JPH043952B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、オートラジオグラフイーによる遺伝
子のスクリーニング方法に関するものである。

近年、急激に発展して来た分子生物学において
は、生物体の機能や複製のメカニズムを解明する
ために、生物体のもつ遺伝情報を明らかにするこ
とが必須となつている。このためには、生物体の
組織あるいは生物体由来の物質中に特定の遺伝情
報を担う遺伝子が存在するか否かを判定したり、
さらには目的とする遺伝子を選別したのち採取す
ること、すなわち遺伝子のスクリーニングが不可
欠となつている。また遺伝子工学においては、組
み換えがなされたDNAの存在を確認したり、そ
れを選別採取することが欠くことのできない手段
となつている。

さらに、上記の遺伝子のスクリーニングは、病
気、特に遺伝病の診断においても該当する遺伝子
の同定を行なう際の有望な手段となつている。た
とえば、癌等の病気に対しては分子レベルでの迅
速な診断が渇望されている。また、妊婦において
は母体中の胎児が先天性異常を有しているか否か
を検査する方法の確立が望まれている。これらの
病気の診断が、遺伝子レベルでの変化を検出する
ことによつて行なわれうることは大きな意味があ
る。

従つて、上述のような種々の分野において、特
定の遺伝情報を担う遺伝子を検出もしくは選別す
ることは非常に重要な手段である。しかしなが
ら、遺伝子の検出、選別を行なう際には目的の遺
伝子が遺伝子群の中に占める割合が非常に小さい
ため、その実施が非常に困難なものとなつてい
る。

遺伝子を検出、選別する方法として、これまで
種々の方法が試みられてきたが、その主なものと
しては、目的遺伝子の分子量、化学的特性等を利
用するカラムクロマトグラフイーまたは電気泳動
法などの分析化学的方法、目的遺伝子の薬剤耐
性、酵素活性など、その遺伝子の発現する形質を
利用する生物学的方法、および目的遺伝子の二本
鎖DNAまたはDNAとRNAとの相補性を利用す
るハイブリダイゼーシヨン法などのプローブ法が
挙げられる。

上記の方法のうちで、分析化学的方法は、遺伝
子が微量であり、かつ目的遺伝子が遺伝子群に占
める割合が小さいために目的とする遺伝子のみを
選択的に検出あるいは分離することが非常に難し
く、実用性に欠けるものである。また、生物学的
方法は、その生物体が目的の遺伝子を有していて
も適当な生物学的条件が満たされない場合には、
その目的遺伝子に関連した形質が必ずしも発現す
るとは限らないという欠点がある。これら二方法
に対して、プローブ法は、遺伝子が本質的に有し
ている相補性を利用するものであり、また操作が
簡単であるという大きな利点もある。

たとえば、プローブ法の代表的な手法であるサ
ザン・ブロツテイング（Southern blotting）法
によるハイブリダイゼーシヨン法を利用した遺伝
子のスクリーニング方法は、以下のような操作に
より実施される。

まず、目的とする遺伝子を含む多数のDNA（も
しくはDNA断片）を電気泳動などの方法で媒体
上に分離展開する。

次に、媒体上の二本鎖DNAを変性
（denaturation）して一本鎖のDNAとしたのち、
転写支持体としてニトロセルロースフイルターを
用いて、この変性DNAの少なくとも一部を転写
支持体上に転写（transfer）し、固定させる。そ
して、得られた転写支持体上でハイブリダイゼー
シヨン処理を行なう。

ハイブリダイゼーシヨンを行なうに際しては、
まず、目的とする遺伝子のDNAに対して相補的
な関係を有するDNAもしくはRNAを放射性標識
することによりプローブを作成する。次に、この
放射性標識が付与された特定のDNAもしくは
RNAと転写支持体上の変性DNAとをハイブリダ
イズさせる。従つて、転写支持体上では目的遺伝
子を有するDNAのみが、放射性標識が付与され
たDNAもしくはRNAとハイブリツドを形成し、
放射性標識が付与される。

すなわち目的遺伝子を有する変性DNAは、加
温処理によりこれと相補的な放射性標識された
DNAもしくはRNAとハイブリダイズして、転写
支持体上では二本鎖のDNAの形成
（renaturation）もしくはDNA・RNA結合体の
形成が行なわれる。

ハイブリダイゼーシヨンが終了したのち、転写
支持体についてオートラジオグラフイー操作を行
なうことにより、目的遺伝子を有するDNAを検
出する。またさらに、目的遺伝子を有するDNA
を固定したのち、このDNAのみを分離展開用の
媒体から選択採取することもできる。

異常に記載したようなサザン・ブロツテイング
（または、サザン・トランスフアーともいう）に
基づくハイブリダイゼーシヨン法を利用した遺伝
子のスクリーニングによつて、目的遺伝子を有す
るDNAを検出、同定することができる。

また、ハイブリダイゼーシヨン法を利用する遺
伝子のスクリーニングとしては、ノアザン・ブロ
ツテイング（Northern blotting）法を利用する
スクリーニング方法も挙げることができる。

ノアザン・ブロツテイング（または、ノアザ
ン・トランスフアーともいう）法では、検体が
RNAもしくはRNA断片であり、放射性標識プロ
ーブとして放射性標識されたDNAを用いて、転
写支持体上で上記と同様にしてハイブリツドを形
成させる操作が行なわれる。

なお、上記に要約したサザン・ブロツテイング
法を利用する遺伝子のスクリーニング方法、およ
びノアザン・ブロツテイング法を利用する遺伝子
のスクリーニング方法については次の文献に詳細
に記載されている。

METHODS IN ENZYMOLOGY，VOL.68，
P.152〜P.176，P.220〜P.242，edited by Ray
Wu，ACADEMIC PRESS，NEW YORK，
1979） 『蛋白質 核酸 酵素』VOL.26，No.４，P.584
〜P.590（1981） 従来において、上記の遺伝子のスクリーニング
に利用されるオートラジオグラフイーは、捕獲さ
れた放射性標識プローブを保持する転写支持体と
高感度Ｘ線フイルムなどの放射線フイルムとを一
定時間重ね合わせて、該フイルムを感光（あるい
は、露光）させることによつて行なわれている。
また、オートラジオグラフイーの検出感度を高め
るために増感紙を用いることも行なわれている。
このようなオートラジオグラフイーについては、
たとえば、次に示す文献に記載されている。

生化学実験講座６ トレーサー実験法（上）
271〜289頁、『8.オートラジオグラフイー』末吉
徹、重松昭世（1977年、(株)東京化学同人刊） 上述のように、オートラジオグラフイーは遺伝
子のスクリーニングにおいて、目的遺伝子を検出
するための重要な手段となつている。さらに、そ
のオートラジオグラフが有する主として二次元的
な位置情報を基にして、目的遺伝子の同定および
目的遺伝子の分離、精製が可能となるため、非常
に有用な手段であるということができる。しかし
ながら、このように有用なオートラジオグラフイ
ーを上記のハイブリダイゼーシヨン法を利用する
遺伝子のスクリーニングに適用するにあたつて
は、いくつかの問題がある。

その第一は、放射性標識物質を含む転写支持体
上の放射性物質を可視化するために、その転写支
持体と高感度Ｘ線フイルムなどの放射線フイルム
とを一定時間重ね合わせて、該フイルムを感光
（露光）させることが行なわれているが、この露
光操作が長時間を必要とする点である。すなわ
ち、従来のスクリーニングにおけるオートラジオ
グフイーの露光操作は通常、数日間かけて実施さ
れている。また露光操作を、増感紙を使用して行
なつた場合でも数十時間を要している。これは、
転写支持体上に固定されたDNAなどの核酸の量
が少ないこと、および放射性標識物質（放射性標
識プローブ）が一般に ³²P等で部分的に標識され
た核酸であるため、高い放射性が付与されていな
いことによる。

第二には、この露光操作は通常、低温（たとえ
ば、０℃〜−80℃）で行なわなければならない点
である。その理由は、室温などの比較的高い温度
では、放射線または蛍光による感光によつて形成
されたフイルム上の銀塩中の潜像が退行して現像
できない像となりやすく、また、上記のハイブリ
ダイズ処理後の転写支持体から、銀塩に対して有
害な成分が移動するなどして化学カブリを形成し
やすいからである。さらに、蛍光増感紙を用いて
増感露光を行なう場合には、増感紙からの発光の
輝度が低いため、室温のような比較的高い温度で
は、潜像を形成しにくいという銀塩の特性にも依
つている。

第三には、化学カブリなどによる画質の低下を
防ぐために、放射性標識物質を含む転写支持体を
乾燥した状態で放射線フイルムと重ね合わせて露
光させなければならない点である。このため、通
常は転写支持体の乾燥もしくは合成樹脂フイルム
等による転写支持体の包装が行なわれている。

オートラジオグラフイーによつて得られた画像
にこのようなカブリが発生すると、ハイブリダイ
ズされた核酸との区別がつけられず、スクリーニ
ングの効果を著しく低下させることになる。

以上の理由により、オートラジオグフイーの操
作が煩雑なものとなつており、このことにより遺
伝子のスクリーニング操作全体が煩雑になつてい
る。

また、放射線フイルムの感光成分である銀塩は
物理的な刺激にも影響されやすく、露光操作時に
おける操作担当者の手あるいは機器との接触など
に起因する物理的圧力などによつて物理的カブリ
現象を起こす傾向がある。この点も遺伝子のスク
リーニングの精度を低下させる原因となり、その
ような放射線フイルムの物理カブリの発生を回避
するためには、その取扱い作業において高度の熟
練と注意とを必要とし、スクリーニング操作をさ
らに複雑にする結果となる。

また、従来のオートラジオグラフイーでは上記
のように長時間の露光操作が行なわれるため、放
射性標識物質以外に転写支持体に混入した不純物
による放射能または自然放射能もまた放射線フイ
ルムの露光に関与し、得られる放射性標識物質の
位置情報の精度を低下させるとの問題がある。そ
のような妨害を排除して適切な露光条件を設定す
るためには、たとえば、対照試料を用いた並行実
験の実施、露光時間の適正化などが図られている
が、並行実験の実施による実験回数の増大、好適
な露光時間の決定を行なうための予備実験の必要
性などにより、その操作全体が煩雑になるとの欠
点がある。

さらに、目的遺伝子を採取する場合には、転写
支持体のオートラジオグラフが可視化されている
放射線フイルムと、試料である核酸などが分離展
開されている媒体とを重ね合わせて、放射性標識
物質によつて感光された部分に対応する核酸等の
遺伝子を操作担当者の目測によつて同定し、採取
する方法が利用されている。従つて、転写支持体
の露光操作等における諸条件が適切でないなどの
理由で、可視化されたオートラジオグラフが好適
な画像（すなわち、位置情報）を有していない場
合には、遺伝子のスクリーニングの精度が低下
し、さらにはスクリーニングが不可能となり、ス
クリーニングの操作回数が増大する結果となる。

特に、サザン・ブロツテイング法などを利用す
る遺伝子のスクリーニング方法は非常に鋭敏な検
出方法であり、この方法を利用して行なわれる遺
伝病等の診断では、ヒトゲノムDNAから単一に
存在するジーンを検出することが要求されるもの
である。従つて、上述のような種々の原因による
オートラジオグラフ像の精度の低下を防ぎ、遺伝
子のスクリーニングの精度を向上させることが望
まれている。

本発明者は、従来のオートラジオグラフイーに
よる遺伝子のスクリーニング方法において附随す
る上記のような問題点の解決を目的として鋭意研
究を行なつた結果、感光材料として放射線フイル
ムの代りに、輝尽性蛍光体を含有してなる蛍光体
層を有する蓄積性蛍光体シートを用いることによ
り、前記の問題点の解決あるいは欠点の低減が実
現することを見出し、本発明に到達した。

すなわち、本発明は、ハイブリダイゼーシヨン
法を利用する遺伝子のスクリーニング方法におい
て、 (1) 媒体上に分離展開された核酸、その断片物も
しくはそれらの誘導体の少なくとも一部を転写
支持体上に転写して固定する工程； (2) 転写支持体上に固定された該核酸、その断片
物もしくはそれらの誘導体と放射性標識が付与
されたプローブとをハイブリダイズさせる工
程； および (3) ハイブリダイズ処理後に、該転写支持体と輝
尽性蛍光体を含有する蓄積性蛍光体シートとを
約10〜35℃の温度にて一定時間重ね合わせるこ
とにより、該転写支持体上の放射性標識物質か
ら放出される放射線エネルギーの少なくとも一
部を該蓄積性蛍光体シートに吸収させたのち、
該シートを電磁波により励起して該シートに蓄
積されている放射線エネルギーを輝尽光として
放出させ、そしてその輝尽光を検出することに
より、該転写支持体上の放射性標識物質の位置
情報を得る工程； および (4) 得られた位置情報に基づいて、該媒体上の核
酸、その、断片物もしくはそれらの誘導体を採
取する工程； からなるオートラジオグラフイーによる遺伝子の
スクリーニング方法を提供するものである。

なお、本発明において転写支持体上の放射性標
識物質の「位置情報」とは、転写支持体上におけ
る放射性標識物質もしくはその集合体の位置を中
心とする各種の情報、たとえば、転写支持体上に
存在する放射性物質の集合体の存在位置と形状、
その位置における放射性物質の濃度、分布などか
らなる情報の一つもしくは任意の組合わせとして
得られる各種の情報を意味する。

本発明において使用する蓄積性蛍光体シートは
放射線像変換パネルとも呼ばれものであり、その
例は、たとえば特開昭55−12145号公報などに記
載されており、一般的な構成としては既に公知で
ある。

すなわち、蓄積性蛍光体シートは輝尽性蛍光体
からなるものであり、複写体を透過した放射線エ
ネルギー、あるいは被検体から発せられた放射線
エネルギーを該シートの輝尽性蛍光体に吸収さ
せ、そののちに該シートを可視光線および赤外線
などの電磁波（励起光）を用いて励起することに
より、該シートの輝尽性蛍光体中に蓄積されてい
る放射線エネルギーを蛍光として放出させること
ができるものである。この蛍光を光電的に読み取
つて電気信号に変換し、得られた電気信号を写真
フイルムなどの記録材料、CRTなどの表示装置
上に可視画像として再生するか、あるいは数値化
もしくは記号化した位置上方などとして表わすこ
とができる。

本発明の方法によれば、転写支持体に捕獲され
た放射性標識物質を検出し、さらには目的遺伝子
を同定するためのオートラジオグラフイーにおい
て、従来のオートラジオグラフイーで用いられて
いる放射線フイルム、あるいはそれと増感紙との
組合わせの代りに、輝尽性蛍光体を含有してなる
蓄積性蛍光体シートを用いることにより、露光時
間の大幅な短縮化が実現されるのみでなく、露光
が環境温度あるいはその付近の温度という温度条
件で行なわれても、得られる放射性標識物質の検
出の精度は低下することがない。従つて、従来に
おいては冷却下で長時間かけて実施されていた露
光操作が著しく簡便なものとなり、放射性標識物
質の検出および目的遺伝子の同定ためのオートラ
ジオグラフイー操作が簡略化されるものである。

そして、オートラジオグラフイーにおける露光
時間の大幅な短縮化が実現することにより、一回
のスクリーニングに要する時間が短縮される。

また、感光材料として蓄積性蛍光体シートを使
用した場合には、蓄積性蛍光体シートに蓄積記録
された放射性標識物質の位置情報を得るために特
に画像化する必要はなく、その蓄積性蛍光体シー
トをレーザーなどの電磁波で走査することにより
上記の位置情報を読み出し、その位置情報を画
像、記号および／または数値、あるいはそれらの
組合わせなどの任意な形態に変えて取り出すこと
が可能となる。さらに、上記の位置情報を電気的
手段などを利用して更に処理することにより、所
望の各種の形態で必要な情報を入手することも可
能である。

このことは、得られた放射性物質の位置情報に
基づく目的遺伝子の有無の判定、さらにはこの位
置情報に基づいて目的遺伝子を採取する際の操作
を著しく容易にし、従つてスクリーニングの精度
を高めてその効率を向上させることが可能となる
ことを意味する。

さらに、オートラジオグラフイーの感光材料と
して上記の蓄積性蛍光体シートを利用することに
より、従来、放射線フイルムの使用において大き
な問題となつていた化学カブリおよび物理カブリ
が実質的に発生しなくなる点も、スクリーニング
の精度の向上および作業性において非常に有利に
作用する。また、転写支持体中に含まれていた不
純物の放射能または自然放射能などに起因する精
度の低下は、蓄積性蛍光体シートに蓄積記録され
ている位置情報を電気的に処理することにより容
易に低減あるいは解消することが可能となる。特
に、サザン・ブロツテイング法などを利用する遺
伝子のスクリーニング方法は非常に鋭敏な検出方
法であるため、得られるオートラジオグラフの精
度を向上させることにより目的遺伝子の検出精度
を高め、さらにその検出感度を高められることは
大きな意味がある。

以下に、本発明のオートラジオグラフイーによ
る遺伝子のスクリーニング方法について、サザ
ン・ブロツテイング法を利用する遺伝子のスクリ
ーニング方法を例にとり、添付図面の第１図に示
した模式図を用いて具体的に説明する。

第１図は、本発明に従うハイブリダイゼーシヨ
ン法を利用する遺伝子のスクリーニング方法を模
式的に示す図である。

まず、目的とする遺伝子からなるDNA断片を
含む複数のDNA断片を、ゲル支持媒体上で電気
泳動を行なうことにより分離展開する［第１図
ａ；１ａ：DNA断片、２ａ：媒体］。得られた支
持媒体上のDNA断片はのちの目的遺伝子の検出、
同定のために、染色した後、その写真を撮つてお
くのが望ましい。

次に、支持媒体上に分離展開されたDNA断片
をアルカリ処理により変性（denaturation）して
一本鎖のDNAとする。次いで公知のサザン法に
従つて、このゲル支持媒体と転写支持体であるニ
トロセルロースフイルターとを空気が入らないよ
うに重ね合わせて３時間〜一夜放置することによ
り、毛細管法にて転写支持体上に変性DNA断片
の少なくとも一部を転写（トランスフアー）する
［第１図ｂ；１ｂ：変性DNA断片、２ｂ：転写支
持体］。従つて、転写支持体上に得られたDNA断
片の分離展開列は、ゲル支持媒体上の分離展開列
とその位置関係が鏡像関係にある。

DNAの転写操作に用いられる転写支持体の例
としては、ニトロセルロースからなるメンブレン
フイルター、濾紙などを挙げることができる。

得られた転写支持体上の変性DNA断片につい
て次に加温処理を施して固定する。

一方、目的とする遺伝子のDNAと相補的な
DNAもしくはRNAを放射性標識することにより
プローブを調製する。上記プローブは、目的とす
るDNAと相補的な塩基配列を有するDNAもしく
はRNAの末端を ³²P等の放射性同位元素で標識
することにより得られる。あるいは、プローブは
目的とするDNAと同一の塩基配列を有する未標
識の二本鎖DNAの片方の鎖に、エンドヌクレア
ーゼによりニツク（切れ目）を入れたのち、
DNAポリメラーゼにより、その片方の鎖のニ
ツクされた位置から順に各ヌクレオチドを除去
し、同時に放射性標識されたヌクレオチドを導入
することからなるニツク・トランスレーシヨン法
によつても得られる。この方法によれば、比活性
（比放射能）の高いプローブを得ることができる。

次いで、上記の放射性標識プローブと転写支持
体上の変性DNA断片とを加温処理によりハイブ
リダイズさせる。すなわち、放射性標識プローブ
を含む転写支持体を加温することにより、二本鎖
DNAの形成（renaturation）もしくはDNA・
RNA結合体の形成を行なう。この時、転写支持
体上の変性DNA断片は固定されているから、プ
ローブDNAもしくはプローブRNAと相補的な
DNA断片のみが、ハイブリダイズして放射性標
識プローブを捕獲する。その後適当な溶液でハイ
ブリツドを形成しなかつたプローブを洗い流すこ
とにより、転写支持体上では目的遺伝子を有する
DNA断片のみが、放射性標識が付与されたDNA
もしくはRNAとハイブリツドを形成し、放射性
標識が付与される［第１図ｃ；１ｃ：ハイブリダ
イズしたDNA断片、２ｃ：ハイブリダイズしな
かつたDNA断片、３ｃ：転写支持体］。ただし、
これらのDNA断片は視覚的には区別できない。

この際に、放射性物質を含有するインクなどを
用いて転写支持体に印を付けることにより、転写
支持体と得られるオートラジオグラフとの対応す
る位置がわかるようにしておくのが望ましい。

なお、ハイブリダイゼーシヨンによりDNA・
DNA結合体（ハイブリツド）を形成させる場合
には、プローブの一本鎖DNAが転写支持体上に
非特異的に吸着することに起因するオートラジオ
グラフイーにおけるノイズの発生を防止するため
に、ハイブリダイゼーシヨンの前処理として種々
のポリマー溶液を用いて転写支持体をマスキング
するのが望ましい。

ハイブリツド形成により放射性標識物質が捕獲
されている転写支持体について、オートラジオグ
ラフ測定を行なうことにより、目的遺伝子を有す
るDNA断片の検出、同定を行なう。

本発明の特徴的な要件である二次元的に分布し
た目的遺伝子の位置情報を得るためのオートラジ
オグラフイーは、まず、上記転写支持体と蓄積性
蛍光体シートとを一定時間重ね合わせて露光操作
を行なうことにより、転写支持体上の放射性標識
物質から放出される放射線の少なくとも一部を該
シートに吸収させる。

露光操作において、上記の転写支持体と蓄積性
蛍光体シートとを重ね合わせた状態は、通常は蓄
積性蛍光体シートと密着させることにより実現す
るが、必ずしも転写支持体と蓄積性蛍光体シート
とを密着させる必要はなく、それらが近接した状
態で配置されていてもよい。また、転写支持体は
必ずしも乾燥状態とする必要はなく、湿つていて
もよいし、あるいは所望によりプローブからの放
射線を妨げない程度の厚みのポリエチレンシート
等で包まれていてもよい。

また、いわゆる露光時間は、転写支持体に含ま
れる放射性標識物質の放射線強度、該物質の量、
蓄積性蛍光体シートの感度、および転写支持体と
蓄積性蛍光体シートとの位置関係などにより変動
するが、露光操作は一定時間、たとえば数秒程度
以上は必要とする。ただし、本発明に従つて感光
材料として蓄積性蛍光体シートを用いた場合に
は、従来の放射線フイルムを使用する場合に必要
な露光時間に比較して、その露光時間は大幅に短
縮される。また、露光により転写支持体から蓄積
性蛍光体シートに蓄積記録された転写支持体中の
放射性標識物質の位置情報を読み出す操作におい
て、該シートに蓄積されているエネルギーの強
さ、分布、所望とする情報などに応じて各種の電
気的処理を施すことにより、たとえば得られる電
気信号の増幅率を任意の値に設定できるなど、得
られる位置情報を好適に処理することが可能とな
るため、露光操作時における露光時間の厳密な制
御は特に必要とはしない。

本発明における蓄積性蛍光体シートを利用した
オートラジオグラフイーは、約10〜35℃などの環
境温度にて実施することが可能となる。ただし、
従来のオートラジオグラフイーにおいて利用され
ている低温（たとえば５℃付近、あるいはそれ以
下の温度）において露光操作を行なうことも差し
つかえない。

上記オートラジオグラフイーにおいて好適に使
用される蓄積性蛍光体シートは、一般に基本構造
として、支持体と、この支持体上に設けられた輝
尽性蛍光体を分散状態で含有支持する結合剤から
なる蛍光体層とから構成される。ただし、蛍光体
層が自己支持性である場合には、必ずしも支持体
を設ける必要はない。

上記の構成を有する蓄積性蛍光体シートは、た
とえば、次に述べるような方法により製造するこ
とができる。

まず、輝尽性蛍光体粒子と結合剤とを適当な溶
剤（たとえば、低級アルコール、塩素原子含有炭
化水素、ケトン、エステル、エーテル）に加え、
これを充分に混合して、結合剤溶液中に輝尽性蛍
光体が均一に分散した塗布液を調製する。

結合剤の例としては、ゼラチン等の蛋白質、ポ
リ酢酸ビニル、ニトロセルロース、ポリウレタ
ン、ポリビニルアルコール、線状ポリエステルな
どような合成高分子物質などにより代表される結
合剤を挙げることができる。

塗布液における結合剤と輝尽性蛍光体との混合
比は、通常１：８乃至１：40（重量比）の範囲か
ら選ばれる。

次に、この塗布液を支持体の表面に均一に塗布
することにより塗布液の塗膜を形成する。この塗
膜を徐々に加熱することにより乾燥して、支持体
上への蛍光体層の形成を完了する。蛍光体層の層
厚は、一般に50乃至500μｍである。

支持体としては、従来の放射線写真法における
増感紙（または増感スクリーン）の支持体として
用いられている各種の材料から任意に選ぶことが
できる。そのような材料の例としては、セルロー
スアセテート、ポリエチレンテレフタレートなど
のプラスチツク物質のフイルム、アルミニウム箔
などの金属シート、通常の紙、バライタ紙、レジ
ンコート紙などを挙げることができる。

なお、支持体の蛍光体層が設けられる側の表面
には、接着性付与層、光反射層、光吸収層などが
設けられていてもよい。

さらに、蛍光体層の支持体に接する側とは反対
側の表面に、蛍光体層を物理的および化学的に保
護するための透明な保護膜が設けられていてもよ
い。透明保護膜に用いられる材料の例としては、
酢酸セルロース、ポリメチルメタクリレート、ポ
リエチレンテレフタレート、ポリエチレンを挙げ
ることができる。透明保護膜の膜厚は、通常は約
0.1乃至20μｍである。

また、蓄積性蛍光体シートの表面は必要に応じ
て、親水化処理などの表面処理が施されていても
よい。

本発明において利用される蓄積性蛍光体シート
に用いられる輝尽性蛍光体は、先に述べたように
放射線を照射した後、励起光を照射すると輝尽発
光を示す蛍光体であるが、実用的な面からは400
〜850nｍの波長範囲の励起光によつて300〜500n
ｍの波長範囲の輝尽発光を示す蛍光体であること
が望ましい。そのような輝尽性蛍光体の例として
は、 米国特許第3859527号明細書に記載されている
SrS：Ce、Sm、SrS：Eu、Sm、ThO₂：Er、お
よびLa₂O₂S：Eu、Smなどの組成式で表わされ
る蛍光体、 特開昭55−12142号公報に記載されている
ZnS：Cu、Pb、BaO・xAl₂O₃：Eu［ただし、0.8
≦ｘ≦10］、および、M²⁺O・xSiO₂：Ａ［ただし、
M²⁺はMg、Ca、Sr、Zn、Cd、またはBaであり、
ＡはCe、Tb、Eu、Tm、Pb、Tl、Bi、または
Mnであり、ｘは、0.5≦ｘ≦2.5である］などの
組成式で表わされる蛍光体、 特開昭55−12143号公報に記載されている
（Ba_1-x-y、Mg_x、Ca_y）FX：aEu²⁺［ただし、Ｘ
はClおよびBrのうちの少なくとも一つであり、
ｘおよびｙは、０＜ｘ＋ｙ≦0.6、かつxy≠０で
あり、ａは、10^-6≦ａ≦５×10^-2である］の組成
式で表わされる蛍光体、 特開昭55−12144号公報に記載されている
LuOX：xA［ただし、LnはLa、Ｙ、Gd、および
Luのうちの少なくとも一つ、ＸはClおよびBrの
うちの少なくとも一つ、ＡはCeおよびTbのうち
の少なくとも一つ、そして、ｘは、０＜ｘ＜0.1
である］の組成式で表わされる蛍光体、 特開昭55−12145号公報に記載されている
（Ba_1-x、M〓_x）FX：yA［ただし、M〓はMg、
Ca、Sr、Zn、およびCdのうちの少なくとも一
つ、ＸはCl、Br、およびＩのうちの少なくとも
一つ、ＡはEu、Tb、Ce、Tm、Dy、Pr、Ho、
Nd、Yb、およびErのうちの少なくとも一つ、そ
してｘは、０≦ｘ≦0.6、ｙは、０≦ｙ≦0.2であ
る］の組成式で表わされる蛍光体、 特開昭55−160078号公報に記載されているM〓
FX・xA：yLn［ただし、M〓はBa、Ca、Sr、
Mg、Zn、およびCdのうちの少なくとも一種、Ａ
はBeO、MgO、CaO、SrO、BaO、ZnO、
Al₂O₃、Y₂O₃、La₂O₃、In₂O₃、SiO₂、TiO₂、
ZrO₂、GeO₂、SnO₂、Nb₂O₅、Ta₂O₅、および
ThO₂のうちの少なくとも一種、LnはEu、Tb、
Ce、Tm、Dy、Pr、Ho、Nd、Yb、Er、Sm、
およびGdのうちの少なくとも一種、ＸはCl、
Br、およびＩのうちの少なくとも一種であり、
ｘおよびｙはそれぞれ５×10^-5≦ｘ≦0.5、およ
び０＜ｙ≦0.2である］の組成式で表わされる蛍
光体、 特開昭56−116777号公報に記載されている
（Ba_1-x、M〓_x）F₂・aBaX₂：yEu、zA［ただし、
M〓はベリリウム、マグネシウム、カルシウム、
ストロンチウム、亜鉛、およびカドミウムのうち
の少なくとも一種、Ｘは塩素、臭素、および沃素
のうちの少なくとも一種、Ａはジルコニウムおよ
びスカンジウムのうちの少なくとも一種であり、
ａ、ｘ、ｙ、およびｚはそれぞれ0.5≦ａ≦1.25、
０≦ｘ≦１、10^-6≦ｙ≦２×10^-1、および０＜ｚ
≦10^-2である］の組成式で表わされる蛍光体、 特開昭57−23673号公報に記載されている
（Ba_1-x、M〓_x）F₂・aBaX₂：yEu、zB［ただし、
M〓はベリリウム、マグネシウム、カルシウム、
ストロンチウム、亜鉛、およびカドミウムのうち
の少なくとも一種、Ｘは塩素、臭素、および沃素
のうちの少なくとも一種であり、ａ、ｘ、ｙ、お
よびｚはそれぞれ0.5≦ａ≦1.25、０≦ｘ≦１、
10^-6≦ｙ≦２×10^-1、および０＜ｚ≦２×10^-1で
ある］の組成式で表わされる蛍光体、 特開昭57−23675号公報に記載されている
（Ba_1-x、M〓_x）F₂・aBaX₂：yEu、zA［ただし、
M〓はベリリウム、マグネシウム、カルシウム、
ストロンチウム、亜鉛、およびカドミウムのうち
の少なくとも一種、Ｘは塩素、臭素、および沃素
のうちの少なくとも一種、Ａは砒素および硅素の
うちの少なくとも一種であり、ａ、ｘ、ｙ、およ
びｚはそれぞれ0.5≦ａ≦1.25、０≦ｘ≦１、10^-6
≦ｙ≦２×10^-1、および０＜ｚ≦５×10^-1であ
る］の組成式で表わされる蛍光体、 本出願人による特願昭56−167498号明細書（特
開昭58−69281号公報）に記載されているM〓
OX：xCe［ただし、M〓はPr、Nd、Pm、Sm、
Eu、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、およびBiか
らなる群より選ばれる少なくとも一種の三価金属
であり、ＸはClおよびBrのうちのいずれか一方
あるいはその両方であり、ｘは０＜ｘ＜0.1であ
る］の組成式で表わされる蛍光体、 本出願人による特願昭57−89875号明細書（特
開昭58−206678号公報）に記載されているBa_1-x
M_x12L_x12FX：_yEu²⁺［ただし、Ｍは、Li、Na、
Ｋ、Rb、およびCsからなる群より選ばれる少な
くとも一種のアルカリ金属を表わし；Ｌは、Sc、
Ｙ、La、Ce、Pr、Nd、Pm、Sm、Gd、Tb、
Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、Al、Ga、In、お
よびTlからなる群より選ばれる少なくとも一種
の三価金属を表わし；Ｘは、Cl、Br、およびＩ
からなる群より選ばれる少なくとも一種のハロゲ
ンを表わし；そして、ｘは10^-2≦ｘ≦0.5、ｙは
０＜ｙ≦0.1である］の組成式で表わせれる蛍光
体、 本出願人による特願昭57−137374号明細書（特
開昭59−27980号公報）に記載されている
BaFX・xA：yEu²⁺［ただし、Ｘは、Cl、Br、お
よびＩからなる群より選ばれる少なくとも一種の
ハロゲンであり；Ａは、テトラフルオロホウ酸化
合物の焼成物であり；そして、ｘは10^-6≦ｘ≦
0.1、ｙは０＜ｙ≦0.1である］の組成式で表わさ
れる蛍光体、 本出願人による特願昭57−158047号明細書（特
開昭59−47289号公報）に記載されている
BaFX・xA：7Eu²⁺［ただし、Ｘは、Cl、Br、お
よびＩからなる群よる選ばれる少なくとも一種の
ハロゲンであり；Ａは、ヘキサフルオロケイ酸、
ヘキサフルオロチタン酸およびヘキサフルオロジ
ルコニウム酸の一価もしくは二価金属の塩からな
るヘキサフルオロ化合物群塩より選ばれる少なく
とも一種の化合物の焼成物であり；そして、ｘは
10^-6≦ｘ≦0.1、ｙは０＜ｙ≦0.1である］の組成
式で表わされる蛍光体、 本出願人による特願昭57−166320号明細書（特
開昭59−56479号公報）に記載されている
BaFX・xNaX′：aEu²⁺［ただし、ＸおよびX′は、
それぞれCl、Br、およびＩのうちの少なくとも
一種であり、ｘおよびａはそれぞれ０＜ｘ≦２、
および０＜ａ≦0.2である］の組成式で表わされ
る蛍光体、 本出願人による特願昭57−166696号明細書（特
開昭59−56480号公報）に記載されているM〓
FX・xNaX′：yEu²⁺zA［ただし、M〓は、Ba、
Sr、およびCaからなる群より選ばれる少なくと
も一種のアルカリ土類金属であり；Ｘおよび
X′は、それぞれCl、Br、およびＩからなる群よ
り選ばれる少なくとも一種のハロゲンであり；Ａ
は、Ｖ、Cr、Mn、Fe、Co、およびNiより選ば
れる少なくとも一種の遷移金属であり；そして、
ｘは０＜ｘ≦２、ｙは０＜ｙ≦0.2、およびｚは
０＜ｚ≦10^-2である］の組成式で表わされる蛍光
体、 本出願人による特願昭57−184455号明細書（特
開昭59−75200号公報）に記載されているM〓
FX・aM〓X′・bM′〓X″₂・cM〓Ｘ₃・xA：
yEu²⁺［ただし、M〓はBa、Sr、およびCaからな
る群より選ばれる少なくとも一種のアルカリ土類
金属であり；M〓はLi、Na、Ｋ、Rb、およびCs
からなる群より選ばれる少なくとも一種のアルカ
リ金属であり；M′〓はBeおよびMgからなる群よ
り選ばれる少なくとも一種の二価金属であり；
M〓はAl、Ga、In、およびTlからなる群より選
ばれる少なくとも一種の三価金属であり；Ａは金
属酸化物であり；ＸはCl、Br、およびＩからな
る群より選ばれる少なくとも一種のハロゲンであ
り；X′、X″、およびＸは、Ｆ、Cl、Br、およ
びＩからなる群より選ばれる少なくとも一種のハ
ロゲンであり；そして、ａは０≦ａ≦２、ｂは０
≦ｂ≦10^-2、ｃは０≦ｃ≦10^-2、かつａ＋ｂ＋ｃ
≧10^-6であり；ｘは０＜ｘ≦0.5、ｙは０＜ｙ≦
0.2である］の組成式で表わされる蛍光体、 などを挙げることができる。

ただし、本発明の方法に用いられる蓄積性蛍光
体シートに含まれる輝尽性蛍光体は上述の蛍光体
に限られるものではなく、放射線の照射を受けた
のち励起光の照射を受けた場合に輝尽発光を示す
蛍光体であればいかなるものであつてもよい。

本発明に従うオートラジオグラフイーに利用さ
れる蓄積性蛍光体シートの詳細については、たと
えば本出願人による特願昭57−193418号明細書
（特開昭59−83057号公報）に記載されている。

次に、蓄積性蛍光体シートに蓄積記録された転
写支持体上の放射性標識物質の位置情報の読み出
しが行なわれる。この読み出し方法について、添
付図面の第２図に示した読出装置（あるいは読取
装置）の例を参照しながら略述する。

第２図は、蓄積性蛍光体シート（以下において
は、シートと略記することもある）１に蓄積記録
されている放射性標識物質の二次元的な位置情報
を仮に読み出すための先読み用読出部２と、放射
性標識物質の位置情報を出力するためにシート１
に蓄積記録されている放射線画像を読み出す機能
を有する本読み用読出部３から構成される読出装
置の例の概略図を示している。

先読み用読出部２においては次のような先読み
操作が行なわれる。

レーザー光源４から発生したレーザー光５はフ
イルター６を通過することにより、このレーザー
光５による励起に応じて蓄積性蛍光体シート１か
ら発生する輝尽発光の波長領域に該当する波長領
域の部分がカツトされる。次いでレーザー光は、
ガルバノミラー等の光偏向器７により偏向処理さ
れ、平面反射鏡８により反射されたのちシート１
上に一次元的に偏向して入射する。ここで用いる
レーザー光源４は、そのレーザー光５の波長領域
が、シート１から発する輝尽発光の主要波長領域
と重複しないように選択される。

蓄積性蛍光体シート１は、上記の偏向レーザー
光の照射下において、矢印９の方向に移送され
る。従つて、シート１の全面にわたつて偏向レー
ザー光が照射されるようになる。なお、レーザー
光源４の出力、レーザー光５のビーム径、レーザ
ー光５の走査速度、シート１の移送速度について
は、先読み操作のレーザー光５のエネルギーが本
読み操作に用いられるエネルギーよりも小さくな
るように調整される。

蓄積性蛍光体シート１は、上記のようなレーザ
ー光の照射を受けると、蓄積記録されている放射
線エネルギーに比例する光量の輝尽発光を示し、
この光は先読み用導光性シート１０に入射する。
この導光性シート１０はその入射面が直線状で、
蓄積性蛍光体シート１状の走査線に対向するよう
に近接して配置されており、その射出面は円環を
形成し、フオトマルなどの光検出器１１の受光面
に連絡している。この導光性シート１０は、たと
えばアクリル系合成樹脂などの透明な熱可塑性樹
脂シートを加工してつくられたもので、入射面よ
り入射した光がその内部において全反射しながら
射出面へ伝達されるように構成されている。蓄積
性蛍光体シート１からの輝尽発光はこの導光性シ
ート１０内を導かれて射出面に到達し、その射出
面から射出されて光検出器１１に受光される。

光検出器１１の受光面には、輝尽発光の波長領
域の光のみを透過し、励起光（レーザー光）の波
長領域の光をカツトするフイルターが貼着され、
輝尽発光のみを検出しうるようにされている。光
検出器１１により検出された輝尽発光は電気信号
に変換され、さらに増幅器１２により増幅され出
力される。増幅器１２から出力された蓄積記録情
報は、本読み用読出部３の制御回路１３に入力さ
れる。制御回路１３は、得られた蓄積記録情報に
応じて、濃度およびコントラストが最も均一でか
つ観察読影性能の優れた画像が得られるように、
増幅率設定値ａ、収録スケールフアクターｂ、お
よび、再生画像処理条件設定値ｃを出力する。

以上のようにして先読み操作が終了した蓄積性
蛍光体シート１は、本読み用読出部３へ移送され
る。本読み用読出部３においては次のような本読
み操作が行なわれる。

本読み用レーザー光源１４から発せられたレー
ザー光１５は、前述のフイルター６と同様な機能
を有するフイルター１６を通過したのちビーム・
エクスパンダー１７によりビーム径の大きさが厳
密に調整される。次いでレーザー光は、ガルバノ
ミラー等の光偏向器１８により偏向処理され、平
面反射鏡１９により反射されたのち蓄積性蛍光体
シート１上に一次元的に偏向して入射する。な
お、光偏向器１８と平面反射鏡１９との間にはfθ
レンズ２０等が配置され、シート１の上を偏向レ
ーザー光が走査した場合に、常に均一なビーム速
度を維持するようにされている。

蓄積性蛍光体シート１は、上記の偏向レーザー
光の照射下において、矢印２１の方向に移送され
る。従つて、先読み操作におけると同様にシート
１の全面にわたつて偏向レーザー光が照射される
ようになる。

蓄積性蛍光体シート１は、上記のようにしてレ
ーザー光の照射を上けると、先読み操作における
と同様に、蓄積記録されている放射線エネルギー
に比例する光量の輝尽発光を発し、この光は本読
み用導光性シート２２に入射する。この本読み用
導光性シート２２は先読み用導光性シート１０と
同様の材質、構造を有しており、本読み用導光性
シート２２の内部を全反射を繰返しつつ導かれた
輝尽発光はその射出面から射出されて、光検出器
２３に受光される。なお、光検出器２３の受光面
には輝尽発光の波長領域のみを選択的に透過する
フイルターが貼着され、光検出器２３が輝尽発光
のみを検出するようにされている。

光検出器２３により検出された輝尽発光は電気
信号に変換され、前記の増幅率設定値ａに従つて
感度設定された増幅器２４において適正レベルの
電気信号に増幅されたのち、Ａ／Ｄ変換器２５に
入力される。Ａ／Ｄ変換器２５は、収録スケール
フアクター設定値ｂに従い信号変動幅に適したス
ケールフアクターでデジタル信号に変換され、信
号処理回路２６に入力される。信号処理回路２６
では、再生画像処理条件設定値ｃに基づいて、濃
度およびコントラストが適正で観察読影適正の優
れた可視画像が得られるように信号処理が行なわ
れ、処理された情報は磁気テープなどの保存手段
に蓄えられる。次いで、必要に応じて所望の記録
装置（図示なし）に伝送される。

記録装置としては、たとえば、感光材料上をレ
ーザー光等で走査して光学的に記録するもの、
CRT等に電子的に表示するもの、CRT等に表示
された放射線画像をビデオ・プリンター等に記録
するもの、熱線を用いて感熱記録材料上に記録す
るもの、ドツトプリンター等白色紙に記録するも
のなど種々の原理に基づいた記録装置を用いるこ
とができる。

ただし、記録装置は上記のように可視画像化す
るものに限られるものではなく、前述したように
放射性標識物質の二次元的な位置情報を、たとえ
ば数値化もしくは記号化するなどして記録するこ
ともできる。

なお、本発明における蓄積性蛍光体シートに蓄
積記録された転写支持体上の放射性標識物質の位
置情報を読み出すための方法について、上記にお
いては先読み操作と本読み操作とからなる読出し
操作を説明したが、本発明において利用すること
ができる読出し操作は、上記の例に限られるもの
ではない。たとえば、転写支持体上の放射性物質
の放射線強度および、その転写支持体についての
蓄積性蛍光体シートの露光時間が予めわかつてい
れば、上記の例において先読み操作を省略するこ
ともできる。

また、本発明における蓄積性蛍光体シートに蓄
積記録された放射性標識物質の位置情報を読み出
すための方法は、上記に例示した方法に限られる
ものではない。

このようにして得られた放射性標識物質の二次
元的な位置情報から、転写支持体上の目的遺伝子
を検出、同定することができる。たとえば、転写
支持体のオートラジオグラフを放射線フイルムな
どを用いて可視画像として得た場合には、目的遺
伝子を有するDNA断片に相当する位置のみが感
光されて、その位置が黒点あるいは黒化した筋と
して示される。従つて、可視画像上に現れた黒点
の相対的な位置、濃度および大きさなどから、目
的遺伝子が含まれているか否かを判定し、目的遺
伝子を検出することができる。［第１図ｄ；１
ｄ：黒化した部分、２ｄ：放射線フイルム］。

そして、この放射線フイルムと、ゲル支持媒体
を染色して得られた写真とを位置を合わせて比較
することにより、転写支持体上の目的遺伝子を同
定することができる。

さらに、所望により、可視化されたオートラジ
オグラフを有する放射線フイルムの上にゲル支持
媒体を位置を合わせて置くことにより、放射線フ
イルム上の黒点と一致する支持媒体上のDNA断
片を目視により同定し、これにより目的遺伝子を
有するDNA断片を採取することもできる。ただ
し、放射線フイルム上に可視化されたオートラジ
オグラフが、転写支持体であるニトロセルロース
フイルターと同一の大きさである場合には、ハイ
ブリダイゼーシヨン処理によりフイルターが収縮
しているために、得られたオートラジオグラフは
ゲル支持媒体の大きさよりも若干小さくなる傾向
があることに注意しなければならない。

本発明において、オートラジオグラフイーを利
用して転写支持体上に存在する目的遺伝子の二次
元的な位置情報を得ることにより、目的遺伝子を
有するDNA断片を検出、同定する方法は、上記
のような放射線フイルム等にオートラジオグラフ
を可視画像化する方法に限られるものではなく、
たとえば、その位置情報を数値化もしくは記号化
することにより、得られた数値・記号等のデジタ
ル値に基づいて目的遺伝子を有するDNA断片を
検出、同定することも可能である。

上記においては、サザン・ブロツテイング法を
利用する遺伝子のスクリーニング方法について説
明したが、遺伝子のスクリーニング方法に利用さ
れるブロツテイング法はサザン・ブロツテイング
法に限られるものではなく、たとえば、ノアザ
ン・ブロツテイング法を利用することもできる。

この方法は、試料として目的とする遺伝子の
RNA断片を含む複数のRNA断片を用いるもので
ある。本発明の遺伝子のスクリーニングは、まず
電気泳動により媒体上に分離展開されたRNA断
片を、転写支持体であるDBMペーパーに転写す
る。次に、上述と同様の方法により目的遺伝子を
有するRNAと放射性標識されたDNAプローブと
をハイブリダイズさせたのち、そのオートラジオ
グラフ測定を行ない、得られた放射性標識物質の
二次元的な位置情報に基づいて目的遺伝子を検
出、同定し、さらには媒体から目的遺伝子を有す
るRNA断片を採取することが行なわれる。

さらに、本発明の遺伝子のスクリーニング方法
は、上述のサザン・ブロツテイング法およびノア
ザン・ブロツテイング法を利用したものに限定さ
れるものではない。すなわち、本発明の方法が適
用される試料（もしくは検体）としてはDNA、
RNAなどの核酸；それら核酸の制限酵素等によ
る分解物、それら核酸の合成酵素等による合成
物、組み換えDNAなどの断片物；メチル化DNA
などの核酸およびその断片の誘導体を挙げること
ができる。

上記試料が分離展開されてなる媒体の例として
は、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲルな
どの電気泳動用支持媒体；シリカゲルなどの薄層
クロマトグラフイー用支持媒体；濾紙などのペー
パークロマトグラフイー用支持媒体を挙げること
ができる。

媒体上の試料が転写される転写支持体の例とし
ては、上記のニトロセルロースフイルター；
DBMペーパー（またはABMペーパー）のほか
に、DPTペーパー（またはAPTペーパー）；
DEAEペーパー；ナイロン誘導体からなるフイル
ター；濾紙を挙げることができる。そして、試料
の転写方法としては、上記の毛細管法のほかにエ
レクトロブロツテイング（電気泳動的転写）法が
挙げられる。

また、ハイブリダイゼーシヨンを行なうために
用いられる放射性標識プローブとしては、放射性
標識されたDNA、その断片およびそれらの誘導
体；放射性標識されたRNA、その断片およびそ
れらの誘導体を挙げることができる。放射性標識
を付与するために用いられる放射性核種の例とし
ては、 ³²P、 ³H、 ¹⁴C、 ³⁵Sを挙げることがで
きる。

以上述べたように、本発明の遺伝子のスクリー
ニング方法は、適当な媒体上で分離展開操作など
により分画された核酸、その断片もしくはそれら
の誘導体の少なくとも一部を好適な転写支持体上
に転写し、ハイブリダイゼーシヨン法を利用して
目的とする遺伝子のみを放射性標識したのち、蓄
積性蛍光体シートを用いてそのオートラジオグラ
フを得ることにより、簡易にかつ高精度で目的遺
伝子を検出、同定する方法である。さらに、本発
明の遺伝子のスクリーニング方法は、オートラジ
オグラフが有する放射性標識物質の二次元的な位
置情報に基づいて、媒体上の目的遺伝子を担う核
酸、その断片もしくはそれらの誘導体を短時間に
容易かつ高精度に採取する方法である。

次に本発明の実施態様を記述する。なお、以下
の実施例において使用した蓄積性蛍光体シートは
下記の方法により製造されたものである。

輝尽性の二価のユーロピウム賦活弗化臭化バリ
ウム蛍光体（BaFBr：Eu²⁺）の粒子と線状ポリ
エステル樹脂との混合物にメチルエチルケトンを
添加し、さらに硝化度11.5％のニトロセルロース
を添加して蛍光体粒子を分散状態で含有する分散
液を調製する。次に、この分散液に燐酸トリクレ
ジル、ｎ−ブタノール、そしてメチルエチルケト
ンを添加したのち、プロペラミキサーを用いて充
分に撹拌混合して、蛍光体粒子が均一に分散し、
結合剤と蛍光体との混合比が１：25（重量比）か
つ粘度が25〜35PS（25℃）の塗布液を調製する。

次に、ガラス板上に水平に置いたカーボンブラ
ツク練り込みポリエチレンテレフタレートシート
（支持体、厚み：250μｍ）の上に塗布液をドクタ
ーブレードを用いて均一に塗布する。そして塗布
後に、塗膜が形成された支持体を乾燥器内に入
れ、この乾燥器内部の温度を25℃から100℃に
徐々に上昇させて、塗膜の乾燥を行なつた。この
ようにして、支持体上に層厚が300μｍの蛍光体
層を形成する。

そして、この蛍光体層の上に、透明なポリエチ
レンテレフタレートフイルム（厚み：12μｍ）の
片面にポリエステル系接着剤を付与したのち、接
着剤層側を下に向けて置いて接着することによ
り、保護膜を形成し、支持体、蛍光体層および保
護膜から構成された蓄積性蛍光体シートを製造す
る。

実施例 １ (1) 電気泳動による分離展開操作 常法によりバクテリオフアージラムダ
（C1857S7）から取り出したDNAを、制限酵素
Hindによつて分解して得られたDNA断片の
混合物を試料とした。

このDNA断片混合物を1.5％のアガロースゲ
ル（10cm×18cm×0.3cm）上で、40mMのトリ
ス・ホウ酸緩衝液（PH8.2）を用いて電気泳動
を行ない、分離展開させた。

得られたゲルを、電気泳動用緩衝液に溶解し
たエチジウムブロミド（0.5μｇ／ml）中に２時
間浸漬してDNA断片を染色したのち、UVラ
ンプ下で撮影してDNA断片の分画像を得た。

(2) 転写操作 DNA断片の分離展開されているゲルを1.5M
の塩化ナトリウム水溶液と0.5Mの水酸化ナト
リウム水溶液中にそれぞれ15分間づつ浸漬する
操作を、溶液を新しくして２回繰り返すことに
より、二本鎖のDNAを一本鎖のDNAに変性し
た。このゲルを次に1Mのトリス・塩酸緩衝液
（PH7.5）中に15分間浸漬する操作を液を取り換
えて２回繰り返して中和した。

公知のサザンの方法に従つて、20×SSC（１
×SSC：0.15Mの塩化ナトリウムおよび0.015M
のクエン酸ナトリウム、PH７）に浸した濾紙の
上に、上記のゲルを置き、さらに２×SSCで湿
らせたニトロセルロースフイルター（HAWP、
ミリポア社製）および数枚の乾いた濾紙を順に
重ねた。そして、この状態でゲルの下側の濾紙
を時々20×SSCで湿らせながら約５時間放置し
て、ゲル上の変性DNA断片をニトロセルロー
スフイルターに転写移動させた。

(3) ハイブリダイゼーシヨン処理 変性DNA断片が転写されているニトロセル
ロースフイルターを、２×SSC中に20分間浸漬
したのち、80℃の温度の真空乾燥器内で２時間
加熱して、このDNA断片をフイルター上に固
定した。

次いで、フイルターを65℃の温度に保つた
Denhardt溶液（0.02％ウシ血清アルブミン、
0.02％ポリビニルピロリドンおよび0.02％フイ
コールを含む３×SSC溶液）中に３時間浸漬し
てフイルターのマスキングを行なつた。

そののち、ラムダDNAの制限酵素Hindに
よる分解物の第四断片（4.2Kbp）を、ニツ
ク・トランスレーシヨン法によつて ³²Pで放射
性標識したプローブ（比活性：１×10⁸（cpm／
μｇ）0.5μｇと、子ウシ胸腺DNA150μｇとを
溶解したDenhardt溶液10ml中に、上記フイル
ターを浸漬し、65℃の温度で30時間加温するこ
とにより、放射性標識プローブをハイブリダイ
ズさせた。

次に、このフイルターを２×SSPE（１×
SSPE：0.18Mの塩化ナトリウムおよび10mM
のリン酸ナトリウム、1mMのEDTA、PH7.7）
と0.1％SDSとを含み溶液中に、65℃の温度で
15分間浸漬する操作を溶液を換えて二回繰り返
して洗浄した。さらに、0.1×SSPEと0.1％
SDSとを含む溶液中に、50℃の温度で15分間浸
漬する操作を溶液を換えて二回繰り返して洗浄
したのち、室温で乾燥させた。

(4) オートラジオグラフ測定による遺伝子の検
出、同定操作 ハイブリダイズされたニトロセルロースフイ
ルターと蓄積性蛍光体シートとを重ねて、明室
にて直接撮影用の医療用Ｘ線カセツテ内に収納
し、室温で30分間露光したのち、蓄積性蛍光体
シートを第２図に示す読出装置に導入し、蓄積
性蛍光体シートに蓄積記録されたフイルターの
オートラジオグラフを読み出すことにより、放
射性標識プローブの二次元的な位置情報をデジ
タル値として得た。

得られたデジタル情報に基づいて、レーザー
スキヤニング装置を用いて写真フイルムを露光
し、現像処理することにより、上記オートラジ
オグラフを可視画像化した。この可視画像は、
比較例１の放射線写真法を用いたオートラジオ
グラフイーによつて得られる画像と同程度の画
質を有していた。

また、得られた位置情報により、予め撮影し
ておいたエチジウムブロミド染色の写真上で、
放射性標識プローブに対応するラムダDNAの
Hind分解物の第四断片を容易に同定するこ
とができた。

比較例 １ 実施例１において、(4)のオートラジオグラフ測
定による遺伝子の検出、同定操作を、蓄積性蛍光
体シートを用いる代りに、医療用Ｘ線フイルム
（RX：富士写真フイルム(株)製）と蛍光増感紙
（ハイスタンダード3D：富士写真フイルム(株)製）
とを組合わせたものを使用し、暗室にてニトロセ
ルロースフイルター、Ｘ線フイルムおよび増感紙
を順に重ねてカセツテ内に収納し、−80℃の温度
で15時間露光した。このＸ線フイルムを現像処理
して、オートラジオグラフを得た。

得られた画像は、実施例１にて写真フイルム上
に可視画像として得られたオートラジオグラフと
同程度の画質であつた。

実施例１および比較例１の結果から、本発明に
従う遺伝子のスクリーニング方法（実施例１）に
よれば、従来のスクリーニング方法（比較例１）
と比較して、簡易な操作を行なうことにより短時
間で目的とする遺伝子を検出、同定することがで
きることが判明した。また、本発明の方法によれ
ば、容易に、効率良くかつ高純度で目的遺伝子を
選択採取することが充分可能であることも判明し
た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の遺伝子のスクリーニング方
法を概略的に説明する模式図である。 aDNA断片が分離展開されている媒体、１
ａ：DNA断片、２ａ：媒体、ｂ転写支持体、１
ｂ：変性DNA断片、２ｂ：転写支持体、ｃハイ
ブリツドが形成されている転写支持体、１ｃ：ハ
イブリダイズしたDNA断片、２ｃ：ハイブリダ
イズしなかつたDNA断片、３ｃ：転写支持体、
ｄ可視化されたオートラジオグラフ、１ｄ：黒化
した部分、２ｄ：放射線フイルム。 第２図は、蓄積性蛍光体シートに蓄積記録され
た転写支持体上の放射性標識物質の位置情報を読
み出すための読出装置（あるいは読取装置）の例
を示すものである。 １：蓄積性蛍光体シート、２：先読み用読出
部、３：本読み用読出部、４：レーザー光源、
５：レーザー光、６：フイルター、７：光偏向
器、８：平面反射鏡、９：移送方向、１０：先読
み用導光性シート、１１：光検出器、１２：増幅
器、１３：制御回路、１４：レーザー光源、１
５：レーザー光、１６：フイルター、１７：ビー
ム・エクスパンダー、１８：光偏向器、１９：平
面反射鏡、２０：fθレンズ、２１：移送方向、２
２：本読み用導光性シート、２３：光検出器、２
４：増幅器、２５：Ａ／Ｄ変換器、２６：信号処
理回路。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ハイブリダイゼーシヨン法を利用する遺伝子
   のスクリーニング方法において、 (1) 媒体上に分離展開された核酸、その断片物も
   しくはそれらの誘電体の少なくとも一部を転写
   支持体上に転写して固定する工程； (2) 転写支持体上に固定された該核酸、その断片
   物もしくはそれらの誘導体と放射性標識が付与
   されたプローブとをハイブリダイズさせる工
   程； (3) ハイブリダイズ処理後に、該転写支持体と輝
   尽性蛍光体を含有する蓄積性蛍光体シートとを
   10〜35℃の温度で一定時間重ね合わせることに
   より、該転写支持体上の放射性標識物質から放
   出される放射線エネルギーの少なくとも一部を
   該蓄積性蛍光体シートに吸収させたのち、該シ
   ートを電磁波により励起して該シートに蓄積さ
   れている放射線エネルギーを輝尽光として放出
   させ、そしてその輝尽光を検出することによ
   り、該転写支持体上の放射性標識物質の位置情
   報を得る工程； および、 (4) 得られた位置情報に基づいて、該媒体上の核
   酸、その断片物もしくはそれらの誘電体を採取
   する工程； からなるオートラジオグラフイーによる遺伝子の
   スクリーニング方法。 ２ 上記の媒体上に分離展開された核酸、その断
   片物もしくはそれらの誘電体が、電気泳動により
   分離展開されたものである請求項第１項記載のオ
   ートラジオグラフイーによる遺伝子のスクリーニ
   ング方法。 ３ 上記の遺伝子のスクリーニング方法がサザ
   ン・ブロツテイング法を利用するものであり、上
   記核酸もしくはその断片物がDNAもしくはDNA
   断片である請求項第２項記載のオートラジオグラ
   フイーによる遺伝子のスクリーニング方法。 ４ 上記遺伝子のスクリーニング方法がノアザ
   ン・ブロツテイング法を利用するものであり、上
   記核酸もしくはその断片物がRNAもしくはRNA
   断片である請求項第２項記載のオートラジオグラ
   フイーによる遺伝子のスクリーニング方法。 ５ 上記(3)の工程において、蓄積性蛍光体シート
   の電磁波による励起が、該シートを電磁波で時系
   列的に走査することにより行なわれる請求項第１
   項乃至第４項のいずれかの項記載のオートラジオ
   グラフイーによる遺伝子のスクリーニング方法。 ６ 上記(3)の工程において、放射性標識物質の位
   置情報を得ることが、輝尽光を画像化することに
   より行なわれる請求項第１項乃至第４項のいずれ
   かの項記載のオートラジオグラフイーによる遺伝
   子のスクリーニング方法。 ７ 上記(3)の工程において、放射性標識物質の位
   置情報が得ることが、輝尽光を記号および／また
   は数値で表示することにより行なわれる請求項第
   １項乃至第４項のいずれかの項記載のオートラジ
   オグラフイーによる遺伝子のスクリーニング方
   法。 ８ 上記蓄積性蛍光体シートが、支持体、輝尽性
   蛍光体を結合剤中に分散してなる蛍光体層および
   保護膜を含むものである請求項第１項乃至第７項
   のいずれかの項記載のオートラジオグラフイーに
   よる遺伝子のスクリーニング方法。