JPH04360867A - アミノ基が保護された４−ヒドロキシプロリン又は４−ヒドロキシプロリン誘導体の精製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、４−ヒドロキシプロリ
ン含有ペプチドの化学的合成を可能とするアミノ基が保
護された４−ヒドロキシプロリン又は４−ヒドロキシプ
ロリン誘導体の精製法に関する。

【０００２】

【従来の技術】イ貝、フジツボ等の貝類の分泌する接着
性タンパク質はポリテトラフルオロエチレン等の低エネ
ルギー表面に対して強い接着力をもっている。この接着
性タンパク質に豊富に含まれている構成アミノ酸の一つ
は４−ヒドロキシプロリンで、４−ヒドロキシプロリン
は接着機構に深く関与していると推定されている。その
ため、４−ヒドロキシプロリンを含有するペプチドは新
しい接着剤への応用が期待される。また、４−ヒドロキ
シプロリンは高等動物の神経に生理活性を示すペプチド
、例えば海ヘビの神経毒のペプチド等にも多量含まれて
いる。そのため、４−ヒドロキシプロリンを含有するペ
プチドは医薬品への応用も期待されるところである。 このような理由から、４−ヒドロキシプロリンを含むペ
プチドを、通常のアミノ酸を含むペプチドと同様に化学
合成する技術が強く望まれていた。

【０００３】いっぽう、ラパトサニス（Ｌ．　Ｌａｐａ
ｔｓａｎｉｓ）らは、９−フルオレニルメトキシカルボ
ニル基（Ｆｍｏｃ基）を４−ヒドロキシプロリンの主鎖
のアミノ基へ導入した誘導体を初めて合成した（Ｓｙｎ
ｔｈｅｓｉｓ，　１９８３，　６７１−６７３）。この
方法は、４−ヒドロキシプロリンの水溶液と炭酸ナトリ
ウムの水溶液の混合溶液に、９−フルオレニルメチル−
Ｎ−スクシンイミヂルカーボネートのジメチルホルムア
ミド溶液（又はジオキサン溶液）を加え、反応後、酢酸
エチルで未反応物や副反応物を除き、水層を濃塩酸でｐ
Ｈ２に調整したのち、目的物を酢酸エチルで抽出し、石
油エーテルを加えて再結晶するものである。

【０００４】また、本発明者らは先に、トリエチルアミ
ン存在下に４−ヒドロキシプロリンと９−フルオレニル
メチルペンタフルオロフェニルカーボネートを反応させ
、反応生成物をジエチルエーテルで抽出したのち、ジエ
チルエーテルから再結晶して、アミノ基が保護された４
−ヒドロキシプロリンを得ている（特願平３−７７４９
４号）。上述のように、上記の２方法においては、アミ
ノ基がＦｍｏｃ基で保護された４−ヒドロキシプロリン
の精製手段はいずれも再結晶によっている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかし、再結晶法で９
−フルオレニルメトキシカルボニル−４−ヒドロキシプ
ロリンを精製する方法は、結晶化に長時間を要し、また
得られる結晶は比較的硬いので、これをジエチルエーテ
ル、酢酸エチル、アセトニトリル等の有機溶媒に溶かす
のに時間がかかる。本発明は、短時間に精製でき、しか
も得られたものが有機溶媒に容易に溶ける、アミノ基が
保護された４−ヒドロキシプロリン又は４−ヒドロキシ
プロリン誘導体の精製法を提供するものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、反応液の
脱水のため、反応液に加える無水硫酸マグネシウムの量
を検討している過程で、脱水に必要な最低の量以上の無
水硫酸マグネシウムを加えると、意外にも、目的物であ
るアミノ基が保護された４−ヒドロキシプロリン又は４
−ヒドロキシプロリン誘導体が硫酸マグネシウムに吸着
されることを見出し、本発明を完成した。

【０００７】すなわち、本発明は、目的物を無水硫酸マ
グネシウムに吸着させる工程を含んでなる、化２

【化２
】 （化２中、Ｒは水素、低級アルキル基又はアリール基を
表す）で表されるアミノ基が保護された４−ヒドロキシ
プロリン又は４−ヒドロキシプロリン誘導体の精製法に
関する。

【０００８】本発明で用いる硫酸マグネシウムは、結晶
水を含まない無水のものがよい。この無水塩は市販品を
容易に入手することができる。用いる硫酸マグネシウム
の量は、反応液に含まれる水を吸着するほか、化２で表
される目的物のアミノ基が保護された４−ヒドロキシプ
ロリン又は４−ヒドロキシプロリン誘導体を吸着するの
に十分な量とする。硫酸マグネシウムに目的物を吸着さ
せるときの温度及び処理時間は、用いる硫酸マグネシウ
ムの量や、反応系に含まれる水分等によっても変わるの
で、適宜最適な条件を選んで設定すればよいが、おおむ
ね、温度は０〜３５℃、処理時間は１〜２４時間である
。

【０００９】目的物を吸着した硫酸マグネシウムからの
、目的物の回収は次のようにして行えばよい。すなわち
、目的物を吸着させた硫酸マグネシウムを濾過等の方法
で採り、エーテル等の適当な有機溶媒で洗浄したのち、
ｐＨ約２の塩酸水溶液で溶解する。化２で表される化合
物はこの操作では溶けない。不溶物を採り、アセトニト
リル等の水と混じりあう有機溶媒で洗ったのち、減圧乾
燥等の方法等で乾燥し、精製品とする。本発明で得られ
る化２で表される化合物のカルボキシル基及び／又は側
鎖の官能基を適当な保護基で保護した化合物と、アミノ
基、カルボキシル基及び／又は側鎖の官能基を適当な保
護基で保護した通常のアミノ酸を原料として、配列中に
ヒドロキシプロリンを含有するペプチドを化学的に合成
する。

【００１０】本発明で得られた化合物の１Ｈ核磁気共鳴
スペクトルを、吸収のある部分について図１〜図４（比
較例は図５〜図８）に、赤外線吸収スペクトルを図９（
比較例は図１０）に、高速液体クロマトグラフの結果を
表１中の試料１（比較例は試料２）に、元素分析値の結
果を表２中の試料１（比較例は試料２）に、それぞれ示
した。これらの結果から、本発明で得られる化合物はＮ
−９−フルオレニルメトキシカルボニル−４−ヒドロキ
シ−Ｌ−プロリンであることが確認できた。

【００１１】なお、１Ｈ核磁気共鳴スペクトルは核磁気
共鳴装置（ブルカー社製、ＡＣ−２５０型）により測定
し、高速液体クロマトグラフィー（本体：ウオーターズ
社製、６００シリーズ）はカラムにマイクロボンダスフ
ェア（μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ）５μｃ１８−１００
Å（３．９ｍｍ×１５ｃｍ、ウオーターズ社製）を用い
、展開溶媒は水とアセトニトリルの５０：５０の混合液
、流量は１．０ｍｌ／ｍｉｎ，検出波長は２５４ｎｍで
行い、赤外線吸収スペクトルは赤外分析装置（日立製２
７０−５０型）を用いＫＢｒ錠剤法で測定した。

【表１】

【表２】

【００１２】

【実施例】

実施例 トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（アルドリッ
チ社製）３．９３ｇ（３０ミリモル）に蒸留水１００ｍ
ｌを加えて溶かし、これに９−フルオレニルメチル−Ｎ
−スクシンイミヂルカーボネート（ケンブリッジ・リサ
ーチ・バイオケミカルズ社製）１１．１７ｇ（３３ミリ
モル）をアセトニトリル１５０ｍｌに溶かした溶液を加
えた。この混合溶液を氷水で冷却しながら、トリエチル
アミン（関東化学社製）１５ｍｌを少量ずつ加え、３０
分間撹拌したのち、室温で更に３時間撹拌した。反応液
に、蒸留水１００ｍｌ及び塩化ナトリウム１５．３ｇを
加え、ジエチルエーテル５０ｍｌで３回洗浄し、水層を
濃塩酸でｐＨを２以下に調整した。この溶液を、ジエチ
ルエーテル１００ｍｌで３回抽出し、エーテル層に無水
硫酸マグネシウム（関東化学社製）を３０ｇ加え、一晩
室温に放置したのち、ミリカップ濾紙（ミリポア社製）
で濾過した。ミリカップ濾紙上の残渣を約１Ｎの塩酸水
溶液５０ｍｌで２回洗浄したのち、軽く減圧濾過しなが
ら水をアセトニトリルで置換し、その後減圧乾燥して、
反応生成物６．３２ｇ（収率：６０％）を得た。

【００１３】比較例 トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（アルドリッ
チ社製）３．９３ｇ（３０ミリモル）に蒸留水１００ｍ
ｌを加えて溶かし、これに９−フルオレニルメチル−Ｎ
−スクシンイミヂルカーボネート（ケンブリッジ・リサ
ーチ・バイオケミカルズ社製）１０．１２ｇ（３０ミリ
モル）をアセトニトリル１５０ｍｌに溶かした溶液を加
えた。この混合溶液を氷水で冷却しながら、トリエチル
アミン（関東化学社製）１５ｍｌを少量ずつ加え、２０
分間撹拌した。反応混合溶液に、蒸留水１５０ｍｌ及び
塩化ナトリウム１６ｇを加え、ジエチルエーテル５０ｍ
ｌで３回洗浄し、水層を濃塩酸でｐＨを２以下に調整し
た。この溶液を、ジエチルエーテル１００ｍｌで３回抽
出し、エーテル層に脱水のため、無水硫酸マグネシウム
（関東化学社製）を３ｇ加え、一晩室温に放置したのち
、硫酸マグネシウムを濾過で除き、濾液をロータリーエ
バポレータで約５ｍｌまで濃縮し、結晶化させ、反応生
成物６．５２ｇ（収率：６１％）を得た。

【００１４】

【発明の効果】本発明は、アミノ基がＦｍｏｃ基で保護
された高純度な４−ヒドロキシプロリン及びその誘導体
を短時間に精製する方法を提供するものである。これに
より４−ヒドロキシプロリン含有ペプチドの化学的合成
が容易となった。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例で得た化合物（Ｎ−９−フルオレニルメ
トキシカルボニル−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン）の
化学シフト１．８〜３．７ｐｐｍにおける１Ｈ核磁気共
鳴スペクトルである。

【図２】実施例で得た化合物（Ｎ−９−フルオレニルメ
トキシカルボニル−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン）の
化学シフト４．０〜５．４ｐｐｍにおける１Ｈ核磁気共
鳴スペクトルである。

【図３】実施例で得た化合物（Ｎ−９−フルオレニルメ
トキシカルボニル−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン）の
化学シフト７．０〜８．１ｐｐｍにおける１Ｈ核磁気共
鳴スペクトルである。

【図４】実施例で得た化合物（Ｎ−９−フルオレニルメ
トキシカルボニル−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン）の
化学シフト１２．２〜１３．２ｐｐｍにおける１Ｈ核磁
気共鳴スペクトルである。

【図５】比較例で得た化合物（Ｎ−９−フルオレニルメ
トキシカルボニル−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン）の
化学シフト１．８〜３．７ｐｐｍにおける１Ｈ核磁気共
鳴スペクトルである。

【図６】比較例で得た化合物（Ｎ−９−フルオレニルメ
トキシカルボニル−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン）の
化学シフト４．０〜５．４ｐｐｍにおける１Ｈ核磁気共
鳴スペクトルである。

【図７】比較例で得た化合物（Ｎ−９−フルオレニルメ
トキシカルボニル−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン）の
化学シフト７．０〜８．１ｐｐｍにおける１Ｈ核磁気共
鳴スペクトルである。

【図８】比較例で得た化合物（Ｎ−９−フルオレニルメ
トキシカルボニル−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン）の
化学シフト１２．２〜１３．２ｐｐｍにおける１Ｈ核磁
気共鳴スペクトルである。

【図９】実施例で得た化合物（Ｎ−９−フルオレニルメ
トキシカルボニル−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン）の
赤外線吸収スペクトルである。

【図１０】比較例で得た化合物（Ｎ−９−フルオレニル
メトキシカルボニル−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン）
の赤外線吸収スペクトルである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】目的物を無水硫酸マグネシウムに吸着させ
   る工程を含んでなる、化１ 【化１】 （化１中、Ｒは水素、低級アルキル基又はアリール基を
   表す）で表されるアミノ基が保護された４−ヒドロキシ
   プロリン又は４−ヒドロキシプロリン誘導体の精製法。