JPH02299583A - トロンビン阻害因子に特異的なモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒルジンに特異的なモノクローナル抗体を分
泌するハイブリドーマ細胞の製造方法、ハイブリドーマ
細胞自体、これらのハイブリドーマ細胞により分泌され
るヒルジンに特異的なモノクローナル抗体及びそれらの
誘導体並びに前記抗体及びそれらの誘導体の製造方法に
関する。さらに、本発明は、ヒルジンに特異的なモノク
ローナル抗体及び／又はその誘導体のヒルジン測定への
使用並びにヒルジンに対する解毒剤としての使用、試験
キット並びに前記抗体及び／又は誘導体を含有する医薬
組成物に関する。

〔従来の技術及びその課題〕

効率的に作用する止血系は、哺乳類の生体にとっては不
可欠である。異常のない生体では、血管系の欠陥、例え
ば、脈管の損傷は２段階の工程で修復される。即ち、血
小板の凝集に続いて、いくつかの血液凝固因子が関与し
た状態で酵素カスケードにおいてフィブリン凝塊が生成
する。これらの因子のほとんどは、セリンプロテアーゼ
であり、例えば、フィブリノーゲンが反応してフィブリ
ンとなるのを触媒するトロンビンである。この凝血系は
、とりわけフィブリンを開裂するプロテアーゼプラスミ
ンを含む線溶系により中和される。通常の生理的条件下
でさえも、血液中に少量のフィブリンが生成し、従って
、持続的フィブリン溶解なしに脈管内血栓が生成するの
で、この線溶系は凝血系と同様に重要である。さらに、
この線溶系は、脈管及び輸出尿路等の尿細管系にフィブ
リン沈澱物がない状態に保つとともに、損傷した領域の
構造が完全に修復された後にフィブリンの凝塊を溶解す
るのに必要である。凝血系と線溶系とは、通常動的平衡
にある。しかしながら、万一、血栓閉塞栓症又は手術後
の合併症に罹っている患者において、生体の線溶ポテン
シャルが妨害されたり、不十分であったりする場合、抗
凝血剤を投与してフィブリンがさらに生成するのを防止
するとともに、血栓溶解剤を投与して生成した血栓を熔
解することにより生体を維持することが不可欠である。

ヒル（Ｈｉｒｕｄｏ　ｍｅｄｔｃｉｎａｌｉｓ）中に自
然に存在する抗凝血物質であるヒルジンは長年知られて
いる。

ヒルジンは、単一のポリペプチド種ではないが、ヒルジ
ン変形体１　（ＨＶＩ）、ヒルジン変形体２（ＨＶ２ｉ
ヨーロッパ特許出願第０１５８５６４号）、ヒルジン変
異株ＰＡ　（ＨＶ３　；　ＰＣＴ出願第ＷＯ８８１０３
４９３号）及びｒｄｅｓ　−（Ｖａ　Ｉ）ｚ　−ヒルジ
ン」（ヨーロンパ特許出１ｔＪｉ第ｏ　１５８９８６　
号）と称する少なくとも４つの代表物からなる等しく作
用するポリペプチドの類である。これらの変形体は、例
えば、Ｎ末端配列での多数のアミノ酸か互イニ異なり、
ＨＶＩの場合Ｖａ　Ｉ−Ｖａ　Ｉ　−Ｔｙｒであり、Ｈ
Ｖ２とＰＡの場合１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒであり、そし
てｒｄｅｓ　−（Ｖａ　Ｉ）ｚ−ヒルジン」の場合Ｔｈ
ｒ−Ｔｙｒである。ＮＭＲでの検討によると、ＨＶ　１
は突出した「フィンガー（ｆｉｎｇｅｒ）　Ｊ　　（残
基３１〜３６）を有するＮ末端コアーと酸性末端ループ
から成る〔クロア（Ｃ１ｏｒｅ）等、エンボジャーナル
（ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａ１（ｒＨＶ１）、β−３５２９
，１９８７）。上記した全てのヒルジン変形体は、Ｎ末
端に疎水性アミノ酸の集積（ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ
）とＣ末端に極性アミノ酸の集積、サルフェートモノエ
ステルとして存在するチロシン残基（Ｔｙｒ６３）、３
個のジスルフィド架橋及び抗凝血剤活性を共通に有して
いる。

トロンビンに特異的な全ての天然凝血物質及び合成抗凝
血物質のうち、ヒルジンは標的酵素に対して最も高い親
和性を有している。この阻害因子は、酵素的に全く不活
性なトロンビンと非常に安定な１：１のモル比の複合体
を形成する。凝血カスケードの他の酵素は、ヒルジンに
よっては阻害されない。

ヒルジンは、期待できる薬物動力的及び薬力学的性質を
有している〔例えば、マークワ−１１Ｍａｒｋｗａｒｄ
　ｔ）等、Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ　
Ｘ４７．２２６．１９８２を参照〕。イヌに対してヒル
ジンを静脈内投与したあと（高い投与量の場合でも）、
心拍数、呼吸、血圧、血小板数、フィブリノーゲン及び
ヘモグロビンに対する影響は観察されなかった。ラット
、ブタ及びイヌについての試験では、ヒルジンは、実験
的血栓症、エンドトキシンショック及び播種性腺管内凝
固にも効果的であることが判明した。

（］１） ヒルジンの治療用途の前提条件としては、バイオテクノ
ロジーの最新の方法を用いて十分な量を製造できるかが
挙げられる。最近、ヒルジン変形体をコードしているｃ
１（ｒＨＶ１）ＮＡ及び合成遺伝子がクローニングされ
、そして微生物宿主中で発現されている。発現生成物は
、Ｔｙｒ６３でサルフェートモノエステルを欠いている
ことからデスルファトヒルジン（ｄｅｓｕｌｐｈａｔｏ
ｈｉｒｕｄｉｎ）と呼ばれているが、少なくとも天然硫
酸化ヒルジンに匹敵する生物学的性質を示すことが判明
した。デスルファトヒルジン変形体ＨＶＩが、大腸菌（
ヨーロッパ特許出願筒０１５８５６４号及び第０１６８
３４２号）及びサツカロミセス・セレビシェ−（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　（ヨ
ーｏ　ツバ特許出願第０１６８３４２号、第０２００６
５５号、第０２２５６３３号及び第０２５２８５４号）
中で発現された。同様に、デスルファトヒルジンＨＶ２
が大腸菌（ヨーロッパ特許出願第０２００６５５号、Ｐ
ＣＴ特許出願第Ｗ０８６１０１２２４号）中で発現され
、そしてｄｅｓ　−（Ｖａ　１）ｚ−デスルファトヒル
ジンが大腸菌（ヨーロッパ特許出願筒０１５８９８６号
）中で発現された。

凝固阻害剤を将来日常的に投与するために同様に重要な
ことは、生体液中の抗凝血物質を感度よく且つ再現性よ
（定量する方法を開発して薬剤を監視できるようにする
ことである。通常、ヒルジンは、トロンビンとの相互作
用を介して評価する。

ヒルジンは非常に劣った免疫抗原であることから、抗凝
血物質の測定用のイムノアッセイに使用することのでき
るヒルジンに対する抗体を製造することには問題があっ
た。ヨーロッパ特許出願筒０１６８３４２号にはヒルジ
ンに特異的なモノクローナル抗体が記載されている。し
かしながら、この特許出願明細書は、恐らく未修飾ヒル
ジンに対して誘発される特許請求の範囲に記載の抗体の
特性決定については触れられていない。ヒルジンの免疫
原性が劣ることから、上記で挙げた特許出願における抗
ヒルジンモノクローナル抗体の製造についての着想には
、免疫操作がうまくいく根拠及び、従って、このような
抗体の製造がうま（いく根拠がない。スピナー（Ｓｐｉ
ｎｎｅｒ）等（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ、　８７．　７９．１９８６）には、ヒルジンでヒツ
ジを免疫することによるポリクローナル抗ヒルジン抗体
（抗血清）の製造についての記載がある。この論文には
、免疫操作があまりうまくぃがず且っ抗血清を製造する
ことが全く困難であることが明確に記載されている。同
し研究グループが、ヒルジンに対する３種のモノクロー
ナル抗体について記載している〔ストツフラー（Ｓ　ｔ
ｏｆ　ｆ　Ｉｅｒ）等、Ｔｈｒ。

ｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓ、　、、補遺７．３８．１９８７
）　、これらの３種のモノクローナル抗体のうちの一つ
は、ヒルジンとα−トロンビンとの相互作用を妨害する
。しかしながら、免疫操作、とりわけ抗原として使用す
るヒルジン変異株だけでなく、モノクローナル抗体とヒ
ルジン／α−トロンビン複合体との間の相互作用につい
ても、この論文には上記以上のことは記載されていない
。

本発明の目的は、天然ヒルジン及び組換えヒルジンに特
異的なモノクローナル抗体を製造することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明の目的は、ヒルジンを適当なキャリヤーに連結さ
せてその免疫抗原性を向上させ、前記免疫原性ヒルジン
複合体を用いて適当な哺乳動物を免疫し、そして前記哺
乳動物の抗体分泌細胞を連続細胞系の細胞と融合するこ
とにより、上記で説明した天然及び組換えヒルジンに特
異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細
胞を製造することにより達成される。免疫原性ヒルジン
複合体を用いた免疫操作により、所望の抗体が高収率で
得られる。免疫操作で使用されるヒルジン変形体の性質
によっては、異なるヒルジン変形体に対する特異性と高
い親和性を有するモノクローナル抗体のパネルを製造す
ることが可能である。

これらのモノクローナル抗体は天然及び組換えヒルジン
の定性的測定及び定量的測定、例えば、イムノアッセイ
に有効であり、そしてそれらのほとんどは免疫に用いる
変形体以外のヒルジン変形体とは交差反応性がないので
ヒルジン変形体の分別に用いることができる。驚くべき
ことに、本発明（Ｉ５） のモノクローナル抗体のあるものは、ヒルジンの高凝血
活性を中和するのにも非常に効果があるのでヒルジンに
対する解毒剤として使用して抗凝血剤の作用を調査及び
調節することができることが見出された。

本発明は、ヒルジン、特に組み換えヒルジンに特異的な
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞の製
造方法であって、適当な哺乳動物を免疫原性ヒルジン複
合体、とりわけ免疫原性組換えヒルジン複合体で免疫し
、前記哺乳動物の抗体産生細胞を連続細胞系の細胞と融
合し、融合で得たハイブリッド細胞をクローニングし、
そして所望の抗体を分泌する細胞クローンを選択するこ
とを特徴とするハイブリドーマ細胞の製造方法に関する
。

好ましくは、本発明は、ヒルジン変形体ＨＶＩ、特に組
換えヒルジン変形体ＨＶＩ　（ｒＨＶ１（ｒＨＶ１）に
特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ
細胞の製造方法であって、哺乳動物を免疫原性ヒルジン
変形体ＨＶＩ複合体、特に免疫原性組換えヒルジン変形
体ＨＶＩ　（ｒＨＶ１（ｒＨＶ１）複合体で免疫するこ
とを特徴とするハイブリドーマ細胞の製造方法に関する
。

本発明の方法において、当該技術分野において公知の免
疫スケジュールを多様に変更することを考慮すると、免
疫操作、即ち、抗体の誘発方法が非常に重要である。免
疫原性は、抗原の性質だけでな（応答する個体の特性及
び抗原の提供方法によっても決まることに注目すること
が特に重要である。

本発明の方法によれば、使用する抗原は免疫原性ヒルジ
ン複合体である。本特許出願において、「ヒルジン」と
は、特記のない限り、文献に記載されているか、又は組
換えＤＮＡ法により得ることのできる、（１）全ての天
然又は合成ヒルジン変形体及びヒルジン誘導体（ヒルジ
ン断片等）並びに（２）全ての組換えヒルジン（デスル
ファトヒルジン）変形体及び組換えヒルジン（デスルフ
ァトヒルジン）誘導体（Ｃ末端短縮デスルファトヒルジ
ン類等）を含む。

このようなヒルジンとしては、例えば、下記のものが挙
げられる。

（ａ）式（Ｉ）： Ｈ−Ｖａ　Ｉ−Ｖａ　１−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ　−
Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−ＣｙＶａｌ
−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｃ１ｎ−Ｇｌｙ−ＡｓＧｌｙ−３ｅ
ｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−ＬｙＴｈｒ−Ｇｌｙ−Ｃ
１ｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰｒＨｉ　５−Ａｓ　ｎ−Ａｓ
　ｐ−Ｃ１ｙ−Ａｓ　ｐ−ＰｈＧｌｕ−ＧＩｕ−Ｔｙｒ
　（Ｒ）　−Ｌｅｕ−〇ｌｎ−〇Ｈ 〔式中、（Ｒ）はＴｙｒのフェノール性ヒドロキシ基（
デスルファトヒルジン）又は−〇−ＳＯ。

Ｈを示し、そして／又は Ｌｙｓ２７はｌｉｅ又はＧｌｕにより置換されているか
、 Ｌｙｓ３６はＩｃｅ又はＧ　Ｌ　ｕにより置換されてい
るか、 Ｌｙｓ４７はＩｌｅ又はＧｒｕにより置換されているか
、 Ｈｉｓ５１はＬｅｕ又はＡｓｐにより置換されているか
、 Ｖａｌｌ−Ｖａｌ２がＴｈｒにより置換されているか、
あるいは 分子全体においてＣ，Ｉｎ６５の箇所か、Ｌｅｕ６４と
Ｇ１ｎ６５の箇所が短縮されている〕で表されるＨＶＩ
型ヒルジン変形体； （ｂ）式（■）： Ｈ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ　−Ｇｌ
ｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−ＣｙＶａｌ−Ｃ
ｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＡｓＧｌｙ−３ｅｒ−
Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＧＩＴｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ
−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰｒＨｉｓ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌ
ｙ−Ａｓｐ−ＰｈＧｌｕ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ　　（Ｒ）−
Ｌｅｕ−〇ｌｎＯＨ 〔式中、（Ｒ）はＴｙｒのフェノール性ヒドロキシ基（
デスルファトヒルジン）又は−０−ＳＯ３Ｈを示し、そ
して／又は １１ｅｌはＶａｌにより置換されており且っＴｈｒ２が
Ｖａｌにより置換されているか、Ａｓｎ４７がＬｙｓ、
、Ａｒｇ又はＨｉｓにより置換されているか、あるいは Ｔｙｒ６３がＧｌｕ又はＡｓｐにより置換されている〕 で表されるＨＶ２型ヒルジン変形体； （ｃ）式（■）： Ｈ−Ｉ　　Ｉｅ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−ＣｙｓＧｌ
ｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−ＣｙＶａｌ−Ｃ
ｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＡｓＧｌｙ−３ｅｒ−
Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＡｓＴｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ
−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−ＰｒＨｉｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−４；
Ｉｙ−Ａｓｐ−ＰｈＡｓ　ｐ　−Ａ　Ｉ　ａ−Ｔｙ　ｒ
　　（Ｒ）　　−Ａｓ　ｐ−Ｇ　Ｉ　ｕＯ１１ 〔式中、（Ｒ）はＴｙｒのフェノール性ヒドロキシ基（
デスルファトヒルジン）又は−Ｏ３Ｏ３Ｈ基を示し、そ
して／又は ポリペプチド鎖はＣ末端でアミノ酸１８個、１０個、９
個、６個、４個又は２個短縮されているか、あるいは ポリペプチド鎖はＮ末端でアミノ酸１個か２個短縮され
ている〕 で表されるＰＡ（ＨＶ３）型ヒルジン変形体。

ヒルジン分子の特異的な所定のエピドープに対する抗体
が所望の場合、ヒルジン断片の複合体での免疫が可能で
ある。このような断片は、例えば、ｒＨＶｌのアミノ酸
残基４０〜６５又は５２〜６５からなるものが挙げられ
る。免疫に使用される断片はトロンビン阻害活性を有す
る必要はない。

それ自体では弱い免疫抗原でしかないヒルジンの免疫原
性を増強するために、キャリヤーに抗原を連結させて免
疫原性ヒルジン複合体を形成することが必要である。適
当なキャリヤー分子としては、多量に市販されている、
例えば、連結に使用される遊離アミノ基を有するリジン
リッチタンパク質、とりわけ牛血清アルブミンのような
高分子量タンパク質（ＢＳＡ；分子量６６．２００）　
、バシラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔ
ｉｌｉｓ）由来のαアミラーゼ（分子量５８，０００）
又はキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬ）１　ｉ
分子量＞１，０００，０００）が挙げられる。ブタのチ
ログロビン、破傷風トキシン、コレラトキシン又はジフ
テリアトキシン等のトキシン類、ヒト血清アルブミン（
ＩＳＡ）、β−２ミクログロブリン等もキャリヤーとし
て使用できる。又、マウスＩｇＧ　　（Ｈ十Ｌ）　　［
カワムラ及びベルシフスキー（Ｋａｗａｍｕｒａ　＆　
Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ）、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　、１
３６．５８．１９８６）に対する精製ウサギＩｇＧ分画
もキャリヤーとして用いることができる。他に用いるこ
とのできるキャリヤー分子としては、多糖類、天然又は
合成リポ多糖類、ポリリジン等の合成ポリペプチド、活
性化膜、ラテックス粒子、サルモネラ等の細菌等が挙げ
られる。

ヒルジン、特に組換えヒルジンが牛血清アルブミン（Ｂ
ＳＡ）又はキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＩ
＋）　、とりわけＢＳＡに連結している免疫原性ヒルジ
ン複合体が好ましい。ヒルジン変形体ＨＶ■、とりわけ
組換えヒルジン変形体ＨＶＩ　（ｒＨＶ１（ｒＨＶ１）
がＢＳＡ又はＫＬＨ３とりわけＢＳＡに連結している免
疫原性ヒルジン複合体が特に好ましい。

本発明のヒルジン複合体は、自体公知の方法、即ち、キ
ャリヤーへのヒルジンの吸着か、過ヨウ素酸塩、グルタ
ルデヒド、カルボジイミド、例えば、Ｎ、Ｎ“−〇−フ
二二レしジマレイミド、Ｎ　−（ｍ−マレイミドベンゾ
イルオキシ）サクシンイミド、Ｎ−（３−〔２°−ピリ
ジルジチオ〕プロピオンオキシ）サクシンイミド、Ｎ−
エチル＝Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ
ジイミド等を用いた連結により調製される。もしカルボ
キシル基を介した連結を意図する場合には、ヒルジンの
アミノ基を、まず、例えば、アセチル基又は第３ブトキ
シカルボニル基でのアシル化により保護できる。

免疫原性ヒルジン複合体は、アジュバントすなわち免疫
操作に関して免疫応答をさらに増加する薬剤と混合でき
る。使用できるアジュバントとしては、フロイント完全
アジュバント（鉱油、木皮びミコバクテリア抽出物から
なるエマルジョン）、フロイント不完全アジュハン１−
（水及び油のみからなるエマルジョン）、水酸化アルミ
ニウムゲル等が挙げられる。

免疫原性ヒルジン複合体を、外来分子として該複合体を
認識する適当な呻乳動物を免疫するのに使用する。特に
好ましいものとしては、Ｂａｌｂ／ｃマウスが挙げられ
る。

免疫の経路としては、とりわけ、皮内注射、皮下注射、
筋肉内注射、腹腔内注射、脈管内注則及び頭蓋的注射が
挙げられる。抗体力価が高いことが望まれるので、連続
的に注射投与を行う。免疫は、例えば、免疫原性ヒルジ
ン複合体を、必要に応じて不完全又は完全フロインドア
ジュバントと混合して、Ｂａｌｂ／ｃマウス内に１０〜
２０μｇの量で１〜３週間の間隔で３回〜８回非経口的
、例えば、腹腔内及び／又は皮下注射し、最後の免疫の
１〜３か月後に約５０〜１００μｇのブースター注射を
行う。

最終ブースター注射後、例えば、３〜５日後に採取した
免疫哺乳動物の抗体産生細胞、好ましくは肺臓リンパ球
等のリンパ球系細胞を、連続細胞系、即ち、この複製能
力を融合から得られるハイブリッド細胞に付与する連続
的に複製する細胞と融合させる。下記の要件を満足する
連続細胞系、例えば、腫瘍細胞系（ミエローマ）を使用
することが好ましい。

（１）細胞系は、それ自体では免疫グロブリン又はその
断片を産生じないが、多量の抗体を産生及び分泌する能
力を有している。

（２）細胞系は、高い頻度で融合細胞クローンを生じな
ければならない。

（３）細胞系は、未融合親細胞に対して選択され得る選
択マーカー、例えば１、ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン及びチミジン（ＨＡＴ）培地に対する感受性（チミジ
ンキナーゼ（ＴＫ）又はヒボキサンチン（グアニン）ホ
スホリポシルトランスフアーゼ（Ｉ（（Ｇ）ＰＲＴ　）
陰性細胞）、ウアバイン耐性等を担持している。

好ましいものとしては、これらの要件を満足するマウス
ミエローマ細胞系、特に市販されているマウスミエロー
マ細胞系Ｓｐ　２１０−Ａｇ　１４〔シュルマン（Ｓｈ
ｕｌｍａｎ）等、Ｎａｔｕｒｅ、　２７６　、２６９．
１９７Ｂ）又はＸ６３−Ａｇ、６５３（キーアネイ（Ｋ
ｅａｒｎｅｙ）等、Ｊ、　Ｉｎ＋ｍｕｎｏ１．．１２３
　、１５４８．１９７９）又はマウスミエローマ細胞系
ＰＡＩ　　（ストッカー（Ｓ　ｔｏｃｋｅｒ）等、ｔｌ
ｏｆｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　
Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ　。

第２１７１３号、１９８２年〕が挙げられる。

融合は、融合促進剤、例えば、必要に応じて紫外線で不
活性化した形態のセンダイウィルス又は他のパラミクソ
ウィルス、カルシウムイオン等の化学融合剤、表面活性
脂質、例えば、リゾレシチン及びとりわけエチレングリ
コール（ＰＥＧ）の存在下で行われる。特に、ミエロー
マ細胞を、分子量が１０００と４０００の間の約３０〜
６０％ポリエチレングリコールを含有する溶液中で、３
〜２０倍過剰の免疫された哺乳動物由来の肺臓細胞と融
合する。

融合後、細胞を選択培地中、例えば、ＴＫ又はＨ（Ｇ）
　ＰＲＴ陰性親ミエローマ細胞の場合ＨＡＴ培地中で再
懸濁及び培養する。この培地中では、ハイブリドーマ細
胞のみが生存する。この理由は、バイプリドーマが親ミ
エローマ細胞のように試験管内で成長及び複製する能力
と免疫された哺乳動物の抗体産生肺臓細胞由来のＨＡＴ
培地での生存に必須の１（ＧＰＩＩＴ又はＴＫ遺伝子を
合わせ持つからである。

ハイブリドーマ細胞のクローニングに適当な培地は、ダ
ルヘッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最少必要培地
、ＲＰＭ１１６４０培地等の標準培養培地で、必要に応
じて哺乳動物血清、例えば、１０〜１５％胎児牛血清を
補充したものである。特にフィーダー細胞、例えば、正
常マウス腹膜浸出液細胞、肺臓細胞、骨髄マクロファー
ジ等を、融合工程直後の細胞成長の初めに添加して、と
りわけ細胞密度が低い場合、成長因子等を提供すること
により、ハイブリドーマ細胞に栄養分を与え、そしてそ
れらの成長を支持する。マクロファージ又は単核細胞等
の食細胞を使用する場合、食細胞は、アミノプテリン処
理後に常に見出される失活ミエローマ細胞の残骸を一掃
するのに有効な役割を果たす。培地に一定の時間間隔で
選択培地を補充して、ミエロ一マ細胞がハイブリドーマ
細胞よりも大きく成長するのを防止する。

ハイプリドーマ細胞培養液の上澄み液を、特に酵素イム
ノアッセイ又はラジオイムノアッセイにより所望のモノ
クローナル抗体についてスクリーニング。陽性のハイブ
リドーマ細胞系を、例えば、限界希釈によるか、軟寒天
中で、とりわけ２回以上クローニングする。必要に応じ
て、ハイブリドーマ細胞を腹腔内注射及び腹水の採収に
より、動物、例えば、マウスを介して継代して、ハイプ
リドーマを安定化し且つ成長特性を向上させる。クロー
ン化細胞系を従来の方法で凍結してもよい。

本発明は、さらに、上記した方法により調製されるハイ
ブリドーマ細胞に関する。本発明のハイブリドーマ細胞
系は、遺伝的に安定であり、一定の特異性のヒルジンに
特異的なモノクローナル抗体を分泌し、そして解凍及び
再クローニングにより低温凍結培養から活性化できる。

好ましいものとしては、組換えヒジンに特異的なモノク
ローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞が挙げられ
る。特に好ましいものとしては、ヒルジン変形体Ｈｖ１
、とりわけ組み換えヒルジン変形体ＨＶＩ　（ｒＨＶｌ
　）に特異的なモノクローナル抗体を分泌するハイブリ
ドーマ細胞が挙げられる。又、それぞれ４０４９−８３
−１２．４１１４−９６−１．４１２０−３７−７及び
４１０２−２１−１４と称するハイブリドーマ細胞系も
好ましい。

これらの細胞系は、ユーロビアン・コレクション・オブ
・アニマル・セル・カルチャーズ（ＥｕｒｏｐｅａｎＣ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ａｎｉｍａｌ　　Ｃｅ
１ｌ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ（ＥＣ：ＡＣＣ）　　、即ち
、英国の５Ｐ４０ＪＧウイルツ、サリスヘリ、ポーショ
ン・ダウンのアプライド・ミクロバイオロジー・アンド
・リサーチ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ
ｙ＆　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）のピーエイチェルエスセンタ
ー（円ＩＬＳ　ｃｅｎｔｅｒ）に寄託された。これらは
、下記の表１に示した寄託番号により明示されそして確
認される。これらのモノクローナル抗体は、Ｍａｂ　４
０４９−８３−１２、　門へｂ　　４１１４−９６−１
　　、　ＭＡｂ　　４１２０−３７−７及びＭＡｂ　４
１０１−２１−１４と称するモノクローナル抗体を分泌
する。

（木頁以下余白） 略語：　ｒＨＶｌ　：組換えヒルジン変形体ＨＶＩＢＳ
Ａ：牛血清アルブミン ＫＬＨ：キーホールリンペットヘモグロビン 同様に好ましいものとしては、組換えヒルジン変形体Ｈ
ＶＩ　（ｒＨＶ１（ｒＨＶ１）に対する解離定数（ＫＤ
）が１．５　ｘ　１０−９Ｍ（ｍｏ＋／リットル）〜６
ｘ１０−′。Ｍの範囲であるモノクローナル抗体を分泌
するハイブリドーマ細胞が挙げられる。又、アミノ酸残
基４３及び４７又はアミノ酸残基６１及び６２を含む組
み換えヒルジン変形体ＨＶＩ　（ｒＨＶ１（ｒＨＶ１）
のエピドープを認識するモノクローナル抗体を分泌する
ハイブリドーマ細胞も好ましい。

又、本発明は、上記したハイブリドーマ細胞により分泌
されることを特徴とするヒルジン、とりわけ組換えヒル
ジンに特異的な新規なモノクローナル抗体及びそのよう
な抗体の誘導体、好ましくはそのようなモノクローナル
抗体自体に関する。

好ましいものとしては、ヒルジン変形体Ｈｖ１、とりわ
け組換えヒルジン変形体ＨＶＩ　（ｒｌｌＶ１（ｒＨＶ
１）が挙げられる。特に好ましいものとしては、ＩｇＧ
アイツタイブ、とりわけＩｇＧ１又はＩｇＧ２ｂアイソ
タイプである本発明のモノクローナル抗体が挙げられる
。

最も好ましいものとしては、αトロンビンに対するヒル
ジンの高凝血活性を中和する、即ち、ヒルジンの作用に
関して解毒活性を示す本発明のモノクローナル抗体が挙
げられる。

本発明のモノクローナル抗体の中和活性は、当該技術分
野において公知の方法、例えば、フェントン・アンド・
フェスコ（Ｆｅｎｔｏｎ　＆　Ｆａｓｃｏ）による凝固
アッセイ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓ、、虹、８０
９．１９７４）か、クロモゲン基質アッセイ、例えば、
クロモチムＴｌｌアッセイ（ヘーリンガー（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ）により測定できる。

とりわけ好ましいものとしては、組換えヒルジン変形体
ＨＶＩ　（ｒｔｌＶ１（ｒＨＶ１）　ニ対する解離定数
（ＫＤ）が１゜５　ｘ　１０−９Ｍ（ｍｏｌ／リットル
）　〜６　ｘ　１０−”Ｍの範囲であるモノクローナル
抗体が挙げられる。又、アミノ酸残基４３及び４７を含
む組換えヒルジン変形体＋１Ｖ１　（ｒＨＶ１（ｒＨＶ
１）のエピドープを認識するモノクローナル抗体も好ま
しい。さらに、Ｃ末端に近接する組換えヒルジン変異株
ＨＶＩ　（ｒＨＶ１（ｒＨＶ１）のエピドープ、特にア
ミノ酸残基６１及び６２を含むエピドープを認識するモ
ノクローナル抗体も好ましい。

とりわけ好ましいものとしては、上記したように、それ
ぞれ４０４１８３−１２（ＥＣＡＣＣ８８０８２５０４
）、４１１４−９６−１（ＥＣＡＣＣ８９０３２１０２
）、　４１２０−３７−７　（ＥＣ八へＣ８９０３２１
０３）及び４１０２−２１−１４（ＥＣＡＣＣ８９０３
２１０１）と称するハイブリドーマ細胞により分泌され
るそれぞれ１八ｂ　４０４９−８３−１２．１八ｂ　４
１１４−９６−１、ＭＡｂ　４１２０−３７−７及びＭ
Ａｂ　４１０２−２１−１４と称するモノクローナル抗
体が挙げられる。ＭＡｂ　４０４１８３−１２及びＭＡ
ｂ　４１２０−３７−７は、ヒルジンの抗凝固活性を中
和できる。ＭＡｂ　４０４９−８３−１２がヒルジン変
形体ｒＨＶ１の量の半分存在すると、二価の抗体である
ＭＡｂ　４０４９−８３−１２はヒルジンの抗凝固活性
を完全に中和する。

さらに、本発明は、ヒルジンの抗原決定基に対する特異
性を維持している上記した本発明のモノクローナル抗体
の誘導体に関する。好ましいものとしては、組換えヒル
ジン変形体ＨＶＩ　（ｒＨＶ１（ｒＨＶ１）に対する解
離定数（Ｋｌ＋）が１．５　ｘ　１０−９Ｍ（ｍｏｌ／
リットル）〜６　ｘ　１０−”Ｈの範囲である本発明の
モノクローナル抗体の誘導体が挙げられる。又、アミノ
酸残基４３及び４７又はアミノ酸残基６１及び６２を含
む組換えヒルジン変形体ＨＶＩ　（ｒＨＶ１（ｒＨＶ１
）のエピドープを認識する本発明のモノクローナル抗体
の誘導体も好ましい。とりわけ好ましいものとしては、
ＭＡｂ　４４０４９−８３−１２、１八ｂ　　４１１４
−９６−１　　、　ＭＡｂ　　４１２０−３７−７及び
ＭＡｂ　４１０２−２１１４が挙げられる。このような
誘導体の例としては、酵素、フルオレッセンスマーカー
、金属キレート、ケミルミネッセントマーカー、アビジ
ン、ビオチン等を有するモノクローナル抗体、又は放射
能標識モノクローナル抗体若しくは抗体断片の複合体が
挙げられる。

本発明の抗体複合体に使用する酵素としては、例えば、
西洋ワザビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファター
ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダー
ゼ、グルコアミラーゼ、カルボアンヒドラーゼ、アセチ
ルコリンエステラーゼ、リゾチーム、リンゴ酸デヒドロ
ゲナーゼ又はグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼが挙げられる。本発明のモノクローナル抗体と結
合する螢光マーカーは、フルオレセイン、螢光色素、ロ
ーダミン等である。ケミルミネッセントマーカーとして
は、例えば、アクリジニウムエステル類又はルミノール
が挙げられる。このような複合体では、抗体が直接又は
スペーサー又はリンカ−基を介して酵素又はマーカーに
結合されている。

金属キレート剤としては、例えば、エチレンジアミンテ
トラ四酢酸（ＥＤＴ八）、ジエチレントリアミン五酢酸
（ＤＰＴＡ）、Ｌ４，８．１１−テトラアザテトラデカ
ン、Ｌ４，８．１１−テトラアザテトラデカン−１，４
，８゜１１−四酢酸、１−オキサ−４，７，１２，１５
−テトラアザヘプタデカン−４，７，１２，１５−四酢
酸等が挙げられる。放射能標識モノクローナル抗体は、
例えば、放射活性ヨウ素（１２３Ｉ、　１２５ｉ、＋３
１１）、イツトリウム（９０ｙ）、テクネチウム（９９
′″Ｔｃ）等を含有している。

本発明の抗体断片としては、例えば、−価の断片Ｆａｂ
（Ｆａｂ−断片抗原結合）又はＦａｂ’及び二価の断片
Ｆ（ａｂ’）ｚが挙げられる。

本発明によるモノクローナル抗体及びその誘導体はそれ
自体既知の方法により調製され、この方法においては、
ヒルジン特異性モノクローナル抗体を分泌する上記で定
義したハイブリドーマ細胞を、試験管内又は生体内で複
製することを特徴とする。必要に応じて、得られるモノ
クローナル抗体を単離及び／又はそれらの誘導体に転化
する。

試験管内での複製は、例えば、ダルベツコ変性イーグル
培地（ＤＭＥＭ）又はＲＰＭ１１６４０培地で、必要に
応じて哺乳動物血清、例えば、牛胎児血清又は微量元素
及び成長維持補足剤、例えば、正常マウス腹膜浸出細胞
、肺臓細胞、骨髄マクロファージ等のフィーダー細胞を
補充したものである適当な培養培地中で行われる。

試験管内生産では、比較的純粋な抗体が調製でき、そし
て所望の抗体を多量に生産できるまでスケールアップが
可能である。組織培養条件下での大規模ハイブリドーマ
培養の手法は当該技術分野において公知であり、例えば
、エアーリフ１〜反応器又は連続攪拌反応器中での均一
懸濁培養、又は中空繊維、マイクロカプセル中、アガロ
ースマイクロビーズ又はセラミックカートリッジ上での
固定化又は捕捉細胞培養が挙げられる。

モノクローナル抗体を単離する場合、培養上清中の免疫
グロブリンを、まず、例えば、硫酸アンモニウムでの沈
澱、ＰＥＧ等の吸湿性物質を用いた透析、選択膜による
濾過等により濃縮する。必要によりそして／又は所望の
場合、濃縮抗体を、通常のクロマトグラフ法、例えば、
ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−
セルロース若しくはプロティン八を用いたクロマトグラ
フィー又はイムノアフィニティークロマトグラフィーに
より精製する。

又、生体内でハイブリドーマ細胞を複製することによっ
ても、所望のモノクローナル抗体を多量に得ることがで
きる。細胞クローンを、親細胞と組織適合する哺乳動物
、例えば、同系マウス内に注射して、抗体産生腫瘍を成
長させる。必要に応じて、動物に、炭化水素、とりわけ
ブリスタン（ｐｒｉｓｔａｎｅ）　（テトラメチルペン
タデカン）等の鉱油を、注射の前に十分供給する。−例
として、Ｂａｌｂ／Ｃマウス由来のハイプリトーマ細胞
を、必要に応じてプリスタンで前処理したＢａｌｂ／ｃ
マウスに腹腔内注射し、そして１〜２週間後にこれらの
マウスの腹水を採取する。所望のモノクローナル抗体を
、上記した従来法により体液から単離する。

本発明のモノクローナル抗体の複合体は、当該技術分野
において公知の方法により、例えば、上記した方法によ
り調製したモノクローナル抗体を、カップリング剤、例
えば、例えば、グルタルデヒド、過ヨウ素酸塩、Ｎ、Ｎ
’−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ−（ｍ−マレイミ
ドヘンジイルオキシ）−ザクシンイミド、Ｎ　−（３−
（２’　　−ピリジルジチオ〕−プロピオンオキシ）−
ザクシンイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルア
ミノプロピル）−カルボジイミド等の存在下で酵素と反
応させることにより調製される。アビジンとの複合体は
、同様に調製される。ビオチンとの複合体は、例えば、
モノクローナル抗体を、ビオチンＮ−ヒドロキシザクシ
ンイミドエステル等のビオチンの活性化エステルと反応
させることにより調製する。螢光マーカーとの複合体を
、カップリング剤、例えば、上記で列挙したものの存在
下で調製するか、イソチオシアネート、特にフオレッセ
インーイソチオシアネートとの反応により調製する。金
属キレートとの抗体複合体は、類似の方法により調製さ
れる。ケミルミネッセンスマーカー、例えば、アクリジ
ニウムエステルとの複合体は、モノクローナル抗体を活
性形態のマーカー、例えば、活性エステル誘導体と反応
させることにより調製する。

ヨウ素（＋２ｆｆＩ、　１２ＳＩ、＋３１１）で放射能
標識したモノクローナル抗体は、例えば、放射性ヨウ化
ナトリウム又はヨウ化カリウムと次亜塩素酸ナトリウム
、クロラミンＴ等の化学酸化剤か、ラクトペルオキシダ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ及びグルコース等の酵素
的酸化剤を用いて、自体公知のヨウ素化法により本発明
に準じてモノクローナル抗体から得られる。本発明によ
るモノクローナル抗体を、例えば、ジエチレン−トリア
ミン五酢酸（ＤＰＴ八）キレート化によりイ・ントリウ
ム（”Ｙ）にカップリングする。テクネチウム−９９ｍ
標識抗体を、リガンド交換法により、例えば、パーチク
ネート（Ｔｃ０４−）を第一錫溶液で還元し、還元した
テクネチウムをセファデックスカラム上にキレート化し
、そして抗体をこのカラムに附することによるか、直接
標識法、例えば、パーチクネート、ＳｎＣ］ｚ等の還元
剤、ナトリウム−カリウムフタレート溶液等の緩衝液及
び抗体をインキュベーションすることにより８周製する
。

ヒルジンに対する特異性を維持しているモノクローナル
抗体の断片、例えば、Ｆａｂ　、　Ｆａｂ　’　又はＦ
　（ａｂ“）２断片は、上記した自体公知の方法、例え
ば、ペプシン又はパパイン等の酵素での消化及び／又は
化学還元によるジスルフィド結合の開裂により調製した
抗体から得られる。本発明によるモノクローナル抗体及
びそれらの誘導体は、ヒルジンの定性測定及び定量測定
に有効である。

例えば、モノクローナル抗体又はそれらの誘導体は、ヒ
ルジン分子の抗原決定基とモノクローナル抗体のバラト
ープとの間の結合相互作用による公知のイムノアッセイ
、例えば、ラジオイムノアッセイ（Ｒ１八）、酵素イム
ノアッセイ、イムノフルオレッセンス、ラテックス凝集
若しくは赤血球凝集、ケミルミネッセンス、レーザー光
散乱又はエバネタセント光試験のいずれにも使用できる
。

本発明のモノクローナル抗体は、そのまま又は放射能標
識誘導体の形態でラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）に使
用できる。ＲｒＡのいずれの公知の変更態様、例えば、
液相（均質）ＲｒＡ、固相（不均質）ＲＩＡ、単−ＲＩ
Ａ又は二重（サンドインチ）ＲＩ八により、直接的又は
間接的（競争的）にヒルジン測定ができる。好ましいも
のとしては、適当なキャリヤー、例えば、ポリスチレン
、ポリプロピレン若しくはポリ塩化ビニル製ミクロタイ
タープレート又は試験管のプラスチック表面、ガラス若
しくはプラスチックビーズ、濾紙、デキストラン等、酢
酸セルロース又はニトロセルロースシート、磁気粒子等
に、ヒルジンに特異的なモノクローナル抗体、特にモノ
クローナル抗体ＭＡｂ　４０４９−８３−１２を塗布す
るサンドイッチＲＩＡが挙げられる。次にヒルジンを含
有する試験溶を添加し、そして最後にこの抗原とも反応
しそして例えば１２５Ｉにより放射性ラヘルされている
ポリクローナル抗体、例えばヒツジ抗−ヒルジンポリク
ローナル抗体を含有する溶液を添加する。試験溶液中の
ヒルジンの量は、結合したポリクローナル抗体の量に比
例し、そしてキャリヤーに結合した放射能を測定するこ
とにより定量する。ポリクローナル抗体は、第一キャリ
ヤー結合モノクローナル抗体とは異なるヒルジンのエピ
ドープを認識する本発明の第二の放射能標識されたモノ
クローナル抗体により置き換えることができる。

本発明によるモノクローナル抗体は、そのままで、又は
酵素イムノアッセイにおいては酵素に複合した誘導体の
形態で使用できる。このようなイムノアッセイとしては
、本発明による酵素標識モノクローナル抗体誘導体又は
本発明の抗体のエピドープを認識し且つそれを結合する
自体公知の酵素標識抗体を使用する試験法が挙げられる
。

エンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩ
ＳＡ）が好ましく、この方法においてはＲＩＡのために
前記したキャリヤーを本発明のモノクローナル抗体、好
ましくはＭＡｂ　４０４９−８３−１２によりコートし
、ヒルジンを含有する試験溶液と共に、酵素と結合した
前記のポリクローナル抗体と共にそして基質溶液と共に
インキュベートする。酵素基質反応により、例えば、色
の変化を生じ、眼又は光学測定装置により観察できるの
で、試験溶液中のヒルジンの量に比例している結合酵素
の量を測定できる。ポリクローナル抗体は、第一のキャ
リヤー結合モノクローナル抗体とは異なるヒルジンのエ
ピドープを認識する本発明の第二の酵素結合モノクロー
ナル抗体により置き換えできる。又、キャリヤーに本発
明によるモノクローナル抗体、特にモノクローナル抗体
ＭＡｂ　４０４！Ｊ−８３−１２をコートし、ヒルジン
を含有する試験溶液と共にインキュベーション後、上記
したポリクローナル血清と共にインキュベーションし、
そして最終的に、ポリクローナル血清の結合抗体を、そ
れを認識し且つ結合する酵素標識抗体により顕現し、そ
して結合タンパク質の量を上記した酵素基質反応により
測定するＥＬＩＳＡも好ましい。このような酵素標識抗
体としては、例えば、ホスファターゼ標識ヤギ抗ヒツジ
免疫グロブリンが挙げられる。

又、イムノドツトアッセイと称する酵素アッセイも好ま
しく、この方法においては、ヒルジンを含有する試験溶
液又は標準溶液を、例えば、ポリペプチドに対して高い
固有の親和性を有する微孔性キャリヤー、例えば、二ｌ
・リセルロース上にスポットし、前記試料の１個又は数
個のドツトを担持しているキャリヤーを、本発明のモノ
クローナル抗体、好ましくはモノクローナル抗体ＭＡｂ
　４０４９−８３−１２の溶液中でインキュベーション
し、次に、本発明のモノクローナル抗体を認識し結合す
る酵素標識第二抗体溶液中でインキュベーションし、そ
して最後に検出可能信号、例えば、着色物質を生じる酵
素基質溶液中でインキュベーションする。

このような酵素標識第二抗体としては、例えば、４−ク
ロロ−１−ナフトール等の適当な酵素基質を用いて顕現
できる西洋ワサビペルオキシダーゼと結合したウサギ抗
マウス免疫グロブリンが挙げられる。

本発明によるモノクローナル抗体は、免疫螢光試験にお
いて、そのままで又は螢光マーカーと結合した本発明に
よる誘導体の形態で使用できる。

このような免疫螢光試験には、本発明によるモノクロー
ナル抗体誘導体、例えば、フルオレセインと結合した誘
導体か、又は本発明のモノクローナル抗体のエピドープ
を認識及び結合する自体公知の螢光マーカー標識抗体を
使用する操作が含まれる。

類似の方法において、本発明のモノクローナル抗体は、
イムノケミルミネッセンス試験で、そのままで又はケミ
ルミネッセンスマーカーと結合した本発明による誘導体
の形態で使用できる。

又、ヒルジンの定性及び定量測定に関して上記で説明し
たモノクローナル抗体及びそれらの誘導体の用途には、
自体公知の他のイムノアッセイ、例えば、抗体被覆又は
抗原被覆ラテックス粒子を用いたラテックス凝集、抗体
被覆又は抗原被覆赤血球小体を用いた血球凝集、結合物
を電気又は光学信号に変換する抗体被覆光学繊維及び他
の直接作用イムノセンサーを用いたエバレッセンス光波
アッセイがある。

上記で説明したアッセイにおける本発明のモノクローナ
ル抗体及び／又はそれらの誘導体を適用することにより
、緩衝液、尿及び血漿中のヒルジンの存在の決定及び／
又はヒルジン濃度の測定ができる。緩衝液及び血漿にお
いては、ヒルジンを０．１〜１１００ｎ／ｍＩ！、の範
囲の濃度で測定できる。

上記アッセイは、例えば、非経口投与及び／又は局所投
与後の患者中のヒルジンの薬理動態の評価、さらに、ク
ローン化ヒルジン遺伝子を発現する細菌株の検出及びヒ
ルジンをヒル又は形質転換した細菌から単離するときに
種々の精製工程の追跡のために使用できる。

又、本発明は、抗凝固活性を中和する本発明のモノクロ
ーナル抗体、好ましくはＭＡｂ　４０４９−８３−１２
又はＭＡｂ　４１２０−３７−３　、及びその誘導体の
、ヒルジンに対する解毒剤としての使用に関する。すな
わち、過剰のヒルジンの抗凝固効果を達成される抗凝固
とは無関係にこれらの抗体の添加により正常化すること
ができる。すなわち、ヒルジンの抗血栓作用がバランス
されるであろう。哺乳動物に対する治療投与量は、患者
の状態及び投与形態に応じて、モノクローナル抗体自体
の場合、体重１　ｋｇ当たり約１　ｍｇと１０ｍｇとの
間であり、そして抗体誘導体の場合、０．１　ｍｇと１
０ｍｇの間である。

本発明のモノクローナル抗体及びその誘導体の解毒活性
は、当該技術分野において公知の従来からの試験、フェ
ントン・アンド・ファスコ（Ｆｅｎｔ。

ｎ＆　Ｆａｓｃｏ）の凝固アッセイ〔トロンボシス　リ
サーチ（Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓ、）により測定
できる。このアッセイでは、本発明の異る濃度のモノク
ローナル抗体を、ヒルジン、トロンビン及びフィブリノ
ーゲンとともにインキュベーションし、そして凝固時間
を測定する。αトロンビンによるクロモゲンの開裂を測
定する、クロモゲン基質を用いるアッセイも解毒活性を
測定するのに適当である。

又、本発明は、本発明のモノクローナル抗体及び／又は
その誘導体並びに必要に応じて他のモノクローナル又は
ポリクローナル抗体及び／又はアジュバントを含むヒル
ジンの定性的及び定量的測定用の試験キットに関する。

ラジオイムノアッセイ用の本発明による試験キットは、
例えば、コートされていないか又は本発明のモノクロー
ナル抗体によりコートされているキャリヤー、ヒルジン
に対して特異的なモノクローナルもしくはポリクローナ
ル抗体及び／又はその放射能標識された誘導体の場合に
よっては凍結乾燥又は濃縮されている溶液、標準ヒルジ
ン溶液、緩衝液、並びに必要に応じてポリペプチド及び
非特異的吸着及び凝集体形成を防止するための洗浄剤、
ピペット、反応容器、検量線、取扱説明書が含まれてい
る。

酵素イムノアッセイ用の本発明による試験キットには、
例えば、適当なキャリヤー、例えば、ミクロタイタープ
レート又はニトロセルロースシート、ヒルジンに又はヒ
ルジンを認識する第一抗体に特異的な本発明のモノクロ
ーナル抗体の及び酵素標識モノクローナル抗体又はポリ
クローナル抗体の必要に応じて凍結乾燥するか濃縮した
溶液、固体又は溶解した形態の酵素基質、標準ヒルジン
溶液、緩衝液並びに必要に応じてポリペプチド及び洗浄
剤、ピペット、反応容器、検量線、色スケール表、取扱
説明書等が含まれている。

又、本発明は、ヒルジンに対して特異的な本発明のモノ
クローナル抗体であってヒルジンの抗凝固活性を中和す
るもの及び／又はその誘導体を、治療学的に効果的な量
で、固形又は液体、有機又は無機製薬キャリヤーととも
に、又はそれらと混合した形態で含有する製剤に関する
。

非経口的投与用製剤が好ましい。筋肉内、皮下又は静脈
内投与用製剤としては、例えば、必要に応じて凍結乾燥
又は濃縮した製剤から、使用の少し前に調製した等張性
水溶液又は懸濁液が挙げられる。製剤は、殺菌してもよ
く、そして、例えば、成分を保存、安定化、湿潤、乳化
するためのアジュバント、浸透圧調節塩、緩衝剤及び／
又は粘度を調節する化合物、例えば、ナトリウムカルボ
キシセルロース、デキス１−ラン、ポリビニルピロリド
ン又はゼラチンを含有していてもよい。上記の製剤は、
当該技術分野において公知の方法、例えば、従来の混合
、溶解又は凍結乾燥により調製され、そして約０．０１
％〜約５０％の活性成分を含有する。注射用製剤を処理
し、アンプル又はバイアルに充填し、そして当該技術分
野において公知の方法により無菌状態でシールする。・ １゛：介入ＥＬｒＳＡ（実施例４゜５参照）第１図にお
いて、阻害因子の濃度（ｎｇ／ｍ　１　）を、ミクロタ
イタープレートに結合したＭＡｂの百分率（Ｂ／Ｂｏ　
ｘ　１００％）に対してプロットしである。符号二＊は
ｒＨＶｌとＭＡｂ　／１０４９−８３−１２を示し、・
はｒＨＶＩペプチド５２〜６５とＭＡｂ　４０４！Ｊ−
８３−１２を示し、△はｒＨＶｌとＭＡｂ　４１０１２
１−１４を示し、そして口はｒＨＶ１ペプチド５２〜６
５とＭＡｂ　４１０２−２１−１４を示す。

２゛ニーヒルジンモノクローナル　　の第２図において
、ＭＡｂ濃度（μｇ　／　ｍｊ２）を、凝固時間（秒）
に対してプロットしである。

符号：・はＭＡｂ　４０４９−８３−１２を示し、Δは
ＭＡｂ４１１４−９６−１を示し、Ｏは４１２０−３７
−７を示し、口はＭＡｂ　４１０２−２１−１４を示し
、＊はｒＨＶｌを伴わないＭＡｂ４０４９−８１１２を
示す。

〔実施例〕

以下に本発明の詳細な説明するが、本発明はこれらの実
施例に限定されない。

朋 ＨＡＴ　：ピポキサンチン／アミノプテリン／チミジン ＨＰＬＳ　：高速液体クロマトグラフィーＭＥＳ　：　
２−　（Ｎ−モルホリノ〕エタン硫酸ＰＢＳ　ニリン酸
緩衝液 ＰＥＧ：ポリエチレングリコール ｒＨＶｌ：組み換えヒルジン変形体ＨＶＩＲＴ：室温 災施±１＝　ヒルジンモノクローナル　　の１１遣 １．１　　皿久■免炎坑旅 ヒルジン−ヒルジン架橋を避けるために、組換えヒルジ
ン変形体ＨＶＩ　（ｒＨＶｌ　；プラントルゲン／チハ
ガイギー社製）のＮＨ２基をジーｔｅｒ　ｔ−ブチル−
ジカーボネート（ｔ　　（ＢＯＣ）２０　、フル力（ｆ
ｌｕｋａ）　）により保護した後、カルボジイミド法に
よりｒＨＶｌを牛血清アルブミン（ＢＳＡ；フル力）に
カプリングする。ヒルジンＣ末端領域は、ヒルジン分子
の表面に露出している酸性残基に冨んでいる〔チャング
（Ｃｈａｎｇ）　、ＦＥＢＳレター、１６４　、３０７
．１９８３）ので、ガルボジイミドカプリング（ヒルジ
ンアミノ基の保護の後）により、主に、ヒルジンのＣ末
端領域をキャリヤータンパク質に結合するので、ヒルジ
ンのＮ末端領域に対する免疫応答を優先的に引き起こす
と思われる。力プリング操作は下記のようにして行う。

水２０μ２にｒＨＶｌ　　１ｍｇを熔解したものに、０
．４Ｍ　）リエチルアミン５Ｉｎ、、Ｎ、Ｎ−ジメチル
ホルムアミド５０μ！及びｔ　　（ＢＯＣ）　ｚｏを２
μ！添加する。３７°Ｃで２時間保持後、水５０μ！と
酢酸エチル２００μｌを添加して、未反応ｔ　−（ＢＯ
Ｃ）　２０を抽出する。抽出を２回繰り返す。下相を乾
燥させ、そして０．１　Ｍ　ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４，７
５）　　２５０μ！を、ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍ１５０μ
ｌ及びＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）−カルボジイミド塩酸塩（２０ｍｇ／　ｍｊ２）　
１００　ｔｔ　１．とともに添加する。室温で２時間後
、混合物を乾燥し、そして９０％トリフルオロ酢酸（Ｔ
ＦＡ）　２００　μｌを添加して、カプリング後のアミ
ノ基の保護をはずす。室温で１０分間保持後、ＴＦＡを
蒸発させ、そしてＰＢＳ［８，５ｇＮａｃＩ、１．２８
　ｇ　ＮａｚＨＰＯ４’　２　ＨｚＯ，０，４３６ｇＮ
ａＨｚＰＯ４Ｈ２Ｈ２Ｏ；水１０１００Ｏ添加〕を１ｍ
ｊ２添加する。この溶液を、免疫に使用する前にＰＢＳ
中で長時間透析する。

ｔ−（ＢＯＣ）　２０によるｒＨＶｌのアミノ基の保護
の程度は、逆相ＨＰＬＣにより判断する。

処理したｒＨＶｌは、主に、未処理ｒＨＶ１よりも保持
時間の長い一つのピークを溶離する。主にピークが一つ
であることは、ｒＨＶ１アミノ基の保護が全ての分子に
関して類似していることを示している。実際に、より多
くのｔ−（ＢＯＣ）２０を添加し、それに付随して反応
時間を延長しても、ｉＪｔプロフィールには何ら影響が
なく、反応が既に完了していることを示唆している。

ＴＦＡ処理によりアミノ基を脱保護し、そして長時間透
析後、この複合体を５ＤＳ−ＰＡＧＥ（ソジウムドデシ
ルサルフエートポリアクリルアミドゲル電気泳動）によ
り分析する。ｒ　Ｉ−Ｉ　Ｖ　１のＢＳＡへのカプリン
グは、散在バンドがＢＳＡよりも遅い速度で移動してい
ることから分かる。

ｒＨＶｌのそれぞれアミノ酸４０〜６５とアミノ酸５２
〜６５を示している合成ペプチド（「それぞれｒＨＶＩ
ペプチド４０〜６５及びｒＨＶ１ペプチド５２〜６５と
称する）を当該技術分野において公知の方法により合成
する〔リンク（Ｒｉｎｋ）、テトラヒドロンレターズ（
Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）　、２Ｂ、
３７８７．１９８７〕。各ｒＨＶ１ペプチド１ｍｊ２の
５０ｎ＋ｊ！水溶液を、ＫＬＨ〔カルビオケム（Ｃａｌ
ｂｉｏｃｈｅｍ）社製キーホール・リンペット・ヘモシ
アニン）５ｍｇの５０Ｏｎ＋４２ＰＢＳ溶液に添加する
。次に、グルタルデヒド（２５％）〔フル力（Ｆｌｕｋ
ａ）　〕を添加し、そして混合物を室温で２時間インキ
ュベーションする。

その後、Ｌ−リジン（１００ｍｇ／ｍ１（ｒＨＶ１）　
５０　ｕ　４２を添加して反応を停止する。

Ｃ末端ヒルジンＨＶＩ及びＨＶ３ペプチドのトロンビン
阻害作用は、例えば、マオ（Ｍａｏ）等〔バイオケミス
トリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、２７．８１７
０．１９８８）とクステナンスキー（Ｋｒｓ　ｔｅｎａ
ｎｓｋｙ）等〔トロンビン・リサーチ（Ｔｈｒｏｍｂ、
　Ｒｅｓ、）、皿、１３７．１９８８）により示されて
いる。トロンビン阻害活性に必要な最少Ｃ末端アミノ酸
残基は、５６〜６５である。

１．２　　々の　　Ｕを　いた ５匹のＢａｌｂ／ｃ雌マウス（４〜６週令）から成る４
つのグループに、それぞれ（グループ１）ＢＳＡ結合ｒ
ＨＶ１（１５μｇ／注射）、（グループＩ［）［、Ｈ結
合ｒＨＶ１ペプチド４０〜６５（１０μｇ／注射）、（
グループｌ［）　ＫＬＨ結合ｒＨＶ１ペプチド５２〜６
５（１０μｇ／注射）、そして（グループ■）天然ｒＨ
Ｖｌ（未カプリング、アジュバント中）（５０μｇ／注
射）を用いて３系列の注射を行う。第一の注射剤は、フ
ロイントの完全アジュバント〔シイフコ（Ｄｉｒｃｏ）
　）の０．１ｍｊ２と１　：１の比で混合したＰＢＳに
添加したそれぞれの免疫抗原０．１ｍｊ２からなってお
り、５０μｌを腹腔注射し、そして１５０　μｌを皮下
注射する。第２（１４日目）と第３（３０日目）系列の
注射では、完全フロイントのアジュバントの代わりに不
完全フロイントのアジュバントを用いる。最後の注射か
ら１週間後、血清を採取し、実施例１．３．１及び実施
例１．５に記載のエンザイムリンクドイムノソルベント
アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定する。

１．３　　　々の血・′の拭　のためのアッセイ種々の
血清における抗体タイターを、実施例１゜５に記載する
ミクロタイタープレートを被覆するためにｒＨＶｌを用
いて、間接１？ＬＩｓＡにより、最後の免疫の１週間後
に測定する。希釈バイプリドーマ上清の代わりに、ＰＢ
Ｓ−）ウィーン（０，１％）で希釈した対応する血清１
００　μβを抗原で被覆したミクロタイターウェルに添
加する。対照として、免疫前の血清（前免疫血清）の抗
体タイターを測定する。

血清タイター、即ち、対照（前免疫血清）よりも３倍高
いシグナルを与える最後の血清希釈は、下記の通りであ
るニ グループ グループ■（天然ｒＨＶ１）　　：　　　　３ｘｌＯ’
最も高いタイターは、免疫抗原としてのＢＳＡに結合し
たｒＨＶｌを用いて得られ、一方、未結合ｒＨＶ１の免
疫応答は非常に低い。

１、３．２　　六　且・の坦１　のための登人白・ＥＬ
ＩＳＩＩ血清における交差阻害の測定のために用いられ
る競合的ＥＬＩＳＡについては、下記の実施例４．５に
説明されている。精製にＡｂの代わりに、Ｐｕｓ−１−
ウィーン（０．１％）に１　　：２０００（グループＩ
及び■）、１　　：１５００（グループ■）及び１：２
００（グループ■）で希釈した各血清５０μｌを使用す
る。

得られるＩＣ５Ｇ値、即ち、プレートへの血清抗体の結
合の５０％を阻害するのに必要な前インキュベーション
に使用する化合物（ｒＨＶｌ、ｒＨＶ１ペプチド５２〜
６５又はｒＨＶ３）の濃度を、表２に示す。

（本頁以下余白） １１　金的ＥＬＩＳＡアッセイでは、溶液中で全ての血
清がｒ　Ｈ　Ｖ　１に結合する。合成ｒＨＶ１ペプチド
５２〜６５又は４０〜６５で免疫したマウスの血清は、
天然ｒＨＶ１と交差反応する。このことは、ｒ　Ｈ　Ｖ
１ペプチド抗血清により認識される決定因子は、適切な
コンフォメーションで天然分子に容易にアクセスできる
ことを示唆している。これらのデータは、Ｃ末端セグメ
ントがヒルジン分子の表面に露出しているとする以前の
考察を裏付けている〔チャンク（Ｃｈａｎｇ）　、ＦＢ
ＢＳレター、１６４工、３０７、１９８３　）。一方、
Ｃ末端ｒＨＶ１ペプチド（グループ■及び■）で免疫し
たマウスのみが、ｒＨＶ１ペプチド５２〜６５により１
００％阻害され得る血清を有し、一方、分子全体（グル
ープ■及び■）で免疫されたマウスの血清は交差反応し
ない。

１、３．３　　　２　の漠　のための凍７　アッセイヒ
ルジンの抗凝固活性を中和するための種々の血清の能力
を測定するために用いた凝固アッセイについては、下記
の実施例８に記載されている。

精製ＭＡｂの代わりに、１：１０又は１；１００に希釈
したマウス血清をｒＨＶｌとともにインキュベーション
する。

結果を、凝固時間の倍数、即ち、ｒ　ＨＶ　１の不存在
下での凝固時間に対するｒＨＶｌの存在下のａ置時間の
比として表３に示す。

（本頁以下余白） 血清は、トロンビンに対するｒＨＶｌの抗凝固活性を中
和するための能力において著しい差を示す。グープＩ由
来のマウスの血清のみが完全な中和性能を示し、一方、
他の血清の中和活性は低い（グループ■）か、中和活性
がない（グループ■、■）。グループ■のマウスの血清
タイターが低いので、グループ の産生のために選択される。

１、４散金プ旦上ユニ上 ２か月の休息期間後、ＰＢＳ　（２００　μりに溶解し
たＢＳＡ−ｒＨＶ１複合体７５μｇ（グループ■）又は
ＫＬＨ−ｒＨＶ１ペプチド複合体８０μｇ（グループ■
及び■）でマウスを腹腔内追加免疫する。３〜４日後、
マウスを殺し、肺臓細胞をマウスミカローマ細胞系Ｓｐ
２１０−八ｇ１４〔シュルマン（Ｓｈｕｌｍａｎ）等、
ネーチャー、１７６、２６９、１９７８　）か、ＰＡＩ
　　Ｃストッカー（Ｓｔｏｃｋｅｒ）等、ホッフマンー
ラロッチェ・リサーチ・ディスクロージャー（Ｈｏｆｆ
ｍａｎｎ　−ＬａＲ。

ｃｈｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ）第
２１７１３．　１９８２号〕と、ＰＥＧ４０００（メル
ク社製）を用いて、本来のケーラー（Ｋｏｅｈｌｅｒ）
及びミルスティン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）法〔ガルフｙ　
　（Ｇａｌｆｒｅ）等、ネーチャー、２６６、５５０　
、１９７７〕の変法により融合し、そして細胞を、ＩＩ
ＡＴ培地〔ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）　：
ｌの入ったミクロタイタープレートに分配する。２〜４
週間後、増殖したハイブリドーマの入ったウェルを、実
施例１、５で説明するＥＬｒＳＡにより特異的モノクロ
ーナル抗体に関して試験する。

クリーニング 増殖したハイブリドーマを、間接エンザイムリンクドイ
ムノソルヘントアッセイ（Ｅｌ、ＩＳＡ）より抗ヒルジ
ン抗体の存在に関して試験する。

ミクロタイタープレート〔ダイナチク（Ｄｙｎａｔｅｃ
ｈ））を、（　ｉ）被覆緩衝液（５０ｍＭ炭酸緩衝液ｐ
ｌ＋９。

６　　：　４７７ｍｇＮａ２ＣＯ：＋　、８７９　ｍｇ
Ｎａｌｌｃｏ：＋、１．８　ｍｆＮａＮｚ（０．５Ｍ）
、３００ｍ／．の１１□０を追加’ｌｒ１：＋ｒＨＶｌ
（３１ｚｇ　／　ｎｕ）の溶液、又は（ｉｉ）被覆緩衝
液中でアビジン（１０μｇ　／　ｎ＋４２）　と複合体
を形成するビオチニル化ｒ　ＨＶ　１　（５μｇ　／　
ｍり（実施例４．１参照）の溶液によりウェル１個当た
り１００ｍｊ２で被覆する。キャリヤー分子に結合させ
たｒＨＶｌを用いた追加の被膜を生じさせて、プラスチ
ックウェルへの吸着後にヒルジン分子のコンホーメーシ
ョンが変化しないようにする。湿潤チャンバーにおいて
、プレートを一晩４°Ｃでインキュベーションし、ＰＢ
Ｓ　−１−ウィーン（０，１％）（１ｍ１２　）イーン
−２０、サーバ（Ｓｅｒｖａ）　、１０００ｍ　４２　
ＰＢＳ）で５回洗浄する。

ウェルを乾燥させ、ウェル１個当たり２００μｌのＰＢ
Ｓ−ＢＳＡ（１％）（１ｇのＢＳＡ　　、　３　　ｍｊ
２　のＮａＮ５（０，５Ｍ）、１００ｍｊ２のＰＢＳ添
加）で満たし、室温で２時間インキュベーションし、Ｐ
ＢＳ−トウィーン（０，１％）で５回洗浄する。その後
、ＰＢＳ　−）ウィーン（０，１％）中に１　：２に希
釈したハイブリドーマ細胞上清２００　μ２を、各ウェ
ルに添加する。室温で２時間インキュヘーション後、プ
レートをＰＢＳ　−トウイーン（０，１％）で５回洗浄
する。次の工程で、ＰＢＳ−トウィーン（０，１％）中
に１：１５００に希釈したマウスＩｇＧに対するアルカ
リ性ホスファターゼアフィニティー精製したヤギ抗体（
Ｋｉｒｋｅｒｇａｒｄ　＆ＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ）１００　ｕ　４２を、各ウェルに添加する。

プレートを、室温で１，５時間インキュベーションし、
ＰＰＢ５−１−ウィーン（０，１％）で５回洗浄する。

最後に、ウェル１個当たり１５０　μ！の基質溶液〔ジ
ェタノールアミン緩衝液Ｉ　Ｂ当たり　ｐ−ニトロフェ
ニルホスフェート（シグマ）１　ｍａ　、　ｐＨ９−８
：　９７ｍｇジェタノールアミン（メルク社製）、６ｍ
ｆｆ１のＮａＮ５（０，５Ｍ）、１００　ｍｇのＭｇＣ
Ｉｚ　　・６１１２０、濃ＨＣＩでｐ１１９．８に調整
、＋１□０を１０００ｍ　ｌ添加）を添加し、５０μ！
のＮａＯＩＩ（３Ｍ）を添加すことにより反応を停止し
、暗所において、室温で２時間インキュヘーション後４
０５　ｎｍで光学密度を読み取る。

抗ヒルジンモノクローナル抗体を分泌する４種のハイブ
リドーマ細胞系を、さらなる研究のためにヒルジンに対
する親和性が高いことに基きそれらの群内で選択し、ヨ
ーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カ
ルチャーズ（ＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　
　ｏｆ　　Ａｎｉｍａｌ　　Ｃｅ１ｌ　　Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅｓ）（ＥＣＡＣＣ）に寄託した。命名と寄託番号を表
４に示す。

これらのハイブリドーマにより分泌されるモノクローナ
ル抗体を、接頭辞ｒＭＡｂ　Ｊ及び、それぞれのハイブ
リドーマの番号で示し、例えば、ＭＡｂ４０４９−８３
−１２とする。

１．６ハイブリドーマの　二　び支り里選択したハイブ
リドーマ細胞を培養において増殖させ、−８０°Ｃで凍
結し、液体窒素中にいれておき、その後、再活性化する
。細胞を、限界希釈法（Ｇｏｄｉｎに、　Ｊ、　Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　、　３９．　２８５．１
９８０〕によりクローニングし、ブリスタン（ｐｒｉｓ
ｔａｎｅ）で感作したＢａｌｂ／ｃマウスにおいて腹水
を生成することにより増やした（実施例２．１参照）。

腹水の製造のために、雌のＢａｌｂ／ｃマウス（２０〜
２５ｇ）ｌ：チアファーム・シッセルン（Ｔｉｃｒｆａ
ｒｍ　５ｉｓｓｅｌｎ）、スイス］を、腹腔内注射によ
り０．３ｍｊ２のブリスタン油（アルドリッチ）で前処
理する。

１〜３週間後、マウスに２回目のプリスタン（ｏ、２ｍ
ｆｆ１ｉ、ｐ、）注射し、０．２ｍｊ２のＰＢＳに添加
した２Ｘ１０６ハイブリドーマ細胞を同時に接種する。

８〜１０日後、得られる腹水を採取し、８００　　ｇで
遠心分離し、−２０°Ｃ又は−８０’Ｃで保存する。

解凍した腹水を、３０，０００　ｇで１時間遠心分離し
て清澄化する。脂質を含有する上相を除去した後、タン
パク質濃度を測定し、ＰＢＳで１０〜１２ｍｇ／　＋ｎ
ｊ！に調整する。０°Ｃで０．９容の飽和硫酸アンモニ
ウムを滴下することにより免疫グロブリンＧ分画（■ｇ
Ｇ）を沈澱させる。１時間後、２２，０００　ｇで１時
間遠心分離すことにより、ＩｇＧ分画をペレット化する
。このペレットを、５０ｍＭ　ＮａＣｌを含有する２０
ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液に溶解し、同じ緩衝液により
４　”Ｃで一晩透析する。ＤＥ５２ジエチルアミノエチ
ルセロース（ワットマン）のカラムにより陰イオン交換
クロマトグラフィーを行って、ＩｇＧ分画をさらに精製
する。試料を、２０ｍＭ　）リス−〇ＣＩ　（ｐＨ７，
９）により１　　：　２（ｖ／ｖ）に希釈して、最終濃
度２５ｍＭ　ＮａＣｌとした後、ゲル１田β当たり１０
ｍｇのタンパク質をカラムに供給する。溶出は、塩化ナ
トリウム濃度を２５ｍＭから２００　ｍＭ（直線勾配）
に増加することによりなされる。一般的に、ＭＡｂは約
８０ｍＭ　ＮａＣｌで溶離される。分画を、ＰＢＳによ
り４°Ｃで一晩透析し、−７０°Ｃで保存する。ＳＤＳ
　−ＰＡＧＥ及び等電点電気泳動により純度を評価する
。純度は９０％以上である。

２、ｇｉ工”　　　でのハイブリドーマの　Ｊｕハイブ
リドーマ細胞を、１０％牛脂児血清（ＦＣ：Ｓ）を含有
するＲＰＭＩ　１６４０培地（セロメト（Ｓｅｔｏｍｅ
ｄ）　）において、生理的温度（約３７”Ｃ）で、最終
細胞密度が１ｍｊ２当たり５　ｘ　１０５〜１０″細胞
となるまで培養することにより、いずれかの細胞系の前
培養を得る。前培養物全体をヘルコ培養容器に入れ、新
鮮なＲＰＭＩ　１６４０培地／１０％ＦＣ５で、総容積
１５００ｍｌに調整する。この培養物を、５％ＣＯ２の
もとで、３０ｒｐｍで約３７°Ｃの温度で２〜３日間攪
拌後、ＲＰＭ１１６４０／１０％ＦＣ３で総容積３００
０ｍ　ｆｌに希釈し、そしてさらに７〜１０日間攪拌す
る。この後、細胞の９５％が死亡する。培養液を１００
０ｘ　　ｇで２０分間４°Ｃの温度で遠心分離する。こ
の上清を、無菌状態下で、孔径０．２μｍのフィルター
を通して濾過する。０°Ｃの温度で、０．９容量の飽和
硫酸アンモニウムをゆっくりと滴下することにより、粗
免疫グロブリンを沈澱させる。この沈澱を、実施例２．
１で説明したようにして精製する。

抗ヒルジンモノクローナル抗体のクラス及びサブクラス
を、バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社製酵素結合免
疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）キットで測定する。

モノクローナル抗体ＭＡｂ４０４１８１１２、ＭＡｂ４
１１４−９６−１及びＭＡ　ｂ４１０２−２１−１４は
クラスＩｇＧ１”ｉｌ’あり、そし７ＭＡ　ｂ４１２０
−３７−７　ハＩｇ　Ｇ２ｂテある。

抗ヒルジンモノクローナル抗体により認識されるヒルジ
ンエピドープの地図を、（ｉ）ｒＨＶｌ、ｒＨＶｌ＠似
体及び組み換えヒルジン変形体ＰＡ（ｒＨＶ３）を用い
る競合的ＥＬＪＳＡ実験、及び（１ｊ）抗原抗体複合体
のタンパク質分解により作成する。

４．１　ビオチニルＰＪｒＨＶ１の”ＪＡｕ火冗−ｒＨ
Ｖｌを、まず、ｒＨＶｌに対するビオチンのモル比を低
く、して、ビオチン−Ｘ−Ｎ−ヒドロキシザクシンイミ
ドエステルでビオチニル化後、下記の方法でアビジンに
結合する。

酢酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ６，０）２００　ｕ　ｌ　
ニ０．５　ｍｇノｒＨＶ１を添加したものを、ｒ　ＨＶ
　１に対するビオチンのモル比が３．２：１　となるよ
うに、４０μｐエタノール／水（１：１、Ｖ／Ｖ）に溶
解したビオチン−Ｘ−Ｎ−ヒドロキシザクシンイミドエ
ステル〔カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））　１
００１１ｇと混合する。この混合物を、室温で２０分間
インキユヘーションする。その後、ＰＢＳを２６０ｍ１
２添加し、溶液を一晩４°ＣでＰＢＳにより透析する。

逆相肝ＬＣによるビオチニル化ｒ　ＨＶ　１のクロマト
グラフィーでは、未変性ｒ　ＨＶ　１に相当する１本の
ピークの他に、いくつかのピークが現れる。

このような不均一性は、実際、ヒルジンに対するビオチ
ンの比が低いことによるものと思われ、このことは変性
のための１分子当たり利用できる４個のアミノ基の一部
分のみを誘導化するのに都合がよい。

各アミノ基のビオチニル化の程度は、さらに、還元的Ｓ
−カルボキシメチル化後後アクロモバクタ・リテイクス
（八ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　ｑ現μ肘）〔ワコ−（
Ｗａｋｏ）　）由来のりシルエンドペプチダーゼによる
〔ハース（Ｈ４ｒｓ）、メソッズ・イン・エンザイモロ
ジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）　、
旦、１９９．１９６７）（Ｓ　−ＣＭ−ｒＨＶ１（ｒＨ
Ｖ１））か又はトリプシンによる〔ワーシングトン（Ｗ
ｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）変性ｒＨＶ１及び未変性ｒＨＶ
１の消化、並びに逆相ＨＰＬＣによる断片の分離により
定量的に測定される。簡単に説明すると、０．１　ｍｇ
のビオチニル化ｒＨＶ１（又はｒＨＶ１（ｒＨＶ１）を
２００１！のトリス緩衝液（０，５Ｍ　、ｐ＋＋８．４
）　（５Ｍグアニジン塩酸塩と２ｍＭＥＤＴＡ（ＲＭ緩
衝液）を補給したもの〕で稀釈する。

この溶液を５０°Ｃで３０分間加熱後、３７°Ｃまで冷
却する。ＲＭ緩衝液１００μｌにＤＬ−ジチオトレイト
ール（ＤＤＴ）をｌ　ｍｇ溶解したものを添加し、この
混合物を３７°Ｃで２時間インキュベーションする。室
温まで冷却後、Ｒ旧妥衝液１００　μｌにイオド酢酸を
２ｍｇ／８解した溶液を添加し、混合物をさらに３０分
間室温でインキｊ−ヘーションする。（ＮＨ４）ＩＩＣ
Ｏ３（５０ｍＭ、　ｐｔ１８．０）を溶離緩衝液として
用いて、Ｇ２５セフアデツクスカラム（ファーマシア）
により、過剰の試薬をゲル濾過により取り除く。次に、
カポキシメチル化ｒ　ＨＶ　ｌを含有する分画をトリプ
シン消化（Ｌ−１−ｐ−ｌ−シルアミド−２−フェニル
エチル−クロロメチルケトン−トリプシン、ワーシント
ン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を添加することによる）
、又はりシルエンドペプチダーゼ消化に附する。ｒ　Ｈ
Ｖ　１に対するトリプシン又はリシルエンドペプチダー
ゼの比は、それぞれ、１〜５０（Ｗ／Ｗ）及び１〜１０
（ｗ／ｗ）である。３７°Ｃで３時間保持後、同量の酵
素を再び添加し、そしてさらに３時間インキュベーショ
ンを行う。−２０°Ｃで混合物を凍結することにより反
応を停止する。タンパク質分解断片（１〜２μｇ）の分
離を、Ｃ−１８カラムを用いたＩＩＰＬＣにより行う。

この勾配は下記の通りである：溶媒Ａ　、０．１％（ｖ
／ｖ）無水トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）水溶液；溶媒Ｂ
　、０．１％（Ｖ／Ｖ）無水トリフルオロ酢酸のアセト
ニトリル溶液。溶離は、直線勾配による。即ち、溶媒Ｂ
を３３分間で３０％から８０％に増加する。流量は１ｍ
！７分である。ペプチドは、２１０　ｎｍでの吸光度を
測定することにより検出される。ペプチドの確認は、上
記で説明したアミノ末端分析によりなされる〔チャング
、アナリテイカル・バイオケミストリー　（八ｎａｌｙ
ｔｉｃａ　ｌ　　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、皿、　５４２　
　、１９８８）　　。

変性の程度が各トリプト断片の消失の程度と直接相関し
ているものと仮定することにより、変性の百分率は、未
変性ｒＨＶ１に対する変性ｒＨＶ１からの各ピークの面
積の減少から計算される。

これらのデータは、さらに、トリプシン消化物のアミノ
末端定量分析（即ち、トリプト断片のＨＰＬＣ分離なし
）により確認される。Ｎ末端アミノ酸■ａｌｌ、Ｌｙｓ
２７及びＬｙｓ３６は、３０％〜５０％の程度に十分変
性される。Ｌｙｓ４７とＰｒｏ４８との間のアミド結合
を開裂するりジルエンドペプチダ−ゼ（トリプシンでは
開裂しない）により、Ｌｙｓ４７の変性の程度を測定で
きる。後者は３０％と４０％との間である。

１ｍ！！、の重炭酸ナトリウム緩衝液（０，１Ｍ　、ｐ
ｌ＋８゜５）に１４０　ｎｍｏｌのｒＨＶｌを加えたも
のに１４０　ｇｍ。

１の無水コハク酸又は無水酢酸を添加することにより、
ｒ　ＨＶ　ｌのアミノ基のアセチル化及びサクシニル化
を行う。室温で３０分間保持後、Ｌ−ＩＪリジン添加（
２ｍｇ）することにより反応をブロックし、そしてその
混合物をＰＢＳにより透析する。

ｒＨＶｌのＳ　−ＤＡＢＩＴＣ（４−Ｎ、Ｎ−ジメチル
アミノベンゼン−４゛−イソチオシアネート−２゛−ス
ホン酸）による誘導体化は以下のようにして行う。

ｒ　ＨＶ　１　（２ｍｇ、凍結乾燥）をＳ　−ＤＡＢＩ
ＴＣ熔液（５０ｍＭ重炭酸ナトリウム溶液中１　ｍＭ、
ｐＨ８，３）１　ｍｆｆに溶解する。誘導体化ば３７°
Ｃで行う。２００　μｇ　（４００μｇ）アリコツトを
３０分、１．５時間、４時間及び７時間の間隔で取り出
し、直ちに使い捨てＧ−２５カラム（ファーマシア製Ｐ
Ｄ−１０，５０ｍＭ重炭酸アンモニウムで平衡化）に通
して、過剰の試薬を除去する。誘導体化ｒＨＶ１はゲル
濾過中に目に見えるので、検出器の補助なしで１．３〜
１．４　ｍｌ！採取する。採取した溶液の吸光度（４６
５ｎｍ）を記録し、そして変性の程度（ｒＨＶｌの１モ
ル当たりの５−ＤＡＢＩＴＣのモル数）は、Ｓ　−ＤＡ
ＢＩＴＣ基のモル吸光係数（２８，０００）を基準とし
て計算する（チャンク（Ｃｈａｎｇ）　、　Ｎ　、　Ｊ
、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、肝、３１１１．１９８９
）。

５−ＤＡＢ−ジアゾニウムを以下のようにして合成する
。２０ｍｇの４−ジメチルアミノ−４゛−アミノアゾベ
ンゼン−２′−硫酸を、炭酸ナトリウム３　ｍｇを含有
する水１ｍｊ２に可溶化する。溶液を氷上に置き、１０
０　μｌの水に５　ｍｇのＮａＮＯ７溶解した溶液を添
加する。この混合物を３００μ！の冷ＨＣＩ　（４Ｎ）
と混合し、３０〜４５分間氷上で攪拌する。混合物のｐ
Ｈを、５Ｎ　ＮａＯＨを用いて５．０に調整する。ジア
ゾニウム誘導体を暗所において一２０’Ｃで保存する。

ｒ　ＨＶ　１　（炭酸ナトリウム緩衝液３９０Ｉｆｆｉ
中２００ｐｇ　、　ｐＨ８，８，０，６７Ｍ）の変性を
、６５０　ｎｍｍｏｌの５−ＤＡＢ−ジアゾニウムを添
加するごとにより行う。

氷上での３時間のインキュベーション後、ゲル濾過（上
記参照）により除去する。Ｓ　−ＤＡＢＩＴＣ又は５−
ＤＡＢ−ジアゾニウムによるヒルジンの反応性残基の変
性の程度の定量測定は、変性ヒルジンの還元性Ｓ−カル
ボキシメチル化後のｖ８タンパク質分解により行う（上
記参照）。断片をＨＰＬＣで分離し、変性残基を含有す
るものを４５０　ｎｍの吸光度により検出する。それら
を採取しアミノ酸配列決定により確認する。

（ＮＨ４）ＨＣＯ３緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ８，０，２
ｍＭ　ＥＤＴＡ補充）９０μｌに熔解した７０Ｍｇの天
然ｒＨＶ１を、２０Ｍｇ　（２０μＩ！、）のスタフィ
ロコッカス・アウレウス（針叶鯉圏並匹巨烈μ狙）ａＶ
８のプロテアーゼ（シグマ社）と混合し、３７°Ｃで３
０分、２時間又は４時間インキュベーションする。５μ
ｌのジイソプロピルフルオロボスフェート（０，０１Ｍ
）（シグマ社）を添加して反応を停止する。消化の程度
は、逆相ＨＰＬＣ（実施例４．６参照）か、アミノ末端
分析〔チャンク（Ｃｈａｎｇ）　、Ａｎａｌｙｔｉｃａ
ｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、１７Ｌ、５４２．１９８Ｂ参
照〕及び５Ｏ３−ＰＡＧＥにより評価する。

４．４　　人　ｒＨＶ１ペプチドの８゜％配列５２〜６
５．４０〜６５．２９〜３８及び１〜１５を有する合成
ｒＨＶ１ペプチドを、当該技術分野において公知の方法
により合成する（リンク（Ｒｉｎｋ）、テトラヘドロン
レター（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒ）、訃
、３７８７．１９８７）。

４．５−韓澄立琲Ｕ鍾− 抗ヒルジンモノクローナル抗体により認識されるｒＨＶ
ｌの抗原性決定基を、ミクロタイクープレートを用いた
競合的ＥＬＩＳＡ試験により検討する。

この際、ミクロタイタープレートは、ＭＡｂ４０４９−
８：３−１２の場合にはアビジンに結合したビオチニル
化ｒＨＶ１で被覆されており、一方、他の３種のｒＨＶ
ｌについてはｒＨＶｌで被覆されたミクロタイタープレ
ートを使用する。ｒＨＶｌを用いて得られる阻害百分率
を、合成ｒ　ＨＶ　１ペプチド、化学変性ｒＨＶ１、ス
タフィロコッカスｖ８プロテアーゼで部分的に消化した
天然ｒＨＶｌ等の上記した方法により調製したｒＨＶ１
類似体及び組み換えヒルジン変異株ＰＡを用いて測定し
た阻害百分率と比較する（ｒＨＶ３　　；ドント（Ｄｏ
ｄ　ｔ）等、パイオル　ケミ　ホッペーセイラ−（Ｂｉ
ｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

Ｈｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ）　、３６７　、８０３．１
９８３）。

二段階競合ＥＬＩＳＡを下記のように行う。アビジンと
複合したビオチニル化ｒＨＶ１（実施例４．１参照）又
はｒＨＶｌを被覆溶液に添加したものを、ミクロタイタ
ープレート上に吸収させ、そして４°Ｃで一晩インギュ
ベーション後、固体支持体上に残存している遊離部位を
、ＢＳＡの１％溶液とのインキュベーションによりブロ
ックする。その後、プレートをＰＢＳ−）ウィーン（０
，１％）で洗浄する。

各精製抗ヒルジンＭＡｂ（４０〜４００　ｎｇ／　ｎｕ
）５０　ｔｔ　Ｐ。

を、増加した量のｒ　ＨＶ　１又は類似体（上記参照）
を含有する標準溶液６５０　μｌとともにインキュベー
ションする。４°Ｃで一晩インキユヘーションしく８２
） た後、各ウェルに混合物２００μ！を添加して更に１時
間インキユヘーションする。その後、ウェルを５回洗浄
し、アルカリ性ホスファターゼ（１／１５００希釈）に
連結したヤギ抗マウス抗体をウェル１個当たり１００　
μ！添加して１．５時間保持する。

洗浄１ｋ、基質ｐ−ニトロフェニルホスフェ−１・（ジ
ェタノールアミン緩衝液中１　ｍｇ／　ｍｊ！、ｐｌ（
９゜８）を、ウェル１個当たり１５０μ！添加する。固
相に結合した抗原と反応する抗体の量に比例する色の変
化を、４０５　ｎｍで監視する。全ての試料につき３回
ずつ行う。

Ｂ／Ｂ　、χ１００（結合パーセント）を存在する阻害
因子の濃度に対してプロットすることにより典型的な阻
害曲線（Ｂ　、は抗体に添加するｒＨＶＩなしで測定し
た吸光度を示し、そしてＢは種々の濃度のｒＨＶｌを用
いた場合の測定吸光度を示す）が得られる。ＩＣ５ｏは
、固相への抗体の結合の５０％を阻害する抗原濃度を表
す。ｒｃｓｏは、４つのパラメータ算定曲線１１−（Ｄ
−Ｃ）／１＋（ｚ／Ａ）ｂ）　＋’Ｃ（式中、Ｕは標準
の投与量２に関する期待応答である）に基づくカーブ・
フィッティング・プログラム・エンラフイック−（ｃｕ
ｒｖｅ　ｆｉｔｔｉｎｇ　ｐｒｏｇｒａｍｍ　ＥＮＺＦ
ＩＴＴＥＲ）（ＲＪ、　Ｌｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗ　
、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）を用いて計算する。４つのパラ
メータは、曲線の形状を示し、Ｄ及びＣは上漸近線と下
漸近線を与え、そして八は中漸近線の投与量である〔カ
ーブ（Ｒａａｂ）、クリソ　ケム（ＣＩｉｎ、　Ｃｈｅ
ｍ、）　、２９．１７５７．１９８３　）。

ミクロタイタープレートへ結合している抗原に対する抗
体の結合の５０％を阻止するｒ　ＨＶ　ｌの濃度を表す
ＴＣｓｏ値は、上記したカーブ・フィッティング・プロ
グラムによって計算される。

ＭＡｂの解離定数（ＫＤ）は、フリゲート（Ｆｒｉｇｕ
ｅｔ）等〔ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッ
ド（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ）　、７
７．３０５．１９８５）の方法により計算される。

結果を第１図及び表５に示す。

ＭＡ　ｂ４０４９−８３−１２の場合、ｒ　ＨＶ　１に
関するＩＣ５ｏ値は４ｎｇ／ｍｆｆ１である。ＭＡ　ｂ
４０４９−８１１２は、下限約１ｎｇ／ｍｊ２のレベル
までのｒＨＶｌを検出する。このＭＡｂの解離定数（Ｋ
Ｏ）は、６ｘ　１０”Ｍである。他の３種のＭＡｂは親
和性が小さい（ＫＩｌ値：　１．５〜７　ｘ　１０−９
Ｍ）けれども、ｒＨＶｌと交差反応する。

ＭＡ　ｂ４０４９−８３−１２の場合、ｒＨＶｌとｒ　
ＨＶ１配列のほとんどをカバーする４種のｒＨＶ１合成
ペプチド（残基５２〜６５．４０〜６５．２９〜３８及
び１〜１５）との間には何ら交差結合は見出されない。

さらに、ｒＨＶｌの還元と、ジスルフィド結合の開裂に
よりｒＨＶｌの３次元構造を破壊するＳ−カルボキシメ
チル化とは、ＭＡｂの結合を完全に防止する。このこと
は、ＭＡ　ｂ４０４９−８３−１２は、天然のｒＨＶ１
分子にのみ存在し且つペプチドにより模倣され得ない不
連続コンフォーメーション依存エピドープを認識するこ
とを示唆している。

「フィンガー（ｆｉｎｇｅｒ）　Ｊ　ｊｉｌ域を代表す
るｒＨＶ１ペプチド２９〜３８との交差反応の不存在は
、可能なエピドープとしてこの領域を除外する。但し、
線状ペプチドは、分子のこの部分の天然コンフォメーシ
ョンとは大きく異なる。

一方、他の３種のＭＡｂは、Ｃ末端ペプチド４０〜６５
と５２〜６５の両方を認識し、天然分子のものと比較し
て、Ｓ−カルボキシチル化ｒＨＶ１に対する親和性はそ
れよりも高いか、同等である。

残基Ｖａｌｌ及びＬｙｓ２７のみを修飾するＤＡＢＩＴ
ＣによるｒＨＶ　１の処理は、ＭＡ　ｂ４０４９−８３
−１２の結合を著しく減少する。Ｓ　−ＤＡＢｒＴＣｒ
　ＨＶ　１を、室温で１０分間９０％ＴＦ八へより処理
するとき、Ｖａ　１１の位置での修飾アミノ末端は開裂
するが、ＭＡｂの完全な結合は修復しない。このことは
、ｒＨＶｌのＮ末端はＭＡ　ｂ４０４９−８３−１２に
より認識されるエピドープには含まれないことを示唆し
ている。これは、ｒ　Ｉ−Ｉ　Ｖ　１ペプチド１〜１５
との交差反応がないことによっても確認される。一方、
他の３種のＭＡｂば、未変性ｒ　ＨＶ　１よりも５−Ｄ
ＡＢＩＴＣにより変性されたｒＨＶｌをよく認識する。

５−ＤＡＢ−ジアゾニウムによるｒＨＶｌの処理は、主
にＴｙｒ３及びＴｙｒ６３を修飾し、一方、ビオチン−
Ｘ−Ｎ−ヒドロキシーサクシンイミドは主にＮ末端Ｖａ
　１１を修飾する。両方の処理は、ＭＡ　ｂ４０４９−
８３−１２の結合にほとんど何ら影響を及ぼさず、ｒＨ
ＶｌのＮ末端とＣ末端の残基は、ＭＡ　ｂ４０４９−８
３−１２の結合には関与しないことを示唆している。

正に帯電したアミノ基を中性基に転化するｒＨＶ１のア
セチル化はＭ　Ａ　ｂ　４０４９−８３−１２の結合に
何ら影響を及ぼさず、一方、代わりに負の帯電を導入す
るｒ　ＨＶ　１のサクシニル化はこのＭＡｂの結合を著
しく減少させる。サクシニルデヒド及びＳ　−ＤＡＢＩ
ＴＣでの処理のみがｒＩ］■１へのＭＡｂ４０４９−８
３−１２の結合を防止するので、これらの試薬を用いた
修飾により、ｒＨＶｌのアミノ残基の一つが直接関与す
るのではなく、このＭＡｂの結合に影響を及ぼす分子の
コンフォメーションの変化が引き起こされるものと考え
られる。

４種の抗ヒルジンＭＡｂのいずれも、両方のヒルジン変
形体間の相同性が８０％を超えるにもかかねらず、ｒＨ
Ｖ３を認識しない〔ドツト（Ｄｏｄｔ）等、Ｂｉｏｌ、
　Ｃｈｅｍ、　Ｈｏｐｐｅ−５ｅｙｌｅｒ、、３６７　
、８０３．１９８３）。

ＭＡｂにより認識されるエピドープは、ｒＨＶｌに特異
的であると思われる。

最後に、プロテアーゼｖ８による天然ｒＨＶ１の消化は
、主にｒＨＶｌのＣ末端セグメン１〜、即ち、Ｇｌｕ４
３及びＧ１ｕ６１の後を開裂する。ＭＡｂ４０４９−８
３−１２の場合、０．５時間及び２時間処理したｒＨＶ
ｌの交差反応性は８０％から４％に減少し、一方、Ｇ　
Ｉ　ｕ４３−　Ｇ　Ｉ　ｙ４４結合及びＧ］ｕ６２−Ｇ
１ｕ６３結合の９７％及び５０％が同時に開裂する。さ
らに、ｒＨＶｌをｖ８プロテアーゼで４．５時間消化し
、そしてｒＨＶ１断片１〜４３及び４４〜６１に対応す
るＨＰＬＣビークを採取し、乾燥し、緩衝液で再懸濁す
ると、ＭＡ　ｂ　４０４９−８３−１２の結合はなんら
観察されない。これらの結果は、Ｃ末端領域が完全に開
裂すると、ＭＡｂにより認識されるエピト−プのよく規
則化された構造が破壊されることを示している。ｒＨＶ
１ペプチドに対して生成した他のＭＡｂの結合性に対す
る■８蛋白質分解の強い影響も、とりわけＭＡ　ｂ４１
１４−９６−１の場合観察される。

リシルエンドペプチダーゼによるｒＨＶｌの消化は、９
０分後にＬ　ｙ　５４７−Ｐ　ｒ　ｏ４Ｂ及びＬｙｓ３
６−Ａｓｎ３７の完全開裂を生しさせる。この後、交差
反応性は、ＭＡ　ｂ４０４９−８３−１２の場合、１４
％に低下するが、他のＭＡｂの場合はとんど影響が認め
られない。

消化 モノクローナル抗体とタンパク様抗原との間の複合体の
形成は、とりわけ抗原抗体接触に関与する領域において
、抗原のタンパク質分解開裂速度を減少させる〔ジエマ
ーソン及びビーターソン（Ｊｅｍｍｅｒｓｏｎ　＆　Ｐ
ａｔｅｒｓｏｎ）、５ｃｉｅｎｃｅ　、、２３２　、１
００１．１９８６）。従って、タンパク質分解の作用は
、ｒＨＶｌと抗ヒルジンモノクローナル抗体との間に生
成する複合体に関して測定する。

２３　ｔｔ　ｇ　（３，２μｍｏ１（ｒＨＶ１）のｒＨ
Ｖｌに、各抗ヒルジンモノクローナル抗体３１５　μｇ
　（２，１μｍｏ１（ｒＨＶ１）を添加する。１５分間
室温でインキュベーション後、７μｇのｖ８プロテアー
ゼ又は２．５　μｇのりシルエンドペプチダーゼを添加
する。この混合物（総容量二８０μりを３０分間又は２
時間３７°Ｃでインキュベーションする。反応は、混合
物を一２０℃で凍結することにより停止する。対照は、
（ｉ）抗ヒルジンＭＡｂなしでのｒＨＶｌの消化、（ｉ
ｉ）非特異的ＭＡｂの存在下でのｒＨＶｌの消化及びｒ
ＨＶｌの不存在下での抗ヒルジンＭＡｂの消化である。

タンパク質分解断片（２，７μｇ）の分離は、下記の勾
配を用いた逆相ＨＰＬＣによりなされる：溶媒Ａ、０゜
１％（ｖ／ｖ）無水トリフルオロ酢酸水溶液；溶媒Ｂ、
０．１％（Ｖ／ν）無水トリフルオロ酢酸のアセトン／
水（６：　４　、ｖ／ｖ）溶液。溶離は、溶媒Ｂが３０
分で２０％から８０％に増加する直線勾配を用いて行う
。流量は、１ｍ１１分である。ペプチドは、２２０　ｎ
ｍでの吸光度を測定することにより検出される。ペプチ
ドの同定は、アミノ酸分析とアミノ末端分析により行う
（実施例４．１参照）。

ｒ　ＨＶ　１　／　ＭＡ　ｂ４０４９−８３−１２複合
体を２時間ｖ８タンパク質分解すると、ペプチド１〜４
３．４４〜６１及び４４〜６５に相当するＨＰＬＣピー
クがクロマトグラムから完全に消失するが、対照ではも
はや検出されない未消化ｒＨＶ１に相当するピークは大
きく増加する。このことは、ＧＩｕ４３はこのＭＡｂの
存在によって防止されるが、Ｃ，］ｕ６１のあとの開裂
は対照の場合と同程度に生じることを明示している。こ
の場合、開裂は完全ではなく、未消化ｒＨＶ１がクロマ
トグラムに現れる。明らかに、ＭＡ　ｂ４０４９−８３
−１２は、ＧＩｕ４３とＬｙｓ４７を含むＮ末端コアー
領域におけるｒＨＶｌのエピドープを認識する（下記参
照）。一方、ｖ８タンパク質分解を他のＭＡｂの一つと
複合したｒＨＶｌを用いて行うとき、ペプチド６２〜６
５．４４〜６１及び１〜６１に相当するピークはクロマ
トグラムから消失し、一方、ペプチド４４〜６５に相当
するピークは著しく増加する。このことは、開裂はＧｌ
ｕ４３の後で生じるが、Ｇｌｕ６１の後では生じないこ
とを示している。又、これらのＭＡｂを、ｒＨＶＩの代
わりに、それぞれｒ　ＨＶ　１ペプチド４０〜６５及び
５２〜６５と複合させると、ＧＩｕ６１の後の開裂がな
いことも観察される。これらのデータは、これらのＭＡ
ｂの結合領域がｒＨＶｌのＣ末端付近、とりわげ残基６
１〜６２の付近に位置していることを示唆している。

これらの結果は、更に、リシルエンドペプチダーゼを用
いてｒＨＶｌ−ＭＡｂ複合体のタンパク質分解の程度を
測定することによって確認される。

ＭＡｂ４０４１８３−１２に結合したｒＨＶｌは、酵素
との６時間のインキュベーション中のタンパク質分解か
ら十分保護される。この結合ｒ　ＨＶ　１は、未処理ｒ
ＨＶ１と同じ保持時間で一つのピークとして溶離するが
、未保護ｒ　ＨＶ　１はペプチド４８〜６５及び１〜４
７に相当する２つのピークで溶離する。

従って、Ｌｙｓ４７の後の開裂は、ＭＡｂの結合により
完全に防止されることが結論できる。

一方、ＭＡｂ　４１０２−２１−１４がＰ　ＨＶ　１に
結合するとき、タンパク質分解は対照のように生しる。

４．７　　二重打　サンドイッチＥＬＩＳへエピドープ
の地回作製を下記に説明する二重抗体サンドイッチＥＬ
ＩＳＡに基づく実験により完成し、抗ヒルジンＭＡｂが
重複エピドープを認識するかどうかを決定する。

ミクロタイタープレートを、炭酸ナトリウム緩衝液（５
０ｍＭ、　ｐＨ９，６）中で調製した０、５　μｇ／ウ
ェルの精製抗ヒルジンで被覆し、４°Ｃで一晩インキユ
ヘーションする。ブロッキングと洗浄工程（ＢＳＡ１％
とＰＢＳ　−）ウィーン０．１％）の後、ＰＢＳ−トウ
イーン（０，１％）（０〜１００　ｎｇ／ウェル）中で
調製したｒＨＶｌを濃度を増加して結合したＭＡｂに添
加し、室温で１時間インキュベーションする。

洗浄後、ビオチニル化第二抗ヒルジンＭＡｂをプレート
（０，５μｇ／ウェル）に添加し、２時間インキュベー
ションする。ＭＡｂのビオチニル化は、バイエル（Ｂａ
ｙｅｒ）等〔メソッズ・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）、奴、３０８．１９７９）に
記載されているのと実質的に同様に行う。ビオチン−Ｘ
−Ｎ−ヒドロキシーサクシンイミドエステル（１００　
ｐ　ｆｉ　ＤＭＳＯ中２００　μｇ）を、５　ｍｇの精
製ＭＡｂを５ｍ　４２　ＰＢＳ溶液（ｐＨ７，０）　（
モル１モル比１３　：　１）に添加する。４°Ｃで４時
間保持後、混合物をＰＢＳ中で長時間透析する。次に、
洗浄後、１００μ！のアルカリ性ホスファクーゼ結合ス
トレプタビジン（１：　２５００に希釈）を、温度で１
．５時間添加及びインキュベーションする。洗浄後、基
質を添加し、そして異なる時間間隔で４０５　ｎｍでの
吸光度を測定する。

この測定は、基質の添加１５分後に開始する。

結果を表６に示す。

（来夏以下余白） 他の３種のＭＡｂのいずれかと結合したＭＡｂ４０４１
８３−１２は、０．２〜２０００ｇ／ｍＩ！、の濃度範
囲で、投与量に依存した態様でヒルジンに結合できる。

これらの結果は、ＭＡｂ４０４１８３−１２により認識
されるエピドープは、他のＭＡｂにより認識されるエピ
ドープとは異なることを示している。

一方、ＭＡ　ｂ４１１４−９６−１　、ＭＡ　ｂ４１２
０−３７−７及びＭＡ　ｂ４１．０２−２１−１４は、
組み合わせて使用したときｒＨＶｌと結合することはで
きない。このことは、それらが重複エピドープを認識す
ることを明らかに示している。さらに、同一のＭＡｂを
対（ＭＡｂｌ　＝ＭＡｂ２）で使用することにより行う
対照はなんら繰り返しエピドープを示さない。

αトロンビンと複合体を形成したｒＨＶｌへの抗ヒルジ
ンＭＡｂの結合を、以下で説明するサンドイッチＥＬＩ
ＳＡにより試験する。

ミクロタイクープレートを、抗トロンビンＭＡｂ　ＥＳ
Ｔ６（０，６μｇ　／ウェル；バイオスコツト（Ｂｉ。

５ｃｏｔ）　、ニシンハラ、英国）で被覆する。４°Ｃ
で一晩インキユヘーションし、ＢＳＡ　（１％）でフ゛
口・シフし洗浄したあと、プレートを、室温で２時間、
ＰＢＳ−ＢＳＡ（０，１％）中で、α］〜ロンビン（０
，０５μｇ／ウェル、３００ＯＮＩＨ単位／　ｍｇ　；
　ＣＲＲラボラｌ−リーズ）とともにインキュベーショ
ンする。プレートをＰＢＳ−）ウィーン（０，１％）で
洗浄し、ｒ　ＨＶｌをＯ〜１μｇ／ウェルの濃度範囲で
添加し、そして１時間インキュベーションを行う。洗浄
後、ビオチニル化ＭＡ　ｂ４０４９−８３−１２を添加
しく０．２μｇ／ウェル）、１時間インキュベーション
を行う。

次に、洗浄後、１００μｇのアルカリ性ホスファターゼ
結合ストレプトアビジン［１／２５００希釈、カルビオ
ケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）　）を添加して１．５時
間後、基質で洗浄する。陰性対照の他に、陽性対照を、
未修飾ｒＨＶ１の代わりにビオチニル化ｒＨＶ１を添加
することにより調製する。これはアビジン複合体で検出
されるので、αトロンビンへのｒＨＶｌの結合を確認す
る（この対照では、ＭＡｂは添加しない）。

４種の抗ヒルジンＭＡｂのいずれも、αトロンビンと複
合体を形成したｒＨＶｌへは結合できない。アルカリ性
ホスファターゼ複合アビジンにより明らかにされるビオ
チニル化ｒ　ＨＶ　１を陽性対照として使用して、ｒＨ
Ｖｌが実際にαトロンビンと複合することを確認する。

ｒＨＶｌは緩衝液又は生体液、例えば、尿、血漿等中で
、捕捉抗体としての特異的モノクローナル抗体ＭＡ　ｂ
４０４９−８３−１２と第二標識抗体としてのアフィニ
ティー精製抗ヒルジンヒツジ血清（スピナー等、Ｊ、　
Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　、　８７．７９．
１９８６）を用いた定量的二重抗体ザンドイッチＥＬＩ
ＳＡで測定できる。その生来のコンホーメーションを有
する遊離ｒＨＶ１のみがこのアッセイで測定され、一方
、αトロンビンヘ一旦結合したｒＨＶｌは測定されない
。

ミクロタイタープレートを、被覆緩衝溶液中ＭＡ　ｂ４
０４９−８３−１２（１０ｐｇ　／　ｍｊり　１００　
ｔｔ　ｌで被覆し、湿潤チャンバー中で４°Ｃで一晩イ
ンキユヘーションし、ＰＢＳ　−）ウィーン（０，１％
）で５回洗浄する。ウェルを乾燥させ、ウェル１個当た
り２００μｌのＰＢＳ　−ＢＳＡ　（１％）で満たし、
室温で１〜２時間インキヱベーションし、ＰＢＳ−トウ
イーン（０，１％）で５回洗浄する。ｒＨＶｌの標準溶
液（即ち、ＰＢＳ　−トウィーン（０，１％）中０　　
；０．１９；０．３９　；　０．７８　；　１．５６　
；　３．１２　、６．２５　；　１２．５　、２５．０
　、１００、Ｏｎｇ／ｍ　１２　）をウェル１個当たり
１００　μｌ添加し、試料をＰＢＳ　−）ウィーン（０
，１％）で相応に希釈する。希釈物を室温で２時間イン
キュベーションし、ＰＢＳ　−１−ウィーン（０，１％
）で５回洗浄する。次に、ビオチニル化ヒツジ抗ヒルジ
ンポリクローナル抗体（５μｇ　／　ｎｕ）をウェル１
個当たり１００μ！添加する。室温で２時間インキュベ
ーションの後、試料をＰＢＳ−）ウィーン（０，１％）
で５回洗浄し、アビジン−アルカリ性ホスファターゼ複
合体（ＰＢＳ−トウイーン（０，１％）で１／２５００
希釈）を添加する。

試料を室温で９０分インキユヘーションし、ＰＢＳ　−
トウイーン（０，１％）で洗浄する。酵素を１５０μ！
の基質溶液（ｐ−ニトロフェニルホスフェートＩｍｇ／
ｍｌのジェタノールアミン緩衝液）とともに、暗所にお
いて室温で１５〜３０分間インキュベーションすること
によりプレートの発色を行う。３Ｍ　ＮａＯＨ５０μｌ
を添加して反応を停止し、光学密度を４０５　ｎｍで読
み取る。

検出の直線範囲は、ｒＨＶｌの０．２〜５０ｎｇ／　ｍ
ｇの間である。

失旌炎ユニｒＨＶ１用ＥＬＩＳＡのＵ上実施例６で説明
したＥＬＩＳＡの試験キットには下記のものが含まれて
いる。

塩化ポリビニルミクロタイタープレート５μｇのｒＨＶ
ｌを含有する標準溶液２ｍ４２ＰＢＳ　−トウィーン（
０，１％）　３００　ｍ１ＰＢＳ　　−ＢＳＡ（１％）
３００ｍ　ｊ２検量線 色強度スケール 取扱説明書 実施例８：ｊｉヒルジンモノクローナル−のｎ■ 抗ヒルジンＭＡｂを、試験管内で、フェントン・アンド
・ファスコ（Ｆｅｎｔｏｎ　＆　Ｆａｓｃｏ）により記
載されている凝固活性〔トロンボシス・リサーチ（Ｔｈ
ｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓ、）　、４．８０９．１９７
４）を用いて、αトロンビンに対するヒルジンの抗凝固
活性を中和する能力について試験する。簡略に説明する
と、種々の濃度のｒ　ＨＶ　Ｉ　（０〜８５ｎＭ、０〜
６００　ｎｇ／　ｍ１（ｒＨＶ１）とともに、増加する
濃度の精製ＭＡｂ５０μ℃を１０分間インキユヘーショ
ンする。次に、新たに調製したαトロンビン溶液（０，
１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．０１ＭＣａＣＩ２及び０．６％
（ｉｙ／ｖ）ポリエチレングリコール６０００を補充し
た０、０１Ｍイミダゾール緩衝液（ｐｌ＋７．４）中２
．４　ｔｔｇ　／　ｍｊ２．６７ｎＭ：ｌを添加し、３
７°Ｃで１分間保持後、３５０μ！の予め温めておいた
フィブリノーゲングレードＬ　（３，２ｍｇ／　ｍｊ２
、カビ・ビトラム（Ｋａｂｉ　Ｖｉｔｒｕｍ）　）を添
加する。凝固時間を、アメラング・コアギュロメータ（
Ａｍｅｌｕｎｇ　ｃｏａｇｕｌｏｍｅｔｅｒ）ＫＣＩＡ
中で３７°Ｃの温度で測定する。ｒＨＶｌの不存在化で
対照試験を行う。実験によっては、増加する濃度のＭＡ
ｂを添加するに先立ち、ｒＨＶｌをαトロンビンととも
に１分間インキュベーションする。

結果を第２図に示す。Ｍ　Ａ　ｂ　４０４９−８３−１
２は、ｒＨＶｌを完全に中和できる。凝固時間が無限大
である８５ｎＭのヒルジン濃度（ｌ−ロンビンに対して
ヒルジンが小過剰である場合に相当する）でさえも、ヒ
ルジンの抗凝固剤活性は、等モル濃度のＭＡ　ｂ　４０
４９−８３−１２結合部位（約５〜１０μｇ／ｍｉりに
より完全に中和される。さらに、既にαトロンビンと複
合体を形成したｒＨＶｌに大過剰のＭＡｂ　４０４９−
８３−１２　（１００μｇ　／　ｍｊりを添加すること
により、トロンビン酵素活性を部分的に回復することが
できる。又、ＭＡ　ｂ４１２０−３７−７　もｒ　ＨＶ
■の活性を中和できる。但し、ＭＡ　ｂ４１２０−３７
−７では、ｒＨＶｌを完全に中和するのに必要とする抗
体濃度はＭＡ　ｂ４０４９−８３−１２よりも１０倍高
い。

【図面の簡単な説明】

第１図は、阻害物質濃度とミクロタイタープレートに結
合したＭＡｂの百分率との関係を示すグラフであり、 第２図はＭＡｂ濃度と凝固時間との関係を示すグラフで
ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒルジンに特異的なモノクローナル抗体を分泌する
   ハイブリドーマ細胞の製造方法であって、適当な哺乳動
   物を免疫原性ヒルジン複合体で免疫し、前記哺乳動物の
   抗体産生細胞を連続細胞系の細胞と融合し、融合で得た
   ハイブリッド細胞をクローニングし、そして所望の抗体
   を分泌する細胞クローンを選択することを特徴とするハ
   イブリドーマ細胞の製造方法。 ２．哺乳動物をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に連結し
   たヒルジンで免疫することを特徴とする請求項１に記載
   の方法。 ３、哺乳動物をキーホールリンペットヘモシアニン（Ｋ
   ＬＨ）に連結したヒルジンで免疫することを特徴とする
   請求項１に記載の方法。 ４、免疫される哺乳動物がマウスであり、そして連続細
   胞系がマウスミエローマであることを特徴とする請求項
   １又は代３に記載の方法。 ５、免疫される哺乳動物がＢａｌｂ／ｃマウスであり、
   そして連続細胞系がマウスミエローマＳｐ２／０−Ａｇ
   １４であることを特徴とする請求項１〜４に記載の方法
   。 ６、免疫される哺乳動物がＢａｌｂ／ｃマウスであり、
   そして連続細胞系がマウスミエローマＰＡＩであること
   を特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法
   。 ７、哺乳動物を免疫原性組換え複合体で免疫することを
   特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。 ８、ヒルジン変形体ＨＶＩに特異的なモノクローナル抗
   体を分泌するハイブリドーマ細胞を製造するための請求
   項１〜６のいずれか１項に記載の方法において、哺乳動
   物を免疫原性ヒルジン変形体ＨＶＩ複合体で免疫するこ
   とを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載のハ
   イブリドーマ細胞の製造方法。 ９、哺乳動物を免疫原性組換えヒルジン変形体ＨＶ１（
   ｒＨＶ１）複合体で免疫することを特徴とする請求項８
   に記載の方法。 １０、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法により
   製造されるハイブリドーマ細胞。 １１、請求項８に記載の方法により製造されるハイブリ
   ドーマ細胞。 １２、請求項９に記載の方法により製造されるハイブリ
   ドーマ細胞。 １３、４０４９−８３−１２（ＥＣＡＣＣ８８０８２５
   ０４）と称するハイブリドーマ細胞。 １４、４１１４−９６−１（ＥＣＡＣＣ８９０３２１０
   ２）と称するハイブリドーマ細胞。 １５、４１２０−３７−７（ＥＣＡＣＣ８９０３２１０
   ３）と称するハイブリドーマ細胞。 １６、４１０２−２１−１４（ＥＣＡＣＣ８９０３２１
   ０１）と称するハイブリドーマ細胞。 １７、請求項１０に記載のハイブリドーマ細胞により分
   泌されることを特徴とするヒルジンに特異的なモノクロ
   ーナル抗体。 １８、請求項１１に記載のハイブリドーマ細胞により分
   泌されることを特徴とするヒルジン変形体ＨＶ１に特異
   的なモノクローナル抗体。 １９、請求項１２に記載のハイブリドーマ細胞により分
   泌されることを特徴とする組換えヒルジン変形体ＨＶ１
   （ｒＨＶ１）に特異的なモノクローナル抗体。 ２０、ＩｇＧアイソタイプであることを特徴とする請求
   項１７〜１９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗
   体。 ２１、ヒルジンの抗凝血活性を中和することを特徴とす
   る請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のモノクロー
   ナル抗体。 ２２、組換えヒルジン変形体ＨＶ１（ｒＨＶ１）に関す
   る解離定数（Ｋ＿Ｄ）が１．５×１０＾−＾９Ｍ（モル
   ／ｌ）〜６×１０＾−＾１＾０Ｍの範囲であるモノクロ
   ーナル抗体。 ２３、アミノ酸残基４３及びアミノ酸残基４７を含む組
   換えヒルジン変形体ＨＶ１（ｒＨＶ１）のエピドープを
   認識するモノクローナル抗体。 ２４、アミノ酸残基６１及びアミノ酸残基６２を含む組
   換えヒルジン変異株ＨＶ１（ｒＨＶ１）のエピドープを
   認識するモノクローナル抗体。 ２５、ＭＡｂ４０４９−８３−１２と称するモノクロー
   ナル抗体。 ２６、ＭＡｂ４１１４−９６−１と称するモノクローナ
   ル抗体。 ２７、ＭＡｂ４１２０−３７−７と称するモノクローナ
   ル抗体。 ２８、ＭＡｂ４１０２−２１−１４と称するモノクロー
   ナル抗体。 ２９、ヒルジンの抗原決定基に対する特異性を保持して
   いることを特徴とする請求項１７〜２８のいずれか１項
   に記載のモノクローナル抗体の誘導体。 ３０、酵素、螢光マーカー、ケミルミネッセンスマーカ
   ー、金属キレート、アビジン、ビオチン等との複合体で
   あることを特徴とする請求項２９に記載の誘導体。 ３１、放射能で標識されていることを特徴とする請求項
   ２９に記載の誘導体。 ３２、断片であることを特徴とする請求項２９に記載の
   誘導体。 ３３、組換えヒルジン変異株ＨＶ１（ｒＨＶ１）に関す
   る解離定数（Ｋ＿Ｄ）が１．５×１０＾−＾９Ｍ（モル
   ／ｌ）〜６×１０＾−＾１＾０Ｍの範囲である請求項２
   ９に記載のモノクローナル抗体。 ３４、アミノ酸残基４３及びアミノ酸残基４７を含む組
   換えヒルジン変形体ＨＶ１（ｒＨＶ１）のエピドープを
   認識するモノクローナル抗体の請求項２９に記載の誘導
   体。 ３５、アミノ酸残基６１及びアミノ酸残基６２を含む組
   換えヒルジン変形体ＨＶ１（ｒＨＶ１）のエピドープを
   認識するモノクローナル抗体の請求項２９に記載の誘導
   体。 ３６、ＭＡｂ４０４９−８３−１２、ＭＡｂ４１１４−
   ９−１、ＭＡｂ４１２０−３７−７及びＭＡｂ４１０２
   −２１−１４と称するモノクローナル抗体からなる群か
   ら選ばれたモノクローナル抗体の請求項２９記載の誘導
   体。 ３７、抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を生体内又は
   試験管内で増殖し、そして得られる抗体を必要に応じて
   単離及び／又はその誘導体に転化することを特徴とする
   請求項１７〜３６のいずれか１項に記載のモノクローナ
   ル抗体及びその誘導体の製造方法。 ３８、請求項１７〜３６のいずれか１項に記載のモノク
   ローナル抗体及び／又はその誘導体並びに必要に応じて
   他のモノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗体及
   び／又は添加剤を含むヒルジンを定性的及び定量的に測
   定するための試験キット。 ３９、請求項１７〜３６のいずれかに記載のヒルジン及
   び／又はその誘導体の抗凝血活性を中和するモノクロー
   ナル抗体を含有するヒルジンの作用を中和するための医
   薬組成物。