JPH05126831A - 免疫測定素子及び免疫測定方法 - Google Patents
免疫測定素子及び免疫測定方法Info
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 洗浄液が要らず、B/F分離が簡便に出来、
そしてバックグラウンドノイズが小さく、高感度な免疫
測定が可能な技術を提供することである。 【構成】 抗体(又は抗原)が固定化された吸水性素材
と、この吸水性素材の下方部に配設された毛細管現象を
呈する物質と、この毛細管現象を呈する物質の下方部に
配設された酵素基質を有する分析素子とを具備する免疫
測定素子。
そしてバックグラウンドノイズが小さく、高感度な免疫
測定が可能な技術を提供することである。 【構成】 抗体(又は抗原)が固定化された吸水性素材
と、この吸水性素材の下方部に配設された毛細管現象を
呈する物質と、この毛細管現象を呈する物質の下方部に
配設された酵素基質を有する分析素子とを具備する免疫
測定素子。
Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、免疫測定素子及び免疫
測定方法に関するものである。
測定方法に関するものである。
【0002】
【発明の背景】生物学的流体試料中に極微量含有される
物質を検出する方法として、各種の分析法が開発されて
来ている。この分析法の一つとして、免疫反応をその原
理とするものがある。そして、この原理を用いた測定法
として種々のものが開発され、精度の高いものとして知
られている。例えば、生物学的流体試料中の特定成分、
特に高分子成分を測定するには、ヘテロジニアスイムノ
アッセイが知られている。ところで、このヘテロジニア
スイムノアッセイはB/F分離(抗原抗体反応生成物
(Bound体)と非反応物(Free体)との分離)
を行わなければならず、分析操作を複雑なものとし、
又、排液がでるといった問題が有る。
物質を検出する方法として、各種の分析法が開発されて
来ている。この分析法の一つとして、免疫反応をその原
理とするものがある。そして、この原理を用いた測定法
として種々のものが開発され、精度の高いものとして知
られている。例えば、生物学的流体試料中の特定成分、
特に高分子成分を測定するには、ヘテロジニアスイムノ
アッセイが知られている。ところで、このヘテロジニア
スイムノアッセイはB/F分離(抗原抗体反応生成物
(Bound体)と非反応物(Free体)との分離)
を行わなければならず、分析操作を複雑なものとし、
又、排液がでるといった問題が有る。
【0003】そこで、例えば特開平1−203975号
公報では酵素阻害剤を用いる方法が提唱されており、
又、特開平2−83448号公報では多孔質膜と乾式分
析素子を用いた免疫測定方法が提唱されている。しかし
ながら、特開平1−203975号公報提案の技術にお
いては、免疫反応、B/F分離、検出反応が同時に進む
為、バックグラウンドノイズが大きい問題が有る。
公報では酵素阻害剤を用いる方法が提唱されており、
又、特開平2−83448号公報では多孔質膜と乾式分
析素子を用いた免疫測定方法が提唱されている。しかし
ながら、特開平1−203975号公報提案の技術にお
いては、免疫反応、B/F分離、検出反応が同時に進む
為、バックグラウンドノイズが大きい問題が有る。
【0004】特開平2−83448号公報提案の技術に
おいては、液の移しかえ操作が要り、操作を繁雑なもの
としている。
おいては、液の移しかえ操作が要り、操作を繁雑なもの
としている。
【0005】
【発明の開示】本発明の目的は、洗浄液が要らず、B/
F分離が簡便に出来、そしてバックグラウンドノイズが
小さく、高感度な免疫測定が可能な技術を提供すること
である。この本発明の目的は、抗体(又は抗原)が固定
化された吸水性素材と、この吸水性素材の下方部に配設
された毛細管現象を呈する物質と、この毛細管現象を呈
する物質の下方部に配設された酵素基質を有する分析素
子とを具備することを特徴とする免疫測定素子によって
達成される。
F分離が簡便に出来、そしてバックグラウンドノイズが
小さく、高感度な免疫測定が可能な技術を提供すること
である。この本発明の目的は、抗体(又は抗原)が固定
化された吸水性素材と、この吸水性素材の下方部に配設
された毛細管現象を呈する物質と、この毛細管現象を呈
する物質の下方部に配設された酵素基質を有する分析素
子とを具備することを特徴とする免疫測定素子によって
達成される。
【0006】又、抗体(又は抗原)が固定化された吸水
性素材、この吸水性素材の下方部に配設された毛細管現
象を呈する物質、及びこの毛細管現象を呈する物質の下
方部に酵素基質を有する分析素子を配設させた免疫測定
素子の前記吸水性素材に対して、被検試料を供給するこ
とを特徴とする免疫測定方法によって達成される。尚、
酵素標識抗体(又は抗原)が吸水性素材に内蔵されてい
ることが好ましい。
性素材、この吸水性素材の下方部に配設された毛細管現
象を呈する物質、及びこの毛細管現象を呈する物質の下
方部に酵素基質を有する分析素子を配設させた免疫測定
素子の前記吸水性素材に対して、被検試料を供給するこ
とを特徴とする免疫測定方法によって達成される。尚、
酵素標識抗体(又は抗原)が吸水性素材に内蔵されてい
ることが好ましい。
【0007】以下、本発明をさらに詳しく説明する。本
発明において、液体試料としてはあらゆる形態の溶液、
コロイド溶液などが使用しうるが、好ましくは生物由来
の試料、例えば血液、血漿、血清、脳脊髄液、唾液、羊
水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げられる。本発明に用いら
れる標識酵素としては、例えばβ−D−ガラクトシダー
ゼ、アルカリホスフォダーゼ、ペルオキシダーゼ、グル
コースオキシダーゼ、グルタメートデヒドロゲナーゼ、
アミラーゼ等が挙げられ、これらの酵素を標識物質とす
る場合、酵素反応系、発色系は公知のものを使用でき
る。具体的には、特開昭61−292060号公報、特
開昭62−90539号公報、特開昭63−13106
2号公報、特開昭63−45562号公報、特願昭63
−219893号明細書に記載の物質(物質群)が挙げ
られるが、これらに限定されるものではない。そして、
これら標識物質の抗体(抗原)への結合は、当業者間で
知られている公知の試薬と方法で行うことができ、例え
ば石川 栄治、河合 忠、宮井 潔編「酵素免疫測定法
(第2版)、医学書院、1978年」や日本臨床病理学
会編「臨床病理」臨時増刊特集第53号「臨床検査の為
のイムノアッセイ−技術と応用−、臨床病理刊行会、1
983年」などに記載された方法を参考にすることがで
きる。
発明において、液体試料としてはあらゆる形態の溶液、
コロイド溶液などが使用しうるが、好ましくは生物由来
の試料、例えば血液、血漿、血清、脳脊髄液、唾液、羊
水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げられる。本発明に用いら
れる標識酵素としては、例えばβ−D−ガラクトシダー
ゼ、アルカリホスフォダーゼ、ペルオキシダーゼ、グル
コースオキシダーゼ、グルタメートデヒドロゲナーゼ、
アミラーゼ等が挙げられ、これらの酵素を標識物質とす
る場合、酵素反応系、発色系は公知のものを使用でき
る。具体的には、特開昭61−292060号公報、特
開昭62−90539号公報、特開昭63−13106
2号公報、特開昭63−45562号公報、特願昭63
−219893号明細書に記載の物質(物質群)が挙げ
られるが、これらに限定されるものではない。そして、
これら標識物質の抗体(抗原)への結合は、当業者間で
知られている公知の試薬と方法で行うことができ、例え
ば石川 栄治、河合 忠、宮井 潔編「酵素免疫測定法
(第2版)、医学書院、1978年」や日本臨床病理学
会編「臨床病理」臨時増刊特集第53号「臨床検査の為
のイムノアッセイ−技術と応用−、臨床病理刊行会、1
983年」などに記載された方法を参考にすることがで
きる。
【0008】本発明で使用される抗体は、その由来を特
に限定されるものではなく、哺乳動物等に抗原を投与、
免疫して得られる抗血清、腹水液をそのままか、あるい
は従来公知の方法である硫酸ナトリウム沈澱法、硫酸ア
ンモニウム沈澱法、セファデックスゲルによるゲル濾過
法、イオン交換セルロースクロマトグラフィ法、電気泳
動法等(右田俊介偏「免疫化学」中山書店pp74〜8
8参照)で精製して用いることができる。あるいは、抗
原で感染した哺乳動物など(例えばマウス)の脾臓細胞
や骨髄腫細胞(ミエローマ)から雑種細胞(ハイブリド
ーマ)を得てモノクローナル抗体を作成し、これを特定
成分と特異的に結合しうる物質として使用すると特異性
が向上し、好ましい。又、これらの抗体はIgG、Ig
M、IgA、IgD、IgE各分画を用いることがで
き、或いはこれらの抗体を酵素処理してFab、Fa
b’又はF(ab’)2 といった活性抗体フラグメント
にして使用しても良い。さらに、これらの抗体は単一で
使用しても、複数の抗体を組み合わせて使用しても良
い。
に限定されるものではなく、哺乳動物等に抗原を投与、
免疫して得られる抗血清、腹水液をそのままか、あるい
は従来公知の方法である硫酸ナトリウム沈澱法、硫酸ア
ンモニウム沈澱法、セファデックスゲルによるゲル濾過
法、イオン交換セルロースクロマトグラフィ法、電気泳
動法等(右田俊介偏「免疫化学」中山書店pp74〜8
8参照)で精製して用いることができる。あるいは、抗
原で感染した哺乳動物など(例えばマウス)の脾臓細胞
や骨髄腫細胞(ミエローマ)から雑種細胞(ハイブリド
ーマ)を得てモノクローナル抗体を作成し、これを特定
成分と特異的に結合しうる物質として使用すると特異性
が向上し、好ましい。又、これらの抗体はIgG、Ig
M、IgA、IgD、IgE各分画を用いることがで
き、或いはこれらの抗体を酵素処理してFab、Fa
b’又はF(ab’)2 といった活性抗体フラグメント
にして使用しても良い。さらに、これらの抗体は単一で
使用しても、複数の抗体を組み合わせて使用しても良
い。
【0009】本発明の免疫測定方法による反応型式とし
ては、競合法、2抗体法、サンドイッチ法などが挙げら
れるが、特に限定はされない。又、他の生物活性物質
(例えば、ビオチン、アビジン)を利用した免疫測定方
法も適用できる。本発明で使用する抗原は特異抗体と反
応するものであり、ハプテン及びその誘導体を含有す
る。
ては、競合法、2抗体法、サンドイッチ法などが挙げら
れるが、特に限定はされない。又、他の生物活性物質
(例えば、ビオチン、アビジン)を利用した免疫測定方
法も適用できる。本発明で使用する抗原は特異抗体と反
応するものであり、ハプテン及びその誘導体を含有す
る。
【0010】抗体(又は抗原)を結合させる不溶化担体
として、吸水性の素材、例えば吸水性シートが用いられ
る。このような吸水性シートの材料としてはアガロー
ス、セルロース、架橋デキストラン、ポリアクリルアミ
ド、セルロース、微結晶セルロース、架橋アガロース、
架橋ポリアクリルアミド、シリカゲル、発泡ポリスチレ
ン等の発泡樹脂、濾紙、脱脂綿、パルプ、羊毛、麻など
の繊維などが挙げられる。抗体又は抗原は、これらの素
材の吸水性シートに化学的及び/又は物理的に直接、あ
るいは間接的に結合させることができる。結合法につい
ては1976年、講談社発行、千畑一郎ほか2名編「実
験と応用 アフィニティクロマトグラフィー」(第1
刷)、1975年、講談社発行、山崎誠ほか2名編「ア
フィニティクロマトグラフィー」(第1版)を参考にで
きる。
として、吸水性の素材、例えば吸水性シートが用いられ
る。このような吸水性シートの材料としてはアガロー
ス、セルロース、架橋デキストラン、ポリアクリルアミ
ド、セルロース、微結晶セルロース、架橋アガロース、
架橋ポリアクリルアミド、シリカゲル、発泡ポリスチレ
ン等の発泡樹脂、濾紙、脱脂綿、パルプ、羊毛、麻など
の繊維などが挙げられる。抗体又は抗原は、これらの素
材の吸水性シートに化学的及び/又は物理的に直接、あ
るいは間接的に結合させることができる。結合法につい
ては1976年、講談社発行、千畑一郎ほか2名編「実
験と応用 アフィニティクロマトグラフィー」(第1
刷)、1975年、講談社発行、山崎誠ほか2名編「ア
フィニティクロマトグラフィー」(第1版)を参考にで
きる。
【0011】尚、結合反応後、標識抗体(又は抗原)の
非特異反応を排除する目的で、測定すべき特異的反応に
関与しない蛋白質を担持させることができる。それらの
代表的な例としては、哺乳動物及び鳥類の正常血清蛋白
質、アルブミン、スキムミルク、乳酸醗酵物、コラーゲ
ン及びそれらの分解物質等が挙げられる。このような非
特異吸着抑制蛋白質は、吸水性シートに担持させるだけ
でなく、免疫反応時にその一定量を免疫反応溶液中に添
加することにより、一層非特異吸着の抑制効果が上が
る。
非特異反応を排除する目的で、測定すべき特異的反応に
関与しない蛋白質を担持させることができる。それらの
代表的な例としては、哺乳動物及び鳥類の正常血清蛋白
質、アルブミン、スキムミルク、乳酸醗酵物、コラーゲ
ン及びそれらの分解物質等が挙げられる。このような非
特異吸着抑制蛋白質は、吸水性シートに担持させるだけ
でなく、免疫反応時にその一定量を免疫反応溶液中に添
加することにより、一層非特異吸着の抑制効果が上が
る。
【0012】酵素標識抗体(又は抗原)は、免疫反応時
に吸水性シートに存在しておれば良く、この点から液体
試料の添加時に存在させられても良い訳であるが、予め
固定化抗体(又は抗原)と共に内在させられていること
が、使用時の作業の簡便性から好ましい訳である。本発
明に用いる分析素子(乾式分析素子)は、少なくとも一
層以上の多孔質層を持つことが好ましい。
に吸水性シートに存在しておれば良く、この点から液体
試料の添加時に存在させられても良い訳であるが、予め
固定化抗体(又は抗原)と共に内在させられていること
が、使用時の作業の簡便性から好ましい訳である。本発
明に用いる分析素子(乾式分析素子)は、少なくとも一
層以上の多孔質層を持つことが好ましい。
【0013】多孔質層の素材は特に限定されないが、好
ましい例としてはサイズ1〜350μmの粒状体あるい
は40〜400メッシュの繊維から一つ以上選ばれた素
材により構成される構造体が挙げられる。該粒状体の材
料としては、ケイ藻土、二酸化チタン、硫酸バリウム、
酸化亜鉛、酸化鉛、微結晶セルロース、ケイ砂、ガラ
ス、シリカゲル、架橋デキストリン、架橋ポリアクリル
アミド、アガロース、架橋アガロース、ポリスチレン等
の各種の合成樹脂のほか、ポリ(スチレン−グリシジル
メタクリレート)、ポリ(スチレン−メチルアクリレー
ト−グリシジルメタクリレート)のような反応性基を持
つ化合物から成る自己結合型粒子が挙げられる。
ましい例としてはサイズ1〜350μmの粒状体あるい
は40〜400メッシュの繊維から一つ以上選ばれた素
材により構成される構造体が挙げられる。該粒状体の材
料としては、ケイ藻土、二酸化チタン、硫酸バリウム、
酸化亜鉛、酸化鉛、微結晶セルロース、ケイ砂、ガラ
ス、シリカゲル、架橋デキストリン、架橋ポリアクリル
アミド、アガロース、架橋アガロース、ポリスチレン等
の各種の合成樹脂のほか、ポリ(スチレン−グリシジル
メタクリレート)、ポリ(スチレン−メチルアクリレー
ト−グリシジルメタクリレート)のような反応性基を持
つ化合物から成る自己結合型粒子が挙げられる。
【0014】又、多孔質層に用いる繊維としては、パル
プ、粉末濾紙、綿、麻、絹、羊毛、キチン、キトサン、
セルロースエステル、ビスコースレーヨン、銅アンモニ
アレーヨン、ポリアミド(6−ナイロン、6,6−ナイ
ロン、6,10−ナイロン等)、ポリエステル(ポリエ
チレンテレフタレート等)、ポリオレフィン(ポリプロ
ピレン、ビニロン等)、ガラス繊維、石綿などの植物
性、動物性、合成、半合成、再生繊維を用いることがで
き、あるいはこれらを混合して用いても良い。あるいは
別の態様としては吸水性の洋紙、和紙、濾紙、ブラッシ
ュポリマー、あるいはガラス繊維、鉱物性繊維(石綿な
ど)、植物性繊維(木綿、麻、パルプ等)、動物性繊維
(羊毛、絹など)、合成繊維(各種ナイロン、ビニロ
ン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン
等)、再生繊維(レーヨン、セルロースエステル等)な
どを単独あるいは混合して製造した織物、不織布、合成
紙などを該多孔質層に用いることもできる。
プ、粉末濾紙、綿、麻、絹、羊毛、キチン、キトサン、
セルロースエステル、ビスコースレーヨン、銅アンモニ
アレーヨン、ポリアミド(6−ナイロン、6,6−ナイ
ロン、6,10−ナイロン等)、ポリエステル(ポリエ
チレンテレフタレート等)、ポリオレフィン(ポリプロ
ピレン、ビニロン等)、ガラス繊維、石綿などの植物
性、動物性、合成、半合成、再生繊維を用いることがで
き、あるいはこれらを混合して用いても良い。あるいは
別の態様としては吸水性の洋紙、和紙、濾紙、ブラッシ
ュポリマー、あるいはガラス繊維、鉱物性繊維(石綿な
ど)、植物性繊維(木綿、麻、パルプ等)、動物性繊維
(羊毛、絹など)、合成繊維(各種ナイロン、ビニロ
ン、ポリエチレンテレフタレート、ポリプロピレン
等)、再生繊維(レーヨン、セルロースエステル等)な
どを単独あるいは混合して製造した織物、不織布、合成
紙などを該多孔質層に用いることもできる。
【0015】このような粒状体、繊維、あるいは粒状体
と繊維の混合物を塗布及び/又は製膜することにより、
自由に接触し得る相互連絡空隙孔を有する多孔性構造が
存在する多孔質層を形成する。自己結合性を有しない粒
子は適当な接着剤を用いて粒子同志が点接着する形で製
膜することができ、例えば特開昭49−53888号公
報、特開昭55−90859号公報、特開昭57−67
860号公報に記載の方法を適用することができる。自
己結合性を有する有機ポリマー粒子は特開昭57−10
1760号公報、特開昭57−101761号公報、特
開昭58−70163号公報に記載の方法により同様に
製膜できる。繊維又は繊維及び粒子の混合物については
特開昭57−125847号公報、特開昭57−197
466号公報に記載された繊維分散液を塗布することに
より多孔質層を形成できる。又、特開昭60−1734
71号公報で行われている方法のようにゼラチンやポリ
ビニルピロリドンのような水溶性バインダーを使用した
繊維分散液を塗布することも可能である。又、このとき
のバインダーは水溶性に限らず、疏水性のバインダーの
使用も可能である。このような分散液を製造する為に
は、多くの方法を単独又は組み合わせて用いることが可
能である。例えば、有用な方法の一つとして、界面活性
剤を液体キャリヤーへ添加し、粒状体及び/又は繊維の
分散液中に分布及び安定化を促進することができる。使
用可能な代表的な界面活性剤の例としては、トライトン
X−100(ロームアンドハース社製、オクチルフェノ
キシポリエトキシエタノール)、サーファクタント10
G(オリーン社製、ノニルフェノキシポリグリシドー
ル)等の非イオン性界面活性剤がある。これらの界面活
性剤は広範に選択された量を用いることが可能である
が、粒状体及び/又は繊維の重量に対して0.005〜
10重量%、好ましくは0.15〜6重量%用いること
ができる。更に、別の方法として、該粒子単位と液体キ
ャリヤーの音波処理、物理的混合、及び物理的攪拌処
理、pH調整がある。これらは前記の方法と組み合わせ
ることにより、更に有用である。
と繊維の混合物を塗布及び/又は製膜することにより、
自由に接触し得る相互連絡空隙孔を有する多孔性構造が
存在する多孔質層を形成する。自己結合性を有しない粒
子は適当な接着剤を用いて粒子同志が点接着する形で製
膜することができ、例えば特開昭49−53888号公
報、特開昭55−90859号公報、特開昭57−67
860号公報に記載の方法を適用することができる。自
己結合性を有する有機ポリマー粒子は特開昭57−10
1760号公報、特開昭57−101761号公報、特
開昭58−70163号公報に記載の方法により同様に
製膜できる。繊維又は繊維及び粒子の混合物については
特開昭57−125847号公報、特開昭57−197
466号公報に記載された繊維分散液を塗布することに
より多孔質層を形成できる。又、特開昭60−1734
71号公報で行われている方法のようにゼラチンやポリ
ビニルピロリドンのような水溶性バインダーを使用した
繊維分散液を塗布することも可能である。又、このとき
のバインダーは水溶性に限らず、疏水性のバインダーの
使用も可能である。このような分散液を製造する為に
は、多くの方法を単独又は組み合わせて用いることが可
能である。例えば、有用な方法の一つとして、界面活性
剤を液体キャリヤーへ添加し、粒状体及び/又は繊維の
分散液中に分布及び安定化を促進することができる。使
用可能な代表的な界面活性剤の例としては、トライトン
X−100(ロームアンドハース社製、オクチルフェノ
キシポリエトキシエタノール)、サーファクタント10
G(オリーン社製、ノニルフェノキシポリグリシドー
ル)等の非イオン性界面活性剤がある。これらの界面活
性剤は広範に選択された量を用いることが可能である
が、粒状体及び/又は繊維の重量に対して0.005〜
10重量%、好ましくは0.15〜6重量%用いること
ができる。更に、別の方法として、該粒子単位と液体キ
ャリヤーの音波処理、物理的混合、及び物理的攪拌処
理、pH調整がある。これらは前記の方法と組み合わせ
ることにより、更に有用である。
【0016】分析素子の形態は分析を行いうるものであ
ればよく、特に制限されるものではないが、製造上及び
測定操作上、フィルム状あるいはシート状であることが
好ましい。分析素子は一層から成っていても、多層から
成っていてもよい。例えば、酵素基質を内蔵した多孔質
層のみからなるものとか、吸水層上に多孔質層(基質が
少なくともどちらかの層に内蔵)が設けられてなるもの
とか、吸水層上に複数の多孔質層(基質が少なくとも何
れかの層に内蔵)が設けられてなるものとかが考えら
れ、必要に応じて、それらは光透過性支持体上に設けら
れたり、光反射性支持体上に設けられたり、光透過性支
持体上に設けられ、その上に光反射性層が設けられたり
する。
ればよく、特に制限されるものではないが、製造上及び
測定操作上、フィルム状あるいはシート状であることが
好ましい。分析素子は一層から成っていても、多層から
成っていてもよい。例えば、酵素基質を内蔵した多孔質
層のみからなるものとか、吸水層上に多孔質層(基質が
少なくともどちらかの層に内蔵)が設けられてなるもの
とか、吸水層上に複数の多孔質層(基質が少なくとも何
れかの層に内蔵)が設けられてなるものとかが考えら
れ、必要に応じて、それらは光透過性支持体上に設けら
れたり、光反射性支持体上に設けられたり、光透過性支
持体上に設けられ、その上に光反射性層が設けられたり
する。
【0017】尚、吸水層の素材としては、例えばゼラチ
ン、フタル化ゼラチン等のゼラチン誘導体、ポリビニル
アルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルイミダ
ゾール、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸ナトリウ
ム等の合成高分子、ヒドロキシエチルセルロース、カル
ボキシメチルセルロースナトリウム塩などのセルロース
誘導体の多糖類などが挙げられる。好ましくは、ゼラチ
ン、フタル化ゼラチン等のゼラチン誘導体である。
ン、フタル化ゼラチン等のゼラチン誘導体、ポリビニル
アルコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルイミダ
ゾール、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸ナトリウ
ム等の合成高分子、ヒドロキシエチルセルロース、カル
ボキシメチルセルロースナトリウム塩などのセルロース
誘導体の多糖類などが挙げられる。好ましくは、ゼラチ
ン、フタル化ゼラチン等のゼラチン誘導体である。
【0018】光透過性支持体の素材としては、例えば酢
酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート、ポリカー
ボネート及びポリビニル化合物(例えばポリスチレン)
のような透明高分子化合物あるいはガラスのような透明
無機化合物が挙げられる。光反射性支持体の素材として
は、例えばセラミックス、金属、あるいは樹脂被覆され
た紙などが挙げられ、必要に応じてこれらの素材中には
TiO2 、BaSO4 、マイカなどの白色顔料などを含
有又は塗布させたものでも良い。
酸セルロース、ポリエチレンテレフタレート、ポリカー
ボネート及びポリビニル化合物(例えばポリスチレン)
のような透明高分子化合物あるいはガラスのような透明
無機化合物が挙げられる。光反射性支持体の素材として
は、例えばセラミックス、金属、あるいは樹脂被覆され
た紙などが挙げられ、必要に応じてこれらの素材中には
TiO2 、BaSO4 、マイカなどの白色顔料などを含
有又は塗布させたものでも良い。
【0019】そして、例えば光透過性支持体上に基質を
内蔵した多孔質層が設けられてなる乾式分析素子が用い
られる場合には、免疫反応が行われる吸水性シートに対
してガラスウール等の毛細管現象を呈する物質を介して
乾式分析素子の多孔質層側が接合されており、吸水性シ
ート中の遊離の酵素標識抗体(又は抗原)が乾式分析素
子の多孔質層に移行し得るようになっている。すなわ
ち、免疫反応が行われた吸水性シートと乾式分析素子と
がガラスウール等の毛細管現象を呈する物質を介して接
合させられていることにより、圧力を印加した場合には
吸水性シート中の遊離の酵素標識抗体(又は抗原)が乾
式分析素子側に速やかに移動し得るので、これによる発
色信号の測定が可能である。
内蔵した多孔質層が設けられてなる乾式分析素子が用い
られる場合には、免疫反応が行われる吸水性シートに対
してガラスウール等の毛細管現象を呈する物質を介して
乾式分析素子の多孔質層側が接合されており、吸水性シ
ート中の遊離の酵素標識抗体(又は抗原)が乾式分析素
子の多孔質層に移行し得るようになっている。すなわ
ち、免疫反応が行われた吸水性シートと乾式分析素子と
がガラスウール等の毛細管現象を呈する物質を介して接
合させられていることにより、圧力を印加した場合には
吸水性シート中の遊離の酵素標識抗体(又は抗原)が乾
式分析素子側に速やかに移動し得るので、これによる発
色信号の測定が可能である。
【0020】尚、光反射性支持体上に基質を内蔵した多
孔質層が設けられてなる乾式分析素子が用いられた場合
には、免疫反応後に乾式分析素子を剥離し、信号の測定
は多孔質層側から行われる。標識に起因した信号は、紫
外線、可視光、近赤外光などを利用した吸光度法(比色
法) などで検出することができ、測定法としては信号の
経時的変化を測定するレート測定法または一定時間後の
信号を測定するエンドポイント測定法で測定することが
できる。
孔質層が設けられてなる乾式分析素子が用いられた場合
には、免疫反応後に乾式分析素子を剥離し、信号の測定
は多孔質層側から行われる。標識に起因した信号は、紫
外線、可視光、近赤外光などを利用した吸光度法(比色
法) などで検出することができ、測定法としては信号の
経時的変化を測定するレート測定法または一定時間後の
信号を測定するエンドポイント測定法で測定することが
できる。
【0021】乾式分析素子は、展開層を有するものであ
っても良い。展開層の素材としては、多孔質層と同様な
ものを塗布、製膜、貼付しても良い。又、展開層内に基
質等を内蔵させ、反応層としての役目を持たせても良
い。吸水性素材及び乾式分析素子には、他の添加剤、例
えば緩衝剤、保恒剤、界面活性剤、媒染剤等を目的に応
じて添加することができる。緩衝剤は、特異的結合反
応、酵素反応、発色反応等に適したpHとする為に含有
される。用いることができる緩衝剤としては日本化学会
編「化学便覧基礎編」(東京、丸善株式会社 196
6)pp1312〜1320、N,E,Good等; B
iochemistry Vol 5、p467(19
66)、今村、斎藤; 化学の領域、Vol30(2)、
p79(1976)、W.J.Ferguson等 A
nal.Biochem.Vol 104、p300
(1980)等の文献に記載されているものを挙げるこ
とができる。具体的な例としては、ホウ酸塩、クエン酸
塩、燐酸塩、炭酸塩、トリスバルビツール、グリシン、
グッド緩衝剤などが挙げられる。これらの緩衝剤は必要
に応じて単独で層を形成させてもよい。保恒剤は、例え
ば基質発色試薬の保存安定化の為に含有され、酸化防止
剤などがある。その物質としては、日本生化学会編「生
化学実験口座1、蛋白質の化学1」(東京化学同人株式
会社 1976) pp66,67、実験と応用「アフィ
ニティクロマトグラフィ」pp16〜104、特開昭6
0−149927号公報などに記載されているものが挙
げられる。具体的例としては、ゼラチン、ゼラチン分解
物、アルブミン、シクロデキストリン類、非還元糖類
(シュクロース、トレハロース)、ポリエチレングリコ
ール、アミノ酸、各種イオン、アジ化ソーダ等が挙げら
れる。界面活性剤としては、前述のものが挙げられる。
その他の層中に含有される試薬としては、溶解助剤、ブ
ロッカー試薬などがある。これらの添加剤は必要に応じ
て適当量添加する。媒染剤は、酵素活性測定の為の検出
物質を測光部側に集中的に集めたり、検出物質が色素の
場合吸光度係数を高めたり、波長をシフトさせる物質で
あり、検出物質と強い相互作用を示す。カチオン性ポリ
マー、アニオン性ポリマー及びこれらのポリマーのラテ
ックスが用いられる。吸水性素材又は乾式分析素子は、
さらに生体試料が血液(全血)の場合に有用な血球分離
層、必要に応じて設ける接着層、保護層、タイミング層
といった補助層を設けることができる。これらの層は、
その機能に応じて設けられるべき位置が決定される。
っても良い。展開層の素材としては、多孔質層と同様な
ものを塗布、製膜、貼付しても良い。又、展開層内に基
質等を内蔵させ、反応層としての役目を持たせても良
い。吸水性素材及び乾式分析素子には、他の添加剤、例
えば緩衝剤、保恒剤、界面活性剤、媒染剤等を目的に応
じて添加することができる。緩衝剤は、特異的結合反
応、酵素反応、発色反応等に適したpHとする為に含有
される。用いることができる緩衝剤としては日本化学会
編「化学便覧基礎編」(東京、丸善株式会社 196
6)pp1312〜1320、N,E,Good等; B
iochemistry Vol 5、p467(19
66)、今村、斎藤; 化学の領域、Vol30(2)、
p79(1976)、W.J.Ferguson等 A
nal.Biochem.Vol 104、p300
(1980)等の文献に記載されているものを挙げるこ
とができる。具体的な例としては、ホウ酸塩、クエン酸
塩、燐酸塩、炭酸塩、トリスバルビツール、グリシン、
グッド緩衝剤などが挙げられる。これらの緩衝剤は必要
に応じて単独で層を形成させてもよい。保恒剤は、例え
ば基質発色試薬の保存安定化の為に含有され、酸化防止
剤などがある。その物質としては、日本生化学会編「生
化学実験口座1、蛋白質の化学1」(東京化学同人株式
会社 1976) pp66,67、実験と応用「アフィ
ニティクロマトグラフィ」pp16〜104、特開昭6
0−149927号公報などに記載されているものが挙
げられる。具体的例としては、ゼラチン、ゼラチン分解
物、アルブミン、シクロデキストリン類、非還元糖類
(シュクロース、トレハロース)、ポリエチレングリコ
ール、アミノ酸、各種イオン、アジ化ソーダ等が挙げら
れる。界面活性剤としては、前述のものが挙げられる。
その他の層中に含有される試薬としては、溶解助剤、ブ
ロッカー試薬などがある。これらの添加剤は必要に応じ
て適当量添加する。媒染剤は、酵素活性測定の為の検出
物質を測光部側に集中的に集めたり、検出物質が色素の
場合吸光度係数を高めたり、波長をシフトさせる物質で
あり、検出物質と強い相互作用を示す。カチオン性ポリ
マー、アニオン性ポリマー及びこれらのポリマーのラテ
ックスが用いられる。吸水性素材又は乾式分析素子は、
さらに生体試料が血液(全血)の場合に有用な血球分離
層、必要に応じて設ける接着層、保護層、タイミング層
といった補助層を設けることができる。これらの層は、
その機能に応じて設けられるべき位置が決定される。
【0022】
1−(1) β−D−ガラクトシダーゼ標識抗CRP抗
体の作成 CRP抗体(ヒツジF(ab’)2 、カッペル社製)2
0mgを0.1Mのリン酸緩衝液(p6.5)2.0m
lに溶解し、これにN−(ε−マレイミドカプロイルオ
キシ)スクシンイミド(同仁化学研究所製)が2.5m
g/mlのジメチルホルムアミド溶液77μlを加え
て、30℃で20分間反応後、5mMのEDTAを含有
する0.1Mのリン酸緩衝液(pH6.0)で平衡化し
たセファデックスG−25カラムで精製し、マレイミド
化したCRP抗体を得た。
体の作成 CRP抗体(ヒツジF(ab’)2 、カッペル社製)2
0mgを0.1Mのリン酸緩衝液(p6.5)2.0m
lに溶解し、これにN−(ε−マレイミドカプロイルオ
キシ)スクシンイミド(同仁化学研究所製)が2.5m
g/mlのジメチルホルムアミド溶液77μlを加え
て、30℃で20分間反応後、5mMのEDTAを含有
する0.1Mのリン酸緩衝液(pH6.0)で平衡化し
たセファデックスG−25カラムで精製し、マレイミド
化したCRP抗体を得た。
【0023】次に、β−D−ガラクトシダーゼ(東洋紡
社製)が10.5mg/mlの0.1Mリン酸緩衝液
1.8mlに、前記マレイミド化したCRP抗体を1
3.6mg含む溶液3.2mlを加えて、4℃で45時
間反応後、0.1Mの2−メルカプトエチルアミン17
5μlを加えて30℃で20分間反応させ、0.15M
の塩化ナトリウムを含有する0.1Mリン酸緩衝液(p
H7.4)で平衡化したスーパーローズ6プレップグレ
ード(ファルマシア社製)カラムで分離、精製し、β−
D−ガラクトシダーゼ標識抗CRP抗体を得た。
社製)が10.5mg/mlの0.1Mリン酸緩衝液
1.8mlに、前記マレイミド化したCRP抗体を1
3.6mg含む溶液3.2mlを加えて、4℃で45時
間反応後、0.1Mの2−メルカプトエチルアミン17
5μlを加えて30℃で20分間反応させ、0.15M
の塩化ナトリウムを含有する0.1Mリン酸緩衝液(p
H7.4)で平衡化したスーパーローズ6プレップグレ
ード(ファルマシア社製)カラムで分離、精製し、β−
D−ガラクトシダーゼ標識抗CRP抗体を得た。
【0024】1−(2) 抗CRP抗体が固定化され、
β−D−ガラクトシダーゼ標 識抗CRP抗体を含浸した吸水性シートAの作成 トラベロン(NP300、金井重要工業社製)を0.1
5Mの塩化ナトリウムを含有する0.1Mのリン酸緩衝
液(pH7.4)40ml中に分散し、これにCRP抗
体(ウサギIgGフラクション、タウンズ社製)120
mgを入れ、40℃で20時間攪拌し、反応させた。反
応後、0.1M酢酸緩衝液(pH4.0)と0.1M炭
酸緩衝液(pH8.0)を交互に用い、充分に洗浄し
た。
β−D−ガラクトシダーゼ標 識抗CRP抗体を含浸した吸水性シートAの作成 トラベロン(NP300、金井重要工業社製)を0.1
5Mの塩化ナトリウムを含有する0.1Mのリン酸緩衝
液(pH7.4)40ml中に分散し、これにCRP抗
体(ウサギIgGフラクション、タウンズ社製)120
mgを入れ、40℃で20時間攪拌し、反応させた。反
応後、0.1M酢酸緩衝液(pH4.0)と0.1M炭
酸緩衝液(pH8.0)を交互に用い、充分に洗浄し
た。
【0025】次いで、水洗した後、3%スキムミルク添
加の0.15M塩化ナトリウム含有0.1Mリン酸緩衝
液(pH7.4)中で4℃で20時間攪拌した。そし
て、凍結乾燥した後、前記で作成したβ−D−ガラクト
シダーゼ標識抗CRP抗体の溶液(10μg/ml)5
ml中に浸し、所定時間後に取り出し、凍結乾燥し、抗
CRP抗体が固定化され、β−D−ガラクトシダーゼ標
識抗CRP抗体を含浸した抗原−抗体反応用の吸水性シ
ートAを得た。
加の0.15M塩化ナトリウム含有0.1Mリン酸緩衝
液(pH7.4)中で4℃で20時間攪拌した。そし
て、凍結乾燥した後、前記で作成したβ−D−ガラクト
シダーゼ標識抗CRP抗体の溶液(10μg/ml)5
ml中に浸し、所定時間後に取り出し、凍結乾燥し、抗
CRP抗体が固定化され、β−D−ガラクトシダーゼ標
識抗CRP抗体を含浸した抗原−抗体反応用の吸水性シ
ートAを得た。
【0026】1−(3) 分析素子Bの作成 厚さ180μmの透明な下引済ポリエチレンテレフタレ
ートフィルムの上に、下記の組成の塗布液(1)を塗布
・乾燥させ、ゼラチン層を形成させた。 塗布液−(1) 脱イオン化ゼラチン 6.0 g トライトンX−100(ロームアンドハース社製) 0.15g 1,2−ビス(ビニルスルホニル)エタン 0.01g 純水 54.0 g 次に、塗布液−(2)を前記ゼラチン層の上に塗布・乾
燥させた。
ートフィルムの上に、下記の組成の塗布液(1)を塗布
・乾燥させ、ゼラチン層を形成させた。 塗布液−(1) 脱イオン化ゼラチン 6.0 g トライトンX−100(ロームアンドハース社製) 0.15g 1,2−ビス(ビニルスルホニル)エタン 0.01g 純水 54.0 g 次に、塗布液−(2)を前記ゼラチン層の上に塗布・乾
燥させた。
【0027】 塗布液−(2) 粉末ろ紙C(東洋濾紙社製) 26.1 g ピロリドン−酢酸ビニル(2:8)共重合体 11.0 g クロロフェニルレッドβ−D−ガラクトピラノシド(ベーリンガー社製) 365 mg n−ブタノール 49.4 g これを1.5cm×1.5cmの大きさに裁断し、分析
素子Bとした。
素子Bとした。
【0028】1−(4) 免疫測定素子Dの作成 図1に示す如く、上記1−(3)で作成した分析素子B
の上方にガラスウールCを敷き、ガラスウールCの上方
に上記1−(2)で作成した抗CRP抗体が固定化さ
れ、β−D−ガラクトシダーゼ標識抗CRP抗体を含浸
した吸水性シートAを重ね合わせ、免疫測定素子Dを作
成した。
の上方にガラスウールCを敷き、ガラスウールCの上方
に上記1−(2)で作成した抗CRP抗体が固定化さ
れ、β−D−ガラクトシダーゼ標識抗CRP抗体を含浸
した吸水性シートAを重ね合わせ、免疫測定素子Dを作
成した。
【0029】1−(5) CRPの測定 1mMの塩化マグネシウム及び3重量%のウシ血清アル
ブミンを含有する0.3Mのビストリス緩衝液50μl
に、CRP溶液(0、3、10、30、100、300
μg/ml)5μlを添加混合し、その50μlを前記
1−(4)で作成した免疫測定素子Dの上方から吸水性
シートAに滴下し、10分間免疫反応させた。
ブミンを含有する0.3Mのビストリス緩衝液50μl
に、CRP溶液(0、3、10、30、100、300
μg/ml)5μlを添加混合し、その50μlを前記
1−(4)で作成した免疫測定素子Dの上方から吸水性
シートAに滴下し、10分間免疫反応させた。
【0030】この後、免疫測定素子Dの上方から応力を
与え、免疫反応を行わせた吸水性シートAと分析素子B
とを10秒間接触させた。そして、応力を解除し、37
℃でインキュベートし、546nmの反射濃度を分析素
子Bの下側から測定した。3分30秒〜7分の反射濃度
差(ΔDr)を用いて検量線を作成したので、その結果
を図2に示す。尚、図2は、本発明により作成されたC
RPの検量線を示すものである。
与え、免疫反応を行わせた吸水性シートAと分析素子B
とを10秒間接触させた。そして、応力を解除し、37
℃でインキュベートし、546nmの反射濃度を分析素
子Bの下側から測定した。3分30秒〜7分の反射濃度
差(ΔDr)を用いて検量線を作成したので、その結果
を図2に示す。尚、図2は、本発明により作成されたC
RPの検量線を示すものである。
【0031】これによればCRPが正確に測定されるこ
とが判り、又、測定は試料を吸水性シートA上に垂ら
し、その後力を加えるだけの手軽な作業で短時間のうち
に行える。すなわち、バックグラウンドノイズは小さ
く、CRPが正確に測定できるものであり、かつ、B/
F分離の為の特別な操作や液の移し換えの操作をせずと
も測定が行える。
とが判り、又、測定は試料を吸水性シートA上に垂ら
し、その後力を加えるだけの手軽な作業で短時間のうち
に行える。すなわち、バックグラウンドノイズは小さ
く、CRPが正確に測定できるものであり、かつ、B/
F分離の為の特別な操作や液の移し換えの操作をせずと
も測定が行える。
【0032】
【効果】本発明によれば、手軽な操作で、すなわちB/
F分離の為の特別な操作や液の移し換えの操作をせずと
も簡単な操作で測定が行え、しかもその測定結果はバッ
クグラウンドノイズが小さく、正確なといった特長を有
する。
F分離の為の特別な操作や液の移し換えの操作をせずと
も簡単な操作で測定が行え、しかもその測定結果はバッ
クグラウンドノイズが小さく、正確なといった特長を有
する。
【図1】本発明の免疫測定素子の概略図である。
【図2】本発明により作成されたCRPの検量線を示す
ものである。
ものである。
A 吸水性シート B 分析素子 C ガラスウール D 免疫測定素子
Claims (2)
- 【請求項1】 抗体(又は抗原)が固定化された吸水性
素材と、この吸水性素材の下方部に配設された毛細管現
象を呈する物質と、この毛細管現象を呈する物質の下方
部に配設された酵素基質を有する分析素子とを具備する
ことを特徴とする免疫測定素子。 - 【請求項2】 抗体(又は抗原)が固定化された吸水性
素材、この吸水性素材の下方部に配設された毛細管現象
を呈する物質、及びこの毛細管現象を呈する物質の下方
部に酵素基質を有する分析素子を配設させた免疫測定素
子の前記吸水性素材に対して、被検試料を供給すること
を特徴とする免疫測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28828391A JPH05126831A (ja) | 1991-11-05 | 1991-11-05 | 免疫測定素子及び免疫測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28828391A JPH05126831A (ja) | 1991-11-05 | 1991-11-05 | 免疫測定素子及び免疫測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05126831A true JPH05126831A (ja) | 1993-05-21 |
Family
ID=17728161
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP28828391A Pending JPH05126831A (ja) | 1991-11-05 | 1991-11-05 | 免疫測定素子及び免疫測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05126831A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU701834B2 (en) * | 1996-07-23 | 1999-02-04 | Roche Diagnostics Gmbh | Volume-independent diagnostic test carrier and methods in which it is used to determine an analyte |
-
1991
- 1991-11-05 JP JP28828391A patent/JPH05126831A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU701834B2 (en) * | 1996-07-23 | 1999-02-04 | Roche Diagnostics Gmbh | Volume-independent diagnostic test carrier and methods in which it is used to determine an analyte |
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