JPH04346794A - 抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒト組織型プラスミノー
ゲンアクチベータ（ｔ−ＰＡ）に対し特異的な結合性を
有し、かつｔ−ＰＡとｔ−ＰＡインヒビターの複合体に
対し等しい親和性を有する抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗
体に関する。本発明の抗体はｔ−ＰＡの測定や生産にお
いて有用な抗体である。

【０００２】

【従来の技術】ｔ−ＰＡは血液の凝固線溶系に係る重要
な因子である。ｔ−ＰＡはプラスミノーゲンをフィブリ
ンの溶解性を有するプラスミンに変える作用を有してお
り、血栓による疾患、例えば心筋梗塞や脳梗塞の治療に
用いることができる。このためｔ−ＰＡの生産を目的と
して細胞培養や遺伝子組み換え法などにより大量に生産
する技術が開発され、ｔ−ＰＡを治療薬として用いるこ
とが可能となった。ｔ−ＰＡは分子量６９０００〜７４
０００の糖蛋白質であり、ｔ−ＰＡに対する抗体が得ら
れておりこれを用いた、ｔ−ＰＡの精製や、測定方法が
提案されている。

【０００３】特開昭５９─５１２１号公報にはｔ−ＰＡ
とウロキナーゼに対して交差性を有するモノクローナル
抗体が開示されている。また特開昭６１─２２１１２８
号公報にはヒト胎児由来の線維芽細胞の生産するｔ−Ｐ
Ａに対するモノクローナル抗体とこの抗体を用いたｔ−
ＰＡの精製方法と検出方法が開示されている。また特開
昭６１─１８３２９９号公報、特開昭６１─１７６６０
０号公報には特定の可変領域のＮ末端アミノ酸配列をも
ち、ｔ−ＰＡに対し親和性を有するモノクローナル抗体
が開示されている。これらの抗体はいずれもｔ−ＰＡの
精製やＥＩＡなどに用いることができるとされているが
必ずしも満足のゆくものではなかった。また抗体として
の特性も必ずしも明らかにされたわけではなく、抗ｔ−
ＰＡ抗体による精密なｔ−ＰＡの分析にはさらに検討が
必要であった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ｔ−ＰＡには、血液中
にｔ−ＰＡと特異的に結合しその活性を阻害するｔ−Ｐ
Ａインヒビター（ＰＡＩ−１）が存在し、ｔ−ＰＡと複
合体を形成しており、通常の分析では、この結合型ｔ−
ＰＡを検出できなかった。またこの阻害物質は高分子の
蛋白質であり、ｔ−ＰＡに結合し、抗ｔＰＡ抗体の抗原
認識部位をブロックして抗体の結合を阻害する可能性が
ある。このようなｔ−ＰＡ複合体とも強い親和性を有し
、かつウロキナーゼなどとの交差性を有しない新規な抗
ｔ−ＰＡモノクローナル抗体を提供することを課題とす
る。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、抗ｔ−Ｐ
Ａモノクローナル抗体について種々検討を行った結果、
この様な目的に適したモノクローナル抗体生産細胞を得
ることができた。そして、本発明のこのようなモノクロ
ーナル抗体生産細胞を用いるとｔ−ＰＡ及びｔ−ＰＡ複
合体と強い新和性をもち、ウロキナーゼなどと交差性を
有しない新規な抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体を得るこ
とができる。

【０００６】まず、本発明のモノクローナル抗体を得る
ために用いる生産細胞について説明する。この抗体生産
細胞は、ヒト胎児肺由来の線維芽細胞の培養により生産
されるｔ−ＰＡを精製して得られる比活性の高いｔ−Ｐ
Ａ、例えば比活性１０４０００ＩＵ／ｍｇタンパクの高
純度ｔ−ＰＡで免疫したマウスからの脾臓細胞をマウス
ミエローマ細胞と細胞融合させ、得られたハイブリドー
マを培養し、抗体を生産する細胞を選別し、上記目的に
合致した抗体生産株を得る。

【０００７】マウスを免疫するためのｔ−ＰＡは、従来
知られている種々の方法で得ることができる。例えば、
特開昭６２─２０５７８４号公報に開示された方法に従
い、ヒト胎児肺由来線維芽細胞であるＩＭＲ−９０（Ａ
ＴＣＣ　　ＣＣＬ−１８６）を培養しその培養液より高
純度ｔ−ＰＡを得ることができる。精製回収にあたって
は、これまで発表されたｔ−ＰＡの精製方法であればど
のような精製方法でも採用できる。本発明においては特
開昭６１─２４６１３１号公報に本発明者らが開示した
方法により精製した。すなわち細胞培養でえた培養液を
イオン交換クロマトグラフィーで処理し、さらに溶出画
分を抗ウロキナーゼ抗体を固定した固定化セファロース
カラムに通液し、ウロキナーゼを吸着させ、得られる溶
出画分をｐ−アミノベンツアミジンをリガンドとしたア
フィニティクロマトグラフィで処理し、ついで得られた
ｔ−ＰＡ画分をゲル濾過し、精製ｔ−ＰＡを得ることが
できる。このようにして得たｔ−ＰＡを抗原として、モ
ノクローナル抗体を作成した。

【０００８】すなわち、この精製ｔ−ＰＡをマウスの腹
腔内に投与し、数回精製ｔ−ＰＡを投与して免疫を行い
、脾臓を取り出し、脾臓からＢ細胞を得る。得られたＢ
細胞とマウスミエローマ細胞とを細胞融合し、ハイブリ
ドーマ細胞を得る。ハイブリドーマ細胞のみが生育し得
るように調製したＨＡＴ培地で培養し、ハイブリドーマ
細胞を選択する。選択されたハイブリドーマ細胞を、抗
原として使用したｔ−ＰＡと同じｔ−ＰＡを抗原として
抗体生産能をチェックし、抗体生産能の認められたハイ
ブリドーマ細胞のみを選択し、クローニングを繰り返し
、抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体を生産する安定な細胞
を得る。得られた細胞は抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体
を生産し、永続的に継代培養が可能である。この抗ｔ−
ＰＡモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを、あらか
じめ免疫抑制剤（プリスタン）を腹腔内に投与したマウ
スの腹腔内に移植して飼育し、腹水を採取する。腹水か
ら抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体を精製する。

【０００９】本発明のモノクローナル抗体は、以下のよ
うな特性により特定される。 （１）　分子量：ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより約１５０００
０（２）　Ｉｇサブクラス：ＩｇＧ２ｂ （３）　Ｌ鎖及びＨ鎖可変領域Ｎ末端アミノ酸配列（４
）　抗原に対する親和性：ｔ−ＰＡ及びｔ−ＰＡとｔ−
ＰＡインヒビターの複合体に対し等しい親和性を有して
いる。 （５）　還元カルボキシメチル化（ＲＣＭ化）ｔ−ＰＡ
との反応性を有しない。 （６）　ウロキナーゼに対し免疫交差性を示さない。 さらに本抗体は、ｔ−ＰＡのフィブリン親和性に対して
は影響を与えずにｔ−ＰＡに結合し、合成基質Ｓ−２２
８８（カビビトラム製）に対する分解活性にも影響を与
えない。またこの抗体のｐＩは通常の等電点電気泳動法
で測定した場合５．１〜６．２を示す。

【００１０】この抗体を生産するハイブリドーマはＨｙ
ｂｒｉＣ１０と命名され、微工研菌寄第１２１０８号と
して寄託されている。

【００１１】以下に実施例実験例を示しさらに本発明を
詳細に説明する。

【００１２】

【実施例１】　　ハイブリドーマの作成ヒト胎児肺由来
細胞ＩＭＲ−９０より特開昭６１−２４６１３１号公報
記載の方法に従って精製ｔ−ＰＡを得た。この精製ｔ−
ＰＡを抗原として、マウス一匹当たり１００〜２００μ
ｇを、アジュバントとしてＦｒｅｕｎｄ’ｓ　ｃｏｍｐ
ｌｅｔｅ　ａｄｊｕｖａｎｔを用いて６〜８週齢のＢＡ
ＬＢ／Ｃマウスに腹腔内に投与した。初回免疫から２週
間後に追加免疫を行い、以後２週間毎に数回の追加免疫
を行った。ついで最終免疫後から３日目に脾臓を摘出し
、脾臓からのＢ細胞とマウスミエローマ細胞（Ｐ−３Ｎ
ＳＩ／１−Ａｇ４−１，略号ＮＳ−１）とを、１：１〜
１０：１の範囲の割合でポリエチレングリコール１００
０の存在下で融合させ、ハイブリドーマ用培地にミエロ
ーマ細胞として１×１０６　ｃｅｌｌｓ／ｍｌ前後にな
るよう懸濁し、９６ｗｅｌｌマイクロタイタープレート
に０．１ｍｌあて蒔く。ついで細胞融合を行った翌日に
融合細胞のみが生育しうるように調整したＨＡＴ培地を
０．１ｍｌ／ｗｅｌｌ添加し、以後毎日培養上清の半分
を新しいＨＡＴ培地に置き換えて、細胞を選別した。生
育ｗｅｌｌから培養上清をとり、免疫に用いたと同じｔ
−ＰＡを抗原としてＥＩＡ法により抗体生産能をチェッ
クした。抗体生産が認められたｗｅｌｌから限界希釈法
によりクローニングを行い、さらに一週間培養し、ＥＩ
Ａ法により抗体産生をチェックした。上記クローニング
を５〜６回繰り返し行い、モノクローナル抗体遺伝子の
脱落の起こらない安定なハイブリドーマのみを選別し抗
ｔ−ＰＡ抗体生産ハイブリドーマとして保存した。この
ハイブリドーマは、永続的に継代培養が可能であり抗ｔ
−ＰＡモノクローナル抗体を生産し続ける。このハイブ
リドーマは１０％牛胎児血清添加ＤＭＥＭ培地中で大量
培養することにより培養液中に抗ｔ−ＰＡ抗体を生産す
る。また常法通りマウス腹腔内にこのハイブリドーマを
移植し、腹水から回収することもできる。

【００１３】

【実施例２】　　抗体の生産あらかじめ１〜２週間前に
免疫抑制剤プリスタン（２，６，１０，１４─テトラメ
チルペンタデカン）０．５ｍｌを腹腔内に投与した成熟
ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内に、実施例１で得たハイブ
リドーマを１×１０７　ｃｅｌｌｓ／匹移植して、腹腔
が充分膨張するまで飼育し、腹水を採取した。腹水中の
モノクローナル抗体の精製は、ＭＡＰＳモノクローナル
抗体精製システム（バイオラッド社製）を使用して行っ
た。 マウス一匹当たりのモノクローナル抗体生産量は３５．
３〜７５．６ｍｇであった。精製抗体のなかでもっとも
本発明の目的に適した抗体をＣ−１０と命名し、以下の
項目についてその特性を分析した。またこの抗体生産細
胞をＨｙｂｒｉＣ１０と命名し微工研菌寄　　１２１０
８号として寄託した。

【００１４】

【実施例３】　　抗体の物理化学的性質実施例２で得た
Ｃ−１０抗体の物理化学的特性を分析した。 （１）　分子量ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルによる
電気泳動をＬａｅｍｍｌｉの緩衝液を用いて行った。抗
体の分子量はＢｉｏ　　Ｒａｄ社の分子量マーカーを用
いて比較した結果分子量は約１５０，０００であった。

【００１５】（２）　ＩｇＧサブクラス免疫グロブリン
クラス及びサブクラス特異性抗マウス免疫グロブリン抗
血清を使用して、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により
決定した。抗体はＩｇＧ２ｂのサブクラスに属すること
が確認された。

【００１６】（３）　等電点 ＬＫＢ−カラム等電点電気泳動装置を用い、１ｍｇ程度
の部分精製したモノクローナル抗体を添加し、ｐＨ３．
５〜９．５のアンホラインキャリア：アンホライト（Ｌ
ＫＢ社製）存在下４℃、定電圧７００Ｖ、４０〜６０時
間通電し、定常状態となったところで１ｍｌずつ分画し
、氷冷下でｐＨ測定後、２８０ｎｍの吸光度とｔ−ＰＡ
に対する特異的抗体の検出を行い、等電点を判定した。 目的の抗体の等電点は５．１〜６．２であった。

【００１７】（４）　Ｎ末端アミノ酸配列抗体の抗原認
識部位は、抗体のＮ末端アミノ酸配列によって決定され
る。抗体のＮ末端アミノ酸配列は、抗体のＬ鎖、Ｈ鎖そ
れぞれに特有の配列を有している。精製した抗体を２μ
ｇ／μｌの濃度に１ｍＭのＥＤＴＡ、２．５％ＳＤＳ、
０．０１％ブロムフェノールブルー（ＢＰＢ）、１０％
メルカプトエタノール、１０％グリセロールを含む１０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した。これ
を１００℃で３分間加熱し、１５０００ｒｐｍで３分間
遠心分離を行い、上清を得た。この上清を１０％の均一
ゲルを用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
を行った。泳動条件は５０ｍＡの電流で、Ｌａｅｍｍｌ
ｉの条件に準じておこなった。泳動後、ポリビニリデン
ジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜へ電気泳動によって分離
したゲル中のＨ鎖とＬ鎖を１５ｍＡ、３０分の条件で電
気的に転写した。転写の終了した膜をクマシーブリリア
ントブルーで１０分間染色した。ついで、染色された膜
を７％酢酸を含む２５％メタノール溶液で一昼夜脱色後
風乾を行った。染色されたＨ鎖、Ｌ鎖をそれぞれ切取り
、切り取った膜を直接気相プロテインシーケンサー（ア
プライドバイオシステムズ社製ＭＯＤＥＬ４７７Ａ）に
導入し、予め作成したプログラムを用いて自動的にｃｏ
ｕｐｌｉｎｇ　ｃｌｅａｖａｇｅ　ｃｏｎｖｅｒｓｉｏ
ｎ反応を行った。 得られたＰＴＨ─アミノ酸を２０％アセトニトリルに溶
解し、逆相高圧液体クロマトグラフィー（アプライドバ
イオシステムズ社製ＭＯＤＥＬ１２０Ａ、カラムＣ−１
８、φ２．１ｍｍ×２２０ｍｍ）に注入し、その保持時
間を標準ＰＴＨアミノ酸の保持時間と比較することによ
って各ＰＴＨアミノ酸を同定した。その結果Ｈ鎖、Ｌ鎖
の配列は以下の通りであることが確認された。 　　この配列はこれまで報告された抗ｔ−ＰＡ抗体のＮ
末端アミノ酸配列とも異なっていた。

【００１８】（５）　還元カルボキシメチル化ｔ−ＰＡ
に対する反応性 Ｃｒｅｓｔｆｉｅｌｄらの方法（Ｇ．Ａ．　Ｃｒｅｓｔ
ｆｉｅｌｄ　ｅｔ．　ａｌ．　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ
　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｒｔ．　Ｂｉｏｌ．
，ｖｏｌ．５１，５５１，１９８６）　に従って、還元
カルボキシメチル化（ＲＣＭ化）ｔ−ＰＡを調製した。 精製ｔ−ＰＡ４．４ｍｇを８Ｍ尿素を含む０．５Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）に溶解し、１０ｍＭ　　Ｄ
ＴＴを加え３７℃で３０分間放置した。ついで最終濃度
が２５ｍＭになるようにヨード酢酸を添加し、室温に２
０分間放置した。その後最終濃度が８０％になるように
エタノールを添加し、─２０℃で一晩放置し、沈澱を１
５０００ｒｐｍ、１０分間遠心処理により回収した。こ
の沈澱を８０％エタノールにより洗浄し、１５０００ｒ
ｐｍ、１０分間遠心処理を行い、この操作を繰り返し、
ＲＣＭ化ｔ−ＰＡを得た。ＲＣＭ化によりｔ−ＰＡは立
体構造が引き延ばされた構造に変換された。このＲＣＭ
化ｔ−ＰＡと精製ｔ−ＰＡを用いて抗体の反応性を検定
した。

【００１９】■競合法ＥＬＩＳＡ ＲＣＭ化及び精製ｔ−ＰＡをそれぞれ１４５μｇをｐＨ
１１．５のＰＢＳ１００μｌに溶解し、０．１％ＢＳＡ
、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むｐＨ７．４のＰＢＳ
で１０倍から２０４８０倍まで段階希釈した。常法通り
ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識をした抗体をｐＨ７．
４のＰＢＳにより６４０倍に希釈し、１００μｌずつ小
試験管に取り、ｔ−ＰＡ希釈液をそれぞれ１００μｌず
つ加え、３７℃で１時間放置した。あらかじめ１０μｇ
／ｍｌのｔ−ＰＡで一昼夜室温でコーティングした後、
１％ＢＳＡを含むＰＢＳで２時間ブロッキングを行った
９６ウエルプレートへ標識抗体と反応後の溶液を５０μ
ｌずつ加え３７℃で一時間放置した。ｐＨ７．４のＰＢ
Ｓによりウエルを３回洗浄し、Ｏ─フェニレンジアミン
で発色させ、６Ｎ硫酸を２５μｌ加え、反応を停止させ
た。ついで波長４９２ｎｍで吸光度を測定した。測定結
果を図１に示した。

【００２０】■ＥＬＩＳＡ ＲＣＭ化及び精製ｔ−ＰＡをそれぞれ１４５μｇをｐＨ
１１．５のＰＢＳ１００μｌに溶解し、０．１％ＢＳＡ
、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むｐＨ７．４のＰＢＳ
で１０倍から２０４８０倍まで段階希釈した。５０μｌ
ずつ９６ウェルプレートに加え、室温にて一昼夜放置し
、ついでｐＨ７．４のＰＢＳによりウエルを３回洗浄し
、０．１％ＢＳＡを含むｐＨ７．４のＰＢＳを１００μ
ｌずつ加え２時間放置しブロッキングを行った。ついで
、ｐＨ７．４のＰＢＳによりウエルを３回洗浄し、ＰＯ
Ｄ標識した抗体をｐＨ７．４のＰＢＳで１００倍に希釈
し、１００μｌずつ各ウエルに加えた。反応後ｐＨ７．
４のＰＢＳによりウエルを３回洗浄し、Ｏ─フェニレン
ジアミンで発色させ、６Ｎ硫酸を２５μｌ加え、反応を
停止させた。ついで４９２ｎｍで吸光度を測定した。測
定結果を図２に示した。■■の結果から、ＲＣＭ化する
ことによりｔ−ＰＡの本発明抗体に対する抗原性は完全
に消失した。このことから本発明抗体はｔ−ＰＡ分子の
立体構造を認識していることが示唆された。

【００２１】（６）　ｔ−ＰＡのフィブリン親和性に及
ぼす抗体の影響 Ｃａｎｏらの方法（　Ｅ．Ａ．　Ｃａｎｏ　ｅｔ．ａｌ
．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．６
９，１１５，１９８４）　によりフィブリン固定化プレ
ートを作成し、ｔ−ＰＡ、ｔ−ＰＡ−抗体コンプレック
スのフィブリン親和性を調べた。抗体の希釈列（０，０
．０２，０．２，２，２０，２００μｇ／ｍｌ　　ＰＢ
Ｓ，ｐＨ７．４）を作り、それぞれ１００μｌに０．０
１％Ｔｗｅｅｎ８０を含むｐＨ７．４のＰＢＳに溶解さ
せたｔ−ＰＡ（１μｇ／ｍｌ）を１００μｌ加え、３７
℃で１時間放置した。フィブリン固定化９６ウェルプレ
ートへ５０μｌずつ各抗体濃度について３ウェルずつ加
え、３７℃で２時間放置した。ついで０．０１％Ｔｗｅ
ｅｎ８０を含むｐＨ７．４のＰＢＳで３回洗浄し、０．
１５Ｍ食塩、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０を含むｐＨ７．
４の０．０５Ｍトリス塩酸で１ｍＭに調製した合成発色
基質Ｓ−２２８８（カビビトラム社製）を５０μｌずつ
加えた。 ついで０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０を含むｐＨ７．４のＰ
ＢＳを１００μｌずつ加え、３７℃で１８時間放置した
。５０％酢酸を５０μｌずつ加え反応を停止させた。 その後４０５ｎｍの吸光度を測定した。測定結果を表１
に示した。

【００２２】

【表１】ｔ−ＰＡ−抗体コンプレックスのフィブリン親
和性 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　＊　３ウエル平均表１
に示すように、抗体とコンプレックスを形成後もｔ−Ｐ
Ａのフィブリンに対する親和性は失われなかった。

【００２３】（７）　ｔ−ＰＡによるＳ−２２８８の分
解に及ぼす抗体の影響 　　合成基質Ｓ─２２８８は蛋白分解酵素の基質として
使用される。抗体の結合によりｔ−ＰＡのＳ−２２８８
の分解活性に影響が現れるか否かを観察した。ＭａｃＧ
ｒｅｇｏｒ　の方法（Ｉ．Ｒ．ＭａｃＧｅｒｇｏｒ　ｅ
ｔ．ａｌ．，　Ｔｈｒｏｍｂ．　Ｈａｅｍｏｓｔ．，ｖ
ｏｌ．５３，４５，１９８５）　に従って行った。０．
０１％Ｔｗｅｅｎ８０を含むｐＨ７．４のＰＢＳに溶解
させたｔ−ＰＡ（１μｇ／ｍｌ）溶液１００μｌを小試
験管にとり、これに（６）で調製した抗体の希釈列を１
００μｌ添加し、３７℃で１時間放置した。この小試験
管より５０μｌをとり、９６ウェルプレートへ注入し、
さらに（６）　で調製したＳ−２２８８溶液を５０μｌ
ずつ添加した。３７℃で１８時間反応させ、５０％酢酸
５０μｌを加え反応を停止させ、４０５ｎｍで吸光度を
測定した。測定結果を表２に示した。

【００２４】

【表２】ｔ−ＰＡによるＳ−２２８８の分解に及ぼす抗
体の影響 ＊　３ウエル平均表２に示すように、抗体とコンプレッ
クスを形成後もｔ−ＰＡのＳ−２２８８に対する分解能
に対してはほとんど影響がなかった。抗体の結合部位は
ｔ−ＰＡの活性中心とは異なった部位に結合すると考え
られる。

【００２５】

【実施例４】本実施例においては、本発明抗体を用いた
ｔ−ＰＡの測定の例を示す。 （１）　ヒト血漿を試料としたｔ−ＰＡの測定本発明抗
体を１００μｇ／ｍｌ（ＰＢＳ）をＰＢＳで１０倍に希
釈したものを９６ウェルマイクロプレートに各ウェル当
たり１００μｌ分注した。次いで、３７℃で３時間放置
した後、上記プレートを裏返して液を排除し、各ウェル
を０．１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）と０．０５％Ｔ
ｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＢＴ−ＰＢＳ）で３回
洗浄したものを一次抗体として用いた。次に試料として
１４名の健康成人からの血漿を、下記組成の燐酸食塩緩
衝液を用いて１０倍に希釈した。５ｍＭ　　ＥＤＴＡ １０ｍＭ　　塩酸ベンズアミジン ０．１％　　ＢＳＡ ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０ 上記組成のものをＰＢＳに溶解し、ｐＨ７．４に調製し
希釈用緩衝液とした。血漿の希釈液を、各ウェル当たり
１００μｌ分注し、３７℃で３時間放置して前記一次抗
体に反応させた後、ＢＴ−ＰＢＳで３回洗浄した。

【００２６】次に、二次抗体としてペルオキシダーゼラ
ベルしたウサギ抗ｔ−ＰＡポリクローナル抗体をＢＴ−
ＰＢＳで１０００倍に希釈したものを各ウェルに１００
μｌ加え、３７℃で３時間放置した後、ＢＴ−ＰＢＳで
３回洗浄し、下記組成の基質液を１００μｌ添加し、３
７℃で３０分間反応させた。 基質液組成： オルトフェニレンジアミン　　　　１０ｍｇ３５％過酸
化水素水　　　　　　　　　　　　５μｌ　　　　０．
１Ｍクエン酸─０．２Ｍリン酸２ナトリウム緩衝液（ｐ
Ｈ４．５） 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　２５ｍｌ反応終了後、６Ｎ硫酸
を各ウェル当たり５０μｌ加え、酵素反応を停止させ、
次いでマイクロプレートフォトメーターで４９２ｎｍの
吸光度を測定した。同様に処理したｔ−ＰＡの標準品を
用いて検量線を描き、血漿当たりのｔ−ＰＡ濃度を測定
した。結果を表３に示す。

【００２７】

【表３】血漿中のｔ−ＰＡ濃度

【００２８】（２）　一本鎖ｔ−ＰＡと二本鎖ｔ−ＰＡ
の回収比較 ｔ−ＰＡ（９０％以上が一本鎖）溶液にプラスミン処理
を行い二本鎖ｔ−ＰＡ（９８％が二本鎖）を得た。一本
鎖、二本鎖の確認は電気泳動法により行った。ついでｔ
−ＰＡ濃度が等しい一本鎖、二本鎖のそれぞれの溶液を
（１）　の方法に従って測定した。測定結果を図３に示
した。これによれば、本発明抗体は一本鎖ｔ−ＰＡと二
本鎖ｔ−ＰＡを等しく認識することがわかる。

【００２９】（３）　ｔ−ＰＡ−ＰＡＩコンプレックス
の回収 ｔ−ＰＡはｔ−ＰＡインヒビター（ＰＡＩ）と結合して
複合体を形成する。このＰＡＩとの複合体との複合体が
本発明抗体と反応性を有することを確認をした。０．１
Ｍグリシン、０．５Ｍ食塩を含む０．１Ｍトリス塩酸（
ｐＨ８．２）で７２．８〜１．２μｇ／ｍｌまで二倍段
階希釈した精製ＰＡＩ−１（アメリカンダイアグノステ
ィカ社製）を用意し、これらに０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０を含むＰＢＳで調整した１００ｎｇ／ｍｌのｔ−ＰＡ
溶液を等容量混合し３７℃で３０分間反応させた。これ
らの反応液のｔ−ＰＡ活性及び抗原量を測定した。ｔ−
ＰＡ活性は、０．０１Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．２）に１
５ｍＭのＳ−２２８８と０．２６ｍｇ／ｍｌのｔ−ＰＡ
　ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ　（Ｋａｂｉ　社）　を加えた
ものを基質液として、これに等容量のサンプルを加え３
７℃で２時間反応させた。標準ｔ−ＰＡとしてＷＨＯ　
　ｔ−ＰＡ　ｓｔａｎｄａｒｄ　を用いて測定した。ま
たｔ−ＰＡの抗原量は（１）　に示した測定方法に従っ
た。結果は図４に示した。ＰＡＩ−１濃度が増加するに
伴い、ｔ−ＰＡ活性は減少したが、ｔ−ＰＡ抗原量は変
化が見られなかった。ｔ−ＰＡ活性が減少するのはｔ−
ＰＡがＰＡＩとコンプレックスを形成しているためと考
えられた。ｔ−ＰＡ−ＰＡＩ−１複合体を本抗体は認識
していることが明らかであった。

【００３０】（４）　ウロキナーゼとの交叉性精製ウロ
キナーゼを（１）　の方法に準じて濃度列をつくり、同
様に測定した。コントロールとの間で差はなく、ウロキ
ナーゼとの交差性はなかった。

【００３１】

【発明の効果】本発明によりｔ−ＰＡに対し特異的な親
和性のあるモノクローナル抗体を入手することが可能と
なる。本発明の抗体は、そのＬ鎖、Ｈ鎖のＮ末端アミノ
酸で特定されており、また、ｔ−ＰＡの活性に影響を与
えずにｔ−ＰＡに結合し、またｔ−ＰＡ─ＰＡＩコンプ
レックスもｔ−ＰＡと同様に認識するなど有用な特徴を
有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＲＣＭ化ｔ−ＰＡの競合法ＥＬＩＳＡの結果を
示す。

【符号の説明】

〇─〇　　天然ｔ−ＰＡを示す。 ●─●　　ＲＣＭ化ｔ−ＰＡを示す。

【図２】ＲＣＭ化ｔ−ＰＡのＥＬＩＳＡの結果を示す。

【符号の説明】

〇─〇　　天然ｔ−ＰＡを示す。 ●─●　　ＲＣＭ化ｔ−ＰＡを示す。

【図３】プラスミン処理により二本鎖としたｔ−ＰＡと
一本鎖ｔ−ＰＡの抗体との反応性を示す。

【符号の説明】

◇　　プラスミン添加ｔ−ＰＡ（２本鎖ｔ−ＰＡ）を示
す。 ◆　　対照のｔ−ＰＡ（１本鎖ｔ−ＰＡ）を示す。

【図４】ｔ−ＰＡとＰＡＩ複合体の本抗体の反応性を示
す。

【符号の説明】

●─●　　ｔ−ＰＡ抗原回収率（％）を示す。 〇─〇　　ｔ−ＰＡ活性（％）を示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ヒト組織型プラスミノーゲンアクチベ
   ータ（ｔ−ＰＡ）に対し特異的な結合性を有し、かつ下
   記の性質を有する抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体（１）
   　分子量：ＳＤＳ─ＰＡＧＥにより約１５００００（２
   ）　Ｉｇサブクラス：ＩｇＧ２ｂ （３）　抗原との結合部位：　ｔ−ＰＡの活性中心と異
   なった部位 （４）　Ｌ鎖及びＨ鎖可変領域Ｎ末端アミノ酸配列（５
   ）　抗原に対する親和性：ｔ−ＰＡ及びｔ−ＰＡとｔ−
   ＰＡインヒビターとの複合体に対し等しい親和性を有し
   ている。 （６）　還元カルボキシメチル化（ＲＣＭ化）ｔ−ＰＡ
   との反応性を有しない。（７）　ウロキナーゼに対し免
   疫交差性を有しない。
2. 【請求項２】　　ヒト組織型プラスミノーゲンアクチベ
   ータがヒト胎児肺細胞由来のものである請求項１記載の
   モノクローナル抗体。
3. 【請求項３】　　抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体生産ハ
   ブリドーマー細胞、ＨｙｂｒｉＣ１０（微工研菌寄第１
   ２１０８号）から得られる請求項１または２記載の抗ｔ
   −ＰＡモノクローナル抗体。