JPH0439994B2

JPH0439994B2 -

Info

Publication number: JPH0439994B2
Application number: JP58046329A
Authority: JP
Inventors: Sachiko Murakami; Toshiro Ishida; Tadashi Funada; Jiro Hirano
Original assignee: Nippon Oil and Fats Co Ltd
Current assignee: NOF Corp
Priority date: 1983-03-19
Filing date: 1983-03-19
Publication date: 1992-07-01
Also published as: JPS59173080A

Description

【発明の詳細な説明】この発明はリパーゼの安定化方法に関する。

リパーゼを用いて油脂を加水分解する方法につ
いては、従来多くの研究がなされているが、ほと
んどの研究は常温付近（25〜37℃）で液体の油を
加水分解するものであり、高融点の脂肪を加水分
解する例は非常に少ない。

この主な理由は、リパーゼが生体細胞により生
産されるタンパク質性の触媒で、至適温度である
薬37℃を超えると熱変性をおこし、失活して油肪
の加水分解能力が低下し、かかる高温下で高融点
の脂肪の加水分解を試みても高い加水分解率が得
られないためであつた。また、上記リパーゼの失
活を防止するために、高融点の脂肪を低温で加水
分解を行うと、脂肪の一部や加水分解により生成
した固体の脂肪酸が結晶となつて析出し、反応系
の粘度が増大して攪拌が困難となり、リパーゼ水
溶液と脂肪との接触が不十分となつて数日間の反
応においても加水分解率が向上してこない。

この出願人は、上記問題を克服して高融点の脂
肪の加水分解率を97〜98％以上に向上させるた
め、すでに、融解した脂肪と冷却したリパーゼ水
溶液とを混合して脂肪の融点以下の温度で安定な
乳化分散液を得、これを静置して加水分解するこ
とにより、リパーゼの失活を防止してつまりリパ
ーゼの活性を有効に保持して上記目的を達する方
法を開示した（特開昭57−57799号）。しかし、こ
の方法においては反応温度が30℃と比較的低温度
であるために反応は48時間を要した。

一方、上記高融点の脂肪とは異なる常温で液体
である油をリパーゼ水溶液により加水分解する方
法については、すでに述べたように数多くの研究
がなされてきた。この場合、常温での加水分解反
応終了後油相を遠心分解などの操作で分離し、リ
パーゼ水溶液を回収して再使用する方法が一般に
採用されている。しかし、常温での加水分解に当
たり、たとえばリパーゼの至適温度である37℃で
97〜98％の分解率を達成するための反応時間は分
散効果の低さから76〜96時間という長時間となる
ため、この間にリパーゼ水溶液の酵素活性が約90
％まで低下する問題があつた。したがつてリパー
ゼ水溶液を回収して再使用するに当り、１回の加
水分解反応終了後酵素活性の約10％に相当するリ
パーゼを補給する必要があつた。

この発明者らは、上述の二つの欠点を回避する
ため、すなわちリパーゼによる加水分解反応が高
融点の脂肪を対象としうるような比較的高温度で
実施できないこと、およびリパーゼの至適温度
（通常37℃）付近でリパーゼ水溶液が徐々にその
酵素活性を減ずることを防止するために鋭意検討
を行つた結果、リパーゼ水溶液中に多数のエーテ
ル結合を含有する物質を共存させることにより、
リパーゼ水溶液の安定性が向上しこれにより上記
欠点を回避できることを見い出し、この発明を完
成するに至つたものである。

すなわち、この発明は、油脂の加水分解に供さ
れる如きリパーゼを含有する水溶液に炭素数１〜
13の一価アルコールまたは多価アルコールのポリ
オキシアルキレンエーテルを添加してリパーゼを
安定化させる方法に係るものである。

この発明において、一価アルコールとは炭素数
１〜13のアルコールであり、多価アルコールとは
一分子内に水酸基を二個以上有するものであり、
二個有するものとしてエチレングリコール、プロ
ピレングリコール、ネオペンチルグリコールなど
があり、三個有するものとしてグリセロール、ト
リメチロールプロパンなどがあり、四個以上有す
るものとしてペンタエリスリトール、ソルビトー
ル、グルコースなどがある。

一価または多価アルコールのポリオキシアルキ
レンエーテル（以下、ポリエーテルという）のオ
キシアルキレン基はオキシエチレン基またはオキ
シプロピレン基であり、これらは単独でも共存し
ていてもよく、共存する場合はブロツク付加物で
もランダム付加物でもよい。オキシアルキレン基
の数は一分子当り２〜40、好ましくは５〜20であ
る。この範囲外ではリパーゼの安定化効果が低下
する。

ポリエーテルは水に溶解または分解させて使用
するが、その添加量はリパーゼ水溶液中で0.1〜
50重量％、好ましくは１〜20重量％になる量であ
る。添加量を50重量％になる量より多くしてもそ
の安定化効果はそれほど向上しないので経済的に
不利である。また、0.1重量％未満ではその安定
化効果は不十分である。

この発明に使用するリパーゼとしては、キヤン
デイダ属、クロモバクテリウム属、アスペルギル
ス属、ペニシリウム属、ムコール属、ジオトリカ
ム属、リゾプス属、アルスロバクター属、ヒコミ
セス属などの微生物を給源とするリパーゼ、すい
臓などの動物蔵器より得られるリパーゼ、ひま種
子などの植物種子より得られるリパーゼ等があ
る。

この発明によるリパーゼの安定化方法により、
至適温度37℃のリパーゼを50℃で使用することが
可能となる。すなわち、50℃においてはポリエー
テルを添加しないリパーゼの水溶液は１時間で最
初の酵素活性の約80％が失なわれる。しかし、ポ
リエーテルを添加したリパーゼの水溶液はその酵
素活性の低下は小さく、２時間経過後にもとの酸
素活性の約10％の低下しか見られず、４時間経過
後でもその酵素活性は約20％低下するに過ぎな
い。

したがつて、この発明の利点として、例えば融
点42℃のトリグリセリドである牛脂を前記この出
願人の先の提案法によつて30℃で静置分解した場
合に反応時間48時間を要して分解率97〜98％に達
したものが、50℃では反応時間は1/10以下の４時
間で分解率97〜98％になることから、反応時間の
短縮による生産効率の大巾な向上を望める。

この発明によるリパーゼの安定化のもうひとつ
の利点は、リパーゼの至適温度である37℃に保持
した場合に従来のリパーゼの水溶液は４〜５日で
酵素活性の約10％が失活してしまうのに対し、ポ
リエーテルを添加したこの発明に係るリパーゼの
水溶液は37℃で10日間経過して上記従来のものと
同じ酵素活性の約10％が失活するため、リパーゼ
のリサイクル効率が約２倍になつて経済的に非常
に有利となることである。

つぎに、この発明を実施例により具体的に説明
する。なお、リパーゼ水溶液の酵素活性の測定法
はつぎの通りである。

PH7.0のリン酸緩衝液５mlとオリーブ油１mlの
混合物にリパーゼ水溶液１mlを加え、37℃におい
て500r・ｐ・ｍで攪拌して１時間反応させ、反応
終了後遊離した脂肪酸の量をアリカリによる滴定
で求めた。リパーゼの活性は、１分間に1μモル
の脂肪酸を遊離する酵素量を１単位とした。

実施例１エタノールにプロピレンオキシド４モルとエチ
レンオキシド６モルがランダム付加したポリエー
テルの５重量％水溶液を調製し、37℃に加温し
た。これにジオトリカム属より得られた1172単
位／mlのブロスを加え、初期酵素活性150単位／
mlのリパーゼ水溶液を調製し、500r・ｐ・ｍで攪
拌しながら37℃に保持し、適時サンプリングして
酵素活性を測定した。その結果、１日経過後で
150単位／ml、３日経過後で150単位／ml、７日経
過後で144単位／ml、11日経過後で136単位／mlの
酵素活性を示した。すなわち、11日経過後で9.3
％しか活性が失なわれなかつた。

比較例１ポリエーテルを用いないほかは実施例１と同一
の条件で試験した結果、１日経過後で150単位／
ml、３日経過後で139単位／ml、５日経過後で131
単位／ml、10日経過後で120単位／mlとなり、５
日目ですでに12.7％、10日目で20％の活性が失な
われた。

実施例２ポリエーテルとして炭素数12〜13の合成第一ア
ルコール（直鎖率80％）のプロピレンオキシド４
モルとエチレンオキシド６モルがこの順序でブロ
ツク付加したポリエーテルを用い、実施例１と同
一の条件で試験を行なつた。その結果、１日経過
後で150単位／ml、７日経過後で145単位／ml、11
日経過後で133単位／mlの酵素活性を示した。す
なわち、11日経過後で11.3％しか活性が失なわれ
なかつた。

実施例３エチレングリコールにエチレンオキシド３モル
とプロピレンオキシド２モルがランダム付加した
ポリエーテルの10重量％の水溶液を調製し、50℃
に加温した。これにキヤンデイダ属より得られた
30000単位／ｇのリパーゼ粉末を加え、初期活性
150単位／mlを含有するリパーゼ水溶液を調製し、
500r・ｐ・ｍで攪拌しながら50℃に保持して、適
時サンプリングして酵素活性を測定した。その結
果、１時間経過後で148単位／ml、２時間経過後
で136単位／ml、４時間経過後で121単位／mlとな
つた。すなわち、４時間経過後で19.3％しか活性
が失なわれなかつた。

比較例２ポリエーテルを用いないほかは実施例３と条件
を同一にして試験した結果、１時間経過後で28単
位／mlの酵素活性しか示さなかつた。すなわち、
１時間で81.3％の活性が失なわれた。

実施例４グリセロールにエチレンオキシド20モルを付加
したポリエーテルを用い、実施例３と同一の条件
で試験した。その結果、１時間経過後で148単
位／ml、２時間経過後で138単位／ml、４時間経
過後で120単位／mlの酵素活性を示した。すなわ
ち、４時間経過後で20％しか活性が失なわれなか
つた。

実施例５ペンタエリスリトールにエチレンオキシド５モ
ルとプロピレンオキシド10モルがこの順序でブロ
ツク付加したポリエーテルの20重量％の水分散体
を調製し、37℃に加温した。これにムコール属よ
り得られた15000単位／ｇのリパーゼ粉末を加え、
初期活性150単位／mlを含有する酵素水溶液を調
製し、500r・ｐ・ｍで攪拌しなが37℃に保持し
た。適時サンプリングして酵素活性を測定した。
その結果、１日経過後で150単位／ml、３日経過
後で148単位／ml、７日経過後で145単位／ml、10
日経過後で135単位／mlの酵素活性を示した。す
なわち、10日経過後で10％しか活性が失なわれな
かつた。

比較例３ポリエーテルを用いないほかは実施例５と同一
の条件で試験した結果、１日経過後で150単位／
ml、３日経過後で137単位／ml、５日経過後で135
単位／ml、10日経過後で122単位／mlとなり、５
日目ですでに10％、10日目で18.7％の活性が失な
われた。

実施例６グルコースのプロピレンオキシド５モル付加物
の１重量％水分散体を調製し、そのほかは実施例
５と同一の条件で試験した。その結果１日経過後
で150単位／ml、３日経過後で146単位／ml、７日
経過後で140単位／ml、10日経過後で137単位／ml
の酵素活性を示した。すなわち、10日経過後で
8.7％しか活性が失われなかつた。

実施例７エチレングリコールにプロピレンオキシド２モ
ルとエチレンオキシド３モルがランダムに付加し
たポリエーテルの10重量％の水溶液を調製し、こ
れにキヤンデイダ属より得られた30000単位／ｇ
のリパーゼ粉末を加え、初期活性500単位／mlを
含有するリパーゼ水溶液を調製した。このものに
牛脂（酸価0.2，けん化価192.3，融点42℃）100g
を加え、500r・ｐ・ｍで攪拌しながら50℃に４時
間保持した。反応終了後油層を分離し脱水した。
このものは酸価199.0，けん化価203.9で分解率
〔（酸価／けん化価）×100〕は97.6％であつた。

比較例４ポリエーテルを用いないほかは実施例７と同一
の条件で試験した結果、油層部分は酸価123.2，
けん化価199.8で分解率は61.7％となつた。

実施例８エタノールにプロピレンオキシド４モルとエチ
レンオキシド６モルがランダム付加したポリエー
テルの５重量％水溶液を調製し、これにジオトリ
カム属より得られた1172単位／mlのブロスを加
え、初期活性500単位／mlのリパーゼ水溶液を調
製した。これにオリーブ油（酸価0.5，けん化価
189.1）100gを加え、500r・ｐ・ｍで攪拌しなが
ら37℃で４日間保持した。反応終了後油層を遠心
分離し脱水した。このものは酸価194.4，けん化
価200.3で分解率は97.1％であり、水相の酵素活
性は490単位／mlであつた。この水相100mlに上述
のブロスを0.01ml加えて酵素活性を500単位／ml
とし、これを用いてオリーブ油の加水分解をくり
返した。反応終了後油層を遠心分離し脱水した。
このものは酸価193.0、けん化価200.0で分解率は
96.5％となつた。

比較例５ポリエーテルを用いないほかは実施例８と同一
の条件で試験した結果、油層部分は酸価190.5，
けん化価199.5で分解率95.5％であつた。水相の
酵素活性は450単位／mlであつた。この水相100ml
に上述のブロスを0.05ml加えて酵素活性を500単
位／mlとし、これを用いてオリーブ油の加水分解
をくり返した。反応終了後油層を遠心分離し脱水
した。このものは酸価190.0，けん化価198.5で分
解率は95.7％であつた。

実施例９（実施例３の再実験）エチレングリコールにエチレンオキシド３モル
とプロピレンオキシド２モルがランダムに付加し
たポリエーテルの10重量％の水溶液を調製し、50
℃に加温した。これにキヤンデイダ属より得られ
た30000単位／ｇのリパーゼ粉末を加え、初期活
性150単位／mlを含有するリパーゼ水溶液を調製
し、500r・ｐ・ｍで攪拌しながら50℃に保持し
て、適時サンプリングして酵素活性を測定した。
その結果、１時間経過後で146単位／ml、２時間
経過後で134単位／ml、４時間経過後で120単位／
mlとなつた。すなわち、４時間経過後でも20％し
か活性が失われなかつた。

比較例６ Triton Ｘ−100（オクチルフエノールのエチレ
ンオキシド９〜10モル付加物）の10重量％の水溶
液を調製し、50℃に加温した。これにキヤンデイ
ダ属より得られた30000単位／ｇのリパーゼ粉末
を加え、初期活性150単位／mlを含有するリパー
ゼ水溶液を調製し、500r・ｐ・ｍで攪拌しながら
50℃に保持して、適時サンプリングして酵素活性
を測定した。その結果、１時間経過後で130単
位／ml、２時間経過後で110単位／ml、４時間経
過後で70単位／mlと時間を追うごとに活性の低下
が起こり、４時間経過後には53.3％の活性が失わ
れた。

比較例７ ADEKA TOL 45−Ｓ−８相当品（炭素数14
と15の二級アルコール混合物のエチレンオキシド
８モル付加物）の10重量％の水溶液を調製し、50
℃に加温した。これにキヤンデイダ属より得られ
た30000単位／ｇのリパーゼ粉末を加え、初期活
性150単位／mlを含有するリパーゼ水溶液を調製
し、500r・ｐ・ｍで攪拌しながら50℃に保持し
て、適時サンプリングして酵素活性を測定した。
その結果、１時間経過後で135単位／ml、２時間
経過後で120単位／ml、４時間経過後で90単位／
mlと時間を追うごとに活性の低下が起こり、４時
間経過後には40％の活性が失われた。

Claims

【特許請求の範囲】

１リパーゼを含有する水溶液に炭素数１〜13の
一価アルコールまたは多価アルコールのポリオキ
シアルキレンエーテルを添加することを特徴とす
るリパーゼの安定化方法。