JPH04357458A - 免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、流体試料中の微量成分
、特に生物学的流体試料中の特定微量成分を測定する免
疫測定法に関するものである。

【０００２】

【発明の背景】生物学的流体試料中に極微量含有される
物質を検出する方法として、各種の分析法が開発されて
来ている。この分析法の一つとして、免疫反応をその原
理とするものがある。そして、この原理を用いた測定法
として種々のものが開発され、精度の高いものとして知
られている。すなわち、１９５８年にＢｅｒｓｏｎとＹ
ａｌｌｏｗが、放射性同位元素Ｉで標識したウシインシ
ュリンと糖尿病患者血清中の抗インシュリン抗体を用い
て、血清中のインシュリンを測定することに成功して以
来、ラジオアイソトープを用いた免疫測定法が広く用い
られて来た。

【０００３】そして、これ以後、標識物質として放射性
同位元素以外のものも種々開発されて来た。例えば、酵
素、酵素基質、補酵素、酵素阻害物質、バクテリオファ
ージ、循環反応体、金属及び有機金属の錯体、有機補欠
分子族、化学発光性反応体及び螢光性分子等が挙げられ
る。ところで、これまで、例えば二つの項目についての
情報を得ようとした場合、免疫反応を二回繰り返して行
わなければならず、すなわち各々の項目について一つ一
つ同じようにして行わなければならず、それだけ手間が
掛かっていた。

【０００４】又、試料を測定してレンジをオーバーした
時、試料を希釈して再測定を行っており、それだけ手間
が掛かっていた。

【０００５】

【発明の開示】本発明の目的は、流体試料中の特定微量
成分の測定回数が少なくても得られる情報量が多い免疫
測定法を提供することである。この本発明の目的は、流
体試料中の特定成分を、該特定成分と特異的に結合し得
る物質が固定化された不溶性担体を用いて免疫反応させ
ることにより流体試料中の特定成分を分析する免疫測定
法であって、前記不溶性担体として、免疫反応が行われ
る反応容器と、この反応容器内に入れられる不溶性物質
との双方が用いられることを特徴とする免疫測定法によ
って達成される。

【０００６】尚、反応容器に固定化した該特定成分に特
異的に結合し得る物質と不溶性物質に固定化した該特定
成分に特異的に結合し得る物質とが異なる物質である場
合には、一回の免疫反応の操作により二項目の測定が可
能となり、それだけ手間が省けるものであり、又、反応
容器に固定化した該特定成分に特異的に結合し得る物質
と不溶性物質に固定化した該特定成分に特異的に結合し
得る物質とが同一の物質であり、双方の固定化濃度が異
なる場合には、例えば低濃度に固定化した方では高値の
検体が測定でき、高濃度に固定化した方では低値の検体
が測定でき、それによってレンジを広く取ることができ
るのである。

【０００７】本発明において、試料としてはあらゆる形
態の溶液、コロイド溶液などが使用しうるが、好ましく
は生物由来の流体試料、例えば血液、血漿、血清、脳脊
髄液、唾液、羊水、乳、尿、汗、肉汁等が挙げられる。 本発明により測定しうる流体試料中での特定成分とは、
その特定成分に特異的に結合する物質が存在しうる物質
（物質群）である。すなわち、ポリペプチド、蛋白質、
複合蛋白質、多糖類、脂質、複合脂質、核酸、ホルモン
類、ビタミン類、薬剤、抗生物質、農薬等が挙げられる
。具体的には、特開昭６２−９０５３９号公報や特開昭
６３−１３１０６２号公報に記載の物質（物質群）を挙
げることができるが、これらに限定されるものではない
。

【０００８】本発明に用いられる標識物質としては通常
の免疫測定法で一般に使用できるものが使用でき、例え
ば放射性物質、発光物質、螢光物質、酵素などがその例
として挙げられ、又、酵素基質、酵素及び酵素前駆体の
活性を変化させる物質（酵素阻害物質、補欠分子族、補
酵素）、酵素前駆体、アポ酵素なども使用できる。具体
的な物質としては、特開昭６２−９０５３９号公報など
に記載のものが挙げられるが、好ましくはβ−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ、アルカリホスフォダーゼ、ペルオキシダ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルタメートデヒドロ
ゲナーゼ、アミラーゼなどの酵素、又は螢光物質である
。これらの酵素を標識物質とする場合、酵素反応系、発
色系は公知のものを使用できる。具体的には、特開昭６
１−２９２０６０号公報、特開昭６２−９０５３９号公
報、特開昭６３−１３１０６２号公報、特開昭６３−４
５５６２号公報、特願昭６３−２１９８９３号明細書に
記載の物質（物質群）が挙げられるが、これらに限定さ
れるものではない。

【０００９】そして、これら標識物質の試料中の特定成
分と特異的に結合する物質、例えば抗体（又は抗原）へ
の結合は、当業者間で知られている公知の試薬と方法で
行うことができ、例えば石川　　栄治、河合　　忠、宮
井　　潔　　編「酵素免疫測定法（第３版）、医学書院
、１９７８年」や日本臨床病理学会編「臨床病理」臨時
増刊特集第５３号「臨床検査の為のイムノアッセイ−技
術と応用−、臨床病理刊行会、１９８３年」などに記載
された方法を参考にすることができる。

【００１０】本発明で使用される抗体は、その由来を特
に限定されるものではなく、哺乳動物等に抗原を投与、
免疫して得られる抗血清、腹水液をそのままか、あるい
は従来公知の方法である硫酸ナトリウム沈澱法、硫酸ア
ンモニウム沈澱法、セファデックスゲルによるゲル濾過
法、イオン交換セルロースクロマトグラフィ法、電気泳
動法等（右田俊介偏「免疫化学」中山書店ｐｐ７４ない
し８８参照）で精製して用いることができる。あるいは
、抗原で感染した哺乳動物など（例えばマウス）の脾臓
細胞や骨髄腫細胞（ミエローマ）から雑種細胞（ハイブ
リドーマ）を得てモノクローナル抗体を作成し、これを
特定成分と特異的に結合しうる物質として使用すると特
異性が向上し、好ましい。又、これらの抗体はＩｇＧ、
ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ各分画を用いることが
でき、或いはこれらの抗体を酵素処理してＦａｂ、Ｆａ
ｂ’又はＦ（ａｂ’）２　といった活性抗体フラグメン
トにして使用しても良い。さらに、これらの抗体は単一
で使用しても、複数の抗体を組み合わせて使用しても良
い。

【００１１】本発明の免疫測定法による反応型式として
は、競合法、２抗体法、サンドイッチ法などが挙げられ
るが、サンドイッチ法が好ましい。又、他の生物活性物
質（例えば、ビオチン、アビジン）を利用した免疫測定
法も適用できる。本発明においては、流体試料中の特定
成分を測定するのに反応型式として免疫反応を挙げてい
るが、免疫反応に準ずる生物活性を示す物質の特異反応
（本明細書では、この特異反応も免疫反応に包含）を利
用することも可能である。この特異的に結合する物質の
組み合わせとしては、次のようなものが挙げられる。

【００１２】酵素と基質（生成物） 酵素と阻害剤 酵素と補欠分子族 酵素と補酵素 酵素とアロステリックエフェクター 抗体と抗原 抗体とプロテインＡ レクチンと多糖類 レクチンと糖タンパク質 核酸と相補性の塩基配列 核酸とヒストン 核酸と核酸 核酸とポリメラーゼ ホルモンと受容体 ピオチンとアビジン（ストレプトアビジン）ビオチシン
とアビジン（ストレプトアビジン）デスチオビオチンと
アビジン（ストレプトアビジン）オキシビオチンとアビ
ジン（ストレプトアビジン）本発明で使用する抗原は特
異抗体と反応するものであり、ハプテン及びその誘導体
を含有する。

【００１３】試料中の特定成分と特異的に結合する物質
、例えば抗体（又は抗原）が固定化される不溶性担体と
しては、免疫反応が行われる反応容器とこの反応容器内
に入れられる不溶性物質との双方が用いられる点に大き
な特徴が有る。反応容器としては無機ガラスやプラスチ
ック製の試験管やマイクロプレートが通常用いられる。 不溶性物質としては粒状体（ビーズ）、シート、棒、繊
維状の形態のものが通常用いられる。中でも粒状体が好
ましく用いられる。不溶性物質の材料としては、アガロ
ース、セルロース、架橋デキストラン、ポリアクリルア
ミド、セルロース、微結晶セルロース、架橋アガロース
、架橋ポリアクリルアミド、ガラス、シリカゲル、ケイ
藻土、二酸化チタン、硫酸バリウム、酸化亜鉛、酸化鉛
、ケイ砂、ポリスチレン等の各種の合成樹脂、磁性微粒
子が利用できる。好ましくはアガロース、架橋アガロー
ス、架橋デキストラン、ポリアクリルアミド、架橋ポリ
アクリルアミド、ガラス、シリカゲル、ポリスチレン、
セルロース、微結晶セルロース等であり、更に好ましく
はポリアクリルアミド、架橋ポリアクリルアミド、ポリ
スチレン、微結晶セルロース等である。

【００１４】抗体（又は抗原）は、これら不溶性担体に
、当業者で公知の方法で化学的及び／又は物理的に直接
、あるいは間接的に結合させることができる。結合法に
ついては１９７６年、講談社発行、千畑一郎ほか２名編
「実験と応用　　アフィニティクロマトグラフィー」（
第１刷）、１９７５年、講談社発行、山崎　　誠ほか２
名編「アフィニティクロマトグラフィー」（第１版）を
参考にできる。結合反応後、標識抗体（又は抗原）の非
特異反応を排除する目的で、測定すべき特異的反応に関
与しない蛋白質を担持させることができる。それらの代
表的な例としては、哺乳動物及び鳥類の正常血清蛋白質
、アルブミン、スキムミルク、乳酸醗酵物、コラーゲン
及びそれらの分解物質等が挙げられる。

【００１５】又、上記の非特異吸着抑制蛋白質は、不溶
化担体に担持させるだけでなく、免疫反応時に、その一
定量を免疫反応溶液中に添加することにより、一層非特
異吸着の抑制効果が上がる。標識に起因した信号は、吸
光度法（比色法）　、螢光法、発光法または放射活性測
定法で検出することができ、測定法としては信号の経時
的変化を測定するレート測定法または一定時間後の信号
を測定するエンドポイント測定法で測定することができ
る。好ましくは吸光度法であり、吸光度法（比色法）　
では紫外線、可視光、近赤外光を利用することができる
。

【００１６】

【実施例】以下、本発明を実施例によって更に具体的に
説明するが、本発明はこれら実施例によって限定される
ものではない。 〔実施例１〕市販の二種の癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のマ
ウスモノクローナル（フナコシ）のうちの一方を０．１
Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．５）に１０μｇ／ｍｌとなる
ように溶解し、この中に直径６．３５ｍｍのポリスチレ
ンビーズ（積水化学工業社の♯８０）を浸漬して４℃で
一晩固定化した。続いて該ビーズをリン酸緩衝生理食塩
水（ＰＢＳ）で洗浄した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液に
３７℃で２４時間浸漬し、抗ＣＥＡ抗体固定化ビーズを
得た。

【００１７】又、他方を、石川英治、河合忠、宮井潔編
「酵素免疫測定法（第３版）、医学書院、１９８７年」
ｐ１０９〜ｐ１１１に記載の方法でペルオキシダーゼを
標識して標識抗体を得た。同様にして二種のα−フェト
プロテイン（ＡＦＰ）（コスモバイオ社）のマウスモノ
クローナル抗体のうちの一方を０．１Ｍ炭酸塩緩衝液（
ｐＨ９．５）に１０μｇ／ｍｌになるように溶解し、直
径１１ｍｍのポリスチレン製試験管に２５０μｌを加え
、４℃で一晩固定化した。続いて該試験管をＰＢＳで洗
浄した後、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液を５００μｌ加え、
抗ＡＦＰ抗体固定化試験管を得た。

【００１８】又、他方をペルオキシダーゼで標識して標
識抗体を得た。該試験管中に該ビーズ及び検体５０μｌ
とＰＢＳ２００μｌの混合液を加えて、３７℃で２時間
反応させた。尚、検体はＣＥＡ及びＡＦＰの標準液を用
い、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ溶液中に下記の表−１の濃度に
各々含有させた五種類の検体を用いた。

【００１９】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　表−１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　Ｎｏ１　　Ｎｏ２　　Ｎｏ３　　Ｎｏ４　　
Ｎｏ５　　　　　　ＣＥＡ（ｎｇ／ｍｌ）　　０　　　
　　　５　　　　　　１０　　　　３０　　　　５０　
　　　　　ＡＦＰ（ｎｇ／ｍｌ）　　０　　　　１２．
５　　２５　　　　５０　　１００その後、ＰＢＳ２ｍ
ｌで３回洗浄後、抗ＣＥＡ（１０μｇ／ｍｌ）及び抗Ａ
ＦＰ（５μｇ／ｍｌ）の標識抗体の１％ＢＳＡ−ＰＢＳ
溶液２５０μｌを加え、３７℃で１時間反応させた。そ
して、ＰＢＳ２ｍｌで３回洗浄後、該ビーズを該試験管
から取り出し、抗体を固定化していない試験管に移した
。

【００２０】その後、３ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレンジ
アミンを溶解したクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０
、０．０２％過酸化水素含有）を抗体固定化試験管及び
抗体を固定化していない試験管に各々３００μｌ加え、
室温で１時間発色させた。その後、各々１Ｎ硫酸１ｍｌ
を加えて発色反応を停止し、４９２ｎｍの吸光度を測定
した。

【００２１】その結果は、図１及び図２のグラフに示す
通りであり、ＣＥＡ及びＡＦＰの双方が一回の免疫反応
操作により測定できたことが判る。 〔実施例２〕ＡＦＰのモノクローナル抗体を試験管及び
ポリスチレンビーズに各々０．５μｇ／ｍｌ及び１０μ
ｇ／ｍｌ濃度で実施例１と同様な操作で固定化を行い、
抗ＡＦＰ固定化試験管及び抗ＡＦＰ固定化ビーズを得た
。そして、これらの試験管及びビーズを用い、既知の濃
度のＡＦＰ溶液（０、１２．５、２５、５０、１００、
２００、４００、８００、１６００μｇ／ｍｌ）につい
て実施例１と同様にして測定した。

【００２２】その結果は図３に示す通りであり、低濃度
に固定化した方では高値の検体が測定でき、高濃度に固
定化した方では低値の検体が測定でき、それによってレ
ンジを広く取ることができている。

【００２３】

【効果】本発明において、反応容器に固定化した該特定
成分に特異的に結合し得る物質と不溶性物質に固定化し
た該特定成分に特異的に結合し得る物質とが異なる物質
である場合には、一回の免疫反応の操作により二項目の
測定が可能となり、それだけ手間が省けるものである。

【００２４】又、反応容器に固定化した該特定成分に特
異的に結合し得る物質と不溶性物質に固定化した該特定
成分に特異的に結合し得る物質とが同一の物質であり、
双方の固定化濃度が異なる場合には、例えば低濃度に固
定化した方では高値の検体が測定でき、高濃度に固定化
した方では低値の検体が測定でき、それによってレンジ
を広く取ることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＣＥＡの吸光度を示すグラフである。

【図２】ＡＦＰの吸光度を示すグラフである。

【図３】ＡＦＰの吸光度を示すグラフである。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　流体試料中の特定成分を、該特定成分
   と特異的に結合し得る物質が固定化された不溶性担体を
   用いて免疫反応させることにより流体試料中の特定成分
   を分析する免疫測定法であって、前記不溶性担体として
   、免疫反応が行われる反応容器と、この反応容器内に入
   れられる不溶性物質との双方が用いられることを特徴と
   する免疫測定法。
2. 【請求項２】　　反応容器に固定化した該特定成分に特
   異的に結合し得る物質と、不溶性物質に固定化した該特
   定成分に特異的に結合し得る物質とが異なる物質である
   ことを特徴とする請求項１の免疫測定法。
3. 【請求項３】　　反応容器に固定化した該特定成分に特
   異的に結合し得る物質と、不溶性物質に固定化した該特
   定成分に特異的に結合し得る物質とは同一の物質であり
   、双方の固定化濃度が異なることを特徴とする請求項１
   の免疫測定法。