JPH0427844A - 不透明試料の顕微吸収分布測定装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は生体試料等の不透明試料のＮ微吸収分布測定方
法及びそのだめの装置に関し、特に、試料の微小領域の
吸収を正確に測定できるように、不要な散乱光を除去し
分解能を高めた顕微吸収分布測定方法及びそのだめの装
置に関する。

〔従来の技術〕

Ｘ線の発見以来、生体（人体）内部を外部より損傷を与
えずに観察する技術（非観血的、あるいは無侵襲的計測
法）は、生物学、特に医学の分野で強く求められ発達し
てきた。この技術は電磁波として見ると最も波長の短い
ガンマ線やＸ線と、最も波長の長いラジオ波が使用され
ている。前者はＸ線ＣＴとして、後者はＮＭＲ−ＣＴ　
（Ｍａｇｎｅｔｉｃ　　Ｒｅ５ｏｎａｎｃｅ　　ｒｍａ
ｇｉｎｇｌＭＲｒ）として実用化されている。

一方、物理や化学の分野で広く用いられている紫外−可
視一近赤外一赤外の領域の分光学を“丸ごと″生体（ｉ
ｎ　　ｖｉｖｏ）へ応用する試みは比較的少ない。これ
は光を用いた生体計測、特に吸収や発光の過程を利用す
るものにおいて、もつとも基本的な“定量性”に関し多
くの問題が解決されずに残されているからである。現在
、固体素子を用いた反射スペクトルの測定装置や高感度
ＴＶカメラ等による計測が試みられているが、再現性や
得られた絶対値に対し信頼性が少ないのはこの理由によ
る。

生体組織のような散乱体に光を照射した際、１８０°向
かい合わせで受光すればある程度直進光を取り出すこと
ができるが、今のところ、その空間分解能はあまり良い
とはいえない。

Ｘ線と光とでの空間分離能の差は今のところ埋めること
はできない。しかしながら光、特に近赤外光を用いると
、血液中のヘモグロビンから組織酸素濃度のイメージン
グができるはずである。これらは他のＮＭＲ−ＣＴやＸ
線ＣＴと異なった情報を与えてくれるであろう。

３〜５ｃｍの厚さの組織ならば、われわれは透過してき
た光を検出することができる。このことは“光−レント
ゲン写真”を診断に使えることを意味する。女憧の乳房
は組織が比較的均一であり光が透過しやすく、またその
形状から透過光の検出（厚さ二〜３ｃｍ程度）が容易で
あり、古くから乳ガンの診断に、Ｄｉａｐｈａｎｏｇｒ
ａｐｈｙ　（Ｌｉｇｈｔｓｃａｎｎｉｎｇ）という名で
用いられてきた。

このような状況の下で、本発明者は、特願平１−６２８
９８号、特願平１−２５００３４号、特願平２−７７６
９０号等において、散乱光に混入している平面波を分離
して取り出し、観察するには、平面波のフランフオーフ
ァ回折像（エアリ−ディスク）００次スペクトル（エア
リ−ディスクの第１暗輪内の部分が対応する。）のみを
観察するようにすればよく、このようにすることによっ
て散乱成分を殆ど除くことができることを示した。

そして、このような観察を実現する高指向性光学系の１
つとして、第１６図のように相互に離れた２つのピンホ
ールＰ　ｌ、　Ｐ　ｘからなる光学系を提案した。この
光学系は、ピンホールＰ、を通して０次光を検出器２３
で検出するものである。また、第１７図に示すように、
直線状の細長い中空のガラス繊維３５からなっており、
その内壁面には光吸収材、例えばカーボン等の吸収材３
５が塗布されている高指向性光学系を提案した。さらに
、第１８図から第２５図に示すような、対物レンズＯｂ
とその焦点面に配置した対物レンズｏｂによるフランフ
ォーファ回折の０次の回折像のみを通過させるピンホー
ルＰとからなる高指向性光学系（第１８図）、屈折率分
布レンズＧＬとその一端の焦点面に配置した同様なピン
ホールＰとからなる高指向性光学系（第１９図）、ピン
ホールＰの代わりにそれと同様な作用をする光ファイバ
ーＳＭを配置した高指向性光学系（第２０図、第２１図
）、これらの高指向性光学系のピンホールＰ又は光ファ
イバーＳＭの出射側に、入射側の対物レンズＯｂｌと同
様の対物レンズＯｂ２を配置した高指向性光学系（第２
２図、第２４図））、入射側の屈折率分布レンズＧＬＩ
と同様の屈折率分布レンズＧＬ２を配置した高指向性光
学系（第２３図、第２５図）等を提案した。

ところで、従来、散乱を伴う試料の顕微吸収分布を測定
するには、例えば第２６図に示したように、広範囲のス
ペクトル成分の光を発光する光源からの光をフーリエ分
光用の干渉計を通して透過型と反射型の切替鏡により透
過光路又は落射光路に切り換える。透過型の場合、コン
デンサーレンズの作用をする下側のカセグレイン系によ
り、照明光を試料台上の試料の微小点に絞って当て、そ
の点を透過した光及びその点で前方散乱を受けた光を対
物レンズの作用をする上側のカセグレイン系によりアパ
ーチャー上に結像し、アパーチャーを通過した光を検出
器に入射させて、その点の吸収特性を測定する。そして
、試料台をＸ−Ｙ方向に走査して同様な測定を繰り返す
ことにより、試料の透過顕微吸収分布を測定することが
できる。

切替鏡を落射光路に切り換え、上側のカセグレイン系に
より照明光を絞って試料上の点へ当て、その点より後側
に反射散乱された光を同じ上側のカセグレイン系により
アパーチャー上に結像し、同様にして、試料の反射顕微
吸収分布を測定することができる。

また、微小な部分の吸収スペクトルを調べる方法として
、光学顕微鏡と分光光度計とを組み合せた顕微分光法の
別の従来法として、第２７図に示したものがある。光源
ｌからの光を分光器ｍｏで単色光とし、絞り（ピンホー
ル）ｐを照明する。

この絞りｐを顕微鏡系の光源とし、照明用顕微鏡ｍ＋に
光を通すと、絞りｐの縮小された像が試料面Ｓにできる
。これをもう１個の顕微鏡ｍ２によって拡大し、検出器
ｄに導く。このとき、絞りの縮小像の位置Ｓに試料を置
けば、試料の中の局部的な部分だけの吸光度を測定する
ことができる。

ところで、従来、散乱を伴う試料の吸収スペクトルを散
乱のない試料と同じ測定法で求めると、散乱による影響
が大きくなり正確な吸収スペクトルは得られない。これ
ら散乱を伴う不透明試料の吸収測定法として、オパール
グラスや積分球等を用いて透過積分減光度を測定する測
定法は知られている（例えば、柴田和雄著「先生物シリ
ーズ分光測定入門」第６２〜８２頁、昭５１１６．２０
、共立出版■）発行）参照）。

〔発明が解決しようとする課題〕 ところで、前述したフリーエ分光器を用いた赤外領域の
顕微分光測定法も、回折折子分光器を用いた可視領域の
顕微分光測定法も、散乱を伴う不透明試料に対する対策
をしていないため、これらの試料の測定は誤差が大きく
、信頼できるデータは得られない。すなわち、測定点の
前後を含む周囲から不要な散乱光が混入するたｔ１正確
な吸収特性を測定することができず、また、対物レンズ
に０次以外のフランフォーファ回折像成分が入ってくる
ため、分解能に限界がある。不透明試料の吸収測定法と
して開発されたオパールグラスや積分球を用いた測定法
と顕微分光測定法を単に結び付けた測定法は、検出信号
光が弱く測定が困難となるため、実用化されない。また
、検出感度が飛躍的に向上されても、オパールグラス法
や積分球を用いた方法はあくまで近似法であるため、反
射光束が大きくなったり、散乱透過光束の波長変化と散
乱反射光束の波長変化が同じであると近似できない試料
では、誤差が大きく使用できない。このように、散乱を
伴う不透明試料の微小な部分の吸収スペイトルは、現在
、適切な測定法がないのが現状である。

本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、
その目的は、生体組織等の不透明試料の微小領域の吸収
を正確に測定できるように、不要な散乱光を除去し、分
解能を高めた顕微吸収分布測定方法及びそのための装置
を提供することである。

〔課題を解決するための手段〕

上記目的を達成する本発明の不透明試料の顕微吸収分布
測定方法は、試料の微小な測定点に指向性の高い光を集
光して照射し、測定点から発散する光を平行光に変換し
て、その平行光のみの強度を高指向性検出系を用いて検
出し、かつ、試料を前記集光光に対して相対的に走査し
ながら前記検出操作を繰り返すことにより、試料の吸収
分市特法を測定することを特徴とする方法である。

この場合、測定点に極近接して集光光のフランフォーフ
ァ回折像成分の０次像の大きさより小さいピンホールを
配置して照明領域を制限するようにすると、より分解能
の高い顕微吸収分布測定が可能となる。

さらに、指向性の高い光として可変波長の光を用いるこ
とにより、顕微分光吸収分布測定が可能となる。

また、測定点から検出器に到る光路中に照射光の波長の
光を遮断する励起光カットフィルターを挿入することに
より、試料の顕微蛍光分布測定が可能になる。

また、試料に照射する照射光束の一部を取り出してその
光束強度を検出して参照光強度とし、高指向性検出系を
用いて検出した光強度を試料からの信号光強度として透
過積分減光度を求めるようにすることもできる。

また、このような方法を実施する本発明の不透明試料の
顕微吸収分布測定製蓋の第１のものは、波長変更可能な
単色光源からの光を２分して、方の光路中に入射光の周
波数をシフトさせる周波数シフト手段を設け、他方の光
路中に２個の収束光学系よりなる共焦点光学系を配置し
、共焦点光学系の集光位置に相対的に走査可能な試料を
配置し、周波数シフト手段から射出する指向性の高い光
と試料の測定点から発散され共焦点光学系によって平行
光に変換された光とを合成して同方向に射出させるビー
ム合成手段を設け、ビーム合成手段によって合成された
光を電気信号に変換してシフト周波数に等しい交流成分
のみの強度を検出する検出手段を設けたことを特徴とす
るものである。

第２の不透明試料の顕微吸収分布測定装置は、波長変更
可能な単色光源からの光を２分して、方の光路中に光路
長を所定速度で変更する光路長変更手段を設け、他方の
光路中に２個の収束光学系よりなる共焦点光学系を配置
し、共焦点光学系の集光位置に相対的に走査可能な試料
を配置し、光路長変更手段から射出する指向性の高い光
と試料の測定点から発散され共焦点光学系によって平行
光に変換された光とを合成して同方向に射出させるビー
ム合成手段を設け、ビーム合成手段によって合成された
光を電気信号に変換して光路長変更速度に応じた周波数
の交流成分のみの強度を検出する検出手段を設けたこと
を特徴とするものである。

さらに、本発明の第３の不透明試料の顕微吸収分布測定
装置は、波長変更可能な単色光源から出る光の光路中に
２個の収束光学系よりなる共焦点光学系を配置し、共焦
点光学系の集光位置に相対的に走査可能な試料を配置し
、試料の測定点から発散され共焦点光学系によって平行
光に変換された光の進行方向の光のみを抽出する高指向
性光学系を配置し、高指向性光学系により抽出された光
の強度を検出する検出手段を設けたことを特徴とするも
のである。

第３の装置の場合、波長変更可能な単色光源から出る光
の光路中に２光路切替え手段を設け、方の光路と他方の
光路が同軸でかつ光の進行方向が反対になるように構成
し、同軸になった光路中に前記共焦点光学系を配置し、
前屈共焦点光学系の一方の側に試料を透過した光又は試
料により反射散乱された光を取り出す光取り出し手段を
設け、光取り出し手段の後方に前記高指向性光学系を配
置することにより、１つの装置で試料の透過光と反射散
乱光の両吸収分布特性を測定することができる。

第１の装置の変形である第４の不透明試料の顕微吸収分
布測定装置は、波長変更可能な単色光源からの光を２分
して一方の光路中に入射光の周波数をシフトさせる周波
数シフト手段を設け、他方の光路中に指向性の高い光を
集光して試料の微小な測定点に照射する第１の収束光学
系を配置し、第１の収束光学系の集光位置に相対的に走
査可能な試料を配置し、周波数シフト手段から射出する
指向性の高い光を試料に照射する第１の収束光学系と同
じ収束球面波となる第２の収束光学系を配置し、両光束
を合成して同方向に射出するビーム合成手段を設け、ビ
ーム合成手段によって合成された光を電気信号に変換し
てシフト周波数に等しい交流成分のみの強度を検出する
検出手段を設けたことを特徴とするものである。

これらのいずれの装置も、試料を透過した光強度又は特
定方向に反射される光強度を信号光強度とし、照射光束
の全部又はその一部を取り出して参照光強度として、透
過積分減光度を求めるようにすることができる。高指向
性検出系を用いる場合、照射光束の一部を取り出して参
照光強度とし、高指向性検出系を用いて検出した光強度
を信号強度として透過積分減光度を求めるようにする。

ヘテロダイン検出系、マイケルソン検出系を用いる場合
、散乱性試料からの光を遮断して、周波数シフト手段又
は光路長変更手段から射出する指向性の高い光のみを検
出して参照光強度とし、ヘテロゲイン検出系又はマイケ
ルソン検出系のビート成分を信号光強度として透過積分
減光度を求めるようにする。

〔作用〕

本発明の不透明試料の顕微吸収分布測定方法及び装置に
よれば、試料の微小な測定点に指向性の高い光を集光し
て照射し、測定点から発散する光を平行光に変換して、
又は、球面波のままその強度をヘテロダイン受光系、マ
イケルソン受光系、高指向性光学系等の高指向性検出系
を用いて検出するって、測定点周囲からの散乱光、その
他のノイズ光を拾うことなく高分解能でｔＪ＝）の微小
領域の吸収を正確に測定でき、生体組織等の不透明試料
の顕微吸収分布測定に適した方法及び装置である。

〔実施例〕

従来、高感度でコヒーレント光を検出する手段としてヘ
テロダイン受光系が知られている。この受光系３は、例
えば第１図に簡単に示したように、レーザ１から出た特
定の周波数ω１の光をビームスプリッタ−ＢＳにより２
分し、一方の直進光中に試料Ｓを挿入し、他方の反射光
はミラーＭ１、Ｍ２を経て上記直進光とハーフミラ−Ｈ
Ｍにより合成し、その合成光を検出器２により光電変換
する。反射光中に周波数をシフトさせてω２にする超音
波光学変調器等の周波数シフターＡＯを挿入すると、検
出器２からは周波数ω１とω３の差の観測可能な周波数
のビート信号が表れ、その交流成分の強さは試料Ｓの透
過率に比例する。したがって、試料Ｓを透過した微弱な
信号を検知することができることになる。ところで、こ
のようなヘテロダイン受光系３は、上記のような微弱な
信号を検知できるだけでなく、試料Ｓによって上記反射
光（周波数ω２の光。以下、参照光とも言う。

）の方向と異なる方向へ散乱された成分は、検出器２の
検出面上で上記参照光と重なり合わないので、ビート信
号を発生させず、単に直流成分として検出されるため、
このような散乱成分を容易に取り除き、参照光と同じ方
向に進む光成分のみを検出することができる高指向性検
出系としての性質を有する。

また、微少な屈折率変化等を検出できる手段としてマイ
ケルソン受光系が良（知られている。この受光系４は、
第２図に示すように、レーザ１から出た光をビームスプ
リッタ−ＢＳにより２分し、一方のミラーＭＬ　Ｍ２を
経た反射光中に試料Ｓを挿入し、その透過光を後記する
直進光とハーフミラ−ＨＭにより合成する。ビームスプ
リッタ−ＢＳを透過した直進光（以下、参照光とも言う
。

）は、ハーフミラ−ＨＭを透過して図示両矢符で示した
ように移動される移動鏡Ｍに当たり、逆方向に反射され
、ハーフミラ−ＨＭにより試料を透過した光と合成され
、その合成光は検出器２により光電変換される。検出器
２からは移動鏡Ｍの速度に応じた周波数の干渉信号が重
畳した信号が得られる。その交流成分の強さは試料Ｓの
透過率に比例し、位相は試料Ｓの厚さ又は屈折率に依存
する。このマイケルソン受光系４も、上記したヘテロダ
イン受光系３と同様、微少な屈折率変化等を検出できる
だけでなく、試料Ｓによって上記参照光と異なる方向へ
散乱された成分は、検出器２の検出面上で上記参照光と
重なり合わないので、干渉信号を発生させず、単に直流
成分として検出されるため、このような散乱成分を容易
に取り除きことができ、参照光と同じ方向に進む光成分
のみを検出することができる高指向性検出系としての性
質を有する。

ところで、上記ヘテロゲイン受光系３もマイケルソン受
光系４も同じ原理に基づいて試料Ｓを透過した光ないし
試料Ｓによって散乱された光の強度を検出するものであ
ると言うことができる。この点を簡単に説明する。合成
される参照光をＶ。

、試料Ｓを透過した光ないし試料Ｓによって散乱された
光（以下、試料光とも言う。）をＶＩとし、それぞれ次
のように表現する。

Ｖ　＋　　＝　Ａ　＋　　ｅｘｐ［−＋　（ｒｎ　　＋
　ｔ　＋　φ　１）］　、Ｖ　２　＝　Ａ　２　ｅＸＰ
［−ｉ　（（１１ａｔ＋φ２）］これらの２つの光波Ｖ
１、■２を重ね合わせて観測（検出）すると、その検出
信号Ｓは次のようになる。

Ｓ＝　　Ｖ＋　＋Ｖ２ ＝Ｖ＋　　　・　Ｖ＋　　　”　　＋Ｖ２　　　・　Ｖ
２＋Ｖ、　　・Ｖ２　”　＋ｖ、”　　・Ｖ２ところで
、 Ｖ、・Ｖ、”＝Ａ、　　、Ｖ、・Ｖ２”＝Ａ。

であり、 Ｖ＋　　’　Ｖ２　”　＝Ａ＋　Ａ２８ＸＩｌｌ［−１
（（ｌｌ＋−ａ＋２）ｊ−ｉ（φ１−φ、）コ　、 ｖ　１　傘　　・　Ｖ２　　＝Ａ＋　　Ａａ　　ｅＸｐ
［＋１（ω　ｔ−ＱＪａ）ｔ＋ｉ（φ１−φ２）］ Ｖ＋　　・Ｖ２　”　　＋Ｖ＋　　”　　・Ｖｚ＝　２
　Ａ　＋　　Ａ　２ｃｏｓ［（ω１−ａｌ　ｚ）を十（
φ　１−φ、）］であるので、 Ｓ＝Ａ＋　２＋Ａ２ 十２　Ａ　＋　Ａ　ｚｃｏｓ［（ａ＋　Ｉ　ｗ　２）　
ｔ＋（φドφ２）コとなる。

ところで、ヘテロダイン受光系３においては、ω２＝ω
１−Δω、φ皿＝φ２と書けるので、Ｓ＝Ａ＋　’　＋
Ａ２　’　＋２ＡＩ　Ａ２Ｃ０９Δａｃｔとなり、検出
された信号の交流成分の大きさから、試料光Ｖ１の振幅
Ａ１を知ることができる。

同様に、マイケルソン受光系４によると、ω。

＝ω２、φ２＝φＩ＋ｋｔと書けるので、検出信号Ｓは
、 Ｓ＝Ａ＋　２＋Ａ２２＋２ＡＩ　Ａｔｃｏｓｋｔとなり
、ヘテロダイン受光系３の場合と同様の信号が得られる
。すなわち、ヘテロダイン受光系３もマイケルソン受光
系４も同様に、検出信号の交流成分の大きさから、試料
光Ｖ１の振幅Ａ１を知ることができるものである。

さらに、高指向性検出系として上記したヘテロゲイン受
光系３及びマイケルソン受光系４以外に、第１６図から
第２５図に例示した高指向性光学系がある。これらの高
指向性光学系を代表するものとして、入射側の対物レン
ズＯｂｌと、その焦点面に配置され対物レンズＯｂｌに
よるフランフォーファ回折の０次の回折像のみを通過さ
せるピンホールＰと、ピンホールＰに前側焦点が一致す
るように配置された同様の対物レンズＯｂ２からなる高
指向性光学系５を第３図に示す（図の高指向性光学系５
は第２２図に示した光学系と同様である。）。ただし、
以下の説明において、高指向性光学系５は第３図のもの
に限定されるものではない。

ところで、第１図から第３図に示したような高指向性検
出系３．４．５において、試料Ｓと平行光束の関係を、
第４図Ａから第６図に示したような構成の高分解能検出
系３０．４０．５０に変更することにより、レンズのフ
ランフォーファ回折像成分の０構成分に相当する試料Ｓ
の微小な黒領域に入射光を当て、その点のみからの散乱
光を集めて検出するようにすることができる。すなわち
、試料Ｓの入射方向に、試料Ｓの測定点に後側焦点が一
致するように開口数（ＮＡ）の大きい集光レンズＬ１を
介在させ、また、集光レンズＬ１の後側焦点に前側焦点
が一致するように同じように大きいＮＡを有する対物レ
ンズＬ２を配置して、レーザ１からの光を集光レンズＬ
１によって試料Ｓの微小点に当て、その点から出てくる
光を対物レンズＬ２によって集めて所定方向に向く平行
光に変換し、上記の高指向性検出系３．４．５の原理に
より、この方向に向く光のみを検出器２により検出する
ようにすることで、試料Ｓのレンズのフランフォーファ
回折像成分の０構成分に相当する微点領域のみからの散
乱光を集とて検出するようにすることができる。そのた
め、上記のような高分解能検出系３０．４０．５０を用
いると、測定点の前後を含む周囲からの不要な散乱光の
混入を避けることができ、また、極めて高い分解能で試
料の吸収特性を測定することができる。

第４図への変形を第４−８に示す。第４図Ａにおいては
、集光レンズＬ１によって試ＵＳの微小点に光を照射し
、その点から出てくる光を対物レンズＬ２によって所定
方向に向く平行光（略平面波）に変換してヘテロダイン
受光するが、第４−８においては、対物レンズＬ２を周
波数シフターＡ○の光束側に配置し、集光レンズＬ１の
焦点からの発散球面波と対物レンズＬ２の焦点からの発
散球面波が一致するように配置して、検出器２によりヘ
テロダイン検出する。これは、レンズにより平面波に変
換してヘテロゲイン検出するのと、球面波でへ゛テロダ
イン検出するのが等しいビート成分が得られ、波面整合
に要求される条件が等しいことによる。

さて、本発明における分光吸収測定の対象となる不透明
試料は、まず第１に、完全には入射光を阻止して前方へ
透過させないような試料ではなく、例えば生体試料のよ
うに、試料によって何ら散乱を受けずに直接透過する光
は殆ど存在しないが、試料中の散乱微粒子によって多重
散乱を受け、前方へ散乱された光が試料より出てくるよ
うな試料である。もちろん、直接透過する光が存在する
ような試料についても測定対象にできる。また、本発明
の第２の測定対象は、例えば粉体のように、入射光を略
完全に遮断して後方へのみ反射及び散乱する試料である
。前者の試料を透過試料、後者の試料を反射試料と呼ぶ
ことにする。

第７図に示した本発明による不透明試料顕微吸収分布測
定製電は、第４図Ａに示したヘテロダイン受光系による
高分解能検出系３０を用いて、透過試料２０の顕微吸収
分布測定を行うものである。

このような測定のた於に、単色光源として、広いスペク
トル範囲の単色光を連続的に掃引して出すことができる
可変波長レーザ」Ｑを用いる。レーザ１０から発した光
束は、ビームスプリッタ−ＢＳにより２分され、直進光
は集光レンズＬｌにより透過試料２０の測定点に集光さ
れ、透過散乱光は対物レンズＬ２により平行光に変換さ
れてハーフミラ−ＨＭにより参照光と合成される。ビー
ムスプリッタ−ＢＳにより反射された参照光は、上記の
合成前に超音波光学変調器等の周波数シフターＡＯによ
り周波数が僅かに変えられており、試料光と合成して光
電変換すると、参照光と試料光の周波数差に相当する周
波数の交流信号を含む信号が検出器２より出力される。

検出器２より得られる信号の交流成分の大きさは、試料
光の振幅に比例するので、検出器２の出力の交流成分を
分離し、その大きさから、測定点の吸収特性が得られる
。試料光の強度は試料２０の測定点の吸収特性に応じて
変化するので、試料２０をＸ−Ｙ走査装置ＸＹによって
走査するようにすることにより、試料２０の走査面上で
の吸収分布を測定することができる。なお、レーザ１０
の波長を掃引しながら各測定点の吸収を測定することに
より、試料２０の分光吸収分布を測定することもできる
。ところで、測定の分解能をレンズＬ１、Ｌ２のフラン
フォーファ回折像成分のＯ＆像の大きさより小さくする
た杓に、測定点（レンズＬｌの焦点）に極近接してその
像の大きさより小さいピンホール板ＰＨを配置して照明
領域を制限することもできる。

この場合、分解能は向上するが、透過光量が少なくなる
欠点を有する。なお、以下の実施例においても同様にピ
ンホール板ＰＨを配置することができる。

さて、第８図は第７図の高分解能検出系３０を用いるも
のを変形して、散乱を伴う反射試料２１を測定するよう
にしたものである。この場合、このレーザ１０から出た
光束を適当な径の平行光束に変換するために、ビーム変
換器１１をレーザ１０の前に配置しであるが、このビー
ム変換器１１は必ずしも必要なものではない。この配置
においては、第７図のハーフミラ−ＨＭの向きを変え、
レーザ１０からの光がビームスプリッタ−ＢＳを透過し
、ハーフミラ−ＨＭを透過した位置に集光レンズ及び対
物レンズの作用をするレンズＬを配置し、その後側焦点
面に反射試料２１を配置し、その反射散乱光をハーフミ
ラ−ＨＭで参照光と合成させるようにしたものである。

例えば、散乱体ＮＺを図のように試料２１の前に存在し
ていているように模式的に書いた場合、散乱体ＮＺによ
る散乱光は検出器２の直流成分となり、高分解能検出系
３０を用いると、検出器２によって交流成分として検出
されない。

次に、第９図に示した装置は、第５図に示したマイケル
ソン受光系による高分解能検出系４０を適用して透過試
料２０の顕微吸収分布測定を行うものであり、可変波長
レーザ１０から出た光をビーム変換器１１により適当な
径の平行光束に変換して、ビームスプリッタ−ＢＳによ
り２分し、方のミラーＭＬ　Ｍ２を経た反射光中に集光
レンズＬ１と対物レンズＬ２を共焦点で配置しその共通
の焦点の位置に透過試料２０を挿入し、その散乱透過光
を参照光とハーフミラ−ＨＭにより合成する。ビームス
プリッタ−ＢＳを透過した参照光は、ハーフミラ−ＨＭ
を透過して図示両矢符で示したように移動される移動鏡
Ｍに当たり、逆方向に反射され、ハーフミラ−ＨＭによ
り試料光と合成され、その合成光は検出器２により光電
変換される。検出器２からは移動鏡Ｍの速度に応じた周
波数の干渉信号が重畳した信号が得られる。その交流成
分の強さは透過試料２０の散乱光の強さに比例するので
、試料２０をＸＹ走査装！ｔＸＹにより走査しながら各
測定点の交流成分の大きさを求めることにより、試料２
０の吸収分布を測定することができる。なお、可変波長
レーザ１０の波長を掃引しながら吸収分布を求めること
により、分光吸収分布も測定することができる。

第１０図は、マイケルソン受光系を利用した高分解能検
出系４０を反射試料２１の吸収分布を求めるように変形
したものである。この場合、ビームスプリッタ−ＢＳを
反射した位置に集光レンズ及び対物レンズの作用をする
レンズＬを配置し、その後側焦点面に反射試料２１を配
置し、その反射散乱光をビームスプリッタ−ＢＳで移動
鏡Ｍから反射してきた参照光と合成させるようにしたも
のである。

さて、第１１図と第１２図は、透過試料２０又は反射試
料２１の吸収分布を測定するのに、第６図の高指向性光
学系５を用いた高分解能検出系５０を適用したものであ
る。第１１図のものは、試料２０の測定点から生じる蛍
光光のみを通過させる励起光カットフィルター１２を対
物レンズＬ２の後側に挿入し、試料２０の顕微蛍光分布
測定を行う場合の配置を示しているが、吸収分布測定の
場合は、この励起光カットフィルター１２は取り外す。

第１１図の顕微吸収分布測定においては、ビーム変換器
１１から適当は径の平行光束に変換されて出てくるレー
ザ１０からの光は、集光レンズＬｌにより透過試料２０
の測定点に集光され、その点を透過しまたその点から前
方へ散乱された光は、測定点に前側焦点一致するように
配置された対物レンズＬ２により平行光に変換され、高
指向性光学系５により他の方向へ向かう光から分離され
て検出器２によりその強さが検出される。したがって、
試料２０をｘＹ走査装置ｘＹにより走査しながら各測定
点からの光の強さを求めることにより、試料２０の吸収
分布を測定することができる。なお、この場合も、可変
波長レーザ１０の波長を掃引しながら吸収分布を求める
ことにより、分光吸収分布も測定することができる。た
だし、励起光カットフィルター１２を挿入して蛍光分布
を測定する場合は、レーザ１０の波長掃引は行わないか
、又は、レーザ１０として可変波長のものでなく、固定
波長のものを用いる。第１２図の反射試料２１の吸収分
布を測定する装置の場合は、ハーフミラ−ＨＭを透過し
た位置に集光レンズ及び対物レンズの作用をするレンズ
Ｌを配置し、その後側焦点面に反射試料２１を配置し、
反射試料２１からの反射散乱光をレンズＬによって平行
光に変換し、ハーフミラ−ＨＭにより入射光の方向とは
異なる方向に反射させ、反射試料２１の測定点からの光
のみを高指向性光学系５により抽出するようにしたもの
である。その他は、第１１図と同様である。

ところで、レーザ１００波長を掃引した場合、光強度が
一般に変化する。そこで、高指向性検出系を用いる場合
、照射光束の一部を取り出して、例えば第３図では、レ
ーザ１０と試料Ｓの中間にハーフミラ−を挿入して、出
力レーザ光強度を検出する。ヘテロダイン検出系を用い
る場合、第４図Ａで、試料Ｓの後方に光遮断素子を挿入
、して、検出器２でレーザの出力強度をモニターする。

あるいは、第４図Ａのハーフミラ−ＨＭの後方に光強度
モニター用検出器を設置して検出してもよい（図示して
いない。）。これらの光強度を参照光強度とし、試料Ｓ
を透過した光強度または特定方向に反射される光強度を
高指向性検出系またはヘテロダイン検出系で検出して信
号光強度として、これらの値を用いて透過積分減光度を
求めて試料の吸収スペクトルを算出する。これは、すで
に従来の不透明試料の吸収スペクトルを求める方法にお
いても、あるいは、散乱のない試料の吸収度を求める方
法においても、用いられている方法である。

次に、具体的に試料のミクロサイズ領域の顕微吸収分布
測定を測定する装置のいくつかの例について簡単に説明
する。第１３図は、Ｘ−Ｙ走査可能な試料台１３上に配
置した試料２０の透過吸収分布特性及び反射吸収分布特
性を測定できる装置の概略の構成を示すもので、可変波
長レーザ１０からの単色光は切り換え鏡ＭＳにより実線
の透過光路と点線の反射光路に切り換えられる。実線光
路を選択すると、ミラーＭ３、Ｍ４を経た光は、集光レ
ンズＬ１の作用をするカセグレイン反射光学系に１によ
り試料２０の測定点に集光され、試料２ａを透過した光
は対物レンズＬ２の作用をするカセグレイン反射光学系
に２により平行光に変換され、ミラーＭ６を経て、例え
ば第１８図に示した対物レンズＯｂとその焦点に配置し
たピンホールＰとからなる高指向性光学系５に入射する
。

高指向性光学系５により測定点以外から出た光が取り除
かれ、試料２０の吸収特性を示す光の強度が検出器２に
より検出される。したがって、試料２０をＸＹ定走査な
がら各測定点からの光の強さを求めることにより、試料
２０の透過吸収分布を測定することができる。切り換え
鏡ＭＳを点線の反射光路に切り換えると、可変波長レー
ザ１０からの単色光はミラーＭ５を経てハーフミラ−Ｈ
Ｍにより下方に反射され、集光レンズ及び対物レンズの
作用をするカセグレイン反射光学系に２により試料２０
の測定点に集光される。測定点から後方に散乱された光
はカセグレイン反射光学系に２により平行光に変換され
、ミラーＭ６を経て高指向性光学系５に入射し、測定点
以外から出た光が取り除かれ、試料２０の反射吸収特性
を示す光の強度が検出器２により検出される。同様に試
＃Ｊ２０をＸＹ定走査ながら各測定点からの光の強さを
求することにより、試料２０の反射吸収分布を測定する
ことができる。カセグレイン反射光学系に２の後に励起
光カットフィルター１２を挿入して顕微蛍光分布測定を
行うことができる。なお、図中、符号１５はチョッパー
を示しており、試料に入射させるレーザ光を所定周波数
で変調し、同期検波してノイズを取り除くためのもので
ある。また、符号１４はアパーチャー、１６は接眼レン
ズを示している。

第１４図、第１５図の装置は、それぞれ第４図へのヘテ
ロダイン受光系による高分解能検出系３０を用いた装置
、第５図のマイケルソン受光系による高分解能検出系４
０を用いた装置を縦型に変形しただけのものであり、格
別の！！門は必要なかろう。なお、第１５図のものにお
いて、駆動系１７は移動鏡Ｍを光軸方向に移動させるた
めのものである。

なお、以上の説明においては、可変波長レーザ１０は連
続的に発振するものを前提にしていたが、パルス動作を
する可変波長レーザを用いてもよい。

特に、レーザ光を連続的に照射すると、その特性が急激
に変化する試料の場合、パルス動作をする可変波長レー
ザを用いることが好ましい。また、検出器２については
、格別説明しなかったが、公知の何れの手段でも用いる
ことができる。また、検出信号の処理方式としても、例
えば入射光をチョッパ等によって強度変調し、検出信号
を位相同期検出することが考えられる。この場合、赤外
光検出の時定数が長いため、同期変調周波数を小さくす
る必要がある。また、光子計数方式（可視光）、電荷蓄
積方式（赤外光）等の同期信号積分検出方式、ヘテロダ
インビート信号検出方式等を用いてもよい。さらに、周
波数シフターとしては、超音波変調Ｙ等の超音波光回折
を用いたものばかりでなく、波長板の組み合わせ及び回
折格子のほか、結晶の電気光学効果を利用することもで
きる。

また、反射鏡を一定速度で移動させるマイケルソン干渉
計ばかりでなく鋸歯状波で反射鏡を振動させてもよい。

また、ヘテロダイン受信をするのに、単色光源のレーザ
ーを２光束に分割して局発光を作るだけでなく、２個の
レーザーを用いてもよいことはもちろんである。

Ｃ発明の効果〕 本発明の不透明試料の顕微吸収分布測定方法及び装置に
おいては、試料の微小な測定点に指向性の高い光を集光
して照射し、測定点から発散する光を平行光に変換して
、又は、球面波のままその強度をヘテロゲイン受光系、
マイケルソン受光系、高指向性光学系等の高指向性検出
系を用いて検出するので、測定点周囲からの散乱光、そ
の他のノイズ光を拾うことなく高分解能で試料の微小領
域の吸収を正確に測定でき、生体組織等の不透明試料の
顕微吸収分布測定に適した方法及び装置である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の前提になるヘテロダイン受光系の構成
と作用を説明するための図、第２図は同様なマイケルソ
ン受光系の構成と作用を説明するための図、第３図は同
様な高指向性光学系の代表的なものの構成を示すための
図、第４図Ａは本発明の不透明試料の顕微吸収分布測定
方法及び装置に用いられるヘテロダイン受光系を用いた
高分解能検出系の構成と作用を説明するための図、第４
図Ｂは第４図への測定方法及び装置の変形を示すための
図、第５図はマイケルソン受光系を用いた高分解能検出
系の構成と作用を説明するための図、第６図は高指向性
光学系を用いた高分解能検出系の構成と作用を説明する
ための図、第７図は透過試料に適用する本発明のヘテロ
ゲイン受光系を用いた顕微吸収分布測定の実施例の構成
を示す図、第８図は第７図の装置を反射試料用に変形し
た顕微吸収分布測定の実施例の構成を示す図、第９図は
透過試料に適用する本発明のマイケルソン受光系を用い
た顕微吸収分布測定の実施ケ＝）構成を示す図、第１０
図は第９図の装置を反射試料用に変形した顕微吸収分布
測定の実施例の構成を示す図、第１１図と第１２図は本
発明の高指向性光学系を用いた顕微吸収分布測定の実施
例の構成を示す図、第１３図から第１５図は本発明によ
る試料の顕微吸収分布特性を測定する装置のいくつかの
具体例を示すための図、第１６図から第２５図は先に提
案した高指向性光学系の構成を示す図、第２５図は従来
のフーリエ分光器を用いた顕微吸収分布を測定するため
の装置の構成を示す図、第２７図は従来の回折格子分光
器を用いた微小試料の顕微吸収分光分布を測定するため
の装置の構成を示す図である。 １・・・レーザ、２・・・検出器、３・・・ヘテロダイ
ン受光系、４・・・マイケルソン受光系、５−・・高指
向性光学系、１０・・・可変波長レーザ、１１・・・ビ
ーム変換器１２・・・励起光カットフィルター、１３・
・・試料台、１４・・・アパーチャー、１５・・・チョ
ッパー、１６・・・接眼レンズ、１７・・・駆動系、２
０・・・透過試料、２１・・・反射試料、３０．４０．
５０・・・高分解能検出系、Ｓ・・・試料、ＢＳ・・・
ビームスプリッタ−１ＨＭ・・・ハーフミラ−１Ｍ１〜
Ｍ７・・・ミラー、ＡＯ・・・周波数シフター、Ｍ・・
・移動鏡、Ｏｂ、Ｏｂｌ、Ｏｂ２・・・対物レンズ、Ｐ
・・・ピンホール、Ｌｌ・・・集光レンズ、Ｌ２・・・
対物レンズ、ＸＹ・・・Ｘ−Ｙ走査装置、ＰＨ・・・ピ
ンホール板、ＮＺ・・・散乱体、Ｌ・・・レンズ、ＭＳ
・・・切り換え鏡、Ｋ１、Ｋ２・・・カセグレイン反射
光学系 出　　願　　人　新技術事業団 代理人　弁理士　蛭　川　昌　信 第１ 図 芽２ 図 第３ 図 第４ｍへ 第５図 第６図 第７図 第８図 Ｍ９図 第１０図 第１１図 第１３図 第１４図 第１５図 第１９図 ＧＬ 第２０図 Ｎ、Ａ子０．１ ＮＡ＝０．１ 第２１図 第２２図 第２３図 第２６図

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）試料の微小な測定点に指向性の高い光を集光して
   照射し、測定点から発散する光を平行光に変換して、そ
   の平行光のみの強度を高指向性検出系を用いて検出し、
   かつ、試料を前記集光光に対して相対的に走査しながら
   前記検出操作を繰り返すことにより、試料の吸収分布特
   性を測定することを特徴とする不透明試料の顕微吸収分
   布測定方法。
2. （２）測定点に極近接して集光光のフランフォーファ回
   折像成分の０次像の大きさより小さいピンホールを配置
   して照明領域を制限することを特徴とする請求項１記載
   の不透明試料の顕微吸収分布測定方法。
3. （３）指向性の高い光が可変波長の光であることを特徴
   とする請求項１又は２記載の不透明試料の顕微吸収分布
   測定方法。
4. （４）測定点から検出器に到る光路中に照射光の波長の
   光を遮断する励起光カットフィルターを挿入して、試料
   の顕微蛍光分布測定を行うことを特徴とする請求項１又
   は２記載の不透明試料の顕微吸収分布測定方法。
5. （５）試料に照射する照射光束の一部を取り出してその
   光束強度を検出して参照光強度とし、高指向性検出系を
   用いて検出した光強度を試料からの信号光強度として透
   過積分減光度を求めることを特徴とする請求項１から３
   の何れか１項記載の不透明試料の顕微吸収分布測定方法
   。
6. （６）波長変更可能な単色光源からの光を２分して、一
   方の光路中に入射光の周波数をシフトさせる周波数シフ
   ト手段を設け、他方の光路中に２個の収束光学系よりな
   る共焦点光学系を配置し、共焦点光学系の集光位置に相
   対的に走査可能な試料を配置し、周波数シフト手段から
   射出する指向性の高い光と試料の測定点から発散され共
   焦点光学系によって平行光に変換された光とを合成して
   同方向に射出させるビーム合成手段を設け、ビーム合成
   手段によって合成された光を電気信号に変換してシフト
   周波数に等しい交流成分のみの強度を検出する検出手段
   を設けたことを特徴とする不透明試料の顕微吸収分布測
   定装置。
7. （７）波長変更可能な単色光源からの光を２分して、一
   方の光路中に光路長を所定速度で変更する光路長変更手
   段を設け、他方の光路中に２個の収束光学系よりなる共
   焦点光学系を配置し、共焦点光学系の集光位置に相対的
   に走査可能な試料を配置し、光路長変更手段から射出す
   る指向性の高い光と試料の測定点から発散され共焦点光
   学系によって平行光に変換された光とを合成して同方向
   に射出させるビーム合成手段を設け、ビーム合成手段に
   よって合成された光を電気信号に変換して光路長変更速
   度に応じた周波数の交流成分のみの強度を検出する検出
   手段を設けたことを特徴とする不透明試料の顕微吸収分
   布測定装置。
8. （８）波長変更可能な単色光源から出る光の光路中に２
   個の収束光学系よりなる共焦点光学系を配置し、共焦点
   光学系の集光位置に相対的に走査可能な試料を配置し、
   試料の測定点から発散され共焦点光学系によって平行光
   に変換された光の進行方向の光のみを抽出する高指向性
   光学系を配置し、高指向性光学系により抽出された光の
   強度を検出する検出手段を設けたことを特徴とする不透
   明試料の顕微吸収分布測定装置。
9. （９）波長変更可能な単色光源から出る光の光路中に２
   光路切替え手段を設け、一方の光路と他方の光路が同軸
   でかつ光の進行方向が反対になるように構成し、同軸に
   なった光路中に前記共焦点光学系を配置し、前記共焦点
   光学系の一方の側に試料を透過した光又は試料により反
   射散乱された光を取り出す光取り出し手段を設け、光取
   り出し手段の後方に前記高指向性光学系を配置したこと
   を特徴とする請求項８記載の不透明試料の顕微吸収分布
   測定装置。
10. （１０）波長変更可能な単色光源からの光を２分して一
    方の光路中に入射光の周波数をシフトさせる周波数シフ
    ト手段を設け、他方の光路中に指向性の高い光を集光し
    て試料の微小な測定点に照射する第１の収束光学系を配
    置し、第１の収束光学系の集光位置に相対的に走査可能
    な試料を配置し、周波数シフト手段から射出する指向性
    の高い光を試料に照射する第１の収束光学系と同じ収束
    球面波となる第２の収支光学系を配置し、両光束を合成
    して同方向に射出するビーム合成手段を設け、ビーム合
    成手段によって合成された光を電気信号に変換してシフ
    ト周波数に等しい交流成分のみの強度を検出する検出手
    段を設けたことを特徴とする不透明試料の顕微吸収分布
    測定装置。
11. （１１）散乱性試料からの光を遮断して、周波数シフト
    手段又は光路長変更手段から射出する光束強度を検出し
    て参照光強度とし、ビーム合成手段によって合成された
    光を電気信号に変換してシフト周波数に等しい交流成分
    又は光路長変更速度に応じた周波数の交流成分を試料か
    らの信号強度とし、これらの参照強度と信号光強度を用
    いて透過積分減光度を求めることを特徴とする請求項６
    、７又は１０の何れか１項記載の不透明試料の顕微吸収
    分布測定装置。