JPH04364132A - 免疫グロブリン用吸着材および抗原用吸着材 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、免疫療法や免疫学的
検査（イムノアッセイ）等に用られる免疫グロブリン用
吸着材および抗原用吸着材に関する。

【０００２】

【従来の技術】免疫グロブリンは、血液中に出現し、自
己免疫疾患、アレルギーなどの原因に関係があると考え
られている。このため、免疫グロブリンの関係する疾患
などの検査や治療のために、免疫グロブリンを選択的に
吸着する免疫グロブリン用吸着材が使用されている。

【０００３】免疫グロブリン用吸着材としては、近年、
キトサンを用いたものが種々提案されている。これは、
キトサンが免疫グロブリンの吸着能を有するからである
。たとえば、特開昭５７−６３６２号公報では、キトサ
ンの有するアミノ基やヒドロキシル基と反応しうる官能
基を少なくとも２個有する化合物とキトサンとを活性炭
やシリコーン樹脂製ディスクなどの固体表面上で反応さ
せて該固体表面上にキトサン皮膜を形成させ、このキト
サン皮膜と免疫反応性物質とを結合させてなる吸着材が
開示されている。この吸着材において免疫反応性物質が
抗原である場合には、この吸着材は免疫グロブリンと特
異的に結合する。特開昭６２−５３６６９号公報では、
球状またはビーズ状のキトサン担体にカップリング剤を
介して複素環式化合物を結合させてなる吸着材が開示さ
れている。特開昭６４−７２７５４号公報では、キトサ
ンもしくはキトサン誘導体を造粒して得られる、粒径が
５０〜５０００μｍφの多孔質粒状体を、アルデヒド基
、カルボキシル基、エポキシ基およびイソシアナート基
から選ばれた官能基を１分子中に２個以上有する多官能
性架橋剤を用いて架橋させ、不溶不融化させた免疫グロ
ブリン選択吸着材が開示されている。

【０００４】他方、免疫グロブリンに含まれる抗体は、
生体中に生成した抗原と抗原抗体反応により特異的に結
合するため、酵素免疫測定法などに利用される。上記特
開昭５７−６３６２号公報記載の吸着材において免疫反
応性物質が免疫グロブリンである場合には、この吸着材
は抗原と特異的に結合するため、抗原の検出や分離に利
用できる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記各公報で開示され
た吸着材は、キトサンの吸着機能の発現に有効な官能基
であるアミノ基が架橋や化学反応のために消費され、本
来の吸着機能を十分に発揮できない。しかも、キトサン
だけでなく担体への固定化や架橋に用いられる化学物質
の溶出または脱離を起こすという問題を有する。特に、
臨床に使われた場合に、架橋剤などの物質が脱離して患
者の血中に流入する可能性がある。キトサン自身を粒子
状に加工して用いる場合には、粒子内部においては吸着
に対する活性が利用されておらず、むだが多い。

【０００６】そこで、この発明は、免疫グロブリンの吸
着性能が著しく改善され、しかも、化学薬品の溶出また
は脱離が起こらない免疫グロブリン用吸着材を提供する
ことを第１の課題とし、免疫グロブリンの吸着量が従来
のものよりも多く、しかも、化学薬品の溶出または脱離
が起こらない抗原用吸着材を提供することを第２の課題
とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記第１の課題を解決す
るために、この発明は、ポリスルホン系樹脂からなる担
体にキトサンが固定化されてなる免疫グロブリン用吸着
材を提供する。上記第２の課題を解決するために、この
発明は、免疫グロブリン用吸着材に免疫グロブリンが固
定化されてなる抗原用吸着材において、前記免疫グロブ
リン用吸着材として、ポリスルホン系樹脂からなる担体
にキトサンが固定化されてなるものが用いられているこ
とを特徴とする抗原用吸着材を提供する。

【０００８】キトサンは、Ｄ−グルコサミンを単位とし
たβ−（１，４）結合を有する多糖類であり、通常、カ
ニ、エビ等の甲殻類の外皮構成物質であるキチンを苛性
ソーダ水溶液との強熱処理などにより脱アセチル化して
得られるが、製造方法には特に制限はない。この発明に
用いるキトサンの脱アセチル化度は、たとえば、５０〜
１００％が好ましく、７０〜１００％がより好ましい。 キトサンの脱アセチル化度がこの範囲を外れると溶解性
が低く均一な溶液にするのが困難である。また、キトサ
ンの平均分子量は、たとえば、５０万〜１５０万が好ま
しい。キトサンの平均分子量がこの範囲よりも小さくな
るとキトサン自身の性能が不均一で吸着性能等の再現性
が得られないことがあり、その範囲よりも大きくなると
溶液が粘稠となり、使用しにくくなるおそれがある。

【０００９】この発明では、キトサンを固着させるため
の担体としてポリスルホン系樹脂を使用する。ポリスル
ホン系樹脂としては、ポリスルホンおよびポリエーテル
スルホンのいずれか一方または両方を使用する。担体の
形態には特に制限はないが、たとえば、膜（またはフィ
ルム）、粒状体、その他成形体などがあり、特に、多孔
質の膜であることが好ましい。これは、ポリスルホン系
樹脂が疎水性を有するため、後述するようにしてキトサ
ンを担持させるときにキトサン水溶液をはじきやすいが
、アルコール等で湿潤処理をすると、多孔質であれば、
孔にキトサン水溶液が入り込みやすくなり、キトサンを
確実にかつ多量に担持させることができる。多孔質の膜
は表面積が大きくなるためキトサンが固着されうる面積
が非常に大きくなり好ましい。しかも、膜だと、ビーズ
などの形態よりも取扱が容易である。多孔質の膜である
場合、その孔径は、たとえば、０．０５〜５μｍが好ま
しく、０．１〜１μｍがより好ましい。膜厚は、０．０
５〜０．５ｍｍが好ましく、０．１〜０．３ｍｍがより
好ましい。

【００１０】ポリスルホン系樹脂製の担体は、たとえば
従来公知の方法で作られたものが使用される。多孔質の
膜である場合も、異方性であると等方性であるとを問わ
ずに使用できる。そのような素材からなる担体にキトサ
ンを固着するには、たとえば次のように行う。キトサン
を酸性の水溶液に溶解し、キトサン水溶液を調製する。 酸性の水溶液としては、たとえば、酢酸の数％水溶液な
どが使用される。キトサン水溶液のキトサン濃度は、た
とえば、０．０５〜１重量％が好ましく、０．１〜０．
５重量％がより好ましい。この範囲よりも低い場合は免
疫グロブリンの吸着効率が小さいおそれがあり、高い場
合は粘性が高く均一固着しないおそれがある。アルコー
ル水溶液に前記担体を浸漬し、取り出して直ぐに水中に
入れるという上記湿潤処理の終わった湿潤担体をキトサ
ン水溶液と接触させる。この接触は、たとえば、浸漬、
コーティング、多孔膜の場合は濾過などにより行われる
。ここでコーティングは、たとえば、担体表面にキトサ
ンの皮膜が形成されている状態であり、担体が多孔質で
ある場合には、内部表面（空隙内の表面）も含めてキト
サンの皮膜が形成されている状態である。担体とキトサ
ン水溶液の接触時間は、たとえば、０．５〜１時間とさ
れ、この範囲よりも短いとキトサンの固着量が少なくな
るおそれがあり、長くても固着量に大きな変化がない。 その後、乾燥させてから塩基性水溶液と接触させる。一
旦乾燥させることによりキトサン水溶液が塩基性水溶液
中に流出するのを防ぐ。塩基性水溶液との接触は、キト
サン塩から元のキトサンとするために行われる。塩基性
水溶液としては、たとえば、ＮａＯＨ，ＫＯＨ，Ｃａ（
ＯＨ）２などの０．５〜４％水溶液などが使用される。 その後、洗浄を行う。

【００１１】他方、ポリスルホン系樹脂担体を作るとき
にキトサンを添加しておいても、この発明の免疫グロブ
リン用吸着材が得られる。すなわち、この発明の免疫グ
ロブリン用吸着材は、ポリスルホン系樹脂の担体の表面
上にキトサンが固定化されている必要はなく、担体中に
含有されていてその一部が表面に臨んでいてもよいので
ある。その製造方法は、たとえば、ポリスルホン系樹脂
を溶剤に溶かし、さらにキトサンを添加した液をキャス
トすることにより得られる。

【００１２】この発明の免疫グロブリン用吸着材は、担
体であるポリスルホン系樹脂と固着されているキトサン
との相乗効果により、免疫グロブリン、特にγ−グロブ
リンを選択的に吸着することができ、しかも、吸着量が
従来の免疫グロブリン用吸着材よりも多くなっている。 この発明の免疫グロブリン用吸着材は、たとえば、免疫
系に絡んだ疾患の治療として血中の抗体あるいは抗体抗
原複合体を血中から選択的に除去する場合に血漿分離交
換法より効率の良い方法として用いられる可能性が考え
られる。

【００１３】上記のようにして得られた免疫グロブリン
用吸着材に免疫グロブリンを固定化させると、従来より
も優れた抗原吸着能力を持つ抗原用吸着材になる。免疫
グロブリンの固定化方法は、特に制限はないが、たとえ
ば次のようなやり方が採用される。すなわち、上記吸着
材を免疫グロブリンを含む液中に浸漬する。あるいは、
吸着材と免疫グロブリンとの間に多官能性化学物質を介
して化学結合させても良い。

【００１４】この発明の抗原用吸着材は、たとえば、抗
原吸着材の免疫グロブリンに対応する抗体さらに酵素で
マークした抗体を特異的に結合させ、この複合体に基質
を加えて呈色させ、目的の抗原を検出する診断薬材料と
して用いられる。

【００１５】

【作用】ポリスルホン系樹脂からなる担体にキトサンを
固着してなる免疫グロブリン用吸着材は、免疫グロブリ
ンの吸着量が高く、牛血清アルブミンとの選択性を持つ
ようになる。この吸着能は、ポリスルホン系樹脂と、キ
トサンとのいずれか一方だけの場合に比べて相乗的に高
くなっている。このような相乗効果は、前記担体とキト
サンとの組み合わせに特異的に見られる。

【００１６】しかも、前記担体へのキトサンの固着は、
通常、物理吸着という簡単な手段で強固に行うことがで
き、架橋剤やカップリング剤が不要になる。キトサンは
、一般に中性〜アルカリ性の水には溶出しにくく、また
、仮に溶出したとしても生体への悪影響はほとんどない
。免疫グロブリン用吸着材に免疫グロブリンを吸着させ
ると、免疫グロブリンの吸着量の高い抗原用吸着材が得
られる。このような抗原用吸着材には、抗原がより多く
吸着されるため、これを診断材料等に使用する場合に抗
原検出力に優れるといった利点がある。

【００１７】担体として、上記素材の多孔膜を用いると
、吸着効率が良いため、操作が迅速となるといった利点
がある。

【００１８】

【実施例】以下に、この発明の具体的な実施例および比
較例を示すが、この発明は下記実施例に限定されない。 −実施例１− （株）加ト吉製キトサン（商品名キトサン７Ｂ、公称平
均分子量１００万〜１５０万、脱アセチル化度７０％）
を３重量％酢酸水溶液中に溶解して０．１重量％溶液と
した。この溶液に９９．５％のエタノールに浸漬した後
水中に浸漬したポリエーテルスルホンからなる孔径０．
４５μｍの多孔膜を浸漬して２時間静置した。その後、
膜を溶液より引き上げ、室温で６時間乾燥した。次に、
この膜を水酸化ナトリウム２重量％水溶液中に浸漬し、
３０分後にこの水溶液より引き上げ、流水で充分に水洗
した。さらに、この膜を乾燥し、キトサン固着ポリエー
テルスルホン膜を得た。キトサンの膜への固着は、たと
えば、酸性染料での染色により確認できる。

【００１９】−比較例１− 実施例１において、ポリエーテルスルホンからなる多孔
膜の代わりに再生セルロースからなる多孔膜を用いたこ
と以外は実施例１と同様にして、キトサン固着再生セル
ロース膜を得た。 −比較例２− 実施例１において、ポリエーテルスルホンからなる多孔
膜の代わりにナイロンからなる多孔膜を用いたこと以外
は実施例１と同様にして、キトサン固着ナイロン膜を得
た。

【００２０】−比較例３− ノニオン系界面活性剤（エマルゲン８１０、花王（株）
製）の０．１重量％水溶液にポリエーテルスルホンから
なる孔径０．４５μｍの多孔膜を浸漬して２時間静置し
た。その後、膜を溶液より引き上げ、室温で６時間乾燥
した。次に、この膜を充分に水洗した後、乾燥して界面
活性剤固着ポリエーテルスルホン膜を得た。

【００２１】上記実施例および比較例で得られた各キト
サン固着膜、比較例で得られた界面活性剤固着膜、およ
び、固着処理前の多孔膜〔ポリエーテルスルホン（比較
例４）、ナイロン（比較例５）、再生セルロース（比較
例６）〕について、固着処理前後の膜の重量測定からキ
トサンの固着量を求めた。各固着膜をγ−グロブリンお
よび牛血清アルブミンの２つのリン酸バッファー溶液（
蛋白質濃度１００ｐｐｍ、ｐＨ７）にそれぞれ別々に浸
漬し、蛋白質の吸着処理を行った。この吸着処理は、３
０℃で２時間振とうして行った。膜への吸着量（μｇ／
ｃｍ２　）は、この吸着処理前後の蛋白溶液の濃度変化
より算出した。濃度は、ＵＶ２８０ｎｍでの吸光度測定
により求めた。結果を表１に示した。なお、ポリエーテ
ルスルホンの多孔膜については、まずアルコール（エタ
ノール）で濡らし、このアルコールを水に置換していっ
て吸着処理を行った。

【００２２】

【表１】

【００２３】表１の結果から次のことがわかる。再生セ
ルロースの多孔膜は、上記２つの蛋白質を全く吸着しな
いし、キトサンを固着させても全く吸着しない。ナイロ
ンの多孔膜は、ある程度γ−グロブリンを選択的に吸着
するが、吸着量が低く、キトサンの固着によりγ−グロ
ブリンの吸着量は若干低下する。ポリエーテルスルホン
の多孔膜は、元来水をはじくため、水溶液の透過が困難
である。そこでアルコールから水への置換を利用して吸
着を行うと、γ−グロブリンと牛血清アルブミンの吸着
に選択性は全くない。常法に従って界面活性剤で親水性
を付与した場合（比較例３）には、γ−グロブリンと牛
血清アルブミンの吸着量が極端に低下してしまう。これ
に対し、ポリエーテルスルホンの多孔膜にキトサンを固
着した実施例では、γ−グロブリンの吸着量が比較例２
の約２倍と非常に高く、かつ、牛血清アルブミンの吸着
量がほとんどない。すなわち、キトサンを固着する対象
の材質を特定することによりγ−グロブリンの吸着量が
格段に向上し、しかも、牛血清アルブミンの吸着量とに
大きな差が生じるのである。

【００２４】−実施例２および比較例７，８−実施例１
および比較例１，２で得られた各キトサン固着膜をγ−
グロブリンのリン酸バッファー溶液（γ−グロブリン１
００ｐｐｍ、ｐＨ７）にそれぞれ浸漬し、γ−グロブリ
ンの固定化処理を行った。それぞれ実施例２および比較
例７，８とする。この固定化処理は、３０℃で２時間振
とうして行った。膜への固定化量（μｇ／ｃｍ２　）は
、この固定化処理前後のγ−グロブリン溶液の濃度変化
より算出した。濃度は、ＵＶ２８０ｎｍでの吸光度測定
により求めた。結果を表２に示した。

【００２５】実施例２および比較例７，８で得られたγ
−グロブリン固定化膜を用いて酵素免疫測定法を行った
。そのやり方は次のとおりである。各膜をそれぞれマイ
クロプレートにセットし、各試料についてウサギ血清原
液とさらにそれを５段階（１／１０、１／１００、１／
１０００、１／１００００）に希釈したものを各々のホ
ールに滴下した。次にカゼインでブロッキング操作を行
い、さらにβ−ガラクトシターゼで標識した抗ウサギＩ
ｇＧを各ホールに所定量滴下した。最後に上記酵素の基
質であるＣＰＲＧを滴下し、呈色させた。この呈色状況
を目視で観察し、膜の性能を次の３つの面より評価した
。 〔感度〕 １／１００００に希釈した血清液を滴下した膜が呈色す
るか。

【００２６】○：濃く呈色する ×：うすく呈色する 〔非特異的吸着性〕血清の代わりにイオン交換水を滴下
した膜が呈色しないか。 ○：呈色しない ×：呈色する 〔吸着容量〕血清原液を滴下した膜が濃く呈色するか。

【００２７】○：濃く呈色する ×：うすく呈色する

【００２８】

【表２】

【００２９】表２にみるように、実施例２の膜は、比較
例のものに比べて抗原の検出力が優れていた。

【００３０】

【発明の効果】この発明の免疫グロブリン用吸着材は、
免疫グロブリンを吸着する能力が高く、選択性があり、
しかも、この吸着材の有するキトサンが仮に溶出したと
しても生体への悪影響はほとんどない。この発明の抗原
用吸着材は、免疫グロブリンの吸着量が高く、しかも、
選択的に吸着されているため、抗原を吸着する能力が高
い。

【００３１】このため、この発明の免疫グロブリン用吸
着材および抗原用吸着材は、免疫治療や免疫学的検査な
どの免疫的手法に有用である。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ポリスルホン系樹脂からなる担体にキ
   トサンが固定化されてなる免疫グロブリン用吸着材。
2. 【請求項２】　　担体が多孔膜である請求項１記載の免
   疫グロブリン用吸着材。
3. 【請求項３】　　免疫グロブリン用吸着材に免疫グロブ
   リンが固定化されてなる抗原用吸着材において、前記免
   疫グロブリン用吸着材として、ポリスルホン系樹脂から
   なる担体にキトサンが固定化されてなるものが用いられ
   ていることを特徴とする抗原用吸着材。
4. 【請求項４】　　免疫グロブリンがγ−グロブリンであ
   る請求項３記載の抗原用吸着材。
5. 【請求項５】　　担体が多孔膜である請求項３または４
   記載の抗原用吸着材。