはペルオキシ
ダーゼ複合体の場合（実験Ｆ）よりも高かった。しかし
、実験Ｂは両方の複合体が互いに結合できると共に標的
細胞にも結合できるように必要なすべての成分を含んで
いるのでずっと高い細胞殺傷効果が得られる。生存細胞
の数は２時間以内に劇的に低下し、最終的にはゼロにな
った。 実施例２ 実施例１の手順を繰返した。ただし、グルコースオキシ
ダーゼ／ヒツジ抗−ラビット複合体の希釈度を２種類に
変えた。すなわち、いくつかの実験では、使用した複合
体はｐＨ８のＰＢＳで１／１０に希釈し、添加後の最終
希釈度が１／１００となるようにした。他の実験では、
複合体は１／１６０の希釈度で使用して、添加後の最終
希釈が１／１６００となるようにした。添加した材料の
組合せと生存細胞のカウントならびに比色法による光学
密度を下記表に示す。
存在下で生存する（実験Ａ）。グルコースオキシダーゼ
複合体が存在すると（実験Ｇ。ただし、Ｓ．ｍｕｔａｎ
ｓ細胞に結合できない）細胞殺傷効果を示す。この複合
体は、標的であるＳ．ｍｕｔａｎｓ細胞に結合すると（
実験Ｄ）それより大きい細胞殺傷効果を示す。驚くべき
ことに、ホースラディッシュペルオキシダーゼ複合体は
グルコースオキシダーゼなしでも多少の細胞殺傷効果を
示した（実験Ｆ）。実験Ｃでは、両方の複合体が存在し
ており、一緒にコンプレックスを形成することができる
が、標的のＳ．ｍｕｔａｎｓ細胞には結合できない。 この場合、細胞殺傷効果は、結合していないグルコース
オキシダーゼ複合体の場合（実験Ｇ）またはペルオキシ
ダーゼ複合体の場合（実験Ｆ）よりも高かった。しかし
、実験Ｂは両方の複合体が互いに結合できると共に標的
細胞にも結合できるように必要なすべての成分を含んで
いるのでずっと高い細胞殺傷効果が得られる。生存細胞
の数は２時間以内に劇的に低下し、最終的にはゼロにな
った。 実施例２ 実施例１の手順を繰返した。ただし、グルコースオキシ
ダーゼ／ヒツジ抗−ラビット複合体の希釈度を２種類に
変えた。すなわち、いくつかの実験では、使用した複合
体はｐＨ８のＰＢＳで１／１０に希釈し、添加後の最終
希釈度が１／１００となるようにした。他の実験では、
複合体は１／１６０の希釈度で使用して、添加後の最終
希釈が１／１６００となるようにした。添加した材料の
組合せと生存細胞のカウントならびに比色法による光学
密度を下記表に示す。
【表２】
表２から明らかなように、細胞はそれに対する抗体の存
在下で生存し（実験Ａ）、ペルオキシダーゼが存在しな
い場合希釈度の高い（すなわち濃度が低い）グルコース
オキシダーゼ複合体は細胞殺傷活性がほとんどない（実
験ＦとＧ）。ペルオキシダーゼ複合体と希釈度の高いグ
ルコースオキシダーゼ複合体とのコンプレックスが（細
胞に）結合してない場合（実験Ｅ）は、濃度の高いグル
コースオキシダーゼ複合体を使用したコンプレックス（
実験Ｃ）の場合より細胞殺傷力がずっと弱い。Ｓ．ｍｕ
ｔａｎｓ細胞に結合したコンプレックス（実験ＢとＤ）
では細胞殺傷がずっと速かった。特に、稀薄なグルコー
スオキシダーゼ複合体とのコンプレックスが結合してい
ると（実験Ｄ）、濃度が高い複合体とのコンプレックス
が結合していない場合（実験Ｃ）よりずっと有効である
ことは注目に値する。 実施例３ 本実施例では、グルコースオキシダーゼとペルオキシダ
ーゼが両方とも細胞を標的として認識した上でこれに結
合するが互いに連結はされていない場合の細胞の殺傷を
示す。本実施例で使用した細胞はヒトの腫瘍細胞（培養
したＬｏｖｏ細胞）であるが、本実施例はその他の細胞
の殺傷に対するモデルでもある。Ｌｏｖｏ細胞は組織培
養した後掻きとり、ＲＰＭＩ１６４０組織培養培地に懸
濁した。この懸濁物の試料をピペットで取り、組織培養
プレートのウェルに植付け、これを３７℃で４日間イン
キュベートしてＬｏｖｏ細胞をプレートに付着させた。 培養プレートを傾けて培地を除き、マウス抗−Ｌｏｖｏ
抗体懸濁液の試料を各ウェルに加えた。この抗体は、Ａ
ＵＡ−１という名称のモノクローナル抗体（Ｕｎｉｐａ
ｔｈ Ｌｔｄ製）である。各試料は、希釈度１／１０
００のＡＵＡ−１抗体懸濁液２００μｌであった。プレ
ートを３７℃で１時間インキュベートした後、抗体懸濁
液を傾けて除いた。次に、各ウェルに次の物質を含有す
る溶液の試料２００μｌを入れた。 グルコースオキシダーゼ（Ｇ．Ｏｘ）
１０μｇ／ｍｌ
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
１０μｇ／ｍｌ マウス抗−
Ｇ．Ｏｘ抗体
１２５０ｎｇ／ｍｌ マウス
抗−ＨＲＰ抗体
２５０ｎｇ／ｍｌ
ラビット抗−マウス抗体
５０μｇ／ｍ
ｌ。 抗原−抗体結合によって次の２種類のコンプレックスが
形成されると思われる。 ａ）Ｌｏｖｏ／マウス抗−Ｌｏｖｏ／ラビット抗−マウ
ス／マウス抗−Ｇ．Ｏｘ／Ｇ．Ｏｘ ｂ）Ｌｏｖｏ／マウス抗−Ｌｏｖｏ／ラビット抗−マウ
ス／マウス抗−ＨＲＰ／ＨＲＰ いくつかのウェルはコントロールとして、酵素のみを含
有する溶液の試料を入れた。次に、各ウェルにカタラー
ゼ溶液５０μｌを入れた。さまざまなカタラーゼ濃度を
使用した。このカタラーゼは過酸化水素を分解する機能
を果たす。プレートを３７℃で１時間インキュベートし
た後、生残っているＬｏｖｏ細胞の程度を測定した。こ
のために、各ウェルから溶液１００μｌを取り出し、代
わりに（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル
）−２，５，ジフェニル）テトラゾリウムブロマイド（
ＭＴＴ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＣＯ）
の１ｍｇ／ｍｌ溶液を５０μｌ入れた。生存細胞はホル
マザンの青い結晶を生じる。各ウェルに０．０４ＮのＨ
Ｃｌを含むイソプロパノール１００μｌを添加すること
によってこれらの青い結晶を溶かした。ＥＬＩＳＡプレ
ートリーダーで５７０ｎｍ光学密度を読んだ。結果は次
の通りである。 このように、カタラーゼが存在しないと遊離の酵素でも
Ｌｏｖｏ細胞を殺傷した。カタラーゼが４０μｇ／ｍｌ
以上だとＨ２Ｏ２を捕捉するため細胞殺傷は完全に抑制
された。それより低い濃度のカタラーゼでも遊離の酵素
による細胞殺傷は抑制されるが抗体が存在すると抑制さ
れない。このことは、これらの酵素が細胞を殺傷できた
ことと、抗体がこれら酵素を標的細胞に結合させること
によって効力を高めたことを示している。 実施例４ 本実施例では、実施例３と同様に、グルコースオキシダ
ーゼとペルオキシダーゼが両方とも細胞を標的として認
識した上でこれに結合するが互いに連結はされていない
場合の細胞の殺傷を示す。本実施例で使用した細胞は口
内に存在する１種Ｓ．ｓａｎｇｕｉｓである。本実施例
で使用した抗体は標準的な技術で作成した。Ｓ．ｓａｎ
ｇｕｉｓ細胞は遠心して培養ブロスから取り出し、ＰＢ
Ｓに再懸濁して遠心した後ＰＢＳに再懸濁することによ
って三回洗浄した。試料をいくつかのチューブの各々に
入れ、遠心し、マウスポリクローナル抗−Ｓ．ｓａｎｇ
ｕｉｓ抗体（腹水から得た）の▲ろ▼過滅菌した懸濁液
（ＰＢＳ中）に再懸濁した。この懸濁液を室温で３０分
間インキュベートして抗体を細胞に結合させた。細胞を
再度遠心し、ＰＢＳで洗浄した。比較として使用したい
くつかのチューブにはマウス抗−Ｓ．ｓａｇｕｉｓ懸濁
液の代わりにＰＢＳを入れた。次に、細胞を以下のもの
を含有する１ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。 グルコースオキシダーゼ（Ｇ．Ｏｘ）
１００μｇ／ｍｌ
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
１００μｇ／ｍｌ マウス抗−Ｇ．
Ｏｘモノクローナル抗体
１．２５μｇ／ｍｌ マウス抗−ＨＲＰモノクロ
ーナル抗体 １．２５
μｇ／ｍｌ ラビット抗−マウスポリクローナル
抗体 ５０μｇ／ｍｌ
（ただし、ラビット抗−マウス抗体は他の４種のものを
さきに添加してある溶液に加えた。）いくつかのチュー
ブでは、酵素と抗体を含む上記溶液の代わりにＰＢＳの
みを使用した。別のチューブでは、酵素と抗体を含んで
はいるがラビット抗−マウス抗体を含まない溶液を使用
した。すべての懸濁液を室温で３０分インキュベートし
て酵素を細胞に結合させた。その後、細胞を遠心により
取り出し、ＰＢＳで洗浄し、ヨウ化カリウム１５μｇ／
ｍｌとグルコース５％ｗ／ｖとを含有するＰＢＳ１ｍｌ
中に再懸濁した。これらの懸濁液を室温で２４時間イン
キュベートした。このインキュベーションの開始時とそ
の１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、および２
４時間後に各懸濁液からサンプルを取り出した。各サン
プルの生存細胞を実施例１と同様な方法で分析した。得
られた結果を下記表３に示す。
在下で生存し（実験Ａ）、ペルオキシダーゼが存在しな
い場合希釈度の高い（すなわち濃度が低い）グルコース
オキシダーゼ複合体は細胞殺傷活性がほとんどない（実
験ＦとＧ）。ペルオキシダーゼ複合体と希釈度の高いグ
ルコースオキシダーゼ複合体とのコンプレックスが（細
胞に）結合してない場合（実験Ｅ）は、濃度の高いグル
コースオキシダーゼ複合体を使用したコンプレックス（
実験Ｃ）の場合より細胞殺傷力がずっと弱い。Ｓ．ｍｕ
ｔａｎｓ細胞に結合したコンプレックス（実験ＢとＤ）
では細胞殺傷がずっと速かった。特に、稀薄なグルコー
スオキシダーゼ複合体とのコンプレックスが結合してい
ると（実験Ｄ）、濃度が高い複合体とのコンプレックス
が結合していない場合（実験Ｃ）よりずっと有効である
ことは注目に値する。 実施例３ 本実施例では、グルコースオキシダーゼとペルオキシダ
ーゼが両方とも細胞を標的として認識した上でこれに結
合するが互いに連結はされていない場合の細胞の殺傷を
示す。本実施例で使用した細胞はヒトの腫瘍細胞（培養
したＬｏｖｏ細胞）であるが、本実施例はその他の細胞
の殺傷に対するモデルでもある。Ｌｏｖｏ細胞は組織培
養した後掻きとり、ＲＰＭＩ１６４０組織培養培地に懸
濁した。この懸濁物の試料をピペットで取り、組織培養
プレートのウェルに植付け、これを３７℃で４日間イン
キュベートしてＬｏｖｏ細胞をプレートに付着させた。 培養プレートを傾けて培地を除き、マウス抗−Ｌｏｖｏ
抗体懸濁液の試料を各ウェルに加えた。この抗体は、Ａ
ＵＡ−１という名称のモノクローナル抗体（Ｕｎｉｐａ
ｔｈ Ｌｔｄ製）である。各試料は、希釈度１／１０
００のＡＵＡ−１抗体懸濁液２００μｌであった。プレ
ートを３７℃で１時間インキュベートした後、抗体懸濁
液を傾けて除いた。次に、各ウェルに次の物質を含有す
る溶液の試料２００μｌを入れた。 グルコースオキシダーゼ（Ｇ．Ｏｘ）
１０μｇ／ｍｌ
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
１０μｇ／ｍｌ マウス抗−
Ｇ．Ｏｘ抗体
１２５０ｎｇ／ｍｌ マウス
抗−ＨＲＰ抗体
２５０ｎｇ／ｍｌ
ラビット抗−マウス抗体
５０μｇ／ｍ
ｌ。 抗原−抗体結合によって次の２種類のコンプレックスが
形成されると思われる。 ａ）Ｌｏｖｏ／マウス抗−Ｌｏｖｏ／ラビット抗−マウ
ス／マウス抗−Ｇ．Ｏｘ／Ｇ．Ｏｘ ｂ）Ｌｏｖｏ／マウス抗−Ｌｏｖｏ／ラビット抗−マウ
ス／マウス抗−ＨＲＰ／ＨＲＰ いくつかのウェルはコントロールとして、酵素のみを含
有する溶液の試料を入れた。次に、各ウェルにカタラー
ゼ溶液５０μｌを入れた。さまざまなカタラーゼ濃度を
使用した。このカタラーゼは過酸化水素を分解する機能
を果たす。プレートを３７℃で１時間インキュベートし
た後、生残っているＬｏｖｏ細胞の程度を測定した。こ
のために、各ウェルから溶液１００μｌを取り出し、代
わりに（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル
）−２，５，ジフェニル）テトラゾリウムブロマイド（
ＭＴＴ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＣＯ）
の１ｍｇ／ｍｌ溶液を５０μｌ入れた。生存細胞はホル
マザンの青い結晶を生じる。各ウェルに０．０４ＮのＨ
Ｃｌを含むイソプロパノール１００μｌを添加すること
によってこれらの青い結晶を溶かした。ＥＬＩＳＡプレ
ートリーダーで５７０ｎｍ光学密度を読んだ。結果は次
の通りである。 このように、カタラーゼが存在しないと遊離の酵素でも
Ｌｏｖｏ細胞を殺傷した。カタラーゼが４０μｇ／ｍｌ
以上だとＨ２Ｏ２を捕捉するため細胞殺傷は完全に抑制
された。それより低い濃度のカタラーゼでも遊離の酵素
による細胞殺傷は抑制されるが抗体が存在すると抑制さ
れない。このことは、これらの酵素が細胞を殺傷できた
ことと、抗体がこれら酵素を標的細胞に結合させること
によって効力を高めたことを示している。 実施例４ 本実施例では、実施例３と同様に、グルコースオキシダ
ーゼとペルオキシダーゼが両方とも細胞を標的として認
識した上でこれに結合するが互いに連結はされていない
場合の細胞の殺傷を示す。本実施例で使用した細胞は口
内に存在する１種Ｓ．ｓａｎｇｕｉｓである。本実施例
で使用した抗体は標準的な技術で作成した。Ｓ．ｓａｎ
ｇｕｉｓ細胞は遠心して培養ブロスから取り出し、ＰＢ
Ｓに再懸濁して遠心した後ＰＢＳに再懸濁することによ
って三回洗浄した。試料をいくつかのチューブの各々に
入れ、遠心し、マウスポリクローナル抗−Ｓ．ｓａｎｇ
ｕｉｓ抗体（腹水から得た）の▲ろ▼過滅菌した懸濁液
（ＰＢＳ中）に再懸濁した。この懸濁液を室温で３０分
間インキュベートして抗体を細胞に結合させた。細胞を
再度遠心し、ＰＢＳで洗浄した。比較として使用したい
くつかのチューブにはマウス抗−Ｓ．ｓａｇｕｉｓ懸濁
液の代わりにＰＢＳを入れた。次に、細胞を以下のもの
を含有する１ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。 グルコースオキシダーゼ（Ｇ．Ｏｘ）
１００μｇ／ｍｌ
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
１００μｇ／ｍｌ マウス抗−Ｇ．
Ｏｘモノクローナル抗体
１．２５μｇ／ｍｌ マウス抗−ＨＲＰモノクロ
ーナル抗体 １．２５
μｇ／ｍｌ ラビット抗−マウスポリクローナル
抗体 ５０μｇ／ｍｌ
（ただし、ラビット抗−マウス抗体は他の４種のものを
さきに添加してある溶液に加えた。）いくつかのチュー
ブでは、酵素と抗体を含む上記溶液の代わりにＰＢＳの
みを使用した。別のチューブでは、酵素と抗体を含んで
はいるがラビット抗−マウス抗体を含まない溶液を使用
した。すべての懸濁液を室温で３０分インキュベートし
て酵素を細胞に結合させた。その後、細胞を遠心により
取り出し、ＰＢＳで洗浄し、ヨウ化カリウム１５μｇ／
ｍｌとグルコース５％ｗ／ｖとを含有するＰＢＳ１ｍｌ
中に再懸濁した。これらの懸濁液を室温で２４時間イン
キュベートした。このインキュベーションの開始時とそ
の１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、および２
４時間後に各懸濁液からサンプルを取り出した。各サン
プルの生存細胞を実施例１と同様な方法で分析した。得
られた結果を下記表３に示す。
【表３】
両方の酵素が標的細胞に結合しているサンプルＢで、他
のサンプルよりずっと有効な細胞殺傷効果が得られた。 実施例５ 本実施例では、標的に向かう２種の酵素を使用して歯の
着色（染み）を漂白するインビトロモデルを提供する。 モデル表面としてニトロセルロース膜を使用した。この
膜を正常なマウス血清と共に１時間インキュベートした
。このような血清はイムノグロブリンを含有している。 その結果、マウスの抗体がこの膜に結合するようになっ
た。次に、この膜を３％ウシ血清アルブミン溶液と共に
インキュベートして膜に残っているタンパク質結合部位
をすべてブロックした。こうして処理した膜のサンプル
をコントロールサンプルおよびテストサンプル（各４）
として使用した。次に、この膜のテストサンプルを以下
のものを含む溶液と共にインキュベートした（ただし、
コントロールサンプルは除く）。 グルコースオキシダーゼ（Ｇ．Ｏｘ）
１００μｇ／ｍｌ
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
１００μｇ／ｍｌ マウス抗−Ｇ．
Ｏｘモノクローナル抗体
１．２５μｇ／ｍｌ マウス抗−ＨＲＰモノクロ
ーナル抗体 １．２５
μｇ／ｍｌ ラビット抗−マウスポリクローナル
抗体 ５０μｇ／ｍｌ
これは前の実施例で使用したものと類似のものである。 これによって、図２に示したようなコンプレックスが形
成する。標的はニトロセルロース膜である。次に、コン
トロールサンプルとテストサンプルに茶の染みをつけた
。すなわち、沸騰水で煎じた茶の葉（２重量％）の滲出
液を室温まで放冷し、テストサンプルおよびコントロー
ルサンプルと共に５分間インキュベートした後、サンプ
ルをＰＢＳで１時間すすいで固定されなかった染みを除
去した。グルコース５．４重量％を含有するｐＨ７．２
のＰＢＳ溶液中でサンプルを一晩（１８時間）インキュ
ベートした。これによって、固定された酵素に対する基
質が与えられ、茶の染みの近くで反応性の分子種が生成
すると期待された。反射率を測定するＭｉｎｏｌｔａＣ
Ｒ ２００クロモメーターを用いて、グルコース溶液
と共にインキュベーションする前と後のサンプルの染み
の程度を評価した。結果は数値的に表わした。観察され
た反射率の増加と標準偏差は次の通りである。 テストサンプル（酵素を含む
） １．１７±０．０４２
コントロールサンプル ０．１５±
０．３１これは、コントロールサンプルと比較してテス
トサンプルでは明るさが統計的に有意（ｐ＜０．０５）
に増大することを示している。
のサンプルよりずっと有効な細胞殺傷効果が得られた。 実施例５ 本実施例では、標的に向かう２種の酵素を使用して歯の
着色（染み）を漂白するインビトロモデルを提供する。 モデル表面としてニトロセルロース膜を使用した。この
膜を正常なマウス血清と共に１時間インキュベートした
。このような血清はイムノグロブリンを含有している。 その結果、マウスの抗体がこの膜に結合するようになっ
た。次に、この膜を３％ウシ血清アルブミン溶液と共に
インキュベートして膜に残っているタンパク質結合部位
をすべてブロックした。こうして処理した膜のサンプル
をコントロールサンプルおよびテストサンプル（各４）
として使用した。次に、この膜のテストサンプルを以下
のものを含む溶液と共にインキュベートした（ただし、
コントロールサンプルは除く）。 グルコースオキシダーゼ（Ｇ．Ｏｘ）
１００μｇ／ｍｌ
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）
１００μｇ／ｍｌ マウス抗−Ｇ．
Ｏｘモノクローナル抗体
１．２５μｇ／ｍｌ マウス抗−ＨＲＰモノクロ
ーナル抗体 １．２５
μｇ／ｍｌ ラビット抗−マウスポリクローナル
抗体 ５０μｇ／ｍｌ
これは前の実施例で使用したものと類似のものである。 これによって、図２に示したようなコンプレックスが形
成する。標的はニトロセルロース膜である。次に、コン
トロールサンプルとテストサンプルに茶の染みをつけた
。すなわち、沸騰水で煎じた茶の葉（２重量％）の滲出
液を室温まで放冷し、テストサンプルおよびコントロー
ルサンプルと共に５分間インキュベートした後、サンプ
ルをＰＢＳで１時間すすいで固定されなかった染みを除
去した。グルコース５．４重量％を含有するｐＨ７．２
のＰＢＳ溶液中でサンプルを一晩（１８時間）インキュ
ベートした。これによって、固定された酵素に対する基
質が与えられ、茶の染みの近くで反応性の分子種が生成
すると期待された。反射率を測定するＭｉｎｏｌｔａＣ
Ｒ ２００クロモメーターを用いて、グルコース溶液
と共にインキュベーションする前と後のサンプルの染み
の程度を評価した。結果は数値的に表わした。観察され
た反射率の増加と標準偏差は次の通りである。 テストサンプル（酵素を含む
） １．１７±０．０４２
コントロールサンプル ０．１５±
０．３１これは、コントロールサンプルと比較してテス
トサンプルでは明るさが統計的に有意（ｐ＜０．０５）
に増大することを示している。
【図１】〜
【図４】それぞれ、酵素が抗体を介して標的に結合して
いる場合の種々の配置を示している。
いる場合の種々の配置を示している。
【図５】〜
【図７】それぞれ、ポリエチレンイミンを使用して形成
された複合体が抗体を介して標的に結合している場合の
種々の配置を示している。
された複合体が抗体を介して標的に結合している場合の
種々の配置を示している。
【図８】抗体断片を介して標的に結合している酵素を示
している。
している。
Ｇ．Ｏｘ グルコースオキシダーゼ、ＨＲＰ ホー
スラディッシュペルオキシダーゼ、ＰＥＩ ポリエチ
レンイミン、 １０、４０ 標的（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、１２、４２
抗原部位、 １４、１６ 抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓ抗体、２０ 第
一の抗体（ラビット抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓ抗体）、 ２２ ラビット抗−グルコースオキシダーゼ抗体、２
４ ラビット抗−ホースラディッシュペルオキシダー
ゼ抗体、 ２６、３６ ヤギ抗−ラビットイムノグロブリン、３
０ ウシ抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓ抗体、３２ ラビッ
ト抗−ウシイムノグロブリン、３４ ヒツジ抗−ラビ
ットイムノグロブリン、３７ 抗−ウシ抗体／抗−グ
ルコースオキシダーゼ抗体二重抗体複合体、 ３８ 抗原、 ３９ 抗−標的抗体、 ４４ 抗−標的Ｆｖ断片、 ４６ ペプチド、 ４８、５０ 抗−酵素Ｆｖ断片、 ５２ Ｆ（ａｂ）２断片。
スラディッシュペルオキシダーゼ、ＰＥＩ ポリエチ
レンイミン、 １０、４０ 標的（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、１２、４２
抗原部位、 １４、１６ 抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓ抗体、２０ 第
一の抗体（ラビット抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓ抗体）、 ２２ ラビット抗−グルコースオキシダーゼ抗体、２
４ ラビット抗−ホースラディッシュペルオキシダー
ゼ抗体、 ２６、３６ ヤギ抗−ラビットイムノグロブリン、３
０ ウシ抗−Ｓ．ｍｕｔａｎｓ抗体、３２ ラビッ
ト抗−ウシイムノグロブリン、３４ ヒツジ抗−ラビ
ットイムノグロブリン、３７ 抗−ウシ抗体／抗−グ
ルコースオキシダーゼ抗体二重抗体複合体、 ３８ 抗原、 ３９ 抗−標的抗体、 ４４ 抗−標的Ｆｖ断片、 ４６ ペプチド、 ４８、５０ 抗−酵素Ｆｖ断片、 ５２ Ｆ（ａｂ）２断片。
Claims (16)
- 【請求項１】 １つ以上のビヒクルを含む製品であっ
て、 ｉ） 標的に対して活性のある物質を発生させる酵素
と、この第一の酵素に対する基質となる中間体を発生さ
せる第二の酵素とからなる２種類の酵素のうちの少なく
とも１種、および ｉｉ） 標的部位に結合することができる抗体または
抗体断片の少なくとも１種が、前記ビヒクルの１つに含
まれているか、または複数のビヒクル間に分配されてお
り、前記酵素の各々が前記抗体もしくは抗体断片に結合
しているか、または、前記製品が、その使用時に前記酵
素を前記抗体もしくは抗体断片に結合させる手段を含ん
でおり、使用時には前記酵素が互いに近接して前記標的
部位に結合するようになっている製品。 - 【請求項２】 第一の酵素が過酸化水素を発生させる
オキシダーゼであり、第二の酵素がペルオキシダーゼで
ある、請求項１に記載の製品。 - 【請求項３】 前記酵素を両方とも含んでいる、請求
項１または２に記載の製品。 - 【請求項４】 各々の酵素が抗体に化学的に結合して
いる、請求項１〜３のいずれかに記載の製品。 - 【請求項５】 少なくとも１種の酵素が、標的部位に
結合することができる抗体に抗原−抗体結合によって結
合している抗体に化学的に結合している、請求項１〜３
のいずれかに記載の製品。 - 【請求項６】 酵素を互いに連結する手段を含んでお
り、この連結手段が、標的部位に結合することができる
抗体もしくは抗体断片とは別であるがそれに結合してい
るかまたは結合することができる、請求項１〜５のいず
れかに記載の製品。 - 【請求項７】 前記連結手段と、標的部位に結合する
ことができる抗体または抗体断片との結合が、抗原−抗
体結合を介して行なわれる、請求項６に記載の製品。 - 【請求項８】 一方の酵素が、標的部位に結合するこ
とができる抗体に結合している第二の抗体に結合してい
るかまたは結合することができ、他方の酵素が、前記第
二の抗体に結合している第三の抗体に結合しているかま
たは結合することができる、請求項７に記載の製品。 - 【請求項９】 少なくとも１種の酵素がそれぞれの抗
体に化学的に結合している、請求項８に記載の製品。 - 【請求項１０】 両方の酵素が、前記連結手段を提供
するキャリヤ物質に化学的に結合している、請求項６に
記載の製品。 - 【請求項１１】 キャリヤ物質がポリエチレンイミン
である、請求項１０に記載の製品。 - 【請求項１２】 標的部位が口内細菌種である、請求
項１〜１１のいずれかに記載の製品。 - 【請求項１３】 前記１つまたは複数のビヒクルが口
内で使用可能である、請求項１〜１２のいずれかに記載
の製品。 - 【請求項１４】 練り歯磨、うがい薬もしくは薬用ド
ロップであるか、または少なくとも１つのビヒクルが練
り歯磨、うがい薬もしくは薬用ドロップによって提供さ
れる、請求項１３に記載の製品。 - 【請求項１５】 請求項１〜１４のいずれかに記載の
製品を投与することからなる、標的を攻撃する方法。 - 【請求項１６】 標的を攻撃する方法であって、ｉ）
標的に対して活性のある物質を発生させる酵素と、
この第一の酵素に対する基質となる中間体を発生させる
第二の酵素とからなる２種類の酵素のうちの少なくとも
１種、および ｉｉ） 標的部位に結合することができる抗体または
抗体断片の少なくとも１種を投与することからなり、前
記酵素の各々が前記抗体もしくは抗体断片に結合してい
るか、または使用時に前記酵素を前記抗体もしくは抗体
断片に結合させる手段が含まれており、使用時には前記
酵素が互いに近接して前記標的部位に結合するようにな
っている方法。
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| GB9006328.0 | 1990-03-21 | ||
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| GB9021671.4 | 1990-10-05 |
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|---|---|---|---|---|
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| US4657853A (en) * | 1984-09-14 | 1987-04-14 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Immunoassays utilizing covalent conjugates of polymerized enzyme and antibody |
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| US4943525A (en) * | 1987-11-02 | 1990-07-24 | Bioventures, Inc. | Simultaneous immunoassay for the determination of antigens and antibodies |
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-
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- 1991-03-18 AU AU72996/91A patent/AU642979B2/en not_active Ceased
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- 1991-03-20 ES ES91302397T patent/ES2088464T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-20 DE DE69120452T patent/DE69120452T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-03-20 EP EP91302397A patent/EP0450800B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-03-20 AT AT91302397T patent/ATE139704T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-03-20 JP JP3130820A patent/JPH04234821A/ja active Pending
- 1991-03-21 BR BR919101118A patent/BR9101118A/pt not_active Application Discontinuation
- 1991-03-21 IN IN84BO1991 patent/IN172886B/en unknown
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|---|---|
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| DE69120452T2 (de) | 1996-10-31 |
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| ATE139704T1 (de) | 1996-07-15 |
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