JPH0429991A - 新規物質ｂｋ９７ｂおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 く技術分野〉 本発明は新規物質に、さらに詳しくは抗酸化活性を有す
る新規物質ＢＫ９７Ｂ　（ＢＫ９７Ｂ−１およびＢＫ９
７Ｂ−２）およびその製造法に関する。

く先行技術〉 抗酸化物質に関してはすでに多数のものが医薬として実
用化されている。一般に化学物質の生理活性はその化学
構造に依存するところが大きいため、抗酸化性を有する
新規な化合物に対しては不断の希求があると言えよう。

〔発明の概要〕

く要旨〉 本発明は上記の希求に応えるものである。

すなわち、本発明による化合物は次式（Ｉ）および（■
′）で示される新規物質ＢＫ９７Ｂおよびその塩基付加
塩である。

本発明は、また、この物質の製造法に関する。

すなわち、本発明による次式（Ｉ）および（Ｉ′）式で
示されるＢＫ９７Ｂの製造法は、ストレプトミセスに属
しＢＫ９７Ｂの生産能を有する菌株を適当な培地で好気
的に培養し、その培養物よりＢ　Ｋ　９７　Ｂを得るこ
と、を特徴とするもの〔発明の詳細な説明〕 く新規物質ＢＫ９７Ｂ＞ １）化学構造 本発明による新規物質Ｂ　Ｋ　９７　Ｂは、前記の式（
Ｉ）および（■′）で示される化学構造を有する（以下
、それぞれＢＫ９７Ｂ−１およびＢＫ９７Ｂ−２ともい
う）。これらの化学構造は、次のようにして決定された
ものである。

ＢＫ９７Ｂ−１のプロトン核磁気共鳴スペクトル（第３
図参照）および炭素１３核磁気共鳴スペクトル（第４図
参照）の解析により、ＢＫ９７Ｂ１はフェナジン側路、
フェニル基、ゲラニル基などの部分構造を有することが
明らかとなった。

また、ＢＫ９７Ｂ−１をクロロホルム中、ジアゾメタン
で処理することにより、メチルエステルを与えることか
ら、カルボン酸の存在が判明した。

スペクトルのさらに詳細な検討により、それぞれの部分
構造のつながりが明らかとなり、さらに高分解能マスス
ペクトルより導かれた分子式からＢＫ９７Ｂ−１の構造
を式（Ｉ）のように決定した。

同様に、ＢＫ９７Ｂ−２のプロトン核磁気共鳴スペクト
ル（第７図参照）および炭素１３核磁気スペクトル（第
８図参照）の解析により、ＢＫ９７Ｂ−２もフェナジン
骨格、フェニル基、ゲラニル基、カルボキシル基を有す
ることが判明し、さらに赤外吸収スペクトル（第６図参
照）においてシアノ基の存在が確認された。これらのス
ペクトルの詳細な解析と高分解能マススペクトルより導
かれた分子式から、ＢＫ９７Ｂ−２の構造を式（■′）
のように決定した。

２）物理化学的性状 ＢＫ９７Ｂ−Ｉ　　　　ＢＫ９７Ｂ−２（Ｉ）外　観：
　暗青色粉末　　　　　紫色粉末（２）融点・　２３５
−２３６℃　　１５７−１５８°Ｃ（３）溶解性：　酢
酸エチル、　　　　　酢酸エチル、クロロホルム、　　
　　クロロホルム、ジメチルスルホキシド、ジメチルス
ルホキシド、ベンゼンに可溶、　　　ベンゼン、 メタノール、　　　　　　メタノール、エタノールに微
溶、　　エタノールに可溶、ヘキサン、　　　　　　ヘ
キサン、 水に不溶。　　　　　　水に不溶。

（４）Ｒｆ値（メルク社製「シリカゲル６０Ｆ２５４」
使用）：クロロホルムーメタノール（Ｉ０：１）０、　
２９　　　　　　　０．８３ トルエン−アセトン（２：１） ０、２２　　　　　　　０．６３ （５）高分解能マススペクトル（ｍ／ｚ）　　：４９Ｂ
、２１０６　　　４９２．２２７９（Ｍ十Ｈ）”　　　
　　　　　（Ｍ十Ｈ）”計算値４９３．２１２７ （０３１Ｈ２９Ｎ２０４） （６）紫外吸収スペクトル　λｍａｘ 第１図に示す。

メタノール中 ２０５　（２１９００）、 ２４９　（２４４００）、 ３４４　（Ｉ５９００）、 ４１５　（６１００）、 ４３０　（６１００）、 ６１５　（Ｉ５７００）。

０．０１規定塩酸−メタノ ２０６　（２２１００）、 ２４５　（２６３００）、 ３３５　（Ｉ５２００）、 ６３２　（Ｉ６４００）。

４９２．２２８７ （０３１Ｈ３ＯＮ３°３） ｎｍ（ε）： 第５図に示す。

２０８　（Ｉ９７００）、 ２４６　（Ｉ８１００）、 ２８３　（Ｉ１３００）、 ４４５　（５７００）、 ４７０　（５３００）、 ５７０　（Ｉ１７００）。

ル中 ２０７　（Ｉ９６００）、 ２４７　（２１１００）、 ２８０　（７８００）、 ３２５　（Ｉ２１００）、 ４１０　（５３００）、 ４３０　（６４００）、 ６６５　（Ｉ３１００）。

０．０１規定水酸化ナトリウム−メタノール中２０８　
（３４９００）、　２０９　（２９５００）、２５０　
（２６４００）、　２５１　（Ｉ６３００）、３４３　
（Ｉ７４００）、　３３５　（８０００）、４１５　（
６５００）、　　４１０　（３６００）、４３０　（６
５００）、　　４４０　（４４００）、６１５　（Ｉ７
３００）。　５３５　（Ｉ１６００）。

（７）赤外吸収スペクトル（ＫＢｒディスク法）：第２
図に示す。　　　　　第６図に示す。

（８）プロトン核磁気共鳴スペクトル （５００メガヘル′人重クロロホルム中）：第３図に示
す。　　　　　第７図に示す。

（９）炭素１３核磁気共鳴スペクトル （Ｉ２５メガヘルツ、重クロロホルム中）：第４図に示
す。　　　　　第８図に示す。

式（Ｉ）および（Ｉ′）で示される化合物は、カルボキ
シル基の位置において塩基付加塩があり得る。本発明に
よる化合物はこの塩基付加塩も包含するものである。塩
基付加塩としては、例えばアルカリ金属化合物（例えば
水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなど）との塩、アル
カリ土類金属化合物（例えば水酸化カルシウム、水酸化
マグネシウムなど）との塩、アンモニウム塩、有機塩基
（例えばトリエチルアミン、エタノールアミンなど）と
の塩をあげることができる。塩基付加塩を医薬として使
用する場合には、塩基は薬学上許容されるものでなけれ
ばならないことは言うまでもない。

ＢＫ９７Ｂの製造 １）概要 化合物ＢＫ９７Ｂ、すなわちＢＫ９７Ｂ−１およびＢＫ
９７Ｂ−２は現在のところ微生物の培養によってのみ得
られているが、類縁化合物の合成化学的修飾によって製
造することも、あるいは全合成化学的に製造することも
てきよう。また、遺伝子工学的手法によることもてきよ
う。すなわち、化合物ＢＫ９７Ｂの産生に関与する遺伝
子を適当な微生物に導入し、この様な形質転換微生物を
培養し、この培養物から得ることも可能であろう。

微生物の培養による場合の菌株としては、例えばストレ
プトミセス属に属するＢＫ９７Ｂの生産能を有するもの
、すなわち、ＢＫ９７Ｂ−１および（または）ＢＫ９７
Ｂ−２の生産能を有するもの、が使用される。具体的に
は、本発明者らの分離したストレプトミセス・プルニコ
ロル１８８４ＳＶＴ２株がＢＫ９７Ｂ−１およびＢＫ９
７Ｂ２を生産することが本発明者らによって明らかにさ
れているが、その他の菌株については、抗生物質生産菌
単離の常法によって適当なものを自然界より分離するこ
とが可能である。また、ストレプトミセス・プルニコロ
ル１８８４−８ＶＴ２株を含めてＢＫ９７Ｂの生産菌を
放射線照射その他の変異処理に付して、ＢＫ９７Ｂの生
産能を高める余地も残されている。遺伝子工学的手法も
また可能であることは前記したところである。

得られる化合物ＢＫ９７Ｂ−１およびＢＫ９７Ｂ−２は
、常法によって前記したような塩基付加塩の形にするこ
とができる。

２）１８８４−８ＶＴ２株 ＢＫ９７Ｂ生成能を有するストレプトミセス属の菌株と
して本発明者らの見出している１８８４ＳＶＴ２株は、
下記の内容のものである。

（Ｉ）由来および寄託番号 １８８４−３ＶＴ２株は青森県藤崎町のリンゴ園で採取
した土壌から分離されたものであり、平成２年１月１７
日に工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されて「微
工研条寄第２７２８号」（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−２７２８
）の番号を得ている。

（２）菌学的性状 １８８４−３ＶＴ２株の菌学的性状は以下のとおりであ
る。

本菌株の基生菌糸は分断しないが、長期間の液体静置培
養において長円形の胞子を単独または短い鎖状に形成す
ることがある。気菌糸は分枝しながら伸長し、後に全菌
糸が分節して１０〜５０またはそれ以上の数からなる直
状の胞子鎖を形成する。しばしば長い気菌糸が絡まり「
鳥の巣状菌糸塊」を形成し、後に胞子塊になる。分節胞
子は非運動性の長円形または円筒形で、０．５〜０．７
×０．７〜１．７μｍの大きさで、平滑表面である。菌
核、胞子のう、その他の特殊形態は観察されない。細胞
壁化学型はＩ型である。

培養性状は表１に示す。集落表面の菌叢色は赤色系列（
桃白色〜明茶味灰色）を呈する。裏面色は明橙色または
明茶色〜茶色〜暗茶色または暗茶味灰色であり、酸性で
黄味を増し、塩基性で赤味を増加する。拡散性色素は橙
色または茶色で、裏面色と同様なｐＨ感受性を示す。生
理的性状は表２に示す。本菌株は中温性で、メラニン色
素を生成し、スターチの分解と蛋白質の分解（弱い）お
よび銅酸塩の還元が共に陽性である。炭素源の同化は診
断糖の全てを利用する。

本菌株の形態的性状と細胞壁化学型から、本菌株はスト
レプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓ以後Ｓと略
す）属に位置される。上述の諸性状を基に［細菌名承認
リスト、１９８０Ｊおよびそれ以後の「有効名リスト」
に記載されたＳ属の種について検索し、近縁の４種を選
出した。最近出版された「バージエイ氏細菌系統分類学
便覧４巻」（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　
Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　ＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙＶｏ
ｌ、４）のＳ属に関するウィリアムス等（Ｗｉｌｌｉａ
ｍｓ。

ｅｔ　ａｌ、）の記述によれば、それ等の近縁４種のう
ちＳ−プルニコロル（Ｓ、ｐｒｕｎｉｃｏｌｏｒ）とＳ
−フルビッシマス（Ｓ、ｆｕｌｖｊｓｓｊｍｕｓ）の２
種以外はＳ−（異名）とされている。ウィリアムス等の
厚相（Ｉ９８３）に拠れば、Ｓ属の承認・有効名を持っ
た（種の）標準菌株を数値分類法により、「各性状は等
価の分類基準」とし、各菌株の数値的類似度の高い多数
のクラスター（群）に分けて種を再分類している。その
報告では上述の４種は隣接したクラスターに置かれてい
る。そこで４種の診断的性状を同報告から選択し、本菌
株の同性状と比較した（表３）。本菌株とＳ・プルニコ
ロルとは一致する性状が１９で不一致が６性状あり、Ｓ
・フルビッシマスとは一致性状が１２で不一致の性状が
４、Ｓ・カリフォルニクスとは一致性状が１０で不一致
が１１性状、Ｓ・エクスフォーリアタスとは一致性状が
９で不一致が４性状ある。本菌株とＳ・プルニコロルお
よびＳ・フルビッシマスの２種は他の２種より類縁塵が
著しく高く、前者は後者より僅かに高い。一方、国際ス
トレプトミセス・プロジェクト（ＩＳＰ）の記載により
比較すると、本菌株はＳφフルビッシマスよりＳ・プル
ニコロルに近縁で、特にその形態は「鳥の巣状菌糸塊」
を形成する点まで一致する。よって本菌株はＳ・プルニ
コロルの一菌株として位置づけられる。以上の理由によ
って本菌株をストレプトミセス　プルニコロル（Ｓｔ　
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｐｒｕｎｉｃｏｌｏｒ）菌株１８
８４−８ＶＴ２と命名する。

表 菌株１８８４−３ＶＴ２の生理的性状 観察はメラニン様色素の場合は２日日、他は２週間目、
その後は３週間以後に丸ａ 表 本菌株と近縁種との主要性状および診断性状の比較十 ９０％以上が陽性、 １０％以下が陽性、 ｄ：１１％〜８９％が陽性 １つ く培養／ＢＫ９７Ｂの生産〉 化合物ＢＫ９７Ｂ、すなわちＢ　Ｋ　９７　Ｂ　−１お
よびＢＫ９７Ｂ−２は、ストレプトミセス属に属するＢ
Ｋ９７Ｂ生産菌を適当な培地で好気的に培養し、その培
養物から目的物を採取することによって製造することが
できる。

培地は、ＢＫ９７Ｂ生産菌が利用しうる任意の栄養源を
含有するものでありうる。具体的には、例えば、炭素源
としてグルコース、シュークロス、マルトース、スター
チおよび油脂類などが使用でき、窒素源として大豆粉、
綿実粕、乾燥酵母、酵母エキスおよびコーンステイープ
リカーなどの有機物ならびにアンモニウム塩または硝酸
塩、たとえば硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウムおよび
塩化アンモニウムなどの無機物が利用できる。また、必
要に応じて、塩化ナトリウム、塩化カリウム、燐酸塩、
重金属塩など無機塩類を添加することができる。発酵中
の発泡を抑制するために、常法に従って適当な消泡剤、
例えばシリコーン油を添加することもてきる。

培養方法としては、一般に行われている抗生物質の生産
方法と同じく、好気的液体培養法が最も適している。培
養温度は２０−３７℃か適当であるか、２５−３０℃か
好ましい。この方法でＢＫ９７Ｂの生産量は、振盪培養
、通気攪拌培養ともに培養２日間で最高に達する。

このようにしてＢＫ９７Ｂ　（ＢＫ９７Ｂ−１およびＢ
Ｋ９７Ｂ−２）の蓄積された培養物が得られる。培養物
中では、ＢＫ９７Ｂはその一部は培養濾液中に存在する
が、その大部分は菌体中に存在する。

このような培養物からＢ　Ｋ　９７　Ｂを採取するには
、合目的的な任意の方法か利用可能である。そのひとつ
の方法は抽出の原理に基づくものであって、具体的には
、培養濾液中のＢ　Ｋ　９７　Ｂについてはこれを水不
混和性のＢ　Ｋ　９７　Ｂ用溶媒（前記Ｂ　Ｋ　９７　
Ｂの物理化学的性状の項参照）、例えば酢酸エチルなと
で抽出する方法、あるいは菌体内のＢＫ９７Ｂについて
は濾過、遠心分離などで得た菌体集体をメタノール、エ
タノール、アセトンなとで処理して回収する方法なとが
ある。菌体を分離せずに培養物そのままを上記の抽出操
作に付すこともできる。適当な溶媒を用いた自流分配法
も抽出の範時に入れることかできる。

培養物からＢＫ９７Ｂを採取する他のひとつの方法は吸
着の原理に基づくものであって、既に液状となっている
Ｂ　Ｋ　９　７　Ｂ含有物、たとえば培養濾液あるいは
上記のようにして抽出操作を行うことによって得られる
抽出液を対象として、適当な吸着剤、たとえばシリカゲ
ル、活性炭、「ダイヤイオンＨＰ−２０Ｊ　　（三菱化
成社製）などを用いて目的のＢ　Ｋ　９　７　Ｂを吸着
させ、その後、適当な溶媒にて溶離させることによって
Ｂ　Ｋ　９　７　Ｂを得ることかできる。このようにし
て得られたＢ　Ｋ９７Ｂ溶液を減圧濃縮乾固すれば、Ｂ
　Ｋ　９　７　Ｂ粗標品か得られる。

このようにして得られるＢＫ９７Ｂの粗標品をさらに精
製するためには、上記の抽出法および吸着法にゲル濾過
法、高速液体クロマトグラフィーなどを必要に応じて組
合せて必要回数行えばよい。

２ま たとえば、シリカゲルなどの吸着剤、「セファデックス
ＬＨ−２０Ｊ　　（ファルマシア社製）などのゲル濾過
剤を用いたカラムクロマトグラフィーｒＭＭＣパック」
　（山村科学社製）なとを用いた高速液体クロマトグラ
フィーおよび向流分配法を適宜組合せて実施することか
できる。具体的には、たとえば、上記のようにして得ら
れるＢＫ９７Ｂの粗標品を少量のクロロホルムに溶解し
てシリカゲルカラムに付し、クロロホルム−メタノール
（２０・１）混合液で溶出させると２つの活性画分を与
える。それぞれを濃縮することによりＢＫ９７Ｂ−１お
よびＢＫ９７Ｂ−２の粗標品を得る。このようにして得
られるＢＫ９７Ｂ−１およびＢＫ９７Ｂ−２の粗標品を
１セファデックスＬＨ−２０Ｊカラムにそれぞれ付し、
前者の場合はクロロホルム−メタノール（Ｉ・１）混合
液で、また後者の場合にはメタノールで、それぞれ活性
画分を溶出させ、濃縮乾固するとＢ　Ｋ　９　７　Ｂ　
−　１およびＢ　Ｋ　９　７　Ｂ　−　２の純品か得ら
れる。

＜ＢＫ９７１３の用途〉 本発明による化合物ＢＫ９７Ｂは、抗酸化活性を有する
という点で有用である。

１）生物活性 ＢＫ９７Ｂはラット肝ミクロソームにおける脂質過酸化
抑制活性を示した。生成した過酸化脂質はチオバルビッ
ール酸法により検出した。例えば、１０％ラット肝ミク
ロソーム（０．　　５ｍｌ）を種々の濃度のＢ　Ｋ　９
　７　Ｂ　−　１またはＢ　Ｋ　９　７　Ｂ　−　２（
Ｏ、０５ｍｌ）および０．００１５Ｍアスコルビン酸（
　０　、　　５　ｎｎｌ　）と共に３７°Ｃ，　１時間
インキュヘ−１・後、０．６７％チオバルビッール酸（
　０　、　　５　ｍｌ　）と共に１００°０１２０分間
インキュベート後、５３０ｎｍの波長で吸光係数を測定
したＩＣ５０値は、ＢＫ９７Ｂ−１では０．０７μｇ／
ｍｌ，ＢＫ９７Ｂー２では０．６７μｇ／ｍｌであった
。

上記のように、本発明によるＢＫ９７Ｂは抗酸化活性を
示すことが明らかにされた。したがって、本発明による
ＢＫ９７Ｂは抗酸化剤として使用することかできる。

２）抗酸化剤 このように、本発明によるＢＫ９７Ｂは、動物の肝ミク
ロソームにおいて脂質過酸化抑制活性を示すことが明ら
かにされた。

したがって、本発明化合物は抗酸化剤として使用するこ
とができる。

〈実験例〉 １）培養 使用した培地は、下記の組成の成分を１リツトルの水に
溶解して、ｐａ７．０に調整したものである。

スターチ　　２５ｇ 大　　豆　　粉　　　　　１５ｇ 乾燥酵母　　　２ｇ 炭酸カルシウム　　　　４ｇ 上記培地を１００ｍ１ずつ５００ｍ１容イボ付三角フラ
スコに分注殺菌したものへ、ストレプトミセス・プルニ
コロル１８８４−３ＶＴ２株を接種し、２７℃にて２日
間、２０Ｏｒｐｍの回転培養を行っ２）ＢＫ９７Ｂの採
取 上記の条件で培養後、培養液（５リツトル）を濾過し、
菌体を１リツトルのアセトンで抽出する。

抽出液を濃縮後、２００ｍ１の酢酸エチルで３回抽出し
、濃縮乾固する。これを１０ｍ１のクロロホルムに溶解
し、シリカゲル（和光純薬社製［ワコゲルＣ２００Ｊ）
のカラム（４ｃｍφＸ２０ｃｍ）に吸着させ、クロロホ
ルムで洗浄後、クロロホルムメタノール（Ｉ０：１）で
溶出する。活性フラクションを濃縮乾固し、トヨパール
ＨＷ−４０Ｆカラム（東ソー社製）　　（２，５ｃｍφ
Ｘ５０ｃｍ）に付し、メタノールで溶出するとＢＫ９７
Ｂ−１粗分画およびＢＫ９７Ｂ−２粗分画を得る。それ
ぞれをさらにシリカゲルカラム（３，５ｃｍφ×２５ａ
ｍ）に吸着させ、クロロホルム−メタノール（Ｉ０：１
）で展開する。青着色フラクションを濃縮乾固すると、
それぞれ２Ｉｌ１ｇのＢＫ９７Ｂ−１純品、および１ｍ
ｇのＢＫ９７Ｂ−２純品を得る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＢＫ９７Ｂ−１のメタノール中（実線）、０
．０１規定塩酸−メタノール中（点線）および０．０１
規定水酸化ナトリウム−メタノール中（破線）での紫外
吸収スペクトルを模写したものである。 第２図は、ＢＫ９７Ｂ−１のＫＢｒディスク法による赤
外吸収スペクトルを模写したものである。 第３図は、ＢＫ９７Ｂ−１の重クロロホルム中における
５００メガヘルツプロトン核磁気共鳴スペクトルを模写
したものである。 第４図は、ＢＫ９７Ｂ−１の重クロロホルム中における
１２５メガヘルツ炭素１Ｂ核磁気共鳴スペクトルを模写
したものである。 第５図は、ＢＫ９７Ｂ−２のメタノール中（実線）、０
．０１規定塩酸−メタノール中（点線）および０，０１
規定水酸化ナトリウム−メタノール中（破線）での紫外
吸収スペクトルを模写したものである。 第６図は、ＢＫ９７Ｂ−２のＫＢｒディスク法による赤
外吸収スペクトルを模写したものである。 第７図は、ＢＫ９７Ｂ−２の重クロロホルム中における
５００メガヘルツプロトン核磁気共鳴スペクトルを模写
したものである。 第８図は、ＢＫ９７Ｂ−２の重クロロホルム中における
１２５メガヘルツ炭素１３核磁気共鳴スペクトルを模写
したものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次式（ I ）で示される、化合物ＢＫ９７Ｂ−１ま
   たはその塩基付加塩。 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） ２、次式（ I ′）で示される、化合物ＢＫ９７Ｂ−２
   またはその塩基付加塩。 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ′） ３、ストレプトミセス属に属しＢＫ９７Ｂの生産能を有
   する菌株を適当な培地で好気的に培養し、その培養物よ
   り化合物ＢＫ９７Ｂを得ることを特徴とする、次式（
   I ）で表されるＢＫ９７Ｂ−１または次式（ I ′）で
   表されるＢＫ９７Ｂ−２の製造法。 ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ′）