JPH0430789A - モノクローナル抗体アフィニティカラムによるウイルスの精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は抗伝染性膵臓壊死症ウィルスモノクローナル抗
体を固定化したアフィニティ力ラムを用いる伝染性膵臓
壊死症ウィルスの精製法に関するものである。

〔従来の技術および発明か解決しようとする課題〕ウィ
ルスは細菌等の他の病原微生物と異なり、細胞内で増殖
するため、ウィルスの培養には必ずその宿主となる細胞
が要求される。ウィルスの感染症に対する予防には、現
在のところ主としてワクチンを用いた予防接種か行われ
ているか、生体内でのウィルスに対する免疫力を高める
には精製したワクチンを用いることが効果的である。従
って、ウィルス粒子をワクチンとして応用するにはウィ
ルス粒子自身を精製することか望ましい。

ウィルスを培養して精製する場合、まずウィルスをその
宿主となる細胞に接種し、培養後、ウィルスを宿主細胞
成分から分画する必要かある。これまで、ウィルスを精
製する手段として、ショ糖や塩化セシウム等の密度勾配
を用いた超遠心分離法、イオン交換分離法、ゲル濾過法
等が用いられているか、このような方法は長時間を要し
、精製法か複雑であり、実用的でない。

近年になって、硫酸化セルロファイン等のゲルを用いた
アフィニティクロマトグラフィーによりウィルスの精製
が行われるようになってきているか、ウィルスの種類に
より精製が困難な場合が多い。そのため、簡便で迅速的
な、しかも高純度に精製できる方法か要望されている。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者等は、ウィルスの精製にあたり、ウィルスに対
するモノクローナル抗体をアフイニテイクロマトグラフ
ィーへ応用し、検討した結果、特定のウィルスに対して
特異的に反応するモノクローナル抗体を用いて作製した
アフイニテイカラムで、ウィルスが高純度に、しかも簡
便な操作で精製される方法を確立して、本発明を完成し
たのである。

すなわち本発明は、抗伝染性膵臓壊死症ウィルスモノク
ローナル抗体を固定化したアフイニテイ力ラムを用いる
ことを特徴とする伝染性膵臓壊死症ウィルス（以下、Ｉ
ＰＮＶと略すことがある。）の精製法を提供するもので
ある。

以下に本発明のモノクローナル抗体アフイニティ力ラム
によるウィルスの精製法について詳述する。

本発明で用いるモノクローナル抗体は特に限定されない
が、特定のウィルスに対して特異的に反応するモノクロ
ーナル抗体か用いられ、具体的にはサケ科魚類の伝染性
膵臓壊死症ウィルスに対するモノクローナル抗体等を挙
げることができる。

モノクローナル抗体は、そのモノクローナル抗体を産生
ずるハイブリドーマをインシュリン、トランスフェリン
、エタノールアミン、セレン酸塩を含有する無血清培地
を用いて培養することによって生産することがてきる。

本発明において用いるモノクローナル抗体産生ハイブリ
ドーマとしては特に制限はないが、好ましくは高効率、
低製造コスト化が要求される魚類感染ウィルスに対する
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマか挙げられ、具
体的には伝染性造血器壊死症ウィルスに対するモノクロ
ーナル抗体産生ハイブリドーマ、伝染性膵臓壊死症ウィ
ルスに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ、
ヒラメラブドウィルスに対するモノクローナル抗体産生
ハイブリドーマ等が挙げられ、さらに具体的には伝染性
膵臓壊死症ウィルスに対して中和活性を有するモノクロ
ーナル抗体を産生ずるハイブリドーマ４ＰＧ−３Ｎ（Ｆ
εＲＭ　Ｐ−１０９８４）および４ＰＧ−２Ｎが挙げら
れる。

培養液中に含まれるモノクローナル抗体は、遠心分離や
濾過等により細胞を取り除き、培養上清のみを直接プロ
ティンＡあるいはプロティンＧを用いたアフィニティク
ロマトグラフィーあるいは陽イオン交換クロマトグラフ
ィー等によって精製する。

精製したモノクローナル抗体は１００ｍＭクエン酸緩衝
液（ｐＨ５，０）で５〜１５ｍｇ／ｍｅとなるように調
整し、更に水酸化シアノホウ素ナトリウム（Ｎ　ａ　Ｃ
Ｎ　Ｂ　Ｈｓ　）を１０〜２０　ｍｇ／ｍ（！の濃度に
なるように溶解させる。この抗体溶液１７７１１をシリ
ンジに入れ、アルデヒドカラム中に押込み、往復させモ
ノクローナル抗体を固定化させる。固定後、クエン酸緩
衝液、リン酸緩衝液等で順次洗浄し、次いで未反応のリ
ガンドを除去する。

このようにしてモノクローナル抗体を固定化したアフィ
ニティ力ラムは１５０ｍＭ　　ＮａＣｆ添加１０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，２）で平衡化した後に、ウィルス
培養上清を流速１　ｍｌ／ｍｌｎ程度で負荷し、６５０
ｍＭ　　ＮａＣｆ添加１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，
２）で、カラム中の非吸着物質を洗浄する。この洗浄に
より、カラム中にはウィルスのみか吸着していることに
なり、吸着したウィルスの溶出は、１００ｍＭグリシン
−ＨＣ１？緩衝液（１）１１２．８）で流速２ｍ／／ｍ
ｉｎ程度で行なうことかでき、ウィルスを分画・精製で
きる。

〔実施例〕

以下、実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例１ ＩＰＮＶに対して中和活性を有するモノクローナル抗体
産生ハイブリドーマ４　Ｐ　Ｇ　−３Ｎ（ＦＥＲＭＰ−
１０９８４）を３　Ｘ　１０　’　ｃｅｌｌｓ／ｍｐに
なるように高密度培養装置５ＨＣ−１（島津製作所製）
中の５００ｍ１の無血清培地ＩＴＥＳ−ＹＬＰ−ＥＲ［
）Ｆ　（インシュリン　５μｇ／ｍ（！、　　ｈランス
フェリン　２０μｇ／ｍ（！、エタノールアミン　２０
μＭ、セレン酸ナトリウム２．５　ｘ　１０−”Ｍ、卵
黄リポプロティン３０ｕｇ／ｍｌを添加したＥ−ＲＤＦ
培地（極東製薬製）〕に懸濁し、３７°Ｃで連続的に培
養した。

培養後、得られた培養上清からモノクローナル抗体をプ
ロティンＡアフィニティ力ラム（ＣＨＲＯＭＡＴＯＰ　
　プロティンＡカラム、日本ガイシ社製）を用いて流速
２７１１／／ｍｉｎで精製した。

精製したモノクローナル抗体を１００ｍＭクエン酸緩衝
液（ｐＨ５，０）中で１３ｍｇ／ｍｌに調整し、水酸化
シアノホウ素ナトリウム（Ｎ　ａ　ＣＮ　Ｂ　Ｈ３）を
２０■添加した。この抗体溶液を２本のシリンジを用い
て、アルデヒドカラム（ＣＨＲＯＭＡＴＯＰアルデヒド
カラム、４．６ｍｍφＸ１０ｃｍ、　　日本ガイシ社製
）中で２０分間往復させ、抗体をカラム中に固定化した
。固定後、１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５，０）、
　ｌ　０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３，３）　。

］ＯｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）、　ｌ　ＯｍＭ炭
酸緩衝液（ｐＨ７，４）、ＩＭ　　ＮａＣｆ添加１０ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）を用いて、それぞれ順次
５ｍｌ／ｍｉｎの流速で５分間洗浄し、未反応のリガン
ドを除去した。

未反応の抗体量をＥＬＴＳＡ法で測定することにより、
固定化された抗体量を算出した。その結果、未反応のり
ガントとして溶出された抗体量は０．６■であり、最終
的に１２．４■の抗体をカラムに固定化することができ
た。

実施例２ 実施例１で作製したモノクローナル抗体アフィニティ力
ラムを用いて、実際に伝染性膵臓壊死症ウィルスの精製
を検討した。まず、ストックした伝染性膵臓壊死症ウィ
ルス（ＩＰＮＶ、ＶＲ２９９株）をＭＥＭ　（日永製薬
社製）培地に１０％の牛脂児血清と１．６％の１Ｍトリ
ス緩衝液及び０．０７５％のＮａＨＣＯ，を添加したＭ
ＥＭ＋ｏ−Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ培地を用いたシロサケ由来の
ＣＨ３Ｅ−２１４細胞培養液に接種した後に、１５°Ｃ
で約１週間培養した。

培養後、ウィルス培養液を冷却遠心分離し、細胞画分を
取り除いた後、上清を０．２２μｍのフィルターで濾過
した。濾過したウィルス液を、１５０ｍＭＮａｃｌ添加
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）で平衡化した上記
実施例１で作製した抗体固定化カラムに直接、流速１ｍ
ｌ／ｍｉｎで負荷した。

ウィルスを負荷後、カラム中に吸着されなかったウィル
ス以外の牛脂児血清等のタンパクを６５０ｍＭＮａＣｌ
！添加１０ｍＭリン酸添加液（ｐＨ７，２）て洗い流し
た。カラム中の抗体に吸着したウィルス粒子は、１００
ｍＭグリシン−ＨＣｊ？　　緩衝液（ｐＨ２，８）で流
速２ｍｌ／ｍｉｎで溶出させた後に、３．４８Ｍ酢酸緩
衝液（ｐＨ２，８）でカラムの洗浄を行った。溶出液は
６ＮのＮａＯＨで直ちに中性に戻した後に、ウィルスの
感染価をプラーク法により調べた。なお、精製前と精製
後のウィルスサンプルのタンパク濃度はＢｉｏ−Ｒａｄ
社のタンパク定量法において行ない、ウィルスの精製度
はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法により確認
した。

その結果、１００ｍＭグリシンＨＣｆ緩衝液による溶出
画分に、単一ピークのＩＰＮＶ画分を得た。

結果を第１図に示した。また、得られたＩＰＮＶ画分は
、タンパク量にして２３３μｇであり、その回収率は、
プラーク法で調べたところ、８７％であった。これらの
結果は第１表に示した。

第１表 １元伝染性膵臓壊死症ウィルス戸イニテイ力ラムにより
精製された伝染性膵臓壊死症ウィルスの回収率総容量　
総タンパク量　総感染価（ＰＦＵ）培養上清　　４００
ｍ１　７４９４００μｇ　　　９．２Ｘ　１０”非吸着
画分　４００ｍ１　７４０４００μｇ　　　２，０ＸＩ
Ｏ”ウィルス画分　　　　　　　５ｍｌ　　　　　　２
３３．ｃｚｇ　　　　　８．０ｘｌＯ”回収率 １００％ ２％ ８７％ 精製したＩ　ＰＮＶのタンパクをＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を調べたところ、第２図に示すように
、レーン２（ＩＰＮＶの培養上清）及びレーン３（ＩＰ
ＮＶの非吸着画分）のＩ　ＰＮＶ培養上清中に含まれる
牛脂児血清中のタンパクはほとんど観察されなかった。

しかもレーン４に示すようにＩ　ＰＮＶの精製タンパク
であるβタンパク及びγタンパクがほとんど夾雑物質を
含まず観察され、抗Ｉ　ＰＮＶモノクローナル抗体アフ
ィニティカラムによりほぼ完全にＩＰＮＶが精製される
ことか確認された。

〔発明の効果〕

本発明の方法は、これまでサケ科魚類の伝染性膵臓壊死
症ウィルスの分子生物学的研究を行なう際に不可欠であ
ったショ糖や塩化セシウム等の密度勾配を用いた超遠心
分離法によるウィルスの精製に代わり、簡便かつ迅速、
しかも高純度にウィルスを精製できるものであり、今後
の他色類ウィルスの精製にも応用することか可能な方法
である。

さらには、本発明で作製したモノクローナル抗体アフィ
ニティ力ラムをスケールアップし、遺伝子組換え手法等
も応用して、大量培養した大腸菌等の培養液から、モノ
クローナル抗体４ＰＧ−３Ｎが認識するＩＰＮＶのタン
パクのみを精製することもでき、コンポーネントワクチ
ンの生産が可能となった。

【図面の簡単な説明】 第１図は、伝染性膵臓壊死症ウィルスの培養上清から、
抗伝染性膵臓壊死症ウィルスモノクローナル抗体アフィ
ニティ力ラムにより伝染性膵臓壊死症ウィルスが精製さ
れることを示す図である。 第２図は、抗伝染性膵臓壊死症ウィルスモノクローナル
抗体アフィニティカラムにより精製された伝染性膵臓壊
死症ウィルスのＳＤＳポリアクリルアミ ドゲル電気泳動図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 抗伝染性膵臓壊死症ウイルスモノクローナル抗体を固定
   化したアフィニティカラムを用いることを特徴とする伝
   染性膵臓壊死症ウィルスの精製法。