JPH0430278B2 - - Google Patents
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- JPH0430278B2 JPH0430278B2 JP60201445A JP20144585A JPH0430278B2 JP H0430278 B2 JPH0430278 B2 JP H0430278B2 JP 60201445 A JP60201445 A JP 60201445A JP 20144585 A JP20144585 A JP 20144585A JP H0430278 B2 JPH0430278 B2 JP H0430278B2
- Authority
- JP
- Japan
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- hybridoma
- cells
- adriamycin
- resistant
- mouse
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- Expired - Lifetime
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
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- Y10S530/861—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving IgG3, IgG4, IgA, or IgY
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y10S530/864—Monoclonal
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
発明の背景
技術分野
本発明は、薬剤耐性癌細胞に関するモノクロー
ナル抗体およびその製造に関する。さらに具体的
には、本発明は、該モノクローナル抗体および該
モノクローナル抗体の生産方法に関する。
ナル抗体およびその製造に関する。さらに具体的
には、本発明は、該モノクローナル抗体および該
モノクローナル抗体の生産方法に関する。
癌を化学療法により治療していく際に、抗癌剤
に対する耐性を有する癌細胞が選択されて出現し
てくる現象がみられ、重大な問題となつている。
この耐性を克服するためには抗癌剤の投与量を増
やすことが考えられよう。しかし、投与量の増大
は正常細胞に対する障害という副作用で患者を不
必要に苦しめることになる。耐性克服のための他
の手段として他の種類の抗癌剤を使用することが
考えられよう。しかし、この場合では、一旦一つ
の薬剤に対し耐性となつた癌細胞はしばしばいわ
ゆる「多剤交叉耐性（pleiotropic drug
resistance）を示すことがあつて効果が少ないこ
とが多い。
に対する耐性を有する癌細胞が選択されて出現し
てくる現象がみられ、重大な問題となつている。
この耐性を克服するためには抗癌剤の投与量を増
やすことが考えられよう。しかし、投与量の増大
は正常細胞に対する障害という副作用で患者を不
必要に苦しめることになる。耐性克服のための他
の手段として他の種類の抗癌剤を使用することが
考えられよう。しかし、この場合では、一旦一つ
の薬剤に対し耐性となつた癌細胞はしばしばいわ
ゆる「多剤交叉耐性（pleiotropic drug
resistance）を示すことがあつて効果が少ないこ
とが多い。
従つて、こうした癌細胞の薬剤耐性を克服する
ため、副作用が少なくて、選択性の高い、かつ多
剤交叉耐性を示す癌細胞に対して有効な薬剤ある
いは方法の確立は重要な課題となつている。
ため、副作用が少なくて、選択性の高い、かつ多
剤交叉耐性を示す癌細胞に対して有効な薬剤ある
いは方法の確立は重要な課題となつている。
先行技術
多剤交叉耐性を示す癌細胞に選択性を有するモ
ノクローナル抗体は既に作成されている〔ジヤー
ナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（J.Clin.
Oncology）、第３巻、第311〜315頁（1985年）〕。
これは、多剤交叉耐性を示す癌細胞の細胞膜上に
特異的に出現する分子量17万〜18万ダルトンの糖
蛋白質に反応するモノクローナル抗体である。し
かし、このモノクローナル抗体を作成する際に用
いた耐性細胞株は、ヒトではなくてチヤイニーズ
ハムスター由来のものであり、またこのモノクロ
ーナル抗体により耐性癌細胞の薬剤に対する感受
性については何ら報告されていない。
ノクローナル抗体は既に作成されている〔ジヤー
ナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（J.Clin.
Oncology）、第３巻、第311〜315頁（1985年）〕。
これは、多剤交叉耐性を示す癌細胞の細胞膜上に
特異的に出現する分子量17万〜18万ダルトンの糖
蛋白質に反応するモノクローナル抗体である。し
かし、このモノクローナル抗体を作成する際に用
いた耐性細胞株は、ヒトではなくてチヤイニーズ
ハムスター由来のものであり、またこのモノクロ
ーナル抗体により耐性癌細胞の薬剤に対する感受
性については何ら報告されていない。
従つて、この先行技術に係るモノクローナル抗
体は、ヒト薬剤耐性癌細胞の選択的治療に用いる
ことができないであろうと解される。
体は、ヒト薬剤耐性癌細胞の選択的治療に用いる
ことができないであろうと解される。
発明の概要
要 旨
本発明者らは、アドリアマイシン耐性腫瘍細胞
で免疫したマウスの脾細胞とマウス骨髄腫細胞と
を融合させて得られたハイブリドーマにより生産
されるモノクローナル抗体が多剤交叉耐性を示す
癌細胞を選択的に増殖阻害するかあるいはその薬
物に対する感受性を高めることを見出して本発明
を完成した。
で免疫したマウスの脾細胞とマウス骨髄腫細胞と
を融合させて得られたハイブリドーマにより生産
されるモノクローナル抗体が多剤交叉耐性を示す
癌細胞を選択的に増殖阻害するかあるいはその薬
物に対する感受性を高めることを見出して本発明
を完成した。
従つて、本発明による薬剤耐性癌に関するモノ
クローナル抗体は、下記の(イ)〜(ニ)によつて定義さ
れるものであること、を特徴とするものである。
クローナル抗体は、下記の(イ)〜(ニ)によつて定義さ
れるものであること、を特徴とするものである。
また、本発明による下記の(イ)〜(ニ)によつて定義
される薬剤耐性癌に関するモノクローナル抗体の
製造法は、下記の工程(a)〜(g)からなること、を特
徴とするものである。
される薬剤耐性癌に関するモノクローナル抗体の
製造法は、下記の工程(a)〜(g)からなること、を特
徴とするものである。
(a) ヒト骨髄性白血病細胞株K562から選抜して
確立したアドリアマイシン耐性株K562／ADM
によりマウスを免疫すること。
確立したアドリアマイシン耐性株K562／ADM
によりマウスを免疫すること。
(b) 免疫されたマウスから脾臓を取り出して、そ
の細胞懸濁液を作成すること。
の細胞懸濁液を作成すること。
(c) この脾細胞をマウス骨髄腫細胞と共に細胞融
合条件に付して、両細胞の融合によるハイブリ
ドーマを形成させること。
合条件に付して、両細胞の融合によるハイブリ
ドーマを形成させること。
(d) 上記の工程より得られる細胞混合物を、ハイ
ブリドーマのみを成育させることのできる選択
培地で培養すること。
ブリドーマのみを成育させることのできる選択
培地で培養すること。
(e) ハイブリドーマ含有上清について目的抗体の
有無を測定して、目的抗体を産生するハイブリ
ドーマを選択すること。
有無を測定して、目的抗体を産生するハイブリ
ドーマを選択すること。
(f) 選択されたハイブリドーマをクローン化する
こと。
こと。
(g) このクローンをマウスの腹腔内に移植するか
あるいは培地にて培養し、癌性の腹水中または
培養上清中に生成蓄積されたモノクローナル抗
体を採取すること。
あるいは培地にて培養し、癌性の腹水中または
培養上清中に生成蓄積されたモノクローナル抗
体を採取すること。
(イ) ヒト骨髄性白血病細胞株K562のアドリアマ
イシン耐性株K562／ADMにより免疫したマウ
スから得られた脾細胞とマウスの骨髄腫細胞と
を融合させて作成したハイブリドーマにより生
産されるものであること。
イシン耐性株K562／ADMにより免疫したマウ
スから得られた脾細胞とマウスの骨髄腫細胞と
を融合させて作成したハイブリドーマにより生
産されるものであること。
(ロ) アドリアマイシン耐性株と反応するがアドリ
アマイシン感受性株とは実質上反応しないこ
と。
アマイシン感受性株とは実質上反応しないこ
と。
(ハ) アドリアマイシン耐性株の細胞増殖を阻害す
るかあるいはその細胞のビンクリスチンまたは
アクチノマイシンＤに対する感受性を高める能
力があること。
るかあるいはその細胞のビンクリスチンまたは
アクチノマイシンＤに対する感受性を高める能
力があること。
(ニ) IgGイソタイプに属するものであること。
効 果
前記したように、また後記実験例から明らかな
ように、本発明によるモノクローナル抗体は多剤
交叉耐性を示す癌細胞を選択的に増殖阻害する
か、あるいはその薬物に対する感受性を高める能
力を有している。
ように、本発明によるモノクローナル抗体は多剤
交叉耐性を示す癌細胞を選択的に増殖阻害する
か、あるいはその薬物に対する感受性を高める能
力を有している。
従つて、本発明によるモノクローナル抗体は、
副作用が少なくて選択性の高いかつ多剤交叉耐性
を示す癌細胞に対して有効な薬剤あるいは方法の
確立という重要な課題に対する一つの解決手段と
なりうるものである。
副作用が少なくて選択性の高いかつ多剤交叉耐性
を示す癌細胞に対して有効な薬剤あるいは方法の
確立という重要な課題に対する一つの解決手段と
なりうるものである。
発明の具体的説明
本発明によるモノクローナル抗体は、抗原とな
る細胞がアドリアマイシン耐性ヒト腫瘍細胞であ
るという点に留意すれば、細胞融合によるハイブ
リドーマの製造およびこのハイブリドーマによる
モノクローナル抗体の製造からなる合目的的な任
意の方法によつて製造することができる。
る細胞がアドリアマイシン耐性ヒト腫瘍細胞であ
るという点に留意すれば、細胞融合によるハイブ
リドーマの製造およびこのハイブリドーマによる
モノクローナル抗体の製造からなる合目的的な任
意の方法によつて製造することができる。
細胞融合法を含めてモノクローナル抗体の製造
に関しては既に綜説ないし成書がいくつか知られ
ているので、本発明の一具体例についての下記の
説明以外に必要な情報に関してはそれらの文献を
参照されたい。適当な文献のいくつかを挙げれ
ば、たとえば、ガルフレおよびミルステイン：
「メソツヅ・イン・エンザイモロジー」（G.
Galre′、C.Milstein：Methods Engymol.）第73
巻、第346頁（1981）およびゴーデイング：「モノ
クローナル・アンチボデイーズ：プリンシプル
ズ・アンド・プラクチス」（アカデミツク・プレ
ス刊1983）（J.W.Goding：Monoclonal
Antibodies：Principles and Practice、
Acadmic Press、1983）がある。
に関しては既に綜説ないし成書がいくつか知られ
ているので、本発明の一具体例についての下記の
説明以外に必要な情報に関してはそれらの文献を
参照されたい。適当な文献のいくつかを挙げれ
ば、たとえば、ガルフレおよびミルステイン：
「メソツヅ・イン・エンザイモロジー」（G.
Galre′、C.Milstein：Methods Engymol.）第73
巻、第346頁（1981）およびゴーデイング：「モノ
クローナル・アンチボデイーズ：プリンシプル
ズ・アンド・プラクチス」（アカデミツク・プレ
ス刊1983）（J.W.Goding：Monoclonal
Antibodies：Principles and Practice、
Acadmic Press、1983）がある。
ハイブリドーマ／モノクローナル抗体の製造
(1) アドリアマイシン耐性癌細胞の選択と確立
本発明らによつて、すでに、ビンカアルカロ
イド系の抗ガン剤であるビンクリスチン耐性の
ヒト骨髄性白血病細胞株（K562／VCR）が選
択確立されているが、この耐性株は、アンスラ
サイクリン系の抗ガン剤であるアドリアマイシ
ンに対してもすでに軽度の交叉耐性を示してい
る〔「癌（Gann）」）第74巻、第751〜758頁
（1983）〕。本発明の具体例では、この株を出発
の細胞株として用いている。この株は、(財)癌研
究会・癌化学療法センター（東京都豊島区上池
袋１−37−１）から自由に入手することができ
る。
イド系の抗ガン剤であるビンクリスチン耐性の
ヒト骨髄性白血病細胞株（K562／VCR）が選
択確立されているが、この耐性株は、アンスラ
サイクリン系の抗ガン剤であるアドリアマイシ
ンに対してもすでに軽度の交叉耐性を示してい
る〔「癌（Gann）」）第74巻、第751〜758頁
（1983）〕。本発明の具体例では、この株を出発
の細胞株として用いている。この株は、(財)癌研
究会・癌化学療法センター（東京都豊島区上池
袋１−37−１）から自由に入手することができ
る。
最初にビンクリスチン耐性細胞株K562／
VCRを、IC50である3nMのアドリアマイシン
を含むRPMI1640（10％牛胎児血清（FCS））で
培養し、成育してきた細胞について以下順次約
３倍の比率でアドリアマイシンの濃度を増量さ
せることにより、高濃度の薬剤耐性株を選択し
ていく。
VCRを、IC50である3nMのアドリアマイシン
を含むRPMI1640（10％牛胎児血清（FCS））で
培養し、成育してきた細胞について以下順次約
３倍の比率でアドリアマイシンの濃度を増量さ
せることにより、高濃度の薬剤耐性株を選択し
ていく。
耐性株が成育しうる最高濃度の薬剤存在下
に、選択した薬剤耐性株を約１年間成育させ、
その後薬剤を含まない培地にて培養しても耐性
の性質を失わない安定した細胞株を得る。
に、選択した薬剤耐性株を約１年間成育させ、
その後薬剤を含まない培地にて培養しても耐性
の性質を失わない安定した細胞株を得る。
(2) 免疫化動物脾細胞の調製
得られたアドリアマイシン耐性ヒト骨髄白血
病細胞株KT562／ADMを、一匹のマウスにつ
き107細胞となるよう0.5mlのハンクスのバラン
ス緩衝生理食塩水（以下、HBBSという）に
て一回洗浄のあと、同量のHBBSに懸濁させ、
４〜６週令のメスのBalb／ｃマウスに腹腔内
投与する。同様に週に一回の割合で抗体価が充
分上昇するまで投与を続け、細胞融合の３日前
に106細胞を0.1mlに懸濁させてブースターとし
て静脈内に投与する。このようにして得た免疫
化動物より無菌的に脾臓を採取する。取り出し
た脾臓はシヤーレ上でピンセツトを用いて無菌
的にほぐし、その一部をとつて、得られた細胞
数を算出する。
病細胞株KT562／ADMを、一匹のマウスにつ
き107細胞となるよう0.5mlのハンクスのバラン
ス緩衝生理食塩水（以下、HBBSという）に
て一回洗浄のあと、同量のHBBSに懸濁させ、
４〜６週令のメスのBalb／ｃマウスに腹腔内
投与する。同様に週に一回の割合で抗体価が充
分上昇するまで投与を続け、細胞融合の３日前
に106細胞を0.1mlに懸濁させてブースターとし
て静脈内に投与する。このようにして得た免疫
化動物より無菌的に脾臓を採取する。取り出し
た脾臓はシヤーレ上でピンセツトを用いて無菌
的にほぐし、その一部をとつて、得られた細胞
数を算出する。
抗体価の測定のためには、抗アドリアマイシン
耐性株抗体価を以下に示す固相法による酸素免疫
測定法で調べる。
耐性株抗体価を以下に示す固相法による酸素免疫
測定法で調べる。
プレートの前処理：フアルコンプレート
3912に、１ウエルあたり、50μlのポリ−Ｌ−
リジン0.001％溶液を加え、室温で30分間反
応させた後、水をきり、風乾させる。
3912に、１ウエルあたり、50μlのポリ−Ｌ−
リジン0.001％溶液を加え、室温で30分間反
応させた後、水をきり、風乾させる。
細胞のプレートへの結合：K562親株およ
びK562／ADM耐性株をそれぞれ200万個・
細胞／mlの濃度で懸濁し、調整したものを１
ウエルあたり50μl（細胞数にして10万個）づ
つ、それぞれのウエルに分注し、1000rpmで
５分間遠心することによりウエルに結合させ
る。その後、0.5％のグルタルアルデヒドを
１ウエルあたり50μlずつ加えることで結合を
より完全にする。
びK562／ADM耐性株をそれぞれ200万個・
細胞／mlの濃度で懸濁し、調整したものを１
ウエルあたり50μl（細胞数にして10万個）づ
つ、それぞれのウエルに分注し、1000rpmで
５分間遠心することによりウエルに結合させ
る。その後、0.5％のグルタルアルデヒドを
１ウエルあたり50μlずつ加えることで結合を
より完全にする。
ブロツキング：余分な結合基をマスクする
ために、RPMI1640中に３％になるよう溶解
したウシ血清アルブミン（BSA）を１ウエ
ルあたり200μl加え、30分間室温で処理する。
ために、RPMI1640中に３％になるよう溶解
したウシ血清アルブミン（BSA）を１ウエ
ルあたり200μl加え、30分間室温で処理する。
測定サンプルの添加： 抗体価を測定する
サンプルは、１ウエルあたり50μlずつ、一種
類のサンプルについて、K562とK562／
ADMのそれぞれのウエルに加え、室温ある
いは37℃にて２時間反応させる。その後、リ
ン酸緩衝生理食塩水（PBS）にて、４回洗
浄する。
サンプルは、１ウエルあたり50μlずつ、一種
類のサンプルについて、K562とK562／
ADMのそれぞれのウエルに加え、室温ある
いは37℃にて２時間反応させる。その後、リ
ン酸緩衝生理食塩水（PBS）にて、４回洗
浄する。
二次抗体の添加：二次抗体としてヤギのペ
ルオキシダーゼ結合−抗マウスIg抗体のＦ
（ab′）2フラグメント〔米国カツペル
（Cappel）社製〕を、1500倍PBS中にて希釈
した溶液を各ウエルに加え、さらに２時間室
温で反応させる。
ルオキシダーゼ結合−抗マウスIg抗体のＦ
（ab′）2フラグメント〔米国カツペル
（Cappel）社製〕を、1500倍PBS中にて希釈
した溶液を各ウエルに加え、さらに２時間室
温で反応させる。
判定： ペルオキシダーゼの基質としてオ
ルトフエニレンジアミンを各ウエルに加え、
反応を硫酸で停止させた後、K562とK562／
ADMの間の発色の有無と差違を、肉眼ある
いはオートリーダーにより判定する。
ルトフエニレンジアミンを各ウエルに加え、
反応を硫酸で停止させた後、K562とK562／
ADMの間の発色の有無と差違を、肉眼ある
いはオートリーダーにより判定する。
(3) マウス骨髄腫細胞の調製
骨髄細胞株としては、たとえば、マウス由来
の８−アザグアニン耐性骨髄腫細胞株P3・
X63・Ag8・653〔ジヤーナル・オブ・イムノロ
ジー（Journal of lmmunology）第123巻第
1548〜1550頁（1979）〕を用いる。融合当日２
×107以上の細胞数をつかえるようにしておく。
この株は、米国メリーランド州のアメリカン・
タイプ・カルチヤー・コレクシヨン
（American Type Culture Collection）に
CRL−1580として登録されており、同所ある
いは米国フロー・ラボラトリー・インコーポレ
ーテツド（Flow Laboratory Inc.）から自由
に入手することができる。
の８−アザグアニン耐性骨髄腫細胞株P3・
X63・Ag8・653〔ジヤーナル・オブ・イムノロ
ジー（Journal of lmmunology）第123巻第
1548〜1550頁（1979）〕を用いる。融合当日２
×107以上の細胞数をつかえるようにしておく。
この株は、米国メリーランド州のアメリカン・
タイプ・カルチヤー・コレクシヨン
（American Type Culture Collection）に
CRL−1580として登録されており、同所ある
いは米国フロー・ラボラトリー・インコーポレ
ーテツド（Flow Laboratory Inc.）から自由
に入手することができる。
(4) 細胞融合
(2)で免疫した動物により得られる脾細胞と(3)
で得られる骨髄腫細胞とを、細胞数が脾細胞：
骨髄腫細胞＝７：１となるよう混合し、ポリエ
チレングリコール4000とジメチルスルホキシド
をそれぞれ43％と13％含むRPMI−1640培地中
で細胞融合させる。
で得られる骨髄腫細胞とを、細胞数が脾細胞：
骨髄腫細胞＝７：１となるよう混合し、ポリエ
チレングリコール4000とジメチルスルホキシド
をそれぞれ43％と13％含むRPMI−1640培地中
で細胞融合させる。
融合した細胞は、96ウエルプラスチツクプレ
ートにて、ヒポキサンチン、アミノプテリンお
よびチミジン（以下HATと略す）を含む
RPMI−1640培地中で７日間、さらにHATを
含まない培地中で成育させる。この間、３〜５
日ごとに培地の交換をおこなう。
ートにて、ヒポキサンチン、アミノプテリンお
よびチミジン（以下HATと略す）を含む
RPMI−1640培地中で７日間、さらにHATを
含まない培地中で成育させる。この間、３〜５
日ごとに培地の交換をおこなう。
融合後約２週間目に、生き残つた細胞につい
て、その培養上清中の、K562／ADMに選択的
に結合する抗体の有無を、上記(2)で示した酸素
免疫測定法により検索する。
て、その培養上清中の、K562／ADMに選択的
に結合する抗体の有無を、上記(2)で示した酸素
免疫測定法により検索する。
陽性のウエルについては20％の牛胎児血清を
含むRPMI−1640を希釈液として、限界希釈法
をくりかえすことにより、陽性細胞のクローン
ニングを行なう。
含むRPMI−1640を希釈液として、限界希釈法
をくりかえすことにより、陽性細胞のクローン
ニングを行なう。
(5) モノクローナル抗体の調製
プリスタンを、あらかじめ一匹あたり0.5ml
腹腔内に投与することにより前処理したマウス
に、目的とする抗体の産生ハイブリドーマ細胞
を一匹あたり107個腹腔内投与する。投与後、
約２週間でハイブリドーマは腹水癌化するの
で、この貯留した腹水を採取し、蓄積した抗体
の有無を上記の(2)の酵素免疫測定法により調べ
る。
腹腔内に投与することにより前処理したマウス
に、目的とする抗体の産生ハイブリドーマ細胞
を一匹あたり107個腹腔内投与する。投与後、
約２週間でハイブリドーマは腹水癌化するの
で、この貯留した腹水を採取し、蓄積した抗体
の有無を上記の(2)の酵素免疫測定法により調べ
る。
腹水を保存する場合は、遠心分離後の上清を
小分けして−70℃で凍結保存する。
小分けして−70℃で凍結保存する。
抗体をさらに精製するために、腹水を45％飽
和の硫安により４℃で塩析し、さらにセフアク
リル−400（スウエーデン国フアルマシア社製）
を用いてゲル過する。タンパク質の定量はロ
ーリー法によりおこなう。
和の硫安により４℃で塩析し、さらにセフアク
リル−400（スウエーデン国フアルマシア社製）
を用いてゲル過する。タンパク質の定量はロ
ーリー法によりおこなう。
モノクローナル抗体の性質
上記のようにして得られるモノクローナル抗体
のクラスは、ウサギの抗マウスIg各クラスの抗体
（米国カツペル社製）を用いて判定することがで
きる。
のクラスは、ウサギの抗マウスIg各クラスの抗体
（米国カツペル社製）を用いて判定することがで
きる。
また、細胞における抗原の局在は、蛍光発色基
であるFITCが結合したヤギ抗マウスIg抗体（米
国カツペル社製）を用いて蛍光を顕微鏡下で観察
することによつて知ることができる。
であるFITCが結合したヤギ抗マウスIg抗体（米
国カツペル社製）を用いて蛍光を顕微鏡下で観察
することによつて知ることができる。
薬物耐性株のK562／ADMに対する選択性は、
親株であるK562を対照として(2)の酵素免疫測定
法によるものの他に、それぞれの細胞株に対する
細胞増殖の阻害の程度を測定して調べることがで
きる。
親株であるK562を対照として(2)の酵素免疫測定
法によるものの他に、それぞれの細胞株に対する
細胞増殖の阻害の程度を測定して調べることがで
きる。
また、薬物耐性株の薬剤に対する感受性のモノ
クローナル抗体による変化も種々の濃度の薬剤の
存在下でモノクローナル抗体と共存させることに
より、その細胞増殖の阻害の程度を測定して調べ
ることができる。
クローナル抗体による変化も種々の濃度の薬剤の
存在下でモノクローナル抗体と共存させることに
より、その細胞増殖の阻害の程度を測定して調べ
ることができる。
本発明によるモノクローナル抗体の具体例は、
イソタイプがIgG3であるもの、IgG2aであるもの
およびIgG1であるもの等である。本発明では、
これらを、それぞれMRK4、MRK16および
MRK17と名付けている。これらのうちで、代表
的なのは、MRK16およびMRK17である。
イソタイプがIgG3であるもの、IgG2aであるもの
およびIgG1であるもの等である。本発明では、
これらを、それぞれMRK4、MRK16および
MRK17と名付けている。これらのうちで、代表
的なのは、MRK16およびMRK17である。
モノクローナル抗体MRK16およびMRK17は、
薬剤耐性ヒト癌細胞に対して選択的な増殖阻害作
用ないし対薬剤感受性増加作用を有する（実施例
参照）。
薬剤耐性ヒト癌細胞に対して選択的な増殖阻害作
用ないし対薬剤感受性増加作用を有する（実施例
参照）。
実施例
実施例
モノクローナル抗体の作成
(a) アドリアマイシン耐性株の選抜および確立ア
ドリアマイシン耐性細胞株K562／ADMの選抜
のために、同じ親株のヒト骨髄性白血病細胞株
K562から作成されていたビンクリスチン耐性
細胞株K562／VCRを出発の細胞株とした。
ドリアマイシン耐性細胞株K562／ADMの選抜
のために、同じ親株のヒト骨髄性白血病細胞株
K562から作成されていたビンクリスチン耐性
細胞株K562／VCRを出発の細胞株とした。
最初に、K562／VCRをこの細胞株のIC50
（細胞増殖を50％阻害する濃度）であるアドリ
アマイシン15nMを含有するRPMI−1640（牛胎
児血清を10％含む）培地で一週間培養の後、成
育してくる細胞を選抜した。次にアドリアマイ
シンの薬物濃度を約３倍の50nMに増量し、一
週間培養ののち得られた耐性細胞について、さ
らに３倍量である150nMと段階的に薬物濃度
を増量していき、最終的に450nMのアドリア
マイシン存在下でも生育しうるアドリアマイシ
ン耐性細胞を得ることができた。
（細胞増殖を50％阻害する濃度）であるアドリ
アマイシン15nMを含有するRPMI−1640（牛胎
児血清を10％含む）培地で一週間培養の後、成
育してくる細胞を選抜した。次にアドリアマイ
シンの薬物濃度を約３倍の50nMに増量し、一
週間培養ののち得られた耐性細胞について、さ
らに３倍量である150nMと段階的に薬物濃度
を増量していき、最終的に450nMのアドリア
マイシン存在下でも生育しうるアドリアマイシ
ン耐性細胞を得ることができた。
このアドリアマイシン耐性細胞は、この薬剤
を500nM含有する倍地中で約１年間培養し続
けることにより、その後約３カ月間アドリアマ
イシンを含まない倍地中で培養してもその耐性
を失わない安定した耐性株となつた。本発明者
らは、これをK562／ADMと名づけた。
を500nM含有する倍地中で約１年間培養し続
けることにより、その後約３カ月間アドリアマ
イシンを含まない倍地中で培養してもその耐性
を失わない安定した耐性株となつた。本発明者
らは、これをK562／ADMと名づけた。
(b) マウスの免疫および細胞融合
(a)で得られたK562／ADMについて、一匹あ
たり107個細胞となる量を0.5mlのHBBSにて浮
遊させ、一度洗浄の後、４〜６週令のメスの
Balb／ｃマウスに腹腔内投与した。同様にし
て、毎週一回、６週間にわたり連続して投与を
くりかえし、最後の週に、追加免疫（ブースタ
ー）として106細胞を0.1mlのHBSSを浮遊させ
て静脈内に投与し、その３日後に無菌的に脾臓
をとりだした。脾臓細胞は、マウス一匹あたり
1.4〜３×108個得られた。脾臓はピンセツトで
ほぐして懸濁液とした。
たり107個細胞となる量を0.5mlのHBBSにて浮
遊させ、一度洗浄の後、４〜６週令のメスの
Balb／ｃマウスに腹腔内投与した。同様にし
て、毎週一回、６週間にわたり連続して投与を
くりかえし、最後の週に、追加免疫（ブースタ
ー）として106細胞を0.1mlのHBSSを浮遊させ
て静脈内に投与し、その３日後に無菌的に脾臓
をとりだした。脾臓細胞は、マウス一匹あたり
1.4〜３×108個得られた。脾臓はピンセツトで
ほぐして懸濁液とした。
細胞の融合は、ケーラーおよびミルステイン
両氏の方法に従つて実施した。すなわち、この
脾細胞1.4×108個を、43％のポリエチレングル
コール4000と、13％のジメチルスルホキシドを
含むRPMI1640倍地中にて２×107個のP3・
63・Ag8・653骨髄腫細胞と融合させた。
両氏の方法に従つて実施した。すなわち、この
脾細胞1.4×108個を、43％のポリエチレングル
コール4000と、13％のジメチルスルホキシドを
含むRPMI1640倍地中にて２×107個のP3・
63・Ag8・653骨髄腫細胞と融合させた。
(c) ハイブリドーマの選択
細胞の融合の後、96ウエルのプラスチツクプ
レート上でHAT培地中で７日間、さらに
HATを含まない培地中で７日間、生育させ
た。一匹のマウスあたり300〜400ウエルの培養
をおこない、そのうちの約75％のウエルで、細
胞の生育がみられた。これらのウエルの培養上
清について、酵素免疫測定法により、K562と
K562／ADMに対する反応をみたところ、約３
分の２ウエルではK562とK562／ADMの両方
に同程度の陽性の発色がみられ、残りの３分の
１のウエルでは両方ともに反応しなかつた。さ
らに、一匹のマウスに由来する300〜400ウエル
あたり０〜３個のK562とK562／ADMに反応
するが、明らかにK562／ADMにより強く反応
するウエルがみつかつた。
レート上でHAT培地中で７日間、さらに
HATを含まない培地中で７日間、生育させ
た。一匹のマウスあたり300〜400ウエルの培養
をおこない、そのうちの約75％のウエルで、細
胞の生育がみられた。これらのウエルの培養上
清について、酵素免疫測定法により、K562と
K562／ADMに対する反応をみたところ、約３
分の２ウエルではK562とK562／ADMの両方
に同程度の陽性の発色がみられ、残りの３分の
１のウエルでは両方ともに反応しなかつた。さ
らに、一匹のマウスに由来する300〜400ウエル
あたり０〜３個のK562とK562／ADMに反応
するが、明らかにK562／ADMにより強く反応
するウエルがみつかつた。
全部で18匹のマウスを用いて約6000ウエルの
スクリーニングを行なつて、同様にK562＜
K562／ADMの反応性を持つ25個のウエルがみ
つかつた。
スクリーニングを行なつて、同様にK562＜
K562／ADMの反応性を持つ25個のウエルがみ
つかつた。
(d) ハイブリドーマのクローニング
(c)で選択された25個のウエルについて、限界
希釈法によつて、反応陽性細胞のクローニング
を行なつた。希釈液としては20％の牛胎児血清
を含むRPMI−1640を用い、１個のウエルに
0.5〜５個の細胞が分配されるように希釈して
培養を行なつた。各々のウエルについて、酵素
免疫測定法により、培養上清中の抗体の有無お
よび性質を調べ、陽性度の強いウエルについて
は、さらに限界希釈法によるクローニングをく
りかえして、25個の安定したハイブリドーマの
クローンを得ることができた。
希釈法によつて、反応陽性細胞のクローニング
を行なつた。希釈液としては20％の牛胎児血清
を含むRPMI−1640を用い、１個のウエルに
0.5〜５個の細胞が分配されるように希釈して
培養を行なつた。各々のウエルについて、酵素
免疫測定法により、培養上清中の抗体の有無お
よび性質を調べ、陽性度の強いウエルについて
は、さらに限界希釈法によるクローニングをく
りかえして、25個の安定したハイブリドーマの
クローンを得ることができた。
(e) 抗体の産生および精製
(d)で得られた25個のハイブリドーマのうち16
個のクローンについて、マウス腹腔内に一匹あ
たり107個の投与を行なつて、腹水癌を発生さ
せ、２週間後に一匹あたり５〜10mlの腹水を得
た。残りの９個のクローンは凍結保存（−70℃
にて）した。腹水中の総タンパク量は、５〜15
mg／mlであつた。
個のクローンについて、マウス腹腔内に一匹あ
たり107個の投与を行なつて、腹水癌を発生さ
せ、２週間後に一匹あたり５〜10mlの腹水を得
た。残りの９個のクローンは凍結保存（−70℃
にて）した。腹水中の総タンパク量は、５〜15
mg／mlであつた。
これらの腹水を、45％飽和硫安で塩析の後
に、セフアクリル−400（スウエーデン国フアル
マシア社製）でゲル過することにより抗体を
精製した。
に、セフアクリル−400（スウエーデン国フアル
マシア社製）でゲル過することにより抗体を
精製した。
実施例
モロクローナル抗体MRK−16およびMRK−
17の性質 (a) 抗体のイソタイプ 得られたモノクローナル抗体16種類につい
て、米国カツペル社製ウサギ抗マウスIg各イソ
タイプの抗体を用いるキツトにより、そのイソ
タイプを判定した。その結果、IgG3が１個
（MRK4）、IgG2aが１個（MRK16）および
IgG1が１個（MRK17）得られ、他は全てIgM
イソタイプに属していることが明らかとなつ
た。
17の性質 (a) 抗体のイソタイプ 得られたモノクローナル抗体16種類につい
て、米国カツペル社製ウサギ抗マウスIg各イソ
タイプの抗体を用いるキツトにより、そのイソ
タイプを判定した。その結果、IgG3が１個
（MRK4）、IgG2aが１個（MRK16）および
IgG1が１個（MRK17）得られ、他は全てIgM
イソタイプに属していることが明らかとなつ
た。
(b) 蛍光抗体法による抗原の所在の判定
FITC結合のヤギ抗マウスIg抗体（カツペル
社）を用いて、MRK16およびMRK17各々の
モノクローナル抗体とK562／ADM細胞上の抗
原との結合部位を調べたところ、両方とも細胞
膜表面上にリング状に分布する蛍光の発色がみ
られた。すなわち、いずれの抗体もK562／
ADM細胞の膜に局在する抗原を認識してい
た。対照として親株のK562に同様の処置をお
こなつても、このような蛍光の発色は全くみら
れず、MRK16、MRK17ともに、K562／
ADMに強い選択性を有することが明らかとな
つた。また、放射性同位元素免疫定量法によつ
てもMRK16とMRK17はK562細胞には反応せ
ず、耐性株であるK562／ADMに非常に高い選
択性をもつて反応することが明らかとなつた
（第１図参照）。すなわち、106個の細胞をそれ
ぞれMRK16および同17の腹水希釈液と反応さ
せ、細胞を洗浄後、125Iでラベルした羊の抗マ
ウスIgのＦ（ab′）2フラグメント（英国アマーシ
ヤム社製）と４℃で30分間反応させ、洗浄後、
細胞と反応したMRK16および同17の反応性
（cpm）を測定した結果は、第１図に示す通り
であつた。
社）を用いて、MRK16およびMRK17各々の
モノクローナル抗体とK562／ADM細胞上の抗
原との結合部位を調べたところ、両方とも細胞
膜表面上にリング状に分布する蛍光の発色がみ
られた。すなわち、いずれの抗体もK562／
ADM細胞の膜に局在する抗原を認識してい
た。対照として親株のK562に同様の処置をお
こなつても、このような蛍光の発色は全くみら
れず、MRK16、MRK17ともに、K562／
ADMに強い選択性を有することが明らかとな
つた。また、放射性同位元素免疫定量法によつ
てもMRK16とMRK17はK562細胞には反応せ
ず、耐性株であるK562／ADMに非常に高い選
択性をもつて反応することが明らかとなつた
（第１図参照）。すなわち、106個の細胞をそれ
ぞれMRK16および同17の腹水希釈液と反応さ
せ、細胞を洗浄後、125Iでラベルした羊の抗マ
ウスIgのＦ（ab′）2フラグメント（英国アマーシ
ヤム社製）と４℃で30分間反応させ、洗浄後、
細胞と反応したMRK16および同17の反応性
（cpm）を測定した結果は、第１図に示す通り
であつた。
(c) 他の薬剤耐性株の識別
これまで、ヒトの腫瘍細胞株ではアドリアマ
イシン耐性株は数が少ないとされ、唯一利用で
きたヒト卵巣カルシノーマ細胞株2780のアドリ
アマイシン耐性株2780ADについて、MRK16お
よびMRK17との反応性を放射性同位元素免疫
定量法を用いて調べたところ、両方のモノクロ
ーナル抗体とも親株の2780に比較して耐性株の
2780ADに強く反応した（第２図参照）。すなわ
ち、３×105個の細胞をデイツシユにまき、細
胞がデイツシユに接着した24時間後に、第１図
に示した場合と同様にしてMRK16と同17の反
応性（cpm）を測定した結果は、第２図に示す
通りであつた。
イシン耐性株は数が少ないとされ、唯一利用で
きたヒト卵巣カルシノーマ細胞株2780のアドリ
アマイシン耐性株2780ADについて、MRK16お
よびMRK17との反応性を放射性同位元素免疫
定量法を用いて調べたところ、両方のモノクロ
ーナル抗体とも親株の2780に比較して耐性株の
2780ADに強く反応した（第２図参照）。すなわ
ち、３×105個の細胞をデイツシユにまき、細
胞がデイツシユに接着した24時間後に、第１図
に示した場合と同様にしてMRK16と同17の反
応性（cpm）を測定した結果は、第２図に示す
通りであつた。
(d) MRK17のK562／ADMに対する選択的細胞
増殖阻害 耐性株のK562／ADMとその親株K562なら
びに比較のために別の細胞株に属する耐性株の
2780ADとその親株2780について、それぞれモノ
クローナル抗体MRK17に含む腹水を段階的に
希釈してその細胞増殖に対する阻害効果を調べ
た（第３図参照）。すなわち、２×104個の
K562およびK562／ADM細胞、ならびに６×
104個の2780および2780AD細胞をMRK17の腹水
希釈液と共にインキユベートし、72時間後の細
胞数を測定して増殖阻害パーセントを計算して
得た結果は第３図に示した通りであつた。
増殖阻害 耐性株のK562／ADMとその親株K562なら
びに比較のために別の細胞株に属する耐性株の
2780ADとその親株2780について、それぞれモノ
クローナル抗体MRK17に含む腹水を段階的に
希釈してその細胞増殖に対する阻害効果を調べ
た（第３図参照）。すなわち、２×104個の
K562およびK562／ADM細胞、ならびに６×
104個の2780および2780AD細胞をMRK17の腹水
希釈液と共にインキユベートし、72時間後の細
胞数を測定して増殖阻害パーセントを計算して
得た結果は第３図に示した通りであつた。
その結果、それぞれの感受性の親株である
K562または2780に対しては400分の１希釈まで
抗体の濃度を増やしてもほとんど阻害は見られ
なかつたのに対し、薬剤耐性株である2780ADで
は同じ抗体濃度で約30％の増殖阻害がみられ、
K562／ADKに至つては80％の増殖阻害が、ま
た100分の１の希釈抗体では90％以上の増殖阻
害が見られた（トリプリケートデータSD＜４
％）。
K562または2780に対しては400分の１希釈まで
抗体の濃度を増やしてもほとんど阻害は見られ
なかつたのに対し、薬剤耐性株である2780ADで
は同じ抗体濃度で約30％の増殖阻害がみられ、
K562／ADKに至つては80％の増殖阻害が、ま
た100分の１の希釈抗体では90％以上の増殖阻
害が見られた（トリプリケートデータSD＜４
％）。
同様の実験をMRK16を用いて行なつたとこ
ろ、K562／ADMに対し、最高で約12％の軽度
の増殖阻害が見られた。
ろ、K562／ADMに対し、最高で約12％の軽度
の増殖阻害が見られた。
すなわち、MRK17の大きな特徴は、薬物耐
性株に選択的な強い増殖阻害作用を有している
ことであるといえる。
性株に選択的な強い増殖阻害作用を有している
ことであるといえる。
(e) MRK16によるK562／ADMの薬剤感受性に
対する効果 MRK16は上記(d)で、薬物耐性株K562／
ADMに対する直接の増殖阻害効果は軽度であ
つたが、この実験率にビンクリスチンを0.5μ
ｇ／mlの濃度で添加したところ、MRK16の共
存により、最大約75％までの耐性株の増殖阻害
が観察された（第４図参照）。すなわち、２×
104個のK562／ADM細胞をビンクリスチン
（VCR）500nｇ／mlの存在下および非存在下に
MRK16の腹水希釈液と共にインキユベート
し、72時間後の増殖阻害パーセントを測定して
得た結果は、第４図に示す通りであつた。
対する効果 MRK16は上記(d)で、薬物耐性株K562／
ADMに対する直接の増殖阻害効果は軽度であ
つたが、この実験率にビンクリスチンを0.5μ
ｇ／mlの濃度で添加したところ、MRK16の共
存により、最大約75％までの耐性株の増殖阻害
が観察された（第４図参照）。すなわち、２×
104個のK562／ADM細胞をビンクリスチン
（VCR）500nｇ／mlの存在下および非存在下に
MRK16の腹水希釈液と共にインキユベート
し、72時間後の増殖阻害パーセントを測定して
得た結果は、第４図に示す通りであつた。
ビンクリスチンを用いて、K562／VCR細胞
内での蓄積に対するMRK16の効果をみたとこ
ろ、抗体無添加の対照実験に比べて約60〜70％
の増加が見られた（第５図参照）。すなわち、
２×105個のK562／VCR細胞をMRK16（腹水
１：20希釈液）存在下および非存在下に、
〔3H〕VCR（100nM）と共にインキユベート
し、細胞にとり込まれたビンクリスチンを定量
した結果は第５図に示す通りであつた。
内での蓄積に対するMRK16の効果をみたとこ
ろ、抗体無添加の対照実験に比べて約60〜70％
の増加が見られた（第５図参照）。すなわち、
２×105個のK562／VCR細胞をMRK16（腹水
１：20希釈液）存在下および非存在下に、
〔3H〕VCR（100nM）と共にインキユベート
し、細胞にとり込まれたビンクリスチンを定量
した結果は第５図に示す通りであつた。
すなわち、MRK16は、耐性株において亢進
している細胞内薬物の細胞外へのくみ出し関与
する作用点を認識している可能性もつている。
している細胞内薬物の細胞外へのくみ出し関与
する作用点を認識している可能性もつている。
ここで、K562／ADM以外の耐性株の2780AD
を用いて、ビンクリスチンに対する感受性の変
化をみたところ、そのIC50値で20〜30％の減
少、すなわち薬物に対する感受性の増加、がみ
られた。
を用いて、ビンクリスチンに対する感受性の変
化をみたところ、そのIC50値で20〜30％の減
少、すなわち薬物に対する感受性の増加、がみ
られた。
MRK16は、また、ビンクリスチン以外に、
アクチノマイシンＤに対するK562／ADMの感
受性も約３倍強めることができた（第６図参
照）。すなわち、２×104個のK562／ADM細胞
をMRK16（腹水１：1000希釈液）の存在下お
よび非存在下に、種々の濃度のアクチノマイシ
ンＤと共に37℃でインキユーベートし、72時間
後の増殖阻害パーセントを測定して得た結果
は、第６図に示す通りであつた。
アクチノマイシンＤに対するK562／ADMの感
受性も約３倍強めることができた（第６図参
照）。すなわち、２×104個のK562／ADM細胞
をMRK16（腹水１：1000希釈液）の存在下お
よび非存在下に、種々の濃度のアクチノマイシ
ンＤと共に37℃でインキユーベートし、72時間
後の増殖阻害パーセントを測定して得た結果
は、第６図に示す通りであつた。
これらの結果から、MRK16は、多くの抗ガ
ン剤耐性株に選択的に働き、その薬物に対する
感受性を高めることができる抗体であるといえ
る。
ン剤耐性株に選択的に働き、その薬物に対する
感受性を高めることができる抗体であるといえ
る。
第１図ＡおよびＢは、放射性同位元素免疫定量
法によるMRK16AおよびMRK17Bのヒト骨髄性
白血病細胞K562およびそのアドリアマイシン耐
性株K562／ADM細胞に対する反応性を示すグラ
フである。第２図ＡおよびＢは、放射性同位元素
免疫定量法によるMRK16AおよびMRK17Bのヒ
ト卵巣癌細胞2780およびそのアドリアマイシン耐
性株2780ADに対する反応性を示すグラフである。
第３図は、MRK17による細胞増殖阻害を示すグ
ラフである。第４図は、MRK16とビンクリスチ
ンの併用による細胞阻害を示すグラフである。第
５図は、MRK16によるビンクリスチンのとり込
み上昇を示すグラフである。第６図は、MRK16
によるアクチノマイシンＤの効果増強を示すグラ
フである。
法によるMRK16AおよびMRK17Bのヒト骨髄性
白血病細胞K562およびそのアドリアマイシン耐
性株K562／ADM細胞に対する反応性を示すグラ
フである。第２図ＡおよびＢは、放射性同位元素
免疫定量法によるMRK16AおよびMRK17Bのヒ
ト卵巣癌細胞2780およびそのアドリアマイシン耐
性株2780ADに対する反応性を示すグラフである。
第３図は、MRK17による細胞増殖阻害を示すグ
ラフである。第４図は、MRK16とビンクリスチ
ンの併用による細胞阻害を示すグラフである。第
５図は、MRK16によるビンクリスチンのとり込
み上昇を示すグラフである。第６図は、MRK16
によるアクチノマイシンＤの効果増強を示すグラ
フである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記の(イ)〜(ニ)によつて定義されるものである
ことを特徴とする、薬剤耐性癌に関するモノクロ
ーナル抗体。 (イ) ヒト骨髄性白血病細胞株K562のアドリアマ
イシン耐性株K562／ADMにより免疫されたマ
ウスから得られた脾細胞とマウスの骨髄腫細胞
とを融合させて作成したハイブリドーマにより
生産されるものであること。 (ロ) アドリアマイシン耐性株と反応するがアドリ
アマイシン感受性株とは実質上反応しないこ
と。 (ハ) アドリアマイシン耐性株の細胞増殖を阻害す
るかあるいはその細胞のビンクリスチンまたは
アクチノマイシンＤに対する感受性を高める能
力があること。 (ニ) IgGイソタイプに属するものであること。 ２ ハイブリドーマがハイブリドーマMRK16ま
たはハイブリドーマMRK17である、特許請求の
範囲第１項記載のモノクローナル抗体。 ３ 下記の工程(a)〜(g)からなることを特徴とす
る、下記の(イ)〜(ニ)によつて定義される薬剤耐性癌
に関するモノクローナル抗体の製造法。 (a) ヒト骨髄性白血病細胞株K562から選抜して
確立したアドリアマイシン耐性株K562／ADM
によりマウスを免疫すること。 (b) 免疫されたマウスから脾臓を取り出して、そ
の細胞懸濁液を作成すること。 (c) この脾細胞をマウス骨髄腫細胞と共に細胞融
合条件に付して、両細胞の融合によるハイブリ
ドーマを形成させること。 (d) 上記の工程より得られる細胞混合物を、ハイ
ブリドーマのみを成育させることのできる選択
培地で培養すること。 (e) ハイブリドーマ含有上清について目的抗体の
有無を測定して、目的抗体を産生するハイブリ
ドーマを選択すること。 (f) 選択されたハイブリドーマをクローン化する
こと。 (g) このクローンをマウスの腹腔内に移植するか
あるいは培地にて培養し、癌性の腹水中または
培養上清中に生成蓄積されたモノクローナル抗
体を採取すること。 (イ) ヒト骨髄性白血病細胞株K562のアドリアマ
イシン耐性株K562／ADMにより免疫したマウ
スから得られた脾細胞とマウスの骨髄腫細胞と
を融合させて作成したハイブリドーマにより生
産されるものであること。 (ロ) アドリアマイシン耐性株と反応するがアドリ
アマイシン感受性株とは実質上反応しないこ
と。 (ハ) アドリアマイシン耐性株の細胞増殖を阻害す
るかあるいはその細胞のビンクリスチンまたは
アクチノマイシンＤに対する感受性を高める能
力があること。 (ニ) IgGイソタイプに属するものであること。 ４ ハイブリドーマがハイブリドーマMRK16ま
たはハイブリドーマMRK17である、特許請求の
範囲第３項記載のモノクローナル抗体の製造法。
Priority Applications (5)
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| JP60201445A JPS6261596A (ja) | 1985-09-11 | 1985-09-11 | 薬剤耐性癌に関するモノクロ−ナル抗体およびその製造 |
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| EP86112391A EP0214640B1 (en) | 1985-09-11 | 1986-09-08 | Monoclonal antibody in relation to drug-resistant cancers and production thereof |
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Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| JP60201445A JPS6261596A (ja) | 1985-09-11 | 1985-09-11 | 薬剤耐性癌に関するモノクロ−ナル抗体およびその製造 |
Related Child Applications (1)
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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| JPH0430278B2 true JPH0430278B2 (ja) | 1992-05-21 |
Family
ID=16441205
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60201445A Granted JPS6261596A (ja) | 1985-09-11 | 1985-09-11 | 薬剤耐性癌に関するモノクロ−ナル抗体およびその製造 |
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| EP0214640A3 (en) | 1988-11-30 |
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