JPH0429981A

JPH0429981A - ピペラジニルキナゾリン誘導体およびこれを含有する蛍光ラベル化試薬

Info

Publication number: JPH0429981A
Application number: JP2026561A
Authority: JP
Inventors: Mitsuto Amino; 網野　光人; Minoru Fukuda; 實福田; Toshihiro Hayashi; 敏広林; Takashi Takagi; 隆高木
Original assignee: Morishita Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Morishita Pharmaceuticals Co Ltd
Priority date: 1990-02-05
Filing date: 1990-02-05
Publication date: 1992-01-31

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は蛍光ラベル化試薬として有用な新規のピペラジ
ニルキナゾリン誘導体およびこれを含有する蛍光ラヘル
化試薬の用途に関する。

〔従来の技術〕

脂肪酸、ステロール、アミノ酸、胆汁酸、カテコールア
ミン、フェノール及びアルコール類等の微量定量を目的
に多くの蛍光ラヘル化試薬が開発され使用されている。

例えば脂肪酸にはＡＤＡＭ（９−アンスリルジアゾメタ
ン）や４−ブロモメチル−７−メドキシクマリン等が使
用され、アルコール類には４−ジアゾメチル−７−メド
キシクマリン、１−アンスロイルニトリルなどが知られ
ており、それぞれの被験化合物に応じて多（の蛍光ラヘ
ル化試薬の中から、試行錯誤によって目的に応じた試薬
を選択することが必要である。しかし、それぞれの試薬
は一般的に保存性が悪かったり、用時調整が必要であっ
たり、ラベル化反応に長時間要したり、各被験化合物の
分離能が悪かったり、目的の濃度で検出できないなどの
欠点を有すること等のため、目的に応じたを用件のある
新規のラヘル化試薬の開発が検討されている。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の課題は、被験化合物の分離定量に当たって、分
離能が良く、且つまた試薬の安定性が良く、多くの目的
化合物に使用できる試薬を開発し提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、ピペラジニルキナゾリン誘導体の合成研
究中に、この化合物のピペラジン骨格にクロロアセチル
基やこれと類似のブロモアセチル基等を導入すれば、従
来から使用されてきたＡＤＡＭ　（９−アンスリルジア
ゾメタン）試薬や４−ブロモメチル−７−メドキシクマ
リン等と比較して安定で強い蛍光性の誘導体に導くこと
ができることを見出し、本発明を完成した。

即ち、本発明は一般式ＣＩ）（式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ水素、メトキシ、エ
トキシまたは一緒になってメチレンジオキシ、ｎは１．
２または３を示し、Ｘはハロゲン原子を表す。）で示されるピペラジニルキナゾリン誘導体またはこれを
含有する蛍光ラベル化試薬に関する。

本発明化合物〔■〕は下記の反応式に従って製造される
。

（式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ水素、メトキシ、エ
トキシまたは一緒になってメチレンジオキシ、ｎは１．
２または３を示し、Ｘはハロゲン原子を表す。）即ち、４−アミノ−６，７−シメトキシー２（１−ピペ
ラジニル）キナゾリン（ＩＩ）とクロルアセチルクロラ
イドを室温にて反応させ、精製して、４−アミノ−２−
（４−クロロアセチルピペラジン−１−イル）−６，７
−シメトキシキナゾリン［Ｉａ）を得る。

ピペラジニルキナゾリン誘導体として、より具体的には
下記のものが例示できる。

４−アミノ−２−（４−ブロモアセチルピペラジン−１
−イル）キナゾリン４−アミノ−２−（４−クロロプロピオニルピペラジン
−１−イル）−６，７−メチレンジオキシキナゾリン４−アミノ−２−（４−ブロモアセチルピペラジン−１
−イル）−６，７−シメトキシキナゾリン４−アミノ−２−（４−クロロプロピオニルピペラジン
−１−イル）−６，７−シメトキシキナゾリン４−アミノ−２−（４−ブロモプロピオニルピペラジン
−１−イル）−６，７−シメトキシキナゾリン４−アミノ−２−（４−クロロブチリルピペラジン−１
−イルＬ−６．７−シメトキシキナゾリン本発明の蛍光ラベル化反応は常温で安定であり、そのジ
メヂルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液としても安定であ
る。そのため、蛍光ラベル化し難い薬物でも高温で反応
させることによって、容易に蛍光ラベル化できる。

本発明のピペラジニルキナゾリン誘導体はカルボン酸、
アミノ基及びフェノール性水酸基と反応し、蛍光ラベル
化できることから、多くの医薬品及びその代謝物、脂肪
酸類、ステロール類、アミノ酸類、胆汁酸類、カテコー
ルアミン類、フェノール類等及びアルコール類に幅広く
用いられ使用できることが考えられる。

本発明では、例えば、血漿または血清５０ｕｊ２から薬
物を抽出し、得られた薬物に塩基の存在下または塩基性
溶媒中で、ピペラジニルキナゾリン誘導体のＤＭＳＯ溶
液を添加し、室温から９０°Ｃで５〜３０分間反応させ
ることによって、速やかに目的の薬物が蛍光ラベル化で
きる。

蛍光ラベル化された化合物は薄層クロマトグラフィー、
高速液体クロマトグラフィーなどで、試薬ブランクと分
離され定量的に検出される。

本発明によって蛍光ラベル化された誘導体は蛍光強度に
おいて優れており、そのため５０ｐｇまで測定可能であ
る。

以下実施例により本発明を説明する。

■、請求項１の実施例〔実施例１〕４−アミノ−６７−シメトキシー２−（１ピペラジニル
）キナゾリン（ＩＩ）５ｇをコルベン入れ、トリエチル
アミン３．６ｇ、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）１５３
ｍｌを加えてけんだくし、水冷下スタラーで撹拌する。

一方、１５ｍ１のＴＨＦにクロルアセチルクロライド２
．７ｇを’ｆ４　解し、コルヘンに滴下する。３０分撹
拌した後、さらに４時間室温にて撹拌する。撹拌終了後
、沈澱物を濾取したあと水洗し、ジメチルホルムアミド
で再結晶し、４−アミノ−２−（４−クロロアセデルピ
ペラジン−１−イル）−６，７−シメトキシキナゾリン
（Ｉａ）（収率７０％、融点（分解点）２７０°Ｃ）を
得る。

ＭＡＳＳ：Ｍ”　３６５．ｍ／ｚ　３１６．ｍ／ｚ　２
ＢＢ、ｍ／ｚ　２５９ｍ／ｚ　２３３．ｍ／ｚ　２０５
．ｍ／ｚ　１２３ＮＭＲ：’ｔｌ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−
ｄ６）　　δ：３．５２（４１１，ｂｓ、ピペラジン−
１１）、３．７９（３１１，３，ＯＣＩ＋３）。

３．８３（３１１，３，ＯＣＩ＋３）　、３．７０（４
１１，ｂｓ、ピペラジン−１１）。

４．４３（２ｔ１．ｓ、ＣＯＣｌ１ｚＣＩ）、６．７６
（１１１，ｓ、八ｒ−１１）。

７．１９（２ｔ１．ｂｓ、Ｎｌ１ｚ）　、　７．４３（
１１１，ｓ、Ａｒ−ｔｌ）ＩＲ：　　νｍａｘ（ＫＢｒ
）ｃｍ−’：３４８０，３３５０．３２５０（Ｎｌｌｚ
）。

３０００　、２９００　、２８４０　（Ｃ１１）　、　
１６５０　（Ｃ−０）〔実施例２）実施例１と同様に、（ＩＩ）とクロロブチリルク０リド
から、４−アミノ−２−（４−クロロブチリルピペラジ
ン−１−イル）−６，７−シメトキシキナゾリン［Ｉｂ
）（収率６５％、融点１９１’ｃ）を得る。

２、請求項２の実施例〔実施例３〕遊離脂肪酸の混合物のアセトン溶液５　Ｑ　／７１！を
分取、溶媒を留去後、（Ｉ　ａ　）　２．　０ｍｇ／ｍ
ｌのＤＭＳＯ溶液と炭酸カリウム０．２ｍＢ／ｍｕのＤ
ＭＳＯ溶液をそれぞれ０，１ｍｌ加え、９０°Ｃ１１５
分間加熱して蛍光ラベル化反応を行った。冷却後アセト
ニトリル０．８ｍｌを加え、その１０μ２をとり、ＨＰ
ＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で分析を行った。

ＨＰＬＣ条件は、ウォターズ製５１０型にＹＭＣ−バッ
ク　Ａ−３１４カラム（６φＸ３００ｍｍ、０勾山村化
学研究所）を装着して使用した。移動相はアセトニトリ
ル：水：酢酸：ＰＩＣ＠　　Ｂ−８−７５：２５　：　
１．：　１を用いて、カラム温度は室温、流速は１　、
　７　ｍ１／　ｍｉｎ、であり、蛍光検出は蛍光スペク
トロモニター　ＲＦ−５３０（＠島津製作所）を用いて
、励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長３８４ｎｍで測定を行
った。表１に各脂肪酸とその保持時間（Ｒｔ値）を示す
。

（以下余白）表１ＨＰ　Ｌ　Ｃにおける各脂肪酸の蛍光誘導体のＲｔ値〔実施例４］ＳＤ系雌雄性ラット血清５０μｉを取り、クロロホルム
−メタノール−２＝１の混液５　ｍｌを加えて、総脂質
を抽出した。抽出液２ｄを取り、濃縮乾固した後、クロ
ロホルム０．５ｍｌ！に溶解して、簡易カラム（Ａｎａ
ｌｙｔｉｃｈｅｍ　１ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ１社製Ｂ
ＯＮＤ　［ＬＵＴ■）に吸着させ、メタノールで溶出し
、溶出液４　ｄを得る。この溶出液を濃縮した後、２％
水酸化カリウム−エタノール溶液０．５７を加えて８０
゛Ｃｌ２Ｏ分間加熱して、リン脂質を加水分解し、遊離
脂肪酸とした。

ついで、２０％酢酸でｐＨ６〜７に調整した後、クロロ
ボルム−ｎ−へブタン（１：　１　）　５ｍｆｌ’Ｅ：
加えて振盪抽出した。その有機層４　ｍｌを分取し、溶
媒を留去後に（Ｉ　ａ　〕２．　０＋ｎｇ／ｍＱのＤＭ
ＳＯｉ液と炭酸カリウム０　、　２　ｍｇ／　ｄのＤＭ
ＳＯ溶液をそれぞれ０．１ｍ！ｌ加え、９０’Ｃ１１５
分間加熱して蛍光ラベル化反応を行った。冷却後アセト
ニトリル０．８ｍ１．を加え、その１０ｔｔ１．をとり
、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で分析を行
目った。ＨＰＬＣ条件ば、実施例１と同様である。

その分析結果を表２に示す。

表２　ラット血清中のリン脂質脂肪酸組成〔実施例５〕ＳＤ系雌雄性ラット血清５０μ尼を取り、クロロホルム
−メタノール−２：１の混液５ｍ１．を加えて、総脂質
を抽出した。この総脂質の１ｍρを取り、濃縮乾固した
後、２％水酸化カリウム−エタノール溶液０．５ｍＱを
加えて８０’Ｃ，２０分間加熱して、総脂質を加水分解
し、遊離脂肪酸とした。

ついで、２０％酢酸でｐＨ６〜７に調整した後、クロロ
ホルム−ｎ−ヘプタン（１：１）５ｍＲを加えて振盪抽
出した。その有機層４　ｍｌを分取し、溶媒を留去後に
ＣＩ　ａ　Ｅ　２．　０ｍｇ／ｍｆｌのＤＭＳＯ溶液と
炭酸カリウム０．２ｍｇ／ｍｌのＤＭＳＯ溶液をそれぞ
れ０．１ｍｌ加え、９０’Ｃ１１５分間加熱して蛍光ラ
ベル化反応を行った。冷却後アセトニトリル０．８ｄを
加え、その１０ｕｌｔをとり、ＨＰＬＣ（高速液体クロ
マトグラフィー）で分析を行った。

ＨＰ　Ｌ　Ｃ条件は、実施例１と同様である。

その分析結果を表３に示す。

表３ラット血清中の総脂質脂肪酸組成［実施例６］１．６−シヒドロー６−オキソー２−（２−イソブトキ
シアニリノ）−５−ピリミジンカルボン酸（治験記号Ｍ
ＡＲ−９９）　　１ｕｇ／ｍｅおよび１．６−ジヒドロ
−６−オキソ）　−２−（２−ペントキシアニリノ）−
５−ピリミジンカルボン酸（内部標Ｙ＃）１μｇ／ｍｐ
、を含むメタノール溶液をそれぞれ０．１ｍＱ分取し、
これに０．２％（Ｖ／Ｖ）酢酸を含むメタノール０．５
ｍｆｆ１を添加し、ジアゾメタン溶液０．５ｍｌを加え
て混和し、室温で３０分間反応させた。溶媒を留去した
後、炭酸カリウムおよび４−アミノ−２−（４−クロロ
アセチルピペラジン−１−イル）−６，’ｌ−ジメトキ
シキナゾリン（Ｉａ）の濃度がそれぞれ２ｍｇ／ｍＱと
なるように用時調製したＤＭＳＯ溶液０．２ｍｌを加え
て、９０°Ｃで３０分間蛍光ラベル化反応を行った。反
応終了後、溶媒を留去し、メタノール１００μ℃に溶解
し、その３０μ！を夏１ＰＬＣにて分析した。

ＨＰ　Ｌ　Ｃ条件は、ウオターズ製５１０型にＭＭＣ−
パック　Ａ−２１２カラム（６φＸ１５Ｑｍｍ、■山村
化学研究所）を装着して使用した。移動相はアセトニト
リル：水：酢酸：ＰＩＣ＠　　１３−ｓ＝４（１：６０
；１：０．５を用いて、カラム温度は室温、流速は１　
、　５　ｍｌ／ｍｉｎ、であり、蛍光検出は蛍光スペク
トロモニター　ＲＦ−５３０（■島津製作所）を用いて
、励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長３８４ｎｍで測定を行
った。表４に各使用薬物の保持時間（Ｒｔ）を示す。

表４　　ＭＡＲ−９９と内部標準の保持時間値被験化合
物　　　　　保持時間値（分）ＡＲ−９９６，４８内部標準８．１５〔発明の効果〕本発明は蛍光ラベル化試薬として有用な新規のピペラジ
ニルキナゾリン誘導体およびそれを含有する蛍光ラベル
化試薬であって、脂肪酸、ステロール、アミノ酸、胆汁
酸、カテコールアミン、フェノール類およびアルコール
類等の定量分析への適用が考えられ、試薬として、安定
性に優れ、ラベル化反応が短時間に行えることから新規
のラベル化試薬として有用である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）一般式〔 I 〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕（式中、Ｒ＾１およびＲ＾２はそれぞれ水素、メトキシ
、エトキシまたは一緒になってメチレンジオキシ、ｎは
１、２または３を示し、Ｘはハロゲン原子を表す。）で示されるピペラジニルキナゾリン誘導体。
（２）一般式〔 I 〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕（式中、Ｒ＾１およびＲ＾２はそれぞれ水素、メトキシ
、エトキシまたは一緒になってメチレンジオキシ、ｎは
１、２または３を示し、Ｘはハロゲン原子を表す。）で示されるピペラジニルキナゾリン誘導体を含有する蛍
光ラベル化試薬。