JPH04357457A

JPH04357457A - 免疫学的測定法

Info

Publication number: JPH04357457A
Application number: JP4830691A
Authority: JP
Inventors: Morito Uemura; 植村　盛人; Takenori Takahashi; 高橋　壮模
Original assignee: Konica Minolta Inc
Current assignee: Konica Minolta Inc
Priority date: 1991-03-13
Filing date: 1991-03-13
Publication date: 1992-12-10

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫学的測定法に関す
るものである。

【０００２】

【発明の背景】生物学的流体試料中に極微量含有される
物質を検出する方法として、各種の分析法が開発されて
来ている。この分析法の一つとして、免疫反応をその原
理とするものがある。そして、この原理を用いた測定法
として種々のものが開発され、精度の高いものとして知
られている。

【０００３】このような免疫学的測定法は、均一免疫測
定法と非均一免疫測定法に大別される。すなわち、抗原
抗体反応生成物（Ｂｏｕｎｄ体）と非反応物（Ｆｒｅｅ
体）との分離（Ｂ／Ｆ分離）が必要な非均一免疫測定法
と、Ｂ／Ｆ分離の必要のない均一免疫測定法とに大別さ
れる。このうち、測定対象物質が高分子である場合には
、Ｂ／Ｆ分離が必要な非均一免疫測定法が利用されてい
る。

【０００４】ところで、この非均一免疫測定法は洗浄操
作、試薬の調整が必要であること、標識物質、基質、反
応停止液等の添加が必要であることから操作が煩雑であ
ること等の問題がある。これらの問題点に対して各種の
技術が提案されている。例えば、特開昭６４−６３８６
３号公報、特開昭６４−６３８６４号公報、特開平２−
８３４４８号公報においては、乾式分析素子を用いるこ
とにより操作性はかなり簡便になっているものの、簡便
性に対する要求は高まる一方であり、改善が待たれてい
る。

【０００５】

【発明の開示】本発明の目的は、液体試料中の特定成分
を、簡便な操作で、再現性良く正確に定量できる技術を
提供することである。この本発明の目的は、抗体（又は
抗原）が固定化された吸水性素材に液体試料を加えるこ
とにより固定化抗体（又は抗原）及び酵素標識抗体（又
は抗原）と液体試料中の抗原（又は抗体）とによる免疫
反応を吸水性素材において行わせ、この後前記吸水性素
材と酵素基質を有する分析素子とを接触させて遊離の酵
素標識抗体（又は抗原）を分析素子側に移行させ、標識
酵素を分析素子で測定することにより液体試料中の抗原
（又は抗体）を分析することを特徴とする免疫学的測定
法によって達成される。

【０００６】又、抗体（又は抗原）が固定化された吸水
性素材に液体試料を加えることにより固定化抗体（又は
抗原）及び酵素標識抗体（又は抗原）と液体試料中の抗
原（又は抗体）とによる免疫反応を吸水性素材において
行わせ、この後前記吸水性素材と酵素基質を有する分析
素子とを接触させて遊離の酵素標識抗体（又は抗原）を
分析素子側に移行させ、その後前記分析素子を吸水性素
材から離し、標識酵素を分析素子で測定することにより
液体試料中の抗原（又は抗体）を分析することを特徴と
する免疫学的測定法によって達成される。

【０００７】尚、酵素標識抗体（又は抗原）は予め吸水
性素材（例えばシート）に内在してなるものが、測定に
際しての操作性の面から好ましい。以下、本発明をさら
に詳しく説明する。本発明において、液体試料としては
あらゆる形態の溶液、コロイド溶液などが使用しうるが
、好ましくは生物由来の試料、例えば血液、血漿、血清
、脳脊髄液、唾液、羊水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げら
れる。

【０００８】本発明に用いられる標識酵素としては、例
えばβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスフォダー
ゼ、ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グル
タメートデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ等が挙げられ、
これらの酵素を標識物質とする場合、酵素反応系、発色
系は公知のものを使用できる。具体的には、特開昭６１
−２９２０６０号公報、特開昭６２−９０５３９号公報
、特開昭６３−１３１０６２号公報、特開昭６３−４５
５６２号公報、特願昭６３−２１９８９３号明細書に記
載の物質（物質群）が挙げられるが、これらに限定され
るものではない。そして、これら標識物質の抗体（抗原
）への結合は、当業者間で知られている公知の試薬と方
法で行うことができ、例えば石川　　栄治、河合　　忠
、宮井　　潔編「酵素免疫測定法（第２版）、医学書院
、１９７８年」や日本臨床病理学会編「臨床病理」臨時
増刊特集第５３号「臨床検査の為のイムノアッセイ−技
術と応用−、臨床病理刊行会、１９８３年」などに記載
された方法を参考にすることができる。

【０００９】本発明で使用される抗体は、その由来を特
に限定されるものではなく、哺乳動物等に抗原を投与、
免疫して得られる抗血清、腹水液をそのままか、あるい
は従来公知の方法である硫酸ナトリウム沈澱法、硫酸ア
ンモニウム沈澱法、セファデックスゲルによるゲル濾過
法、イオン交換セルロースクロマトグラフィ法、電気泳
動法等（右田俊介偏「免疫化学」中山書店ｐｐ７４ない
し８８参照）で精製して用いることができる。あるいは
、抗原で感染した哺乳動物など（例えばマウス）の脾臓
細胞や骨髄腫細胞（ミエローマ）から雑種細胞（ハイブ
リドーマ）を得てモノクローナル抗体を作成し、これを
特定成分と特異的に結合しうる物質として使用すると特
異性が向上し、好ましい。又、これらの抗体はＩｇＧ、
ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ各分画を用いることが
でき、或いはこれらの抗体を酵素処理してＦａｂ、Ｆａ
ｂ’又はＦ（ａｂ’）２　といった活性抗体フラグメン
トにして使用しても良い。さらに、これらの抗体は単一
で使用しても、複数の抗体を組み合わせて使用しても良
い。

【００１０】本発明の免疫測定方法による反応型式とし
ては、競合法、２抗体法、サンドイッチ法などが挙げら
れるが、特に限定はされない。又、他の生物活性物質（
例えば、ビオチン、アビジン）を利用した免疫測定方法
も適用できる。本発明で使用する抗原は特異抗体と反応
するものであり、ハプテン及びその誘導体を含有する。

【００１１】抗体（又は抗原）を結合させる不溶化担体
として、吸水性の素材、例えば吸水性シートが用いられ
る。このような吸水性シートの材料としてはアガロース
、セルロース、架橋デキストラン、ポリアクリルアミド
、セルロース、微結晶セルロース、架橋アガロース、架
橋ポリアクリルアミド、シリカゲル、発泡ポリスチレン
等の発泡樹脂、濾紙、脱脂綿、パルプ、羊毛、麻などの
繊維などが挙げられる。抗体又は抗原は、これらの素材
の吸水性シートに化学的及び／又は物理的に直接、ある
いは間接的に結合させることができる。結合法について
は１９７６年、講談社発行、千畑一郎ほか２名編「実験
と応用　　アフィニティクロマトグラフィー」（第１刷
）、１９７５年、講談社発行、山崎誠ほか２名編「アフ
ィニティクロマトグラフィー」（第１版）を参考にでき
る。

【００１２】尚、結合反応後、標識抗体（又は抗原）の
非特異反応を排除する目的で、測定すべき特異的反応に
関与しない蛋白質を担持させることができる。それらの
代表的な例としては、哺乳動物及び鳥類の正常血清蛋白
質、アルブミン、スキムミルク、乳酸醗酵物、コラーゲ
ン及びそれらの分解物質等が挙げられる。このような非
特異吸着抑制蛋白質は、吸水性シートに担持させるだけ
でなく、免疫反応時にその一定量を免疫反応溶液中に添
加することにより、一層非特異吸着の抑制効果が上がる
。

【００１３】前記酵素標識抗体（又は抗原）は、免疫反
応時に吸水性シートに存在しておれば良く、この点から
液体試料の添加時に存在させられても良い訳であるが、
予め固定化抗体（又は抗原）と共に内在させられている
ことが、使用時の作業の簡便性から好ましい訳である。本発明に用いる乾式分析素子は、少なくとも一層以上の
多孔質層を持つことが好ましい。

【００１４】多孔質層の素材は特に限定されないが、好
ましい例としてはサイズ１ないし３５０μｍの粒状体あ
るいは４０ないし４００メッシュの繊維から一つ以上選
ばれた素材により構成される構造体が挙げられる。該粒
状体の材料としては、ケイ藻土、二酸化チタン、硫酸バ
リウム、酸化亜鉛、酸化鉛、微結晶セルロース、ケイ砂
、ガラス、シリカゲル、架橋デキストリン、架橋ポリア
クリルアミド、アガロース、架橋アガロース、ポリスチ
レン等の各種の合成樹脂のほか、ポリ（スチレン−グリ
シジルメタクリレート）、ポリ（スチレン−メチルアク
リレート−グリシジルメタクリレート）のような反応性
基を持つ化合物から成る自己結合型粒子が挙げられる。

【００１５】又、多孔質層に用いる繊維としては、パル
プ、粉末濾紙、綿、麻、絹、羊毛、キチン、キトサン、
セルロースエステル、ビスコースレーヨン、銅アンモニ
アレーヨン、ポリアミド（６−ナイロン、６，６−ナイ
ロン、６，１０−ナイロン等）、ポリエステル（ポリエ
チレンテレフタレート等）、ポリオレフィン（ポリプロ
ピレン、ビニロン等）、ガラス繊維、石綿などの植物性
、動物性、合成、半合成、再生繊維を用いることができ
、あるいはこれらを混合して用いても良い。あるいは別
の態様としては吸水性の洋紙、和紙、濾紙、ブラッシュ
ポリマー、あるいはガラス繊維、鉱物性繊維（石綿など
）、植物性繊維（木綿、麻、パルプ等）、動物性繊維（
羊毛、絹など）、合成繊維（各種ナイロン、ビニロン、
ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン等）、再
生繊維（レーヨン、セルロースエステル等）などを単独
あるいは混合して製造した織物、不織布、合成紙などを
該多孔質層に用いることもできる。

【００１６】このような粒状体、繊維、あるいは粒状体
と繊維の混合物を塗布及び／又は製膜することにより、
自由に接触し得る相互連絡空隙孔を有する多孔性構造が
存在する多孔質層を形成する。自己結合性を有しない粒
子は適当な接着剤を用いて粒子同志が点接着する形で製
膜することができ、例えば特開昭４９−５３８８８号公
報、特開昭５５−９０８５９号公報、特開昭５７−６７
８６０号公報に記載の方法を適用することができる。自
己結合性を有する有機ポリマー粒子は特開昭５７−１０
１７６０号公報、特開昭５７−１０１７６１号公報、特
開昭５８−７０１６３号公報に記載の方法により同様に
製膜できる。繊維又は繊維及び粒子の混合物については
特開昭５７−１２５８４７号公報、特開昭５７−１９７
４６６号公報に記載された繊維分散液を塗布することに
より多孔質層を形成できる。又、特開昭６０−１７３４
７１号公報で行われている方法のようにゼラチンやポリ
ビニルピロリドンのような水溶性バインダーを使用した
繊維分散液を塗布することも可能である。又、このとき
のバインダーは水溶性に限らず、疏水性のバインダーの
使用も可能である。このような分散液を製造する為には
、多くの方法を単独又は組み合わせて用いることが可能
である。例えば、有用な方法の一つとして、界面活性剤
を液体キャリヤーへ添加し、粒状体及び／又は繊維の分
散液中に分布及び安定化を促進することができる。

【００１７】使用可能な代表的な界面活性剤の例として
は、トライトンＸ−１００（ロームアンドハース社製、
オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、サーフ
ァクタント１０Ｇ（オリーン社製、ノニルフェノキシポ
リグリシドール）等の非イオン性界面活性剤がある。こ
れらの界面活性剤は広範に選択された量を用いることが
可能であるが、粒状体及び／又は繊維の重量に対して０
．００５ないし１０重量％、好ましくは０．１５ないし
６重量％用いることができる。更に、別の方法として、
該粒子単位と液体キャリヤーの音波処理、物理的混合、
及び物理的攪拌処理、ｐＨ調整がある。これらは前記の
方法と組み合わせることにより、更に有用である。

【００１８】乾式分析素子の形態は分析を行いうるもの
であればよく、特に制限されるものではないが、製造上
及び測定操作上、フィルム状あるいはシート状であるこ
とが好ましい。乾式分析素子は一層から成っていても、
多層から成っていてもよい。例えば、酵素基質を内蔵し
た多孔質層のみからなるものとか、吸水層上に多孔質層
（基質が少なくともどちらかの層に内蔵）が設けられて
なるものとか、吸水層上に複数の多孔質層（基質が少な
くとも何れかの層に内蔵）が設けられてなるものとかが
考えられ、必要に応じて、それらは光透過性支持体上に
設けられたり、光反射性支持体上に設けられたり、光透
過性支持体上に設けられ、その上に光反射性層が設けら
れたりする。

【００１９】尚、吸水層の素材としては、例えばゼラチ
ン、フタル化ゼラチン等のゼラチン誘導体、ポリビニル
アルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルイミダ
ゾール、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸ナトリウ
ム等の合成高分子、ヒドロキシエチルセルロース、カル
ボキシメチルセルロースナトリウム塩などのセルロース
誘導体の多糖類などが挙げられる。好ましくは、ゼラチ
ン、フタル化ゼラチン等のゼラチン誘導体である。

【００２０】光透過性支持体の素材としては、例えば酢
酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート、ポリカー
ボネート及びポリビニル化合物（例えばポリスチレン）
のような透明高分子化合物あるいはガラスのような透明
無機化合物が挙げられる。光反射性支持体の素材として
は、例えばセラミックス、金属、あるいは樹脂被覆され
た紙などが挙げられ、必要に応じてこれらの素材中には
ＴｉＯ２　、ＢａＳＯ４　、マイカなどの白色顔料など
を含有又は塗布させたものでも良い。

【００２１】そして、例えば光透過性支持体上に基質を
内蔵した多孔質層が設けられてなる乾式分析素子が用い
られる場合には、免疫反応が行われた吸水性シートが乾
式分析素子の多孔質層側から接合（免疫反応前及び免疫
反応中は互いに離間状態）され、吸水性シート中の遊離
の酵素標識抗体（又は抗原）が乾式分析素子の多孔質層
に移行し得るようにされる。すなわち、免疫反応が行わ
れた吸水性シートと乾式分析素子とが接合させられるこ
とにより、吸水性シート中の遊離の酵素標識抗体（又は
抗原）が乾式分析素子側に移動するので、これによる発
色信号の測定は両側から行うことが可能である。又、光
反射性支持体上に基質を内蔵した多孔質層が設けられて
なる乾式分析素子が用いられる場合には、免疫反応が行
われた吸水性シートが乾式分析素子の多孔質層側から接
合され、吸水性シート中の遊離の酵素標識抗体（又は抗
原）が乾式分析素子の多孔質層に移行し得るようにされ
る。そして、信号の測定は多孔質層側から行われる。尚、光透過性支持体上に基質を内蔵した多孔質層が設け
られ、その上に光反射性層が設けられてなる乾式分析素
子が用いられる場合には、吸水性シートは光反射性層側
に接合がなされ、信号の測定は光透過性支持体側から行
われる。

【００２２】標識に起因した信号は、紫外線、可視光、
近赤外光などを利用した吸光度法（比色法）　などで検
出することができ、測定法としては信号の経時的変化を
測定するレート測定法または一定時間後の信号を測定す
るエンドポイント測定法で測定することができる。乾式
分析素子は、展開層を有するものであっても良い。展開
層の素材としては、多孔質層と同様なものを塗布、製膜
、貼付しても良い。又、展開層内に基質等を内蔵させ、
反応層としての役目を持たせても良い。吸水性素材及び
乾式分析素子には、他の添加剤、例えば緩衝剤、保恒剤
、界面活性剤、媒染剤等を目的に応じて添加することが
できる。緩衝剤は、特異的結合反応、酵素反応、発色反
応等に適したｐＨとする為に含有される。用いることが
できる緩衝剤としては日本化学会編「化学便覧基礎編」
（東京、丸善株式会社　　１９６６）ｐｐ１３１２ない
し１３２０、Ｎ，Ｅ，Ｇｏｏｄ等；　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ　　Ｖｏｌ　　５、ｐ４６７（１９６６）、今
村、斎藤；化学の領域、Ｖｏｌ３０（２）、ｐ７９（１
９７６）、Ｗ．Ｊ．Ｆｅｒｇｕｓｏｎ等　　Ａｎａｌ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ１０４、ｐ３００（１９８０）
等の文献に記載されているものを挙げることができる。具体的な例としては、ホウ酸塩、クエン酸塩、燐酸塩、
炭酸塩、トリスバルビツール、グリシン、グッド緩衝剤
などが挙げられる。これらの緩衝剤は必要に応じて単独
で層を形成させてもよい。保恒剤は、例えば基質発色試
薬の保存安定化の為に含有され、酸化防止剤などがある
。その物質としては、日本生化学会編「生化学実験口座
１、蛋白質の化学１」（東京化学同人株式会社　　１９
７６）ｐｐ６６，６７、実験と応用「アフィニティクロ
マトグラフィ」ｐｐ１６ないし１０４、特開昭６０−１
４９９２７号公報などに記載されているものが挙げられ
る。具体的例としては、ゼラチン、ゼラチン分解物、ア
ルブミン、シクロデキストリン類、非還元糖類（シュク
ロース、トレハロース）、ポリエチレングリコール、ア
ミノ酸、各種イオン、アジ化ソーダ等が挙げられる。界
面活性剤としては、前述のものが挙げられる。その他の
層中に含有される試薬としては、溶解助剤、ブロッカー
試薬などがある。これらの添加剤は必要に応じて適当量
添加する。媒染剤は、酵素活性測定の為の検出物質を測
光部側に集中的に集めたり、検出物質が色素の場合吸光
度係数を高めたり、波長をシフトさせる物質であり、検
出物質と強い相互作用を示す。カチオン性ポリマー、ア
ニオン性ポリマー及びこれらのポリマーのラテックスが
用いられる。吸水性素材又は乾式分析素子は、さらに生
体試料が血液（全血）の場合に有用な血球分離層、必要
に応じて設ける接着層、保護層、タイミング層といった
補助層を設けることができる。これらの層は、その機能
に応じて設けられるべき位置が決定される。

【００２３】

〔実施例１〕

１−（１）　　β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識ＣＲＰ抗
体の作成ＣＲＰ抗体（ウサギＩｇＧフラクション、タウンズ社製
）２０ｍｇを０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐ６．５）２．
０ｍｌに溶解し、これにＮ−（ε−マレイミドカプロイ
ルオキシ）スクシンイミド（同仁化学研究所製）が２．
５ｍｇ／ｍｌのジメチルホルムアミド溶液７７μｌを加
えて、３０℃で２０分間反応後、５ｍＭのＥＤＴＡを含
有する０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化
したセファデックスＧ−２５カラムで精製し、マレイミ
ド化したＣＲＰ抗体を得た。

【００２４】次に、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（東洋紡
社製）が１０．５ｍｇ／ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液１
．８ｍｌに、前記マレイミド化したＣＲＰ抗体を１３．
６ｍｇ含む溶液３．２ｍｌを加えて、４℃で４５時間反
応後、０．１Ｍの２−メルカプトエチルアミン１７５μ
ｌを加えて３０℃で２０分間反応させ、０．１５Ｍの塩
化ナトリウムを含有する０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
．４）で平衡化したスーパーローズ６プレップグレード
（ファルマシア社製）カラムで分離、精製し、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ標識ＣＲＰ抗体を得た。

【００２５】１−（２）　　抗ＣＲＰ抗体が固定化され
、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識抗ＣＲＰ抗体を内在（
含浸）した抗原−抗体反応用の吸水性シートの作成トラ
ベロン（ＮＰ３００、金井重要工業社製）の１．０ｃｍ
×１．０ｃｍ片１０枚を０．１５Ｍの塩化ナトリウムを
含有する０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）４０ｍ
ｌ中に分散し、これにＣＲＰ抗体（ウサギＩｇＧフラク
ション、タウンズ社製）１２０ｍｇを入れ、４０℃で２
０時間攪拌し、反応させ、固定化した。反応後、０．１
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）と０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）を交互に用い、充分に洗浄した。

【００２６】次いで、洗浄した後、３％スキムミルク添
加の０．１５Ｍ塩化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．４）中で４℃で２０時間攪拌した。尚、こ
の操作により、スキムミルクによるブロッキングが行わ
れ、後述のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識ＣＲＰ抗体は
トラベロンに固定化されることがない。そして、凍結乾
燥した後、前記で作成したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ標
識ＣＲＰ抗体の溶液（１０μｇ／ｍｌ）中に浸し、所定
時間後に取り出し、凍結乾燥し、抗ＣＲＰ抗体が固定化
され、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識抗ＣＲＰ抗体を内
在（含浸）した抗原−抗体反応用の吸水性シートを得た
。

【００２７】１−（３）　　乾式分析素子の作成厚さ１
８０μｍの透明な下引き済ポリエチレンテレフタレート
フィルムの上に、下記の組成の塗布液（１）を塗布し、
乾燥させ、ゼラチン層を作成させた。　　　　　　塗布液−（１）　　　　脱イオン化ゼラチン　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　６．０ｇ　　　　トライ
トンＸ−１００　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　０．１５ｇ　　　　１，２−ビス（ビニル
スルホニル）エタン　　　　　　０．０１ｇ　　　　純
水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　５４．０ｇ次に、塗布液
−（２）を前記ゼラチン層の上に塗布し、乾燥した。

【００２８】　　　　　　塗布液−（２）　　　　粉末ろ紙Ｄ（東洋濾紙社製）　　　　　　　　
　　　　　　　　２１．６ｇ　　　　ピロリドン−酢酸
ビニル（２対８）共重合体　　１１．０ｇ　　　　クロ
ロフェニルレッドβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ベーリ
ンガー社製）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　３６５ｍｇ　　　　ｎ−ブタノール　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４９．４
ｇこれを１．５ｃｍ×１．５ｃｍの大きさに裁断し、乾
式分析素子とした。

【００２９】１−（４）　　ＣＲＰの測定１ｍＭの塩化
マグネシウム及び３重量％のウシ血清アルブミンを含有
する０．３Ｍのビストリス緩衝液５０μｌに、ＣＲＰ溶
液（０．１、３、１０、３０、１００μｇ／ｍｌ）５μ
ｌを添加混合し、その３０μｌを前記１−（２）で作成
した抗原−抗体反応用の吸水性シート上に滴下し、１０
分間免疫反応させた。

【００３０】この後、この吸水性シートを前記１−（３
）で作成した乾式分析素子の上方から接合した。そして
、３７℃でインキュベートし、５４６ｎｍの反射濃度を
乾式分析素子の支持体側から測定した。３分３０秒ない
し７分の反射濃度差（ΔＤｒ）を用いて検量線を作成し
たので、その結果を図１に示す。尚、図１は、本発明に
より作成されたＣＲＰの検量線を示すものである。

【００３１】これによればＣＲＰが正確に測定されるこ
とが判り、又、測定は試料を吸水性シート上に垂らし、
これを乾式分析素子に重ねるだけの手軽な作業で行える
。すなわち、バックグラウンドノイズは小さく、ＣＲＰ
が正確に測定できるものであり、かつ、Ｂ／Ｆ分離の為
の特別な操作や液の移し換えの操作をせずとも測定が行
える。

【００３２】〔実施例２〕２−（１）　　β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識ＣＲＰ抗
体の作成前記１−（１）における〔β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標
識ＣＲＰ抗体の作成〕と同様にしてβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼ標識ＣＲＰ抗体を作成した。２−（２）　　抗ＣＲＰ抗体が固定化され、β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ標識抗ＣＲＰ抗体を内在（含浸）した抗
原−抗体反応用の吸水性シートの作成１．０ｃｍ×１．０ｃｍのパルプ片８０ｇを２．５Ｍの
リン酸緩衝液（ｐＨ１２．０）８００ｍｌ中に浸漬し、
臭化シアン８０ｇを加え、室温で２０分間反応させ、そ
の後充分に水洗した。

【００３３】この活性化したパルプ片１ｇとヒツジ由来
の抗ＣＲＰ抗体１０ｍｇとをＰＢＳ５ｍｌの溶液中に入
れ、室温で１昼夜反応させた。充分に洗浄した後、０．
１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ８．５）に３％ＢＳＡを溶解し
た液により、ヒツジ由来の抗ＣＲＰ抗体が固定化された
パルプ片に対してブロッキング処理が行われ、β−Ｄ−
ガラクトシダーゼ標識ＣＲＰ抗体がパルプ片に固定化さ
れることがないようにした。

【００３４】そして、前記で作成したβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼ標識ＣＲＰ抗体の溶液（２μｇ／ｍｌ）を０．
１Ｍビストリス−塩酸（ｐＨ８．０）に希釈した溶液中
にヒツジ由来の抗ＣＲＰ抗体が固定化されたパルプ片を
浸漬し、所定時間後に取り出し、凍結乾燥し、抗ＣＲＰ
抗体が固定化され、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識抗Ｃ
ＲＰ抗体を内在（含浸）した抗原−抗体反応用のパルプ
片を得、これをプラスチック製の支持体上に接着した。

【００３５】２−（３）　　乾式分析素子の作成前記１
−（３）における〔乾式分析素子の作成〕と同様にして
乾式分析素子を作成した。２−（４）　　ＣＲＰの測定１ｍＭの塩化マグネシウム及び３％のＢＳＡを含有する
０．３Ｍのビストリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中に
、ＣＲＰ溶液（０、３、１０、３０μｇ／ｍｌ）を添加
混合し、その５０μｌを前記１−（２）で作成した抗原
−抗体反応用のパルプ片上に滴下し、室温下で１０分間
免疫反応させた。

【００３６】この後、このパルプ片上前記１−（３）で
作成した乾式分析素子を重ね合わせ、そして所定時間後
に乾式分析素子を剥離し、次いで３７℃で３０分間イン
キュベートし、５４６ｎｍの反射濃度を乾式分析素子の
支持体側から測定した。３分３０秒ないし７分の反射濃
度差（ΔＤｒ）を用いて検量線を作成したので、その結
果を図２に示す。尚、図２は、本発明により作成された
ＣＲＰの検量線を示すものである。

【００３７】これによればＣＲＰが正確に測定されるこ
とが判り、又、測定は試料をパルプ片上に垂らし、これ
に乾式分析素子を重ねるだけの手軽な作業で行える。す
なわち、バックグラウンドノイズは小さく、ＣＲＰが正
確に測定できるものであり、かつ、Ｂ／Ｆ分離の為の特
別な操作や液の移し換えの操作をせずとも測定が行える
。

【００３８】

【効果】本発明によれば、試料の滴下、そして重ね合わ
せといった手軽な操作で、すなわちＢ／Ｆ分離の為の特
別な操作や液の移し換えの操作をせずとも簡単な操作で
測定が行え、しかもその測定結果はバックグラウンドノ
イズが小さく、正確なといった特長を有する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明により作成されたＣＲＰの検量線を示す
ものである。

【図２】本発明により作成されたＣＲＰの検量線を示す
ものである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　抗体（又は抗原）が固定化された吸水
性素材に液体試料を加えることにより固定化抗体（又は
抗原）及び酵素標識抗体（又は抗原）と液体試料中の抗
原（又は抗体）とによる免疫反応を吸水性素材において
行わせ、この後前記吸水性素材と酵素基質を有する分析
素子とを接触させて遊離の酵素標識抗体（又は抗原）を
分析素子側に移行させ、標識酵素を分析素子で測定する
ことにより液体試料中の抗原（又は抗体）を分析するこ
とを特徴とする免疫学的測定法。
【請求項２】　　抗体（又は抗原）が固定化された吸水
性素材に液体試料を加えることにより固定化抗体（又は
抗原）及び酵素標識抗体（又は抗原）と液体試料中の抗
原（又は抗体）とによる免疫反応を吸水性素材において
行わせ、この後前記吸水性素材と酵素基質を有する分析
素子とを接触させて遊離の酵素標識抗体（又は抗原）を
分析素子側に移行させ、その後前記分析素子を吸水性素
材から離し、標識酵素を分析素子で測定することにより
液体試料中の抗原（又は抗体）を分析することを特徴と
する免疫学的測定法。
【請求項３】　　酵素標識抗体（又は抗原）が吸水性素
材に内在してなることを特徴とする請求項１又は請求項
２の免疫学的測定法。