JPH04244231A - 体外循環治療用の補体の活性化抑制材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、長期透析患者にみられ
る手根管症候群の病因物質と考えられているβ２　−　
ミクログロブリンを除去するための体外循環治療用β２
　−　ミクログロブリン吸着体に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】近年
、長期にわたって人工透析をうけた患者に手根管症候群
と呼ばれる疾患が多発している。手根管症候群とは、正
中神経が手根管部で圧迫され、正中神経の麻痺症状を呈
する疾患である。かかる患者の患部にはアミロイド物質
と呼ばれるβ−　フィブリル状の蛋白が沈着し、かかる
アミロイド物質に対応する前駆蛋白が、患者の血液中に
存在するアミノ酸からなる低分子量蛋白質であるβ２　
−　ミクログロブリンであることが明らかにされている
。

【０００３】そこでこれまでに、血液または血漿中の成
分をそのサイズに応じてある程度選択的に分離する膜を
用いることによってかかるβ２　−　ミクログロブリン
を分離する試みがなされているが、β２　−　ミクログ
ロブリンと同時に他の有用な蛋白質が除去されたり、β
２　−　ミクログロブリンの除去量が少ないなどの欠点
があるため、より選択的かつ効率よく大量にβ２　−　
ミクログロブリンを除去しうる方法が望まれている。

【０００４】またβ２　−　ミクログロブリンを除去す
る他の方法としては、現在のところあまり試みられてい
ないが、たとえば抗β２　−　ミクログロブリン抗体を
担体に固定した免疫吸着体を用いてβ２　−　ミクログ
ロブリンを吸着除去する方法が考えられている。これら
の吸着体はβ２　−　ミクログロブリンに対して高い選
択性を示すが、抗β２　−　ミクログロブリン抗体など
のリガンドは高価であり、また吸着体の保存安定性が悪
く滅菌が困難であるなどの欠点を有しており、治療用の
吸着体としては実用的ではない。

【０００５】さらにこれらの吸着体は血液あるいは血漿
成分と直接接触してβ２　−　ミクログロブリンを血液
あるいは血漿中から吸着除去し、その後再び血液を患者
体内に戻すものであることから、他の有用な血中成分の
吸着以外に、白血球、血小板、補体などの活性化につい
ても考慮しなくてはならない。血中の成分は親水性の表
面を持つものには吸着しにくいといわれており、したが
って親水性の表面が有利である。また、白血球や血小板
の活性化についても親水性の表面が有利である。しかし
ながら、親水性の硬質担体として血液あるいは血漿の体
外循環療法に最適なセルロース系の担体は補体系の活性
化を起こすことが知られている（ピー・ビー・シン（Ｐ
．　Ｂ．　Ｓｉｎ　）ら、バイオケミカル・ジャーナル
（Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｊ．　）、１９３巻、１１５　頁
（１９８１年）参照）。

【０００６】補体は新鮮血清中に存在し、免疫複合体に
非特異的に反応する易熱性の因子で、第１成分、第２成
分…第９成分の９個の成分タンパク質からなる。各成分
は順に活性化されるが、第１成分から第５成分までの反
応ではポリペプチド鎖の切断が起こり、前駆体から活性
型へと変化する。このようにして生じたフラグメントの
中には、アナフィラトキシンといわれるＣ３ａやＣ５ａ
のように強い生物活性を持ったものがあるほか、補体の
活性化が手根管症候群の一因であるとの説もあることか
ら、補体の活性化はできるだけ避けなければならない。

【０００７】そこで本発明者らは、β２　　−　　ミク
ログロブリンを大量に吸着除去でき、さらにβ２　−　
ミクログロブリンの吸着速度および吸着量が大きく、し
かも吸着選択性にすぐれ、そのうえ血中成分、とくに補
体の活性化を抑えることができる吸着体をうるべく鋭意
研究を重ねた結果、疎水性リガンドの量を一定範囲にし
て担体に固定することにより、β２　−　ミクログロブ
リンの吸着量および吸着速度、さらに吸着選択性を高く
保ちつつ、血中成分、とくに補体の活性化を抑えること
ができることを見出だし、本発明を完成するにいたった
。

【０００８】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は多孔
質水不溶性担体に炭素数４以上のアルキル基を有するリ
ガンドを固定してなる吸着体であって、リガンド量が８
〜６０μｍｏｌ／ｍｌ担体であることを特徴とする体外
循環治療用β２　−　ミクログロブリン吸着体に関する
。

【０００９】

【実施例】本発明の体外循環治療用β２　−　ミクログ
ロブリン吸着体は、多孔質水不溶性担体に炭素数４以上
のアルキル基を有するリガンドを固定したものである。

【００１０】本発明に用いられる多孔質水不溶性担体と
しては、たとえばガラスビーズ、シリカゲルなどの無機
担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレー
ト、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの
合成高分子化合物や結晶性セルロース、架橋セルロース
、架橋アガロース、架橋デキストリンなどの多糖類から
なる有機担体、さらにはこれらの組合せによってえられ
る有機−有機、有機−無機などの複合担体などが代表例
としてあげられる。本発明に用いられる多孔質水不溶性
担体は親水性であっても疎水性であってもよいが、親水
性担体が非特異吸着が比較的少なくβ２　−　ミクログ
ロブリンの吸着選択性が良好であるので好ましい。ここ
で親水性担体とは、担体を構成する化合物を平板状にし
たときの水との接触角が６０度以下の担体をいう。この
ような担体としてはたとえば、セルロース、セルロース
誘導体、架橋ポリビニルアルコール、エチレン−酢酸ビ
ニル共重合体けん化物、架橋ポリアクリルアミド、架橋
ポリアクリル酸、架橋ポリメタクリル酸、ポリメタクリ
ル酸メチル、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレ
ン、ガラスなどからなる担体が代表例としてあげられる
が、セルロースおよびセルロース誘導体は、■機械的強
度が比較的大きく強靭であるため、撹拌などの操作によ
り破壊されたり微粉を生じたりすることが少なく、カラ
ムに充填したばあいに体液を高流速で流しても圧密化や
、目詰まりしないので高流速で流すことが可能となり、
また細孔構造が高圧蒸気滅菌などによって変化を受けに
くい■親水性であり、リガンドの結合に利用しうる水酸
基が多数存在し、非特異吸着も少ない■空孔容積を大き
くしても比較的強度が大きいため軟質ゲルに劣らない吸
着容量がえられる■血液適合性が合成高分子に比べて高
いなどのすぐれた点を有しており、本発明に用いる最も
適した担体の１つである。

【００１１】前記セルロースとは、いわゆる天然セルロ
ースまたは再生セルロースのことであり、たとえば天然
セルロースには木綿繊維を脱脂したもの、麻類の繊維、
木材からリグニンやヘミセルロースなどを除去してえら
れるパルプ、該パルプをさらに精製してえられる精製セ
ルロースなどがその代表例としてあげられるが、これら
に限定されるものではない。なお前記再生セルロースと
は、セルロースをいったん成形しやすいセルロース誘導
体にして成形したのち、加水分解などによりセルロース
を再生させたセルロースのことである。

【００１２】また前記セルロース誘導体とは、たとえば
セルロースの水酸基の一部または全部がエステル化やエ
ーテル化などされたもの、セルロースの水酸基の一部が
エステル化され、一部がエーテル化されたものなど、セ
ルロースから誘導されたもののことである。

【００１３】前記セルロースの水酸基の一部または全部
がエステル化されたものの具体例としてはたとえば、酢
酸セルロース、プロピオン酸セルロース、酪酸セルロー
ス、ニトロセルロース、硫酸セルロース、リン酸セルロ
ース、酢酸酪酸セルロース、硝酸セルロース、セルロー
スのジチオカルボン酸エステル（ビスコースレーヨン）
などがあげられるが、これらに限定されるものではない
。

【００１４】前記セルロースの一部または全部がエーテ
ル化されたものの具体例としてはたとえば、メチルセル
ロース、エチルセルロース、ベンジルセルロース、トリ
エチルセルロース、シアンエチルセルロース、カルボキ
シメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、オ
キシエチルセルロースなどがあげられるが、これらに限
定されるものではない。

【００１５】前記セルロース系粒子を構成するセルロー
ス系材料の中では、精製セルロースが不純物が少なく、
溶解したときに未溶解物が少ないなどの点から好ましく
、酢酸セルロース、プロピオン酸セルロースなどのセル
ロースエステルが、多種の溶剤に溶解するため、粒子製
造時の種々の製造条件の選択範囲も広くなり、粒子の分
配係数やスキン層の厚さ、内部の網目状組織における孔
の大きさなどの調整が容易となり、所望のセルロース系
粒子を製造することができ、さらに加水分解することに
よって容易に再生セルロース粒子にすることもできるな
どの点から一層好ましい。

【００１６】ところで、本発明に用いられる多孔質水不
溶性担体は硬質担体および軟質担体のいずれであっても
よいが、カラムに充填し、通液する際などに目詰まりを
生じないようにするためには充分な機械的強度が要求さ
れるので、硬質担体であることがより好ましい。ここで
いう硬質担体とは、たとえば粒状ゲルのばあい、ゲルを
円筒状カラムに均一に充填し、水性流体を流した際の圧
力損失ΔＰと流量の関係が０．３ｋｇ／ｃｍ２　まで直
線関係にあるものをいう。

【００１７】なお、吸着体の表面には、リガンドの固定
化反応に用いうる官能基が存在していると好都合である
。これらの官能基の代表例としてはたとえば、水酸基、
アミノ基、アルデヒド基、カルボキシル基、チオール基
、シラノール基、アミド基、エポキシ基、ハロゲン基、
サクシニルイミド基、酸無水物基などがあげられる。

【００１８】本発明に用いられる多孔質水不溶性担体に
は、炭素数４個以上のアルキル基を有するリガンドが固
定されるが、その固定化の方法としては公知の種々の方
法を特別な制限なしに用いることができる。しかしなが
ら、本発明の吸着体は体外循環治療に供せられるため、
滅菌時または治療時においてのリガンドの脱離溶出を極
力抑えることが安全上重要であり、そのためには共有結
合法により固定化することが最も好ましい。

【００１９】固定化の方法としてはたとえばつぎのよう
なものがあげられる。 １）　長鎖脂肪酸をエステル結合で導入する方法。 ２）　セルロースのアルコキシドにハロゲン化長鎖アル
キルを反応させエーテル結合で導入する方法。 ３）　エピクロロヒドリンで活性化したセルロースに長
鎖アルキルアミンを反応させ、アミノ結合で導入する方
法。

【００２０】本発明において炭素数４個以上のアルキル
基を有するリガンドが用いられるのは、かかるリガンド
を用いたばあいにはβ２　−　ミクログロブリンに対す
る吸着能が大幅に向上するからである。炭素数４個未満
のアルキル基を有するリガンドでは疎水性が小さくなり
、満足しうるβ２　−　ミクログロブリンの吸着能が呈
されなくなる。

【００２１】前記アルキル基としては直鎖状、分岐鎖状
もしくは環状の脂肪族炭化水素のいずれであってもよく
、これらは飽和炭化水素であっても１個以上の不飽和結
合を有するものであってもよい。

【００２２】該アルキル基の具体例としてはたとえば、
ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−
オクチル基、ｎ−デシル基、ｎ−ドデシル基、ｎ−テト
ラデシル基、ｎ−ヘキサデシル基、ｎ−オクタデシル基
、ｉ−ブチル基、シクロヘキシル基、オレイル基などが
あげられ、これらの中ではｎ−ドデシル基、ｎ−テトラ
デシル基、ｎ−ヘキサデシル基、ｎ−オクタデシル基が
好ましく、さらにｎ−ヘキサデシル基、ｎ−オクタデシ
ル基が最も好ましい。

【００２３】前記炭素数４個以上のアルキル基を有する
リガンドの具体例としてはたとえば、前記のアルキル基
を有する飽和または不飽和炭化水素、アルコール、アミ
ン、チオール、カルボン酸およびその誘導体、ハロゲン
化物、アルデヒド、ヒドラジド、イソシアネート、グリ
シジルエーテルなどのオキシラン環含有化合物、ハロゲ
ン化シランなどがあげられるが、これら以外にもグリコ
ール類のモノアルキルエーテル、ジカルボン酸のモノア
ルキルエステルのごとき、化合物中のヘテロ原子に結合
したアルキル基を有する化合物を用いることができる。 なお、これらの化合物はそれぞれ単独で用いてもよく、
また任意の２種類以上を混合して用いてもよい。

【００２４】前記リガンドの多孔質水不溶性担体に対す
る賦与量は、多孔質水不溶性担体１ｍｌあたり８〜６０
μｍｏｌ　、とくに１５〜３５μｍｏｌ　であることが
好ましい。かかる賦与量が８μｍｏｌ　未満であるばあ
い、β２　−　ミクログロブリンの吸着量が不充分であ
るばかりでなく、血液との接触により補体の活性化が起
こりＣ３ａ、Ｃ５ａが多量に発生する。そのため、かか
る吸着体を利用して体外循環を行なうばあい、治療効果
を向上せしめるためには多量の吸着体を使用しなければ
ならず、体外循環血液量または血漿量も増えるうえに補
体の活性化によるアナフィラキシーショックの可能性も
高くなる。また、６０μｍｏｌ　をこえるばあい、血小
板の粘着および活性化が起こりやすくなりカラム内での
血液凝固の可能性が高くなる。

【００２５】本発明の吸着体を治療に用いるには種々の
方法がある。最も簡便な方法としてはたとえば、患者の
血液を体外に導出して血液バッグに貯め、これに本発明
の吸着体を混合してβ２　−　ミクログロブリンを除去
したのちフィルターを通して吸着体を除去し、血液を患
者に戻す方法などがある。この方法は複雑な装置を必要
としないので好ましい。他の方法は吸着体をカラムに充
填し、体外循環回路に組込み、オンラインで吸着除去を
行なうものである。処理方法には、全血を直接灌流する
方法と血液から血漿を分離したのち、血漿をカラムに通
す方法とがあり、本発明の吸着体はいずれの方法にも用
いることができるが、前記のごとくオンライン処理に最
も適している。

【００２６】つぎに本発明の吸着体を具体的な実施例に
よりさらに詳細に説明するが、本発明はかかる実施例の
みに限定されるものではない。

【００２７】実施例１ セルロース系多孔質硬質ゲル（数平均粒径　５４０μｍ
　で、±５％以内にすべての粒子径が入っており、表面
の孔に入らない最小の大きさの分子量が１６０００）　
１７０ｍｌに水を加えて全量を３４０ｍｌ　としたのち
、２Ｍ水酸化ナトリウム９０ｍｌを加えて４０℃とした
。これにエピクロルヒドリン３１ｍｌを加え、４０℃で
撹拌下に２時間反応させた。反応終了後、充分に水洗し
、エポキシ化ゲルをえた。

【００２８】このエポキシ化ゲル１０ｍｌにリガンドと
してｎ−デシルアミン１０ｍｇを加え、エタノール中で
室温で静置下８時間反応させた。反応終了後、エタノー
ルおよび水で充分に洗浄し、ｎ−デシルアミン固定化ゲ
ルをえた。

【００２９】えられたゲルのリガンド賦与量を下記の方
法で測定したところ、ゲル１ｍｌに対して８．４　μｍ
ｏｌ　であった。

【００３０】（リガンド賦与量）結合したアミンを塩酸
でイオン交換し、水酸化ナトリウム水溶液で逆滴定する
ことにより求める。

【００３１】（β２　−　ミクログロブリンおよびアル
ブミンの吸着量）このゲル０．４ｍｌ　にβ２　−　ミ
クログロブリン濃度６５μｇ／ｍｌの透析患者血清２．
４ｍｌを加え、３７℃で２時間インキュベートした。上
澄み液中のβ２　−　ミクログロブリンおよびアルブミ
ンの濃度を測定し、吸着体１ｍｌあたりのβ２　−　ミ
クログロブリンの吸着量を求めたところ、１５８　μｇ
／ｍｌゲルであった。

【００３２】つぎにこの吸着体の血液適合性試験の方法
および結果について述べる。

【００３３】（補体の活性化）まずこのゲルの補体の活
性化の測定方法および結果について述べる。なお、ここ
ではアナフィラキシーショックの原因であるＣ３ａ、Ｃ
５ａに着目して補体の活性化について評価を行なった。

【００３４】オートクレーブで滅菌後（１２１　℃、２
０分）、０．４ｍｌ　のゲルをポリスチレン製の遠沈管
中で５Ｕ／ｍｌのヘパリンを加えた生理食塩水で３回洗
浄したのち、新鮮な人血４ｍｌを加え、３７℃で３０分
間、３６回／ｍｉｎの速度で振盪し、その後活性化され
た補体のフラグメントであるＣ３ａ、Ｃ５ａの血漿中の
濃度を測定したところ、それぞれ２０８３ｎｇ／ｍｌ　
、１７．８ｎｇ／ｍｌ　であった。

【００３５】ブランクとしてゲルを入れずに新鮮な人血
４ｍｌだけを加えたばあい、Ｃ３ａ、Ｃ５ａはそれぞれ
７２７ｎｇ／ｍｌ、１１．３ｎｇ／ｍｌ　であり、また
リガンドをつけていない担体で補体の活性化を調べたと
ころ、Ｃ３ａ、Ｃ５ａはそれぞれ５９０５ｎｇ／ｍｌ　
、６３．１ｎｇ／ｍｌであった。このように、リガンド
量が８〜１５μｍｏｌ／ｍｌゲルの吸着体ではＣ３　は
多少活性化されたが、Ｃ５　はあまり活性化されていな
い。

【００３６】（血小板透過率）つぎに血小板透過率の測
定方法と結果を示す。吸着体１ｍｌを内径８ｍｍのカラ
ムに詰め、７Ｕ／ｍｌのヘパリンを加えた生理食塩水を
１００ｍｌ　流したのち、血液を流速０．５ｍｌ／ｍｉ
ｎ　で３０分間流し、血小板の透過率を測定したところ
、８０〜９３％であった。

【００３７】またリガンドを導入していないゲルについ
ては、９０〜９８％であった。

【００３８】実施例２ 実施例１の反応時間を４時間とした以外は同じ方法で吸
着体の合成を行なった。えられた吸着体について、実施
例１と同様の実験を行なった結果を以下に示す。

【００３９】リガンド賦与量：３．１　μｍｏｌ／ｍｌ
ゲル補体の活性化：Ｃ３ａ濃度　　３５７０ｎｇ／ｍｌ
Ｃ５ａ濃度　　３４．２ｎｇ／ｍｌ このように、リガンド賦与量が８μｍｏｌ／ｍｌゲル以
下の吸着体ではＣ３　、Ｃ５　ともかなり活性化されて
いる。

【００４０】また、血小板透過率については、８２〜９
５％と実施例１の吸着体よりはよくなっている。

【００４１】実施例３ 実施例１の反応時間を３６時間とし、加えたｎ−デシル
アミンの量を４０ｍｇとした以外は同じ方法で吸着体の
合成を行なった。えられた吸着体について、実施例１と
同様の実験を行なった結果を以下に示す。

【００４２】リガンド賦与量：５６．３μｍｏｌ／ｍｌ
ゲル補体の活性化：Ｃ３ａ濃度　　７５８　ｎｇ／ｍｌ
Ｃ５ａ濃度　　１０．９ｎｇ／ｍｌ このように補体の活性化はほとんど起こっていないが、
血小板透過率は４８〜６３％とかなり落ちていることが
わかる。

【００４３】実施例４ 実施例１の反応時間を２４時間とし、加えたｎ−デシル
アミンの量を２０ｍｇとした以外は同じ方法で吸着体の
合成を行なった。えられた吸着体について、実施例１と
同様の実験を行なった結果を以下に示す。

【００４４】リガンド賦与量：２３．３μｍｏｌ／ｍｌ
ゲルβ２　−　ミクログロブリン吸着量：３６０　μｇ
／ｍｌゲルアルブミン吸着量：４ｍｇ／ｍｌ　ゲル補体
の活性化：Ｃ３ａ濃度　　１１０２ｎｇ／ｍｌＣ５ａ濃
度　　１２．９ｎｇ／ｍｌ 血小板透過率：６５〜８０％ 実施例５ 実施例１の反応時間を２４時間とし、加えたｎ−デシル
アミンの量を３０ｍｇとした以外は同じ方法で吸着体の
合成を行なった。えられた吸着体について、実施例１と
同様の実験を行なった結果を以下に示す。

【００４５】リガンド賦与量：３４．８μｍｏｌ／ｍｌ
ゲル補体の活性化：Ｃ３ａ濃度　　８３０　ｎｇ／ｍｌ
Ｃ５ａ濃度　　１１．５ｎｇ／ｍｌ 血小板透過率：５８〜７６％ このように、リガンド量が担体１ｍｌあたり１５〜３５
μｍｏｌの範囲にあるとβ２　−ミクログロブリン吸着
量、吸着選択性、血液適合性のいずれもよいレベルには
いった。

【００４６】以上の結果を表１、表２にまとめる。

【００４７】

【表１】

【００４８】

【表２】

【００４９】以上のようにリガンド賦与量が８μｍｏｌ
／ｍｌ以下のばあいは補体の活性化が無視できず、５６
μｍｏｌ／ｍｌ以上になると血小板の透過率が悪くなっ
ていることから、リガンド賦与量の範囲が決定した。

【００５０】参考例１ 実施例４のデシルアミンをエチルアミンにした以外は同
様の方法で合成した。えられた吸着体について、実施例
１と同様の実験を行なった結果を以下に示す。

【００５１】リガンド賦与量：３３．４μｍｏｌ／ｍｌ
ゲルβ２　−　ミクログロブリン吸着量：２５μｇ／ｍ
ｌゲルこのように、リガンドのアルキル鎖長が４以下で
あるとβ２　−　ミクログロブリンの吸着量が極端に少
なくなってしまう。

【００５２】実施例６ 実施例４のデシルアミンをヘキシルアミンにした以外は
同様の方法で合成を行なった。えられた吸着体について
、実施例１と同様の実験を行なった結果を以下に示す。

【００５３】リガンド賦与量：３０．８μｍｏｌ／ｍｌ
ゲルβ２　−　ミクログロブリン吸着量：１３８　μｇ
／ｍｌゲル補体の活性化：Ｃ３ａ濃度　　１３５０ｎｇ
／ｍｌＣ５ａ濃度　　１３．１ｎｇ／ｍｌ 血小板透過率：６７〜８２％ 実施例７ 実施例４のデシルアミンをヘキサデシルアミンにした以
外は同様の方法で合成を行なった。えられた吸着体につ
いて、実施例１と同様の実験を行なった結果を以下に示
す。

【００５４】リガンド賦与量：２１．５μｍｏｌ／ｍｌ
ゲルβ２　−　ミクログロブリン吸着量：３８０　μｇ
／ｍｌゲル補体の活性化：Ｃ３ａ濃度　　１０７８ｎｇ
／ｍｌＣ５ａ濃度　　１２．６ｎｇ／ｍｌ 血小板透過率：６６〜８０％

【００５５】

【発明の効果】本発明の吸着体は、特定量の疎水性リガ
ンドを有するため、血液中からβ２　−ミクログロブリ
ンを吸着除去する際に、高い選択性と吸着量を維持した
うえで、補体の活性化をほとんど起こすことなく体外循
環治療を行なうことができるという効果を奏する。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　多孔質水不溶性担体に炭素数４以上の
   アルキル基を有するリガンドを固定してなる吸着体であ
   って、該担体に対するリガンド賦与量が担体１ｍｌあた
   り８〜６０μｍｏｌ　であることを特徴とする体外循環
   治療用β２　−　ミクログロブリン吸着体。
2. 【請求項２】　　多孔質水不溶性担体がセルロースまた
   はセルロース誘導体からなる請求項１記載の体外循環治
   療用β２　−　ミクログロブリン吸着体。