JPH0431671B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は微生物源から油脂、特にトリグリセラ
イドに富む油脂の製造法に関する。 藻類、細菌、黴および酵母を包含する油脂を合
成する微生物を培養することにより油脂を製造す
ることができることは知られている。このような
微生物は彼等の細胞の代謝の通常のコースにおい
て油脂を合成する。どの微生物、培地、条件が経
済的、実用的な油脂製造を可能にするかを確認す
るため努力して広範な研究が行なわれてきた。 特に注意をひいた発酵による油脂の製造の１分
野はカカオバター代用品を製造する分野である。
カカオバターは大量の１，３−ジ飽和−２−不飽
和トリグリセライドを含有する自然に産出する物
質である。これらのトリグリセライドは１−ステ
アロイル−２−オレオイル−３−パルミトイルト
リグリセライドおよび１，３−ジパルミトイル−
２−オレオイルトリグリセライドを含む。上記の
化合物に富むトリグリセライドを製造する方法は
1977年６月28日に授与された米国特許第4032405
号に記載されている。 この特許に記載されているように、カカオバタ
ー代用品はエンドミセス（Endomyces）、ロドト
ルラ（Rhodotorula）、リポミセス
（Lipomyces）、またはロドスポリジウム
（Rhodosporidium）属から選ばれる微生物を好
気的条件下に培養し、ついで菌体を集め、この菌
体から１，３−ジ飽和−２−不飽和トリグリセラ
イドに富む油脂を分離することにより製造され
る。上記特許の発酵方法に用いられる培地は、一
般に同化可能な窒素源、および炭素源好ましくは
アルドースまたは二糖類または多糖類の形の炭素
源を含有する。得られた菌体は集められ、この菌
体から１，３−ジ飽和−２−不飽和トリグリセラ
イドに富む油脂の混合物が分離される。 上記特許に記載された方法の改良は、1979年５
月８日に出願された同時係属出願第904099号に記
載されている。この同時係属出願に記載されてい
るように、発酵用培地が10個と20個の間の炭素原
子を含有する脂肪酸の１つまたはそれ以上の形に
おける炭素源を含むとき、油脂の収量が増加され
ることができ、そして特別な油脂の分布がコント
ロールされることができることが発見されてい
る。例えば発酵用培地にカカオバターの脂肪酸部
分を形成する酸、すなわちパルミチン酸、オレイ
ン酸、およびステアリン酸を用いることによりグ
リセリル油の不飽和酸基に対する飽和酸基の比率
がコントロールされることができることが発見さ
れている。 上記出願に記載された方法における更に改良
が、これと同時に出願された同時係属出願の特開
昭57−5491号（特開昭57−144987号広報）に述べ
られている。この改良では、脂肪酸が乳化液の形
で発酵培地中に存在する場合に、所望の油脂、特
にトリグリセライドに富む油脂の収量が非常に増
加されることができることが報告されている。上
記係属出願に記載されているように、この出願に
は乳化液、特に10ミクロンより小さい粒子の大き
さをもつ脂肪酸の粒子を含有する乳化液の使用は
酵母によつて効果的に利用され、高収量で油脂が
製造され得ることが発見されたことが述べられて
いる。 これらの方法は当該技術における明らかな改良
を示しているが、なおさらに改良、特に製造され
る油脂の収量における改良の余地がある。 それ故に、本発明の目的は上記のような油脂の
収量が短かい発酵時間で非常に増加される発酵に
よる油脂の製造法を提供することにある。 本発明のさらに特別な目的は飽和油脂の収量が
従来の方法に比べて増加されるという微生物源か
らの油脂、特にトリグリセライドに富む油脂の製
造法を提供することにある。 本発明の概念は、第１段階で酵母菌対を炭素源
および窒素源を含有するように処方された増殖用
培地で増殖し、ついでこの酵母菌体を10−20個の
炭素原子よりなる脂肪酸の少なくとも１つを含有
するように処方された蓄積用培地で培養する油
脂、特にトリグリセライドに富む油脂の製造法に
ある。２段階方法の使用は望ましくない副産物の
同時増加なしに油脂の生産を非常に増加すること
が発見された。 本発明方法はカカオバターが主要素をなすタイ
プの油脂の製造に用いることに対し特によく適合
する。本発明の１具体例にしたがつて、リピド蓄
積用培地がパルミチン酸、オレイン酸およびステ
アリン酸を、好適にはこれと同時に出願された同
時係属出願の特開昭57−5491号（特開昭57−
144987号広報）に記載されているような乳化液の
形で含むように処方されると、上記のように油の
生産が非常に増加されることができることが発見
された。 本発明にしたがい、第１段階における酵母菌体
の迅速な増殖の条件が最適なものにされ、そして
第２段階における飽和脂肪の生産条件か別に最適
なものにされる。最適な第２段階の飽和脂肪の生
産条件は酵母菌体の迅速な増殖に対しては不利で
あるので、この２段階方法は従来の公知技術を越
えて非常な改良を提供する。 本発明方法の第１段階においては、増殖増進用
培地は、酵母菌体がまだ対数期にある、すなわち
酵母菌体の数が時間とともに対数的に増加して存
在する酵母菌体の総数を増加するような割合で炭
素源と窒素源の両方を含有するように処方され
る。かくして対数期は酵母菌体の増殖は増進する
が脂肪の蓄積は最小にされる高い窒素：炭素の比
により特徴づけられる。ついで、脂肪の蓄積が望
まれる第２段階においては、微生物、特に以下に
十分に記載されるような酵母は高い炭素：窒素の
比をもつ培地で培養され、それによつて油脂の蓄
積が増進される。 以下、本発明は、１，３−ジステアロイル−２
−オレオイルトリグリセライド、１−ステアロイ
ル−２−オレオイル−３−パルミトイルトリグリ
セライド、および１，３−ジパルミトイル−２−
オレオイルトリグリセライドを含有するトリグリ
セライドであるカカオバターを主要素とするタイ
プの油脂の製造に関して記載されるが、本発明の
概念は発酵による他の油脂の製造にも同様にもち
いられることは当業界の専問家にとつて理解され
るところである。 本発明の実施に有用な微生物は油脂合成酵母と
して特徴づけることができる。このような酵母は
当業界でよくしられており、そして手に入れるこ
とができる。例えばこれら酵母の多数は文献を挙
げて発表されている米国特許第4032405号明細書
に記載されている。本発明の実施に用いる特に好
適なものは、ロドスポリジウム
（Rhodosporidium）属、リポミセス
（Lipomyces）属、キヤンデイダ（Candida）属、
エンドミセス（Endomyces）属、サツカロミセ
ス（Saccharomyces）属、ロドトルラ
（Rhodotorula）属、トリコスポロン
（Trichosporon）属、またはトルロプシス
（Torulopsis）属から選ばれる種（species）であ
る。 このような油脂合成酵母はよく知られており、
そして葉や植物の茎などのような自然の資源から
通常の技術によつて単離することができる。しか
しながら、例えばアメリカン・タイプ・カルチユ
ア・コレクシヨン（American Type Culture
Collection）を包含する各種の培養菌貯蔵寄託所
からこのような酵母を得るのが一般にずつと便利
である。経済的な理由で、大量の油を合成し貯蔵
する傾向にある油脂合成酵母を使用するのが一般
に好ましい。標準培地（グルコース、アンモニウ
ム塩および無機物のような）で20％油、好ましく
は30％油を蓄積する能力を有する酵母が一般に好
適である。 使用する特別な酵母の種（species）の培養の
ために栄養物を供給する増殖用および発酵用の培
地は、本発明方法で用いるために選択された特別
な酵母に幾分依存する。一般に、このような培地
は、一般に培地の重量を基準にして６重量％より
少ない量において、炭素源および窒素源を含有す
る希釈水性塩基性溶液である。好適な培地は、一
般に、最適な酵母培養に通例のように、pHが約
4.0と9.0の間、好ましくは５ないし8.5の範囲にあ
るように調整または緩衝化される。 窒素源としては、微生物の増殖用の栄養源とし
てしばしば用いられる各種の通常の窒素含有化合
物を使用することができる。好適な窒素化合物は
アスパラギン、グルタミン、ペプトンなどを包含
する。さらに、アンモニウム塩や尿素のような他
の窒素化合物も同様に使用することができる。 本発明の実施において使用するのに特によく敵
する１つの窒素含有栄養源はコーンスチープ、す
なわち通常のコーン湿潤粉砕法−この方法では乾
燥コーンが加熱希亜硫酸中に浸漬される−で形成
される水性液である。コーンスチープは約25重量
％の粗蛋白（８重量％の窒素）と少量の灰分、糖
および他の有用な培養成分からなる。コーンスチ
ープは安価でしかも完全な窒素源であるので単独
で使用することができるが、当業界の専問家によ
く知られている他の通常の窒素源と一緒に組合わ
せて用いることもできる。 培地はまたカリウム、ナトリウム、カルシウ
ム、マグネシウム、鉄などの塩を包含する公知の
重要な代謝無機塩の１つまたはそれ以上を含むべ
きである。さらにビタミンおよびアミノ酸のよう
な第２の栄養源も同様に望ましく、特に酵母に対
する培養期間が延長される場合は望ましい。 本発明の実施にしたがつて、培地中に存在する
窒素：炭素のモル比を基礎にして窒素：炭素の比
は２：１、そして好適には５：１である。増殖段
階における炭素源は好適には少なくとも１つの炭
水化物であることが発見された。この炭水化物は
一般にアルドース（例えばグルコース、ヘキソー
ス、ペントースなど）、マルトース、蔗糖などの
ような二糖類、およびオリゴ糖−このオリゴ糖は
澱粉の加水分解から得られるものが好適である。
−の形のものである。 発酵用培地がリピド蓄積用培地である第２段階
においては、発酵用培地は炭素源、一般に10個と
20個の間の炭素原子を含有する脂肪酸の１つまた
はそれ以上の優勢な量を含有する。理論に関し本
発明を制限することなしに、酵母細胞はその代謝
中にこのような脂肪酸を利用することが信じられ
ており、かくして脂肪酸培地の脂肪酸含量を全炭
素源の少なくとも10％、そして好適には40％また
はそれ以上とするのが好ましいことである。この
手段においては、脂肪酸は、特別な脂肪酸含量を
もつトリグリセライド油をつくるように酵母細胞
の代謝を変化するに役立つ程度まで、リピド蓄積
用培地中の他の炭素源の存在によりマスクされな
いのである。既に述べたように、リピド蓄積段階
は高い炭素：窒素の比によつて特徴づけられる。
一般に第２段階における炭素：窒素の比は約10：
１より大きく、好適には約50：１より大きい。 本発明の実施において炭素源として用いられる
脂肪酸また複数の脂肪酸は各種の公知の資源から
得ることができる。例えばパルミチン酸（C₁₆：
０）、ステアリン酸（C₁₈：０）、またはオレイン
酸（C₁₈：１）は、遊離の酸の形であるいはナト
リウム塩のような塩の形で、市販されていて得る
ことができる。これらの普通の脂肪酸は単独で用
いることができ、または他の脂肪酸と混合して用
いることができる。リノール酸（C₁₈：２）、リノ
レン酸（C₁₈：３）、および16ないし20個の炭素原
子を含有する他の脂肪酸のような多不飽脂肪酸も
また純粋な形で得ることもできるが、石鹸原料の
ような市販の混合物のより安価な形でより容易に
手に入れることができる。 使用する脂肪酸の組成は、各脂肪酸が使用した
酵母の種（species）の油脂合成代謝においてユ
ニークなタイプの変化を生ずる程度に重要であ
る。脂肪酸の混合物が用いられたときは、その組
み合わさつた作用は発酵用培地中に存在する各種
脂肪酸を含有するトリグリセライドの代謝混合物
を生ずる相互作用である。 しかしながら、特別な脂肪酸炭素源から得られ
るべき油の組成における正確な収量の正確な予報
は大いに経験に基いて行なわれる。通常の分析手
段は特別な炭素源からつくられる油の組成におけ
る収量の決定を可能にし、それ故にきまりきつた
実験は特別な油の製造に対し適切な脂肪酸炭素源
の迅速な確認を可能にする。 しかしながら、一般的な規準の形における若干
の通則が決定されている。例えば炭素源中の所定
の炭素の長さの脂肪酸の存在はトリグリセライド
の成分として該脂肪酸を含有するトリグリセライ
ドエステルの割合における増加を生ずる。同様
に、製造される油中の飽和および／または不飽和
（そして特に多不飽和）の程度は、炭素源として
用いられる脂肪酸組成の相当する飽和レベルに直
接関係する。かくして炭素源としてパルミチン
酸、オレイン酸およびステアリン酸の使用はカカ
オバターに存在する脂肪酸組成に密接する油の形
成を増進する。 本発明方法にしたがつて油脂を製造するために
酵母を培養する条件は従来の発酵システムにおい
て一般に用いられる条件と異ならない。一般に、
上記のような油脂を製造するために本発明の実施
におい用いられる酵母は同じタイプの酵母の種
（species）を用いる従来の方法におけるものと一
般的に同じである。 発酵が行なわれる温度は一般に約20ないし40℃
の範囲内であり、この範囲より高い温度では飽和
油の生産を助長し、この範囲より低い温度では不
飽和油の生産を助長する。 同様に、酸素は酵母菌体の増殖に若干の影響を
もつ。一般に、酵母菌体の好気的培養は微生物に
より製造される油の最終的な収量を増加すること
が発見された。 発酵が所望の期間、一般に１ないし７日間、好
ましくは５日より少ない期間実施されると、酵母
菌体を通常の手段で発酵培地から分離し、その油
分を回収する。例えば、酵母菌体を先ず第一に例
えば凍結乾燥または加水分解により破壊し、つい
でこの破壊物から適当な溶剤、好適には続いて行
なわれる油からの溶剤の除去を容易にするために
揮発性溶剤で油を抽出することができる。 上述したように、リピド蓄積用培地中に存在す
る脂肪酸が乳化した形であるのが本発明の重要な
概念である。このことは、使用する脂肪酸と相容
性があり酵母細胞の代謝に不利な影響を与えない
乳化剤を発酵用培地に添加することにより好適に
行なわれる。一般に本発明の実施において用いら
れる乳化剤は約15以上のHLVをもつイオン性お
よび非イオン性の乳化剤である。 この目的に対し好適な乳化剤はソルビトールお
よびソルビトール無水物の脂肪酸誘導体の形にお
ける乳化剤である。特に好適な乳化剤は、ソルビ
トール無水物の脂肪酸部分エステルのポリオキシ
エチレン誘導体である”ツイーン（Tween）”の
商標のもとにアトラス・ケミカル・インダストリ
ース・インコーポレーテツド（Atlas Chemical
Industries Inc.）により市販されている乳化剤、
およびソルビトール無水物の脂肪酸部分エステル
である”スパン（Span）”の商標のもとに市販さ
れている乳化剤のような非イオン性乳化剤であ
る。この２つのタイプの乳化剤は食品用として
FDAによつて認可されているものである。これ
らの乳化剤は油脂の形成における酵母細胞の代謝
に不利な影響を与えないことが意外にも発見され
たのである。 一般に、リピド蓄積用培地中に存在する脂肪酸
を乳化するに十分であるような量だけの乳化剤が
使用される。一般に、この量は発酵用培地の重量
を基礎にして0.0001ないし１％の範囲である。乳
化液は好適には乳化剤を脂肪酸または複数の脂肪
酸に添加し、ついで、攪拌時に添加される培地の
他の成分を添加しまたは添加することなく、実質
的に均質な培地をつくるに十分を攪拌を行なうこ
とによりつくられる。 本発明の好適な実施においては、乳化液は脂肪
酸を緩衝液とともに加熱して７ないし９の範囲の
pHにし、ついでもし必要ならば殺菌するために
脂肪酸をオートクレープで処理することによつて
形成される。ついでこれに乳化剤を添加し、得ら
れた混合物を均質化する。次にこの乳化液は、非
常に小さい大きさのステアリン酸粒子を結晶化す
るに十分な速度で急速に冷却する。本発明の実施
にしたがつて、10ミクロンより小さい粒子の大き
さは、脂肪酸または複数の脂肪酸がリピド蓄積用
培地において効果的に利用されることを確実にす
るのに特に適することが発見された。 本発明の基本的概念を記述したので、次に例を
挙げて説明する。これらの例は本発明の実施の例
示のために与えられるものであり、本発明の実施
を制限するものではない。これらの例中、すべて
パーセントは、特に指示する場合以外は重量パー
セントである。 例 １ 本例は２段階方法および炭素源としてステアリ
ン酸を利用する本発明の実施を例示するものであ
る。 次の増殖用培地 グルコース ５％ ペプトン ５％ 酵母エキス １％ 水 300ml を入れた500mlフラスコ中でロドトルラ・トルロ
イデス（R.toruloides）の酵母菌体を増殖した。 増殖用培地のpHは5.0であつた。そして増殖は
末期の対数期（すなわち脂肪の蓄積なし）まで続
けられた。 ついで酵母菌体を採取し、１：１酵母菌体／リ
ピドの比（乾燥重量）で１系列の乳化液に添加し
た。乳化液はテクマー（Teckmar）均質機中で
調整した。対照の発酵用培地（試料Ａ）は次の組
成をもつた。 ステアリン酸 １％ K₂HPO₄ 0.1％ 乳化剤（ツイーン20） 0.01％ 抗生物質 10μg／ml 水 100ml 試料Ｂ〜Ｆは、次の添加剤を含有する以外は上
記と同じ組成で処方された。 試料Ｂ 対照 0.1％グルコース 試料Ｃ 対照 0.5％グルコース 試料Ｄ 対照 1.0％グルコース 試料Ｅ 対照 0.2％グリセリン 試料Ｆ 対照 0.1％ステルクリン酸 試料Ａ〜Ｆの発酵は200rpmで振盪フラスコ中
で初期pH 8.0および28℃で３日間行なわれた。
ついで油が例１に記載されたように回収され、そ
して分析された。 得られた結果は次のとおりである。

【表】 ＊ 比較のために用いられた値
上記のデータに示されるように、少量の炭水化
物および／またはグリセリンの添加は増加した変
換効率を生ずる。0.1％添加したグルコースまた
はグリセリンは最大の変換を生じた。そしてさら
にグルコースのレベルを増加することはさらに変
換を増加せず、実際には変換がリピドおよび基質
としての糖に関して計算されたとき効率を減少し
始めた。ステルクリン酸もまた変換を増加するよ
うに見える。 低いレベルのグルコース（0.1ないし0.5％）の
添加はオレイン酸およびリノレン酸を犠牲にして
パリミチン酸およびステアリン酸における大変僅
かな増加を生じたが、１％添加したグルコースは
ステアリン酸を犠牲にして僅かに増加した脱飽和
（desaturation）を生じた。グリセリンは僅かに
脱飽和を刺戟するように見える。少量のステルク
リン酸の添加は非常に減少したデサチユラーゼ
（desaturase）活性を生じ、そしてステアリン酸
レベルを増加した。 例 ２ 本例は発酵時間が変えられた本発明の２段階方
法を例示するものである。 例１に記載したようにして増殖した酵母菌体を
遠心分離により採取し、これを１：１酵母菌体／
リピドの比で１系列の乳化液に加えた。各乳化液
は次の組成をもつた。 リピド １％ ステアリン酸 0.7％ パルミチン酸 0.3％ K₂HPO₄ 0.1％ 乳化剤 ３滴 発酵用フラスコは200mlを含有し、200rpm、32
℃で培養が行なわれた。pHは8.0に維持された。 酵母菌体は20時間、２日、３日、５日、７日、
９日および11日で採取した。油を回収し、そして
分析を行なつた。得られた結果は次のとおりであ
る。

【表】 この例では、だい２段階の培養開始後20時間は
パルミチン酸レベルが高いが、ステアリン酸レベ
ルは比較的低かつた。20時間で変換は部分的に完
了しただけであつた。48時間でパルミチン酸レベ
ルおよびオレイン酸レベルは減少したが、ステア
リン酸レベルは増加した。48時間で組成はカカオ
バターに近づき、そして変換レベルもまた最高に
なつた。この時点から、変換効率は除々に減少し
たが、組成は著しく同様なままにとどまつた。中
性油以内のトリグリセライドのパーセントもまた
48時間で最高であり、そしてむしろ一貫して約90
％レベルにとどまつた。最後の日までには、変換
割合、トリグリセライド％、パルミチン酸および
ステアリン酸レベルはすべて僅かに下がつたが、
オレイン酸およびリノレン酸レベルは僅かに増加
した。この結果は、一度トリグリセライドが合成
され、貯蔵されると、トリグリセライドはほとん
ど変えられないが、ゆつくりとエネルギー維持に
代謝されることを示している。 例 ３ 本例はココアバターの油に類似する油を製造す
る本発明の２段階方法を例示するものである。 例２の方法を用いて酵母菌体を増殖、採取し、
そして１系列の乳化液に１：１酵母細胞／リピド
の比で添加した。 １系列の乳化液は次の組成をもつて調製した。 リピド １％ 乳化剤（ツイーン20） 0.01％ グリセリン 0.2％ K₂HPO₄ 0.1％ パルミチン酸／ステアリン酸（45／55）
pH6.5 試料Ａ）は200mlの容積でフラスコ中で
200rpm、32℃で72時間培養した。 試料Ｂ）はＡと同じであるが、リポミセス・ス
ターケイー（Lipomyces starkeyii）を加えて培
養した。 試料Ｃ）はＡと同じであるが、攪拌を300rpm
に増加し、容積を100mlに減じ、48時間で培養を
完了し、そしてグリセリンを加えなかつた。 試料Ｄ）はＣと同じであるが、リピドを３％に
増加し、そしてツイーン20を0.03％に増加した。 試料Ｅ）はＤと同じであるが、0.6％の炭化水
素を添加した。 得られた結果は次のとおりである。

【表】 試料Ａは60％の変換割合をもち、そして脂肪酸
内容はココアバターに全く類似していた。異なる
微生物（リポミセス・スターケイー）を用いた試
料Ｂは各種酵母間の若干の差異を示す同様な組成
をもたなかつた。 試料Ｃ、Ｄ、およびＥはより大なる通気／攪拌
割合（より小なる容積、より大なるRPM）で培
養が行なわれ、そしてこれらの因子が得られるバ
ターの脂肪酸をまたコントロールすることができ
るということを示すステアリン酸レベルにおける
明白な減少を示す。 本発明の精神、特に特許請求の範囲に記載され
たような本発明の精神を逸脱することなしに、処
方、手順および操作の詳細において種々の変化お
よび変更がなし得ることは理解されるべきであ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 同化可能な窒素源および同化可能な炭素源を
   含有し、かつ窒素：炭素の比が、酵母菌体がその
   対数期において増殖するような比である増殖用培
   地で酵母菌体を増殖する段階、およびこのように
   増殖された酵母菌体を採取し、この酵母菌体をリ
   ピド蓄積用培地の炭素数10〜20個を有する脂肪酸
   少なくとも１種と接触させて油脂の生産を増殖さ
   せる段階よりなる、油脂の製造方法。 ２ 増殖用培地が少なくとも１つの炭水化物を含
   有する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 炭水化物が糖類である特許請求の範囲第２項
   記載の方法。 ４ 酵母菌体が好気的に培養される特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ５ リピド蓄積用培地の脂肪酸が乳化液の形であ
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６ 脂肪酸が10ミクロンよりも小さい粒子の大き
   さをもつ特許請求の範囲第５項記載の方法。 ７ 脂肪酸が15よりも大きいHLBをもつ乳化剤
   で乳化される特許請求の範囲第５項記載の方法。 ８ 脂肪酸が10ないし20個の炭素原子を含有する
   特許請求の範囲第１項記載の方法。９ 脂肪酸が
   ステアリン酸およびパルミチン酸の混合物である
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 １０ 脂肪酸がステアリン酸、パルミチン酸およ
   びオレイン酸の混合物である特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 １１ 同化可能な窒素源および同化可能な炭素源
   を含有し、かつ窒素：炭素の比が、酵母菌体がそ
   の対数期において増殖するような比である増殖用
   培地で酵母菌体を増殖する段階、およびこのよう
   に増殖された酵母菌体を採取し、この酵母菌体を
   10ないし20個の炭素原子を含有する脂肪酸の少な
   くとも１つの乳化液と接触させてカカオバター中
   に見出される油脂を生産させる、特許請求の範囲
   第１項記載の方法。